You are on page 1of 8

10/16/2013

Materi Kuliah
Bioteknologi Pertanian

TEKNIK FUSI SEL:
Isolasi Protoplasma
Fusi protoplasma

Protoplasma
• Sel tanpa dinding sel
• Dapat digunakan sebagai eksplan
• Digunakan untuk rekayasa genetika
– Paling sering untuk ekspresi transien
– transformasi konifer

• Digunakan untuk membuat hibrid interspesifik

Fusi Protoplas:
Mengapa menggunakan ini?
• Jika secara persilangan tidak bisa dilakukan
• Mengatasi tanaman yang incompatibilitas
• Dimungkinkan untuk persilangan secara luas
• Digunakan untuk pengenalan ciri penyakit dan
kualitas
• Potensi yg sangat besar untuk masa depan jika ingin
memecahkan permsalahan yang sulit di masa kini
• Protoplas juga target untuk rekayasa genetika .

1

Menghasilkan tan ploidi 2 X lipat Ploidi sama dengan tetuanya Hibridisasi somatik 2 .Mempunyai organel dr kedua sel tetua yang bersatu dalam satu sel Berisi organel yang berasal dari tetua betina 2.10/16/2013 Terminologi dalam teknik fusi sel • Hibridisasi genetik: fusi protoplasma sel yg berbeda jenisnya • Heterokarion: gabungan 2 atau lebih inti sel protoplasma • Cybrid: gabungan sitoplasma 2 sel atau lebih Perbedaan Hibrida somatik dan hibrida seksual : Hibrida Somatik Hibrida Seksual 1.Hasil fusi terdapat genom inti dari kedua sel tetua Genom ½ berasal dr tetua betina dan ½ dari tetua jantan 3.

3. Tahapan Fusi Protoplas Mencari prosedur yang tepat untuk isolasi protoplas Mencari prosedur yang tepat untuk mendapatkan hasil fusi yang mempunyai persentase tinggi dalam menghasilkan heterokarion binukleat Seleksi heterokarion setelah fusi Kultur heterokarion dengan persentase pembelahan sel dan regenerasi yang tinggi Analisis karakter hibrid/sibrid dan konstitusi genetik dari tanaman yang dihasilkan Persyaratan fusi :  Carlson et al. 5. Power et al. (1975) – persyaratan tumbuh diferensial hibrida untuk menghilangkan protoplas 2 (dua) dua donor spesies  Ahli lain – menggunakan senyawa kimia untuk menyeleksi protoplas hibrida atau menghilangkan protoplas tetua Metode seleksi : Menggunakan penanda genetik yang dapat dideteksi secara visual (defisiensi klorofil) 3 . 2. (1972). 4.10/16/2013 Produksi Hibrida Melalui Fusi Protoplas Empat tahap untuk produksi hibrida: • Isolasi Protoplas • FusiProtoplas • Seleksi Hibrida • Regenerasi tanaman 1.

saring dg saringan 50-100 μm •Pindahkan filtrat ke dalam tabung centrifuge. ulangi sentrifugasi.10/16/2013 Metode Fusi Protoplas : 1. Fusi secara elektrik 4. pektinase – Terjadi degradasi dinding sel • Pencucian dan pemurnian dg sentrifugasi • Inkubasi untuk memisahkan protoplasma viabel 1. tambah 5 ml media kultur. tambah 10 ml float medium. hitung kerapatan protoplasma dg haemacytometer (1x100000)/ml •Teteskan protoplasma ke petridish yg diberi kertas saring lembab •Inkubasi di cahaya rendah. centrifuge lagi •Supernatant dibuang. tambah media kultur 5 ml. campur. Induksi fusi secara kimia 3. hemiselulase. dipisahkan media dg selnya •Tambahkan 10 ml larutan enzim. Pemilihan protoplas tetua 2. centrifuge lagi pada 155xg selama 5 menit •Ambil larutan terkeruh. Protoplas Tetua • Asal : jaringan hipokotil/daun dari tunas kultur in vitro atau kultur suspensi sel umur 3-5 hari • Protoplas mesopil dan hipokotil mempunyai kapasitas regenerasi lebih baik • Enzim untuk isolasi protoplas kombinasi dari pektinase (untuk pemisahan sel) dan selulase (penghancuran dinding sel) • Pemilihan enzim dan lamanya penghancuran dinding sel mempengaruhi viabilitas protoplas dan fusogenik Pelaksanaan isolasi dan kultur protoplasma •20 ml suspensi sel. Mikrofusi Isolasi Protoplas secara enzimatik • Daun: lapisan epidermis dibuang • Letakkan daun dalam larutan(diberi osmotikum) – Isotonik sampai larutan yang hipertonik ringan – Biasanya mengandung mannitol atau sorbitol 500600 mM/L • Tambahkan enzim – Selulase. cuci dg menambahkan 5ml washing medium melalui filter •Centrifuge larutan pada 155xg selama 5 menit •Buang supernatan. masukkan ke petridish • Inkubasikan 28o C 6 jam. Praktek elektrofusi 5. tambahkan 100 ul media kultur setelah 7-10 hari 4 .

BM PEG.4 D atau NAA • Sitokinin yg digunakan: BAP. juga bisa diinduksi secara elektrik atau diberi virus • Tiga kemungkinan produk hasil fusi: – Sel A=Sel A – Sel B=Sel B – Sel A=Sel B • Inti biasanya tidak berfusi (sel heterokarion) 5 . konsentrasi dan lama perlakuan PEG • Galur sel mempengaruhi optimasi fusi. Protoplas dg vakuola kecil lebih mudah fusi dibandingkan dg bervakuola besar Hasil isolasi protoplasma Protoplas ma dalam larutan Daun plantlet kentang sbg sumber protoplasma FUSI PROTOPLAS: • Tidak terjadi secara spontan • Selain bisa diinduksi dengan menambah promotor fusi berupa senyawa kimia PEG. tergantung suhu medium.10/16/2013 Media kultur protoplasma • Umumnya menggunakan media MS atau B5 dan modifikasinya • Diberi larutan osmotikum: manitol atau sorbitol 500-600 mM/L • Penambahan 1 mM/L CaCl2 meningkatkan pembelahan sel • ZPT: auksin & sitokinin utk inisiasi • Auksin yg digunakan: 2. 2i-P 2. Kinetin. Induksi Fusi secara Kimiawi • Membran protoplas bermuatan negatif dan protoplas menjadi saling tolak menolak  berdekatan  mengubah pH medium dg polikation atau efek dehidrasi • PEG – menyebabkan aglutinasi (penggumpalan).

10/16/2013 Sel A Tambahkan Enzim Sel B Tambah Promotor Fusi PROTOPLASMA DILIHAT DI BAWAH MIKROSKOP HASIL FUSI PROTOPLASMA 6 .

Sortasi sel menggunakan flowcytometer (pemilih sel yang diaktifkan dengan fluoresen) 3. maka tekanan osmose media yg tinggi akan menghambat pembelahan sel • Terjadi ketidakstabilan genetik dan atau kromosom • Menghasilkan tanaman bebas patogen KULTUR PROTOPLASMA UNTUK MERAKIT TANAMAN HIBRIDA Regenerasi protoplasma menjadi plantlet bersifat hibrida Contoh Fusi Protoplas: Hibrida Intergenerik Wortel X Aegopdium Kedelai X Alfalfa Wortel X Barlei Kedelai X Barlei Wortel X Petunia Kedelai X Jagung Wortel X Tembakau Kedelai X Meadow Saffron Jagung X Oat Kedelai X Pea Jagung X Sorghum Kedelai X Tembakau Petunia X Fava Bean Kedelai X Rape Petunia X Parthenocissus Tomat X Kentang 7 .10/16/2013 Seleksi dan kultur heterokarion 1. Penanda yang dapat dilihat Misal : fluorochrome – klorofil berwarna merah (mesofil) fluorescein diaceate – kloroplas hijau kekuningan (kloroplas) 2. Penanda biokimia menggunakan nitrat sebagai sumber nitrogen  planlet yang tumbuh sebagai hibrid 4. protoplasma viable telah meregenerasikan dinding selnya dan membelah diri • Tekanan osmose media perlahan-lahan diubah dg cara meneteskan media tanpa manitol atau sorbitol • Tekanan osmose media apbl tdk diubah. Kultur heterokarion  sangat tergantung materi yang difusikan Regenerasi Protoplasma menjadi plantlet •Osmotikum digunakan untuk proteksi osmotik dalam media kultur • Dalam seminggu-10 hari.

sylvestris Petunia hybrida LATIHAN • Jelaskan pengertian hibridisasi somatik.10/16/2013 Contoh Fusi Protoplas : Hibrida interspesifik Dacus carota X D. hibridisasi somatik. knightiana Nicotiana tabacum X N. debneyi Nicotiana tabacum X N. fusi protoplas. variasi somaklonal. parodii 8 . capillifplius Datura innoxia X D. discolor Datura innoxia X D. kultur heterokarion! • Jelaskan tahapan fusi protoplas dan contoh aplikasinya! • Sebutkan beberapa cara dalam seleksi heterokarion! • Sebutkan beberapa variasi somaklonal yang terjadi pada hibridisasi somatik! • Mengapa dalam kultur anther diperlukan konfirmasi jumlah kromosom? • Jelaskan perbedaan hasil hibridisasi secara seksual. dan tanaman sibrid! Lengkapi dengan gambar! X P. langsdorffii Nicotiana sylvertris X N. stramonium Nicotiana glauca X N.