INSTITUTO DE MACROMOLÉCULAS PROFESSORA ELOISA MANO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
IMA - UFRJ

CROMATOGRAFIA
DE
PERMEAÇÃO EM GEL
Ricardo Cunha Michel
LAFIQ
sala J-210
3938-7228
rmichel@ima.ufrj.br
IMA – CT / UFRJ
Ricardo C. Michel
v. 2015

ou
CROMATOGRAFIA DE
EXCLUSÃO POR TAMANHO
O experimento de GPC / SEC
O princípio da técnica
Determinação relativa de Massa Molar
Precisão e Exatidão da técnica
O problema da relação entre massa molar e volume hidrodinâmico
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Ricardo C. Michel
v. 2015

Cromatografia
Separar é Reduzir a entropia
Métodos cromatográficos, de uma forma geral,
- permitem a separação, quantificação e identificação de espécies químicas;
- separam os componentes de uma mistura pela distribuição destes
componentes em duas fases que se encontram em contato, uma fase móvel e
outra fase estacionária;
- durante a passagem da fase móvel pela estacionária, os componentes da
mistura são seletivamente retidos pela fase estacionária, o que resulta em
migrações diferenciais destes componentes.
- a retenção seletiva pode operar por mecanismos entrópicos ou entálpicos.

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Ricardo C. Michel
v. 2015

Cromatografia
Permeação em Gel ou Exclusão por Tamanho
A Cromatografia de Permeação em Gel
é uma técnica na qual existe um suporte fixo,
um gel,
que NÃO É a fase estacionária, mas que a contém.
Além disto,
espera-se que não haja interações
entre os componentes da amostra a separar e o suporte fixo,
de modo que todo o processo cromatográfico
deve se dar apenas
devido ao tamanho dos componentes da mistura.
Este aspecto desta técnica cromatográfica justifica
seu outro nome:
Cromatografia de Exclusão por Tamanho
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ou cromatografia em peneira molecular de difusão restrita. Permite obter a distribuição de Massa Molar. cromatografia de filtração em gel. ou GFC.Cromatografia de Exclusão por Tamanho SEC Também conhecida por GPC. bem como os valores relativos de Massa Molar Numérica Média (Mn) e de Massa Molar Ponderal Média (Mw). 2015 . cromatografia de permeação em gel. Michel v. IMA – CT / UFRJ Ricardo C.

2015 Esta imagem pode ter Direitos Autorais .Cromatografia de Exclusão por Tamanho Esquema Básico do Aparelho IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v.

Cromatografia de Exclusão por Tamanho Esquema Básico do Aparelho processamento de dados seringa garrafa contendo a fase móvel 'loop' detector coluna bomba isocrática ou de gradiente IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais injetor descarte ou reuso . Michel v.

Michel v. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais injetor descarte ou reuso .Cromatografia de Exclusão por Tamanho Esquema Básico do Aparelho processamento de dados seringa garrafa contendo a fase móvel 'loop' detector coluna bomba isocrática ou de gradiente IMA – CT / UFRJ Ricardo C.

sendo. imensamente maiores do que os poros reais.: esta foto apenas representa os poros das partículas que recheiam a coluna. IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. Obs. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais .Cromatografia de Exclusão por Tamanho Como é a Coluna de Separação? A coluna consiste de um tubo metálico recheado de pequenas esferas de polímero reticulado. de fato.

Cromatografia de Exclusão por Tamanho Ação da Coluna de Separação IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. 2015 Esta imagem pode ter Direitos Autorais .

2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais .Cromatografia de Exclusão por Tamanho Qual o princípio desta cromatografia? IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v.

IMA – CT / UFRJ Ricardo C. ao longo da coluna.Cromatografia de Exclusão por Tamanho Descrições do Princípio de Funcionamento Um dos modos de descrever como a separação ocorre: • as moléculas pequenas o bastante para entrarem nos poros da resina. Outro modo de descrever este processo é: • as moléculas que são pequenas o bastante para entrar nos poros da coluna têm acesso a um volume maior da mesma. 2015 . Michel v. necessitando de mais tempo para atravessar a coluna. são momentaneamente removidas do fluxo principal de solvente (exclusão).

2015 n=1 : Mw .Como Calcular Massa Molar? Massa Molar e sua Distribuição n=0 : Mn ∑ Concentração (g/mL) Mx = i ∑ i Ci Mi Ci M i n n−1 n=2 : Mz n=3 : Mz+1 PD = Mw/Mn Massa Molar (g/mol) IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v.

Como Calcular Massa Molar? tensão elétrica (volts) Como é a curva obtida no experimento de GPC? tempo (minutos) ou volume (mL) IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 . Michel v.

IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 .Como Calcular Massa Molar? tensão elétrica (volts) Como é a curva obtida no experimento de GPC? tempo (minutos) ou volume (mL) Precisamos obter da curva: valores relativos a Massa Molar e valores relativos a concentração. Michel v. para cada fração eluída através da coluna.

Como Calcular Massa Molar? Como é a curva obtida no experimento de GPC? n=0 : Mn n Concentração (g/mL) tensão elétrica (volts) Mx = tempo (minutos) ou volume (mL) Precisamos obter da curva: valores relativos a Massa Molar e valores relativos a concentração. 2015 ∑ Ci M i i ∑ C i M i n−1 i n=1 : Mw n=2 : Mz n=3 : Mz+1 PD = Mw/Mn Massa Molar (g/mol) volume de eluição  massa molar (curva de calibração) concentração em cada volume de eluição (detectores de concentração) . Michel v. para cada fração eluída através da coluna. IMA – CT / UFRJ Ricardo C.

Curva de Calibração Injeção de padrões M1. maior o volume hidrodinâmico e mais cedo esta amostra deixa a coluna. V1 Padrões para GPC são amostras poliméricas com distribuição estreita e conhecida de massa molar. coluna. V4 volume de eluição em ml IMA – CT / UFRJ Ricardo C. volume de eluição em ml volume de eluição em ml M3. Michel v. Os padrões de M.M. conhecida são injetados para que se obtenha o volume de eluição de cada um deles neste equipamento. solvente e temperatura. V2 As diferentes amostras de padrão. V3 volume de eluição em ml M4. M2. . quanto maior a massa molar. cada qual com um diferente valor de massa molar. possuem a mesma relação entre massa molar e volume hidrodinâmico. 2015 Assim.

Isto é. 2015 volume de eluição em ml A massa molar de qualquer amostra que tenha a mesma relação entre massa e volume hidrodinâmico que os padrões e que deixe a coluna após Ve é dada por: M i =10 ab. cujos parâmetros são “a” e “b”. V1 Com os pares de pontos log(Mi) e Vi traça-se um gráfico e calcula-se a melhor reta. Michel v. V3 volume de eluição em ml M4. y = a + b.Curva de Calibração Básica: volume de eluição versus massa M1. V2 volume de eluição em ml M3.x log M i =ab. V4 volume de eluição em ml IMA – CT / UFRJ Ricardo C.V e volume de eluição em ml log (Mw) M2.V e .

de fato. o TEMPO de eluição. Michel v. t ei IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 . por quê fazemos as contas usando o VOLUME de eluição? Porque a curva passa a ser independente da vazão empregada! Vei  vazão.Curva de Calibração Tempo de Eluição versus Volume de Eluição Se medimos.

Cálculo de Massa Molar Concentração (g/mL) O que falta? Falta obter Ci Volume de retenção  massa molar OK! IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. 2015 .

esta quantidade é proporcional a concentração da amostra. Esta diferença é função da concentração da amostra. Detector de UltraVioleta (UV) (Photodiode Array Detector . Michel v. Sendo conhecida a absorvância e os parâmetros da célula.Como Calcular Massa Molar? Sensores de Concentração Os dois sensores principais utilizados para a medida da concentração das alíquotas fracionadas da amostra principal são: Detector de Índice de Refração (RI) Detecta a diferença de índice de refração entre a solução e o solvente empregado.Matriz de Foto-diodos) Detecta a quantidade de luz ultra violeta absorvida em um ou vários comprimentos de onda. IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 .

PC ADC IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 .Sensores de Concentração Matriz de Foto-diodos alíquota proveniente da coluna Célula de fluxo Grade de difração Fonte de UV O sinal em cada foto-diodo é função da absorção da amostra na faixa de Matriz de Foto-diodos comprimentos de onda detectados por este foto-diodo específico. Michel v.

Michel v. 2015 . Detectores alíquota proveniente da coluna Fonte de luz de comprimento de onda conhecido (branca. em alguns modelos) IMA – CT / UFRJ Ricardo C.Sensores de Concentração Refratômetro Diferencial A deflexão do feixe de luz é função da diferença entre o índice de refração da amostra e o índice de refração do solvente empregado.

si Assim. Michel v. s M  i i  i i  Mx  n 1 n 1  . Mx  IMA – CT / UFRJ Ricardo C. cujo valor é proporcional à concentração da alíquota: Sinal (V)  C ou seja: C = k. em Volts. s M  . sem a necessidade de se calibrar os sensores de concentração para obter os valores das constantes . s M  i i i i n s M i i n 1 s M i i . s M  .Sinal (V)  C i =  . as equações para cálculo de massa molar média podem ser descritas em termos do sinal elétrico gerado.Concentração é necessária ou um valor proporcional a concentração Estes sensores de concentração geram um sinal elétrico. 2015 n C M  i i  Ci M n 1 i  n n  .

4) Com a nova curva de “sinal proporcional à concentração versus massa molar” são calculados os valores de Massa Molar Média Numérica.Medida em SEC Resumo 1) As colunas separam a amostra de acordo com os volumes hidrodinâmicos das moléculas presentes. 3) Da curva obtida de “sinal proporcional à concentração versus volume de eluição” converte-se os valores de volume de eluição em valores de Massa Molar. IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 . utilizando a curva de calibração previamente obtida. o qual gera um sinal de tensão proporcional a concentração da amostra. 2) A amostra separada passa pelo detector de concentração. Michel v. Massa Molar Média Ponderal e dispersidade de acordo com as equações mostradas.

Michel v.Cálculo dos Valores de Massa Molar Preparação da curva obtida Tipicamente. 2015 . utiliza-se uma reta para fazer este ajuste. IMA – CT / UFRJ Ricardo C.

Michel v. 2015 . massa molar IMA – CT / UFRJ Ricardo C.Agora a curva está pronta para ser analisada. gerando os valores de Massa Molar.

Michel v.Cálculo da Massa Molar e Polidispersão Concentração (g/mL) Mx = ∑ C i M in i ∑ C i M i n−1 i n=1 : Mw n=2 : Mz n=3 : Mz+1 PD = Mw/Mn Massa Molar (g/mol) IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 n=0 : Mn .

R9 PRINT INPUT "Entre com intervalo de volume ".R8 PRINT INPUT "Entre com a intersecao (a) ".primeira parte INI: DEFDBL A-Z CLS rem A curva de calibracao INPUT "Entre com a inclinacao (b) ". Michel v. R7 IF R7=-1 then GOTO INI PRINT : PRINT PRINT "Entre com os valores de Hi.Cálculo Automatizado Exemplo em BASIC . <ENTER>":LINE INPUT S$:CLS INPUT "Entre com o volume de eluicao Ve para o primeiro valor de intensidade Hi <-1 p/ novas incl e interc> ".os valores de volume de eluicao nao precisariam ser igualmente espacados PRINT PRINT VE: rem os valores da rotina estatistica sao calculados durante a leitura dos dados a partir do teclado Q=0:R3=0#:R5=0#:R6=0#:R7=0#:N=0 PRINT"Press.<-1 indica fim dos dados>" rem os valores de hi ja tiveram a linha de base subtraida PRINT IMA – CT / UFRJ Ricardo C.nit rem nit eh constante para simplificar o trabalho do usuario . 2015 . seguidos de <RETURN>.

"<---". este do chr$30 ." Hi" rem truquezinho grafico meio ultrapassado. N. INT((R5 / R3) / (R3 / R6) * 100) / 100 goto VE IMA – CT / UFRJ Ricardo C.segunda parte entr: N = N + 1: INPUT X: PRINT " ". INT(R5 / R3) PRINT "Mn = ". 2015 . CHR$(167).Só funciona em DOS IF X = -1 THEN goto RES 'rotina estatistica Q = R7 * R8 + R9 R3 = R3 + X R5 = R5 + X * EXP(Q) R6 = R6 + X / EXP(Q) R7 = R7 + nit goto entr RES: PRINT : PRINT "Mw = ". CHR$(30). INT(R3 / R6) PRINT "Mw/Mn = ". Michel v.Cálculo Automatizado Exemplo em BASIC .

por GPC . 2015 Programa desenvolvido no IMA para cálculo de M.IMA – CT / UFRJ Ricardo C.M. Michel v.

Massas Molares Médias obtidas por GPC São valores relativos e não absolutos! Os valores de massa molar obtidos para uma dada distribuição são calculados a partir de uma curva de calibração. 2015 . Assim. os valores de massa molar obtidos são ditos serem valores relativos. obtida para amostras padrão. Michel v. IMA – CT / UFRJ Ricardo C.

precisão: (repetitividade) melhor do que 5% exatidão ou acurácia: (concordância com o valor verdadeiro) em torno de 10% IMA – CT / UFRJ Ricardo C.. 2015 Esta imagem pode ter Direitos Autorais .Precisão e Exatidão na técnica de GPC . Michel v.

2015 volume de eluição em ml . V1 volume de eluição em ml Uma amostra com a mesma massa do padrão 2. V2 ln (Mw) volume de eluição em ml M3.O problema da calibração Relação entre massa molar e volume hidrodinâmico M1. isto é. terá um volume hidrodinâmico maior e sairá mais cedo da coluna. porém de um polímero mais rígido. De acordo com esta curva de calibração. Michel v. será mais aberta. será como se a amostra tivesse uma massa molar maior do que sua massa real. V3 volume de eluição em ml M4. V4 volume de eluição em ml IMA – CT / UFRJ Ricardo C. M2.

) IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. Ramificações etc. 2015 .MASSA MOLAR E VOLUME HIDRODINÂMICO Massa Molar versus Volume Hidrodinâmico Fatores que afetam o Volume Hidrodinâmico Conformação e Configuração (Rigidez.

IMA – CT / UFRJ Ricardo C.Volume Hidrodinâmico e Massa Molar Em SEC a separação se dá por Volume Hidrodinâmico De fato. a técnica de SEC não separa as moléculas de acordo com suas massas molares. 2015 . a curva de calibração obtida só é válida para amostras que possuam a mesma relação entre massa molar e volume hidrodinâmico que aquela apresentada pelos padrões empregados. mas de acordo com o volume hidrodinâmico que apresentam. Michel v. Assim.

Volume Hidrodinâmico e Massa Molar
O que é Volume Hidrodinâmico?

O Volume Hidrodinâmico indica
quão grande é o novelo em solução.
O volume hidrodinâmico não informa
sobre a distribuição de massa no interior do novelo.
Para uma dada amostra,
quanto maior for sua massa molar,
maior será seu volume hidrodinâmico.
IMA – CT / UFRJ
Ricardo C. Michel
v. 2015

Volume Hidrodinâmico e Massa Molar
Fatores que afetam esta relação

Os fatores que afetam a relação entre Vh e M.M. são:
Configuração da cadeia polimérica
Conformação da cadeia polimérica
Interação entre o polímero e o solvente
Temperatura

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Ricardo C. Michel
v. 2015

Volume Hidrodinâmico e Massa Molar
exemplos
Mesmo valor de massa molar,
mas diferentes valores de volume hidrodinâmico
cadeia mais
aberta,
maior Vh

Mesmo valor de volume hidrodinâmico,
mas massas molares distintas:

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Ricardo C. Michel
v. 2015

cadeia mais
fechada,
menor Vh

Massa Molar Relativa...
...quer dizer mais do que se imagina!
Quando se usa um padrão de massa molar
que não possui a mesma relação
entre Vh e MM que o polímero-problema,
então
a massa molar obtida será relativa também ao tipo de padrão usado:
“relativa” por ter sido calculada com o uso de padrões de massa molar e
“relativa” ao tipo de padrão usado!

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Ricardo C. Michel
v. 2015

.000 g/mol.” ou: “A massa do polímero-problema foi calculada em 100. 2015 . Michel v.na verdade o que se quer transmitir é: “O polímero-problema apresenta o mesmo volume hidrodinâmico que PS de massa molar igual a 100.. obtendo-se o valor de 100.O que realmente significa quando se diz que a amostra apresenta certo valor de Massa Molar? Quando se diz: “A massa do polímero-problema foi calculada usando padrões de PS.” IMA – CT / UFRJ Ricardo C.” .000 g/mol em relação a padrões de PS.000 g/mol.

2015 .Curvas de Calibração Calibração com Padrões de Distribuição Estreita de Massa Molar Calibração com Amostras de Distribuição Larga de Massa Molar Calibração Universal Quando cada tipo de calibração é mais eficaz Técnicas Absolutas em GPC IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v.

2015 .Calibração com Padrões de Distribuição Estreita IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v.

solvente e temperatura. V2 As diferentes amostras de padrão. conhecida são injetados para que se obtenha o volume de eluição de cada um deles neste equipamento. cada qual com um diferente valor de massa molar. maior o volume hidrodinâmico e mais cedo esta amostra deixa a coluna.Calibração com Padrões de Distribuição Estreita Injeção de padrões M1. . volume de eluição em ml volume de eluição em ml M3. 2015 Assim. quanto maior a massa molar. Michel v. V1 Padrões para GPC são amostras poliméricas com distribuição estreita e conhecida de massa molar. coluna. V4 volume de eluição em ml IMA – CT / UFRJ Ricardo C.M. V3 volume de eluição em ml M4. possuem a mesma relação entre massa molar e volume hidrodinâmico. Os padrões de M. M2.

Curva de Calibração Básica: volume de eluição versus massa M1. Michel v. V2 volume de eluição em ml M3.x log M i =ab. V3 volume de eluição em ml M4. V4 volume de eluição em ml IMA – CT / UFRJ Ricardo C.V e volume de eluição em ml log (Mw) M2. Isto é. y = a + b. 2015 volume de eluição em ml A massa molar de qualquer amostra que tenha a mesma relação entre massa e volume hidrodinâmico que os padrões e que deixe a coluna após Ve é dada por: M i =10 ab. cujos parâmetros são “a” e “b”.V e . V1 Com os pares de pontos log(Mi) e Vi traça-se um gráfico e calcula-se a melhor reta.

V e Volume de Eluição cúbico (3a ordem) 2 3 log M i =ab.V e d. 2015 .V e c. Michel v.V e Alguns fabricantes de colunas sugerem que se use polinomiais de 5 a ordem!!! Isto por quê a distribuição de volume dos poros no recheio da coluna não é linear! IMA – CT / UFRJ Ricardo C.V e quadrático (2a ordem) 2 log M i =ab.Curva de Calibração Relação entre Massa Molar e Volume de Eluição Ajuste Polinomial log (Mi) linear log M i =ab.V e c.

. V0 IMA – CT / UFRJ Ricardo C.Curva de Calibração Limites de Exclusão Ve  V0  KVP Ve = volume de eluição V0 = volume intersticial Vp = volume dos poros K = coeficiente de distribuição do soluto O pico em (A) indica algum tipo de repulsão entre as moléculas do polímero (exclusão iônica). -O modo como este polímero elui poderia ser representado pela curva indicada em (B) (interações hidrofóbicas ou hidrofílicas). Michel v. 2015 Esta imagem pode ter Direitos Autorais VP V0+VP -O pico em (C) indica adsorção do polímero pelo material da coluna.

Michel v. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais .Curva de Calibração Alguns Exemplos IMA – CT / UFRJ Ricardo C.

Michel v. serão acumuladas no volume de eluição V o. não? Mas não é! Vejam: Todas as moléculas maiores do que o limite de exclusão sairão juntas da coluna. IMA – CT / UFRJ Ricardo C.Curva de Calibração Atenção aos limites da curva! Não extrapolar! Sempre observar com atenção os picos em torno de Vo e de Vo+Vp ! Uma amostra com moléculas que ultrapassem os limites de eluição da coluna poderá se apresentar da seguinte forma: Parece bimodal. as quais sairão em torno de Vo+Vp. 2015 . isto é. parecendo constituir um pico. O mesmo tipo de problema pode ocorrer com moléculas menores do que o limite da coluna.

1 IMA – CT / UFRJ Ricardo C.Curva de Calibração Padrões Comuns Padrões para GPC orgânico: poli(metaacrilato de metila) poli(isoprenos) polibutadienos poli(THF) Padrões para GPC aquoso: poli(etileno glicol) poli(óxido de etileno) pululanas Polidispersão usual: < 1. Michel v. 2015 .

Michel v.Calibração com Amostras de Distribuição Larga IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 .

Michel v. De posse desta curva de distribuição e dos valores conhecidos de M w e de Mn para o padrão. para se realizar a análise de uma dada amostra-problema. IMA – CT / UFRJ Ricardo C.Calibração com Amostras de Distribuição Larga Injeção de padrões Nesta técnica. injeta-se na coluna um padrão de distribuição larga e de massa molar conhecida. A curva de distribuição é obtida para este padrão. Este padrão pode ser comercial ou. do mesmo polímero sendo analisado. Os pontos da curva de calibração correspondem a M n e a Mw de cada um dos padrões empregados. na mesma coluna e condições na qual se analisará a amostra-problema. se possível. 2015 . calcula-se por um método iterativo a curva de calibração que será empregada para a análise das amostras-problema. É conveniente empregar pelo menos dois padrões ao usar esta técnica.

Calibração Universal IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 . Michel v.

obtém-se M da amostra-problema em relação a uma curva construída com padrões de distribuição estreita. para a qual se utiliza um viscosímetro em linha com o sistema de GPC. Uma vez dispondo deste produto para o padrão. Em um mesmo volume de eluição. Caso o equipamento não disponha de um viscosímetro em linha. basta medir a [] da amostra problema em cada alíquota e calcular seu valor de M. 2015 . então.M. IMA – CT / UFRJ Ricardo C. pode ser usada a segunda forma de construção da calibração universal.Calibração Universal em duas formas diferentes Existem duas formas de realizar a Calibração Universal: A primeira delas é a calibração universal clássica. Esta forma combina os princípios da calibração universal com a equação de Mark-Houwink-Sakurada. portanto. Neste caso. Michel v. um mesmo valor para o produto []. as amostras problema e padrão apresentarão um mesmo volume hidrodinâmico e. corrigido. usando-se para tal os valores de K e de a da amostra problema e do padrão. Este valor de M é.

M V Assim.M1 = []2. .Mede-se Ve para cada alíquota da amostra-problema e obtém-se da curva de calibração seu valor de []. Michel v.M) versus volume de eluição” a qual consistirá na curva de calibração para este polímero.As curvas de calibração para uma grande variedade de polímeros orgânicos são sobreponíveis. . pode-se traçar a curva “log([]. IMA – CT / UFRJ Ricardo C. e verificando seus volumes de eluição. .A interação do polímero com o solvente irá se refletir no valor de viscosidade intrínseca. . []1.Polímeros com o mesmo volume hidrodinâmico (VH) eluirão no mesmo volume de eluição.Medindo o valor de [] para padrões de massa molar conhecida.Calibração Universal Para sistemas com viscosímetro em linha .M2 . 2015 . Divide-se este valor por [] medido no viscosímetro para esta alíquota e obtém-se M da alíquota. por isto o nome “Calibração Universal”.M. [].Segundo Einstein VH   .

M) curvas para vários polímeros em uma mesma coluna volume de eluição IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 Esta imagem pode ter Direitos Autorais .Calibração Universal log([]. Michel v.

obtém-se M1. M 1=[ 2 ]. 2015 . M 1 1a 2 =K 2 . Michel v.Calibração Universal Para sistemas sem viscosímetro em linha Do princípio de calibração universal: [ 1 ]. M 2 1 2 1 a1   K M 1i = K1 . IMA – CT / UFRJ Ricardo C.M a Desta forma se obtém: Isolando M1 nesta equação: 1a1 K1 .M 1 a 2 1 a 1 2i M2 é obtido para a amostra-problema a partir do Ve e de uma curva de calibração com padrões de distribuição estreita. o valor corrigido de massa. Se forem conhecidos 'K' e 'a' para as amostras padrão e problema. M 2 Substitui-se [] pelo valor da equação de Mark-Houwink-Sakurada: [ ]=K.

M) Curva de Calibração Universal log([]. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais log [] versus log M [] = KMa a log (M) a é a inclinação e log(K) é a interseção da curva mostrada .Curva de Calibração Universal e a equação de Mark-Houwink-Sakurada log([]. Michel v.M) versus Ve volume de eluição log([]) Mark-Houwink log k IMA – CT / UFRJ Ricardo C.

Técnicas Absolutas em GPC Descrição sucinta Espalhamento de Luz Estático SLS Osmometria de Membrana IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais Mi  RTci i . Michel v.

Michel v. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais .Cromatografia de Exclusão por Tamanho Esquema Básico do Aparelho IMA – CT / UFRJ Ricardo C.

Michel v. 2015 .Cromatografia de Exclusão por Tamanho Esquema Básico do Aparelho IMA – CT / UFRJ Ricardo C.

entupimento. controle de pressão Proteção das colunas IMA – CT / UFRJ Ricardo C. seletividade e resolução Contribuições para o alargamento dos picos Condições ótimas de análise Contaminação.As Colunas Recheios Definição de termos Escolha das colunas Eficiência. Michel v. 2015 .

Colunas de GPC Recheios Características desejadas: Inércia química. IMA – CT / UFRJ Ricardo C. (para GPC em baixa pressão) Recheios comuns de colunas para solventes orgânicos: Divinilbenzeno Divinilbenzeno sulfonado Poliestireno-Divinil benzeno Poli(meta acrilato de metila) Os recheios podem ser melhor escolhidos se for conhecida a aplicação específica que se deseja para o equipamento. Sepharose etc.: Bio-Gel da Bio-Rad) Glicose-Divinilbenzeno Géis de ágar. estabilidade nas condições desejadas de pH e temperatura. Recheios comuns de colunas para água: Géis de dextrana (ex.: Sephadex da Pharmacia) Géis de poliacrilamida (ex. agarose. Michel v. reduzida interação com a amostra etc. 2015 .

2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais .Curva de Calibração Alguns Exemplos IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v.

Michel v.Escolha da Coluna de Separação IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais .

B e C. a coluna 2 separa melhor as amostras A.Escolha da Coluna de Separação de acordo com sua Curva de Calibração Neste exemplo. Michel v. Assim. Deseja-se que pequenas variações de VH nas amostras levem a grandes variações no volume de eluição de seus picos. deve-se escolher sempre as colunas de separação cuja curva de calibração apresente a MENOR inclinação na faixa de massa molar das amostras de interesse. 2015 Esta imagem pode ter Direitos Autorais . IMA – CT / UFRJ Ricardo C.

Escolha da Coluna de Separação IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. 2015 Esta imagem pode ter Direitos Autorais .

Michel v. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais .Escolha da Coluna de Separação observar as sugestões dos fabricantes IMA – CT / UFRJ Ricardo C.

Qualidade da Separação . IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Michel v. 2015 Esta imagem pode ter Direitos Autorais .RESOLUÇÃO O que é? do que depende? Alta resolução significa boa seletividade (grande mudança em Ve para pequenas mudanças em R H) e grande eficiência (pequeno alargamento de bandas .pequeno W).

Seletividade O que é? Seletividade é a habilidade de separar os picos entre si. baixa seletividade grande seletividade IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Em GPC uma boa seletividade significa que a coluna é capaz de levar a uma grande mudança no volume de eluição para pequenas mudanças no raio hidrodinâmico das amostras. 2015 . Michel v.

2015 Esta imagem pode ter Direitos Autorais . Michel v. Isto justifica o uso de bombas-gradiente. isto se consegue através de mudanças no solvente. IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Para uma dada coluna.Seletividade Como medir? A seletividade pode ser medida pela separação relativa entre os picos de interesse: t R1  t 0  t R 2  t0 A seletividade pode ser melhorada alterando-se o coeficiente de distribuição.

2015 A eficiência pode ser controlada alterando-se a vazão da fase móvel e evitando irregularidades na mesma. isto é. Uma medida de eficiência é o número de pratos teóricos de uma dada coluna. eficiência está relacionada ao alargamento dos picos.Eficiência O que é? Eficiência está relacionada com a faixa de valores de volume de eluição que correspondem a um mesmo valor de volume hidrodinâmico. que relaciona a largura do pico com o tempo que a amostra ficou retida na coluna. Michel v. . alta eficiência baixa eficiência IMA – CT / UFRJ Ricardo C. Grande eficiência significa que os picos são estreitos.

Verificando a Eficiência Número de Pratos Teóricos 2   t R1 N =5. HETP. maior é o número de pratos teóricos. Michel v. w 1 /2 Quanto maior o comprimento da coluna. .54 . mas maior será a pressão. de forma independente de seu comprimento. Altura Equivalente a um prato teórico (HETP) HETP = comprimento da coluna / N IMA – CT / UFRJ Ricardo C. indica-se a altura equivalente de um prato teórico. 2015 Esta imagem pode ter Direitos Autorais Para indicar a eficiência em uma dada coluna.

IMA – CT / UFRJ Ricardo C. * as frações coletadas devem ser de volume reduzido. * usar células dos detectores que não diluam ou misturem zonas separadas. células de fluxo e conectores pelos quais as frações eluídas passarão contribuem para o alargamento das bandas! Para reduzir este efeito de alargamento: * usar tubos com diâmetro interno reduzido. 2015 .Eficiência de Separação Alargamento de Bandas Fora da Coluna Todos os tubos. * usar conectores sem volume morto. Michel v. para preservar a separação obtida.

Seletividade e Resolução Relação entre os termos Resolução OK ? eficiência boa eficiência ruim OK! OK! OK! NÃO! seletividade boa seletividade ruim IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 . Michel v.Eficiência.

IMA – CT / UFRJ Ricardo C.Alargamento da Curva Difusão Difusão ao longo do comprimento da coluna. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais . Michel v.

2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais .Alargamento da Curva em função da Vazão Transferência de massa para dentro e para fora dos poros do recheio. Michel v. IMA – CT / UFRJ Ricardo C.

Alargamento da Curva Os Efeitos Principais IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais . Michel v.

Alargamento da Curva Efeitos Combinados . 2015 Estas imagens podem ter Direitos Autorais . Michel v.Condições ótimas de análise IMA – CT / UFRJ Ricardo C.

2015 Esta imagem pode ter Direitos Autorais .em função do tamanho molecular IMA – CT / UFRJ Ricardo C.Alargamento da Curva Efeitos Combinados . Michel v.

como em um centro de pesquisas? Quanto mais informações. porém as informações básicas são: IMA – CT / UFRJ Ricardo C. melhor.Como escolher uma coluna (ou conjunto de colunas) para GPC ? Para a seleção de uma coluna de GPC. 2015 . Serão análises de rotina (sempre os mesmos polímeros). Michel v. é necessário conhecer o tipo de polímero que será analisado. como em controle de qualidade? ou Serão análises variadas.

) Qual é a faixa de massa molar esperada para estas análises? Existem informações sobre quais colunas. os passos para a escolha da coluna são: IMA – CT / UFRJ Ricardo C. 2015 . temperatura.Como escolher uma coluna (ou conjunto de colunas) para GPC ? Qual é o polímero? Em quais solventes é solúvel? Em quais condições ocorre esta solubilização? (pH. concentração salina. presença de etanol ou DMSO etc. Michel v. solventes e temperaturas outros laboratórios utilizam para realizar estas análises? (ou sugestões dos próprios fabricantes das colunas?) A partir destas informações.

IMA – CT / UFRJ Ricardo C. selecionar aquelas que apresentem a melhor separação das amostras-problema na faixa de valores de massa molar de interesse. rejeitar aquelas colunas cujo recheio possa interagir com a amostra-problema. * Dentre estas. isto é. * Entre as colunas sobrantes. necessidade e disponibilidade de pré-colunas etc. * Dentre estas colunas. com a melhor resolução e eficiência.Como escolher uma coluna (ou conjunto de colunas) para GPC ? * Procurar colunas que operem com a 'classe' de solventes necessários para as análises de interesse: solventes orgânicos ou aquosos. prazos de entrega. colunas cuja curva de calibração nominal cubra toda a faixa desejada. isto é. Michel v. procurar por aquelas que suportem as condições de análise (pH. concentração salina. selecionar as colunas com o maior número de pratos teóricos. temperatura. * Comparar a lista de colunas selecionadas com aquelas indicadas na literatura. apresentado uma inclinação o mais próxima possível de 45 graus. * Verificar preços. * Do subconjunto já selecionado. 2015 . presença de outros solventes).

O material. de decisão de seus proprietários. 2015 . IMA – CT / UFRJ Ricardo C. figuras e tabelas de minha autoria podem ser usados para finalidades didáticas. “Métodos Físicos Aplicados a Polímeros (MMP-712)”. Rio de Janeiro. 2015. sendo usadas aqui de acordo com as condições de "fair use". Michel v. por questões de copyright. usando a seguinte forma de citação: Ricardo Cunha Michel. Instituto de Macromoléculas Professora Eloisa Mano. Anotações de aula. IMA/UFRJ.É importante notar que algumas das figuras ou tabelas utilizadas neste material podem ter restrições para uso não acadêmico.

Michel v. 2015 .FIM IMA – CT / UFRJ Ricardo C.