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47 *para R.toruloides. 20 g/l ACIDO ACETICO MEJOR ACUMULACION DE LIPIDOS , (C2H4O2) Masa
molar 60,021129372 g/mol , SE USO TAMBIEN 5 , 10 Y 40(CONTROL)
La glicerina (C3H803) 92.09382 g/mol, C = 12 * 3 = 36 ,H - 1 * 8 = 8 ,O - 16 * 3 = 48
60,021129372g ac,acetico--------12.0107*2 g C
En 20 g ac.acetico------------- x=8.00431 g Carbono

92.09382 g ac,acetico--------12.0107*3 g C
x-------------------- =8.00431 g Carbono
46.
50. Culture conditions
The inoculum of yeast R. toruloides Y4 was prepared using JA extracts with a total sugar concentration at 40 g
l1. Cells were cultured at 30C for 36 h on a shaking incubator at 200 rpm. The inoculum was diluted tenfold
in the bioreactor to initiate the lipid production culture. Batch and fed-batch cultures were performed in a 15-l
stirred-tank bioreactor (FUS-15L (A), Shanghai Guoqiang Bioengineering Equipment Co. Ltd., Shanghai,
China) with an initial volume of 9 l at 30C. The dissolved oxygen was maintained at 4050% of air saturation
by automatically varying with the agitation speed. The minimum and maximal agitation speeds were set at 200
and 600 rpm, respectively. The pH value was maintained at 6.0 by automatic addition of 10 M NaOH or 2 M
HCl. The gas Xow rate was set at 0.8 vessel volume per minute. Both JA extracts and JA hydrolysates with
total sugar concentration at 700 g l1 were employed as the feeding substrates, and about 400500 ml of the
feeding substrates were introduced into the bioreactor upon the dissolved oxygen burst to above 70% of air
saturation when the agitation speed decreased to the minimum.
El inculo de la levadura R. toruloides Y4 se prepar usando extractos de JA con una concentracin de azcar
total de 40 g l^-1. Las clulas se cultivaron a 30 C durante 36 horas en una incubadora de sacudidas a 200 rpm.
El inculo se diluy diez veces en el biorreactor para iniciar el cultivo de produccin de lpidos. Los cultivos
discontinuos y alimentados se llevaron a cabo en un biorreactor de tanque de agitacin de 15 l (FUS-15L (A),
Shanghai Guoqiang Bioengineering Equipment Co. Ltd., Shanghai, China) con un volumen inicial de 9 l a 30
C. El oxgeno disuelto se mantuvo a 40-50% de saturacin de aire variando automticamente con la velocidad
de agitacin. Las velocidades de agitacin mnimas y mximas se fijaron a 200 y 600 rpm, respectivamente. El
valor de pH se mantuvo a 6,0 por adicin automtica de NaOH 10 M o HCl 2 M. La tasa de gas Xow se fij en
0,8 volumen de recipiente por minuto. Tanto los extractos de JA como los hidrolizados de JA con concentracin
total de azcar a 700 g / l se emplearon como sustratos de alimentacin, y aproximadamente 400-500 ml de los
sustratos de alimentacin se introdujeron en el biorreactor a razn de la explosin de oxgeno disuelto por
encima del 70% de saturacin de aire cuando La velocidad de agitacin disminuy al mnimo.
The time courses of total sugar, DCW and lipid are shown in Fig. 1. The maximal DCW of 40 g l1 and lipid
of 17.2 g l1 were obtained after 45 h. This batch mode gave 57 and 70% increments in DCW and lipids,
respectively, compared to those of the shaking Xask culture.

20g/L glucosa = 15 g/L glicerol

The agitation was adjusted to maintain dissolved O2 (DO) at 30 % relative to saturation with ambient air. The
culture media for the initial batch fermentations contained 50 g total reducing sugar (TRS) l-1 from Brazilian
molasses and 4.76 g l-1 (NH4)2SO4, and the target carbon/nitrogen (C/N) ratio was 11.6. A pulse of TRS from
Brazilian molasses [without (NH4)2SO4 supplementation] was fed in order to readjust the TRS to 60 g l-1 when
agitation frequency decreased and there was an indication of nitrogen limitation (0.3- 0.4 g l-1 of ammonical
N).

44kl
La agitacin se ajust para mantener el O2 (DO) disuelto al 30% con respecto a la saturacin con
aire ambiente. Los medios de cultivo para las fermentaciones iniciales en lotes contenan 50 g de
azcar reductor total (TRS) l-1 de melaza brasilea y 4,76 g l-1 (NH4) 2SO4, y la relacin de
carbono / nitrgeno objetivo (C / N) era 11,6. Se aliment un pulso de TRS de melaza brasilea [sin
suplementacin de (NH4) 2SO4] con el fin de reajustar el TRS a 60 g l-1 cuando la frecuencia de
agitacin disminuy y hubo una indicacin de limitacin de nitrgeno (0.3- 0.4 g l-1 de Amnico
N).

Ph=4.5 optimo 4 a 5
Temperatura 30 C PRODUCE MAS ACIDOS GRASOS
150 RPM ,
El crecimiento del microorganismo
2.1. Preparacin de Pre-inculo y el inculo
Para iniciar la preparacin pre-inculo se procedi a la preparacin del medio de cultivo descrito
por Yoon y Rhee (1983). En este ensayo, sulfato de amonio ((NH4) 2SO4 (1 g / L)) fue sustituido por
urea (CH4N2O (0,4547 g / l)) por el hecho de haber mostrado en estudio previo que la levadura
Rhodosporidium toruloides aumentaron su contenido de lpidos cuando se utiliz urea en lugar de
sulfato de amonio como fuente de nitrgeno. Por lo tanto, la medio de cultivo se prepar en las
siguientes proporciones: 0,134 g / L CaCl2.2H2O; 0,73 g / L MgSO4; 2 g / L Na2HPO4; 7 g / L de
KH2PO4; 0,5 g de extracto / L de levadura; 0,4547 g / ly CH4N2O 35 g / l de glucosa
La glucosa y sales se esterilizaron por separado a 121 C durante 20 minutos y despus se aadi a
la otra. El pre-inculo se prepar en 100 ml de medio cultura, en matraces de 1000 ml con
mamparos, por duplicado, siendo cada inoculado con la biomasa que contiene un toruloides
colonias de rampa Rhodosporidium. Los matraces Erlenmeyer se incubaron en un agitadorincubador (Unitrom Infors, Suiza) a 30 C 150 rpm, hasta que llegaron a la fase exponencial
(despus de 24 h).

Las pruebas se realizaron en matraces Erlenmeyer de 1000 ml que contiene 200 con mamparos ml
de medio de cultivo, preparado por triplicado. Tambin se prepar una prueba de control (Que
contiene el mismo medio de cultivo no inoculado). Los matraces Erlenmeyer se inocularon con 5 ml
de inculo fase de pre-exponencial. El pH inicial del medio de cultivo fue previamente ajustado a
3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5 y 6,0 mediante la adicin de solucin 5M de NaOH o HCl 5M esterilizada.
Despus de la inoculacin se incubaron los cultivos a 30C y 150 rpm.
Para estudiar el efecto de la temperatura, los cultivos se inocularon como anteriormente descrito,
y se incubaron a 27C, 30C y 33C (ajuste del pH a 4.5, ya que era Se obtuvo una mayor
productividad en carotenoides).
Para estudiar el efecto de la agitacin, los cultivos se inocularon como anteriormente descrito, y se
incub a 120 rpm, 150 rpm y 180 rpm (despus de haber sido ajustado previamente el pH inicial del
medio a 4,5 y la temperatura ptima 30 C).
Las pruebas se llevaron a cabo en un perodo de aproximadamente 72 h, momento en el cual clulas
alcanzaron la fase estacionaria. Durante todo este tiempo, y en ciertos perodos, Las muestras se
recogieron para la lectura de la densidad ptica (D.O.) a 600 nm (ThermoSpectronic Genesys 20,
Portugal), el pH del cultivo (Consor C3021, Blgica) a observacin de la cultura bajo el microscopio
(Olympus BX60 con la cmara DP10, Japn) a deteccin de la contaminacin de la centrifugacin de
cultivo (9.000 rpm a 5 C durante 10 minutos usando una centrfuga (Beckman Avanti J-25I, EE.UU.))
para recoger el sobrenadante y almacenamiento para la posterior determinacin de azcares
reductores y nitrgeno residual (Tecator digestin Lab System 61007 Digestor, Suecia) y anlisis de
citometra de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson Instruments, Blgica) para la cuantificacin de
carotenoides.
Se recogi la biomasa de levadura y se coloca en el congelador durante la liofilizacin subsiguiente
(Heto Poder LL3000 en seco Freeze Secadora, Thermo Scientific, EE.UU.) para su posterior anlisis
de los cidos grasos por cromatografa de gas-lquido

el efecto inicial pH sobre el crecimiento de R. toruloides


El pH del medio de cultivo es uno de los factores que ms influyen en la produccin de lpidos
carotenoides y levaduras (Luo et al., (2013)).
Como puede verse en la Figura 2, el pH inicial del medio de cultivo para inducir concentracin
mxima de biomasa fue de 4,0, se puede decir que este es el pH ptimo crecimiento de la levadura.
Este resultado es inesperado, ya que el trabajo publicado que utiliza esta cepa de levadura (Yoon y
Rhee (1983) y Pan et al. (1986)) ensayos de crecimiento de levadura realizaron a pH 5,5

Figura 2. Evolucin de la concentracin de biomasa (g / L) frente al tiempo (h) para la


R. toruloides crecimiento de la levadura en matraces de agitacin. [Los valores de biomasa
son la media de las lecturas por triplicado con una desviacin estndar que no lo hace
superado 10% (n = 3)].
A este pH, se observa una fase de adaptacin, el perodo de latencia, que se produce incluso a 4 h
(Figura 3). Despus de 6 h de crecimiento, levadura entr en fase exponencial duplicado su
crecimiento. De 24 h, el microorganismo se detiene su crecimiento entrar en la fase estacionaria y
de alcanzar la concentracin mxima de biomasa de 5,90 g.L-1 despus de 48 h

Figura 3. Grfica de biomasa Ln frente al tiempo (h) para el crecimiento de la levadura R.