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1, Place de Turenne
94417 SAINT-MAURICE
Tel : 01.49.76.52.52
Fax : 01.49.76.52.42
Stage effectu
du 12 avril au 28 mai 2010 sous
la responsabilit de
Mme Florence Poty
ANALYSE
MICROBIOLOGIQUE
DE LEAU
Jai effectu ce stage au Centre dAnalyses Environnementales situ Saint-Maurice aussi appel Laboratoire
central. Sa mission est danalyser des chantillons deau provenant de divers sites de prlvement.
Mon rle tait deffectuer diffrentes analyses sur des chantillons deau provenant dusine de traitement et de
canalisation domestique. Ces analyses ont pour but de vrifier la propret microbiologique de leau c'est--dire si
celle-ci ne contient pas de micro-organismes pathognes pour lHomme, conformment aux rglementations de
la sant publique.
I did this internship in Centre dAnalyses Environnementales located in Saint-Maurice (94) also called Laboratoire
central. Its mission is to analyze water samples taken from different sites. I had to analyse water samples
from pipeline servant and plant treatment. These tests aim to control the microbiological cleanliness of the
water, in order to determine if it is dangerous to humans, conformly to public health regulations.
Marie Mligne
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REMERCIEMENTS
Je tiens remercier :
-
Mme Stphanie HOUDARD, responsable de lunit technique de microbiologie ainsi que Mme Sophie
MOREAU, responsable de lunit technique lgionelle pour leur disponibilit et pour mavoir encadr
tout au long de mon stage.
Mme Aurore FAURE et Melle Marie-ve BERCHERY, pour mavoir forme en bactriologie et en
DAPI/CTC, ainsi que pour leur aide quotidienne pendant mon stage.
Toute lquipe de production du laboratoire danalyse pour leur accueil, leurs conseils, leur
disponibilit et leur patience tout au long de mon stage : Isabelle BONANNI, Florian DARCO, Sandra
DA SILVA, Virginie DEL, Sophie DELGADO, Fabien GADY, Stphanie HOUVET, Sbastien JEAN, Antoine
JICQUEL, Benjamin LALOE, Emilie NATALI, Camille NEGRE.
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SOMMAIRE
Remerciements ....................................................................................................................................................... 2
Sommaire ................................................................................................................................................................ 3
Glossaire .................................................................................................................................................................. 4
Introduction ............................................................................................................................................................ 5
1)
2)
3)
B.
Appareillage ........................................................................................................................................... 7
2)
Recherche des Entrocoques et des bactries coliformes (Escherichia coli) par filtration ................... 8
B.
2)
3)
4)
Conclusion ............................................................................................................................................................. 12
Bibliographie ......................................................................................................................................................... 13
1)
Sites internet........................................................................................................................................ 13
2)
Annexe 1................................................................................................................................................................ 14
Annexe 2................................................................................................................................................................ 17
Annexe 3 : Composition des divers milieux de culture ......................................................................................... 20
Annexe 4 : Composition des divers milieux de repiquage ..................................................................................... 21
Annexe 5 : Schma simplifi des relations entre diffrents acteurs du domaine de leau dalimentation ............ 22
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GLOSSAIRE
Anarobiose : dsigne la capacit d'un organisme ou micro-organisme se dvelopper en labsence oxygne
AFNOR : Association Franaise de NORmalisation
AFSSA : Agence Franaise de Scurit Sanitaire des Aliments
BEA : Glose Esculine Azide
CAE : Centre dAnalyses Environnementales
Catalase (positif ou ngatif) : enzyme catalysant la dismutation de leau oxygne (peroxyde dhydrogne)
CEN : Commissions Europen de normalisation
COFRAC : COmit FRanais dAccrditation
CSHPF : Conseil Suprieur d'Hygine Publique de France
DASS : Direction des Affaires Sanitaires et Sociales
GIE : Groupement dIntrt Economique
Gram (positif ou ngatif) : les bactries Gram positif sont mises en vidence par une technique de coloration
appele coloration de Gram, elles apparaissent alors mauves au microscope. La technique de coloration repose
sur les caractristiques membranaires et de paroi de la bactrie
ISO : International Organization for Standardization
Oxydase (positif ou ngatif) : enzyme catalysant la raction d'oxydo-rduction impliquant une molcule de
dioxygne, qui est rduit en eau H2O ou en peroxyde d'hydrogne.
PCA : Plate Count Agar, milieu ordinaire, sans inhibiteurs, permettant la croissance de l'ensemble des bactries
PCR : Raction en chane par polymrase (de l'anglais polymerase chain reaction), mthode de biologie
molculaire d'amplification d'ADN in vitro
TTC : Chlorure de Triphnyl Ttrazolium, milieu de culture slectif utilis pour le dnombrement des bactries
coliformes
TSC : Tryptose Sulfite
Slanetz (glose de) : milieu de culture slectif utilis pour le dnombrement des Entrocoques
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INTRODUCTION
Leau est essentielle la vie et au bien-tre. La quantit moyenne deau contenue dans un organisme adulte est
de 65 %. Or le corps humain ne peut la stocker : lhomme doit donc chaque jour subvenir ses besoins en eau.
Cest pourquoi elle a besoin dtre protge, traite et conomise. De plus en raison de son caractre vital,
leau consomme doit tre de bonne qualit sanitaire afin dviter la survenue de certaines pathologies
hydrique.
Actuellement, les principaux risques sanitaires susceptibles dtre engendrs par lingestion de leau du robinet
sont de deux types :
- Le risque microbiologique
- Le risque chimique
Des laboratoires danalyses tels que les Centres dAnalyses Environnementales (CAE) de Veolia Environnement
sont l pour procder un contrle complet de leau afin dassurer une bonne qualit et une protection de
lenvironnement. Lors de mon stage, je me suis intresse ce premier type de risque.
La recherche dans leau de tous les micro-organismes potentiellement dangereux savre irraliste, tant pour
des raisons techniques quconomiques. Ainsi, actuellement, la stratgie de contrle repose sur la recherche
de bactries dites germes tmoins de contamination fcale , faciles dtecter, non directement
pathognes, mais dont la prsence laisse supposer lexistence de germes autrement dangereux. Le contrle de
la conformit de la qualit microbiologique de leau porte sur la vrification de labsence dEscherichia coli et
dentrocoques dans un chantillon de 100 millilitres deau prlev dans le cadre du contrle sanitaire courant.
Par ailleurs, la recherche de spores de bactries anarobies sulfito-rductrices telles que les Clostridium, dans
le cadre du contrle sanitaire renseigne sur lefficacit des systmes de filtration.
Les efforts mens par lensemble des acteurs (collectivits, responsables de la production, financeurs,
administrations, etc.) ont permis damliorer fortement la qualit microbiologique des eaux au cours des
dernires annes. Ainsi, la proportion de population ayant t expose des eaux non conformes vis--vis de la
qualit microbiologique a diminu de moitir depuis 2000 (4,4 % contre 8,8 % en 2006).
Les quipes du CAE ont pour mission dvaluer les besoins, les prlvements et transports des chantillons, de
lanalyse, de la validation et de la restitution des rsultats. Le domaine dexpertise se situe au-del des eaux
propres et rsiduaires, puisquil recouvre lensemble des domaines de lenvironnement : l'air, les dchets et
combustibles et les matriaux.
De plus, le laboratoire central doit sassurer de la conformit des oprations et propose un accompagnement et
des services complmentaires. Ces prestations font du CAE un ple dexpertise reconnu de lanalyse
environnementale. Membre du GIE (Groupement dIntrt conomique), il est accrdit par le COFRAC (COmit
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FRanais dACcrditation) dans les domaines de la mesure physico-chimique et de la microbiologie des eaux. Il
est galement membre des commissions de normalisation en France (AFNOR), en Europe (CEN) et au niveau
international (ISO).
3) Le service microbiologie
Le laboratoire danalyses microbiologiques traite chaque anne 80 000 chantillons. Selon la nature des
chantillons et la demande faite par les clients, ils y subiront des analyses diffrentes. Ce service comprend une
Unit Technique Microbiologie (bactriologie, parasitologie, algologie, virologie, bactriophage) et une
Unit Legionelle (mthode par culture et par PCR). Toutes ces analyses constituent un moyen de contrler et
de garantir la qualit de leau pour le consommateur.
Au cours de mon stage, j'ai donc pu voluer dans le service de microbiologie dont voici l'organigramme :
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B. Appareillage
Dans la salle, toutes les manipulations se font soit sous un plafond laminaire, une hotte flux laminaire ou
encore proche dune flamme pour assurer la strilit de lenvironnement de lanalyse. (Cf Annexe 1, figure 2)
Sont aussi prsents plusieurs bains marie. Un premier bain-marie rgl sur environ 100C pour fondre les
milieux pendant une heure maximum, et deux autres rgls (45 1)C et 50C pour les maintenir en
surfusion. Un dernier bain-marie, rgl une temprature de (75 5)C, pour la slection des spores de
bactries anarobies sulfito-rductrices de type Clostridium.
Pour permettre toutes les flores de se dvelopper 4 types dtuves thermostates sont prsents. Des tuves
rgles (36 2) C, dautres rgles (22 2) C, certaines (44 2) C, et enfin (37 2) C (Cf Annexe 1,
figure 3).
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C. Recherche des spores de micro-organismes anarobies sulfitorducteurs par filtration sur membrane
Ces micro-organismes sont capables de sporuler, ces spores rsistent un chauffage de 15 minutes (755) C.
Ils sont capables de se dvelopper (371) C en (444) heures en anarobiose, sur un milieu glos contenant
des sels de fer.
Le principe de la recherche et du dnombrement de ces micro-organismes est proche des autres modes
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opratoires.
1. On slectionne les spores bactriennes dans lchantillon par un chauffage au bain-marie (755) C
pendant 15 minutes, pour que les cellules vgtatives soient dtruites.
2. Filtration de ces 100 mL dchantillon au travers dune membrane filtrante strile dont les pores
prsentent une dimension de 0.45 m pour que les spores de bactries soient retenues lintrieur de
la membrane filtrante.
3. Dpt de la membrane lenvers sur un milieu de culture spcialement slectif (glose Tryptose
sulfite). (Cf Annexe 1, figure 9)
4. Lanarobiose est cre par une seconde couche de ce milieu sur la membrane.
5. Incubation des botes (371) C pendant (444) heures.
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LECTURES ET REPIQUAGES
1) Dnombrement des Entrocoques
Aprs 48 heures dincubation, on dnombre toutes les colonies prsentant une couleur rouge caractristique et
pouvant tre limite leur centre ou leur priphrie (Cf Annexe 2, figure 1).
Toute membrane prsentant ce type de colonie suspecte est transfre sur un milieu de confirmation qui est
une glose bilie lesculine (BEA). Ce milieu permet lisolation slectif des Entrocoques, car ils tolrent
jusqu 40 % de bile contrairement de nombreux autres germes et lazoture de sodium limine toutes les
bactries Gram ngatifs.
Aprs deux heures dans une tuve (44 1)C, les colonies confirmes comme entrocoques prsentent un
halo noir traduisant lhydrolyse de lesculine en escultine qui se lie avec le fer (Cf Annexe 2, figure 2).
La rglementation franaise actuelle impose un seuil limite, stipulant quaucun entrocoque ne soit prsent
dans un chantillon de 100 mL.
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Durant lincubation, il y a rduction du sulfite (SO3 ) de sodium sulfure dhydrogne (H2S) et donc production
de sulfure de fer se manifestant par un halo noir autour des colonies. Seul ce type de colonie est compt. (Cf
Annexe 2, figure 7)
Si le nombre de colonies est compris entre 1 et 10 comprise, on repiquera toutes les colonies. Tandis que si lon
1/2
en observe un nombre X suprieur 10, on repiquera X colonies.
Lors de ce repiquage, on recherche les Clostridium perfringens qui peuvent entraner des gangrnes.
Deux talements sont effectus, un premier sur glose au sang qui permettra dapprcier lhmolyse de ces
bactries. Et un second, sur TTC enrichi en d-cyclosrine, un puissant antibiotique ne laissant pousser que les
clostridium perfringens.
Aprs incubation (362)C pendant 24 heures, trois cas peuvent alors se prsenter :
1. Culture sur la glose au sang : les bactries appartiennent au genre Clostridium . (Cf Annexe 2, figure 8)
2. Aucune culture : les bactries nappartiennent pas au genre Clostridium.
3. Culture sur les deux botes : les bactries sont de type Clostridium Perfringens.
Si le rsultat est positif sur les deux botes et uniquement dans ce cas-l, on procde un test
complmentaire dit test RP . Jai prfr ne pas faire figurer dans ce rapport le mode opratoire
pour ne pas risquer de dcrire un protocole erron ou incomplet, car il est encore en cours de
rdaction.
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CONCLUSION
Tout au long de mon stage, jai pu me familiariser avec le confronter au travail de laboratoire de microbiologie.
En participant une des tapes dune dmarche de contrle qualit contribuant la prservation dune denre
alimentaire prcieuse, leau.
Durant ces sept semaines de stage, jai acquis une exprience professionnelle concrte et largie mes
connaissances pratiques et thoriques dans le domaine de la microbiologie. Et notamment, le respect des rgles
dhygines et de scurit qui sont indispensables pour le maintien de la strilit dans le laboratoire.
Mon intgration et le travail en quipe se sont faits naturellement grce la disponibilit du personnel
technique et la bonne ambiance qui rgne au sein du laboratoire. La confiance que les techniciens mont
accorde ds les premiers jours ma permis de dvelopper mon sens des responsabilits ainsi que mon esprit
dinitiative.
Cette exprience professionnelle m'a donn envie d'approfondir mes connaissances thoriques, de
perfectionner mes manipulations pratiques, mais aussi de connatre dautres tapes du contrle qualit. Ce
stage restera alors comme un excellent aperu de l'organisation et de la rigueur du travail dans un laboratoire.
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BIBLIOGRAPHIE
1) Sites internet
Dpartement des Administrations Sanitaires et Sociales de l'tat
Leau potable en France : http://ile-de-france.sante.gouv.fr/sante-publique/environnement-et-sante/eaupotable
Aspect rglementaire : http://www.sante-sports.gouv.fr/la-qualite-de-l-eau-potable-en-france-aspectssanitaires-et-reglementaires-septembre-2005.html#doc
Divers milieux de cultures
http://www2.ac-lyon.fr/enseigne/biotech/microbio/milieux.html
Journal officiel du 7 novembre 2003
http://www.car-analyse.com/hydro/a170903.htm
Ministre de lcologie
Directives : http://www.developpement-durable.gouv.fr/Directive-cadre-EAU.html
Veolia Environnement, CAE
http://www.veolia.com/fr/solutions/cae/
Wikipdia
http://fr.wikipedia.org/
2) Notices techniques
Laruelle, S. Houdart, Mode opratoire, dnombrement des spores de bactries anarobies sulfitorductrices
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ANNEXE 1
Figure 1 : Matriels de filtration
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ANNEXE 2
Figure 1 : Dnombrement des entrocoques aprs 48h dincubation
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Rle
Source dazote et dnergie
Inhibiteur de la croissance des Gram
Source de carbone et dnergie
Indicateur de la croissance bactrienne
Source de minraux
Agent glifiant
Solvant
Rles
Source d'azote et d'nergie
Source de vitamines et de facteurs de croissance
Source de vitamines et de facteurs de croissance
Source de carbone et d'nergie
Agent slectif
Inhibiteur des Bactries Gram +
Indicateur de pH
Agent glifiant
3) Milieu PCA
Constituants
Peptones (5,0g)
Extrait de levures (2,5g)
Glucose (1,0g)
Agar (12g)
Eau (qsp 1,0L)
Rles
Source dazote et dnergie
Source de vitamines et facteurs de croissance
Source de carbone et dnergie
Agent glifiant
Solvant
Rle
Source dazote et dnergie
Source de vitamines et de facteurs de croissance
Source dazote et dnergie
Source de sulfites
Rvlateur de la rduction des sulfites en sulfures
Agent glifiant
phase liquide
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Rles
Source dazote et dnergie
Source de vitamines et facteurs de croissance
Inhibiteur de croissance des Gram+
Inhibiteur de croissance des GramSource de carbone et dnergie
Rvlateur de production descultine
Source de minraux/maintient de la pression osmotique
Agent glifiant
Solvant
2) Milieu PCA
Constituants
Peptones (5,0g)
Extrait de levures (2,5g)
Glucose (1,0g)
Agar (12g)
Eau (qsp 1,0L)
Rles
Source dazote et denergie
Source de vitamines et facteurs de croissance
Source de carbone et dnergie
Agent glifiant
Solvant
Rles
Source dazote et dnergie
Source de carbone et dnergie, dtoxifiant
Source de vitamines et de facteurs de croissance
Source de minraux/maintient de la pession osmotique
Mise en vidence du pouvoir hmolytique
Agent glifiant
Solvant
Rles
Source d'azote et d'nergie
Source de vitamines et de facteurs de croissance
Source de vitamines et de facteurs de croissance
Source de carbone et d'nergie
Agent slectif
Inhibiteur des Bactries Gram +
Antiobiotique : Agent slectif
Indicateur de pH
Agent glifiant
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