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Escherichia coli es el agente causal ms comn de la infeccin del tracto

urinario (UTI), y el diagnstico de esta infeccin por lo general se basa en


mtodos bacteriolgicos. Sin embargo, los mtodos de cribado pueden ser
tiles para un diagnstico rpido presuntivo, aunque algunos de estos
mtodos de cribado tienen poca sensibilidad o son caros. Para investigar un
posible nuevo enfoque alternativo, un inmunoensayo basado en antgenoenzima vinculado a inmunoelectrodiffusion ensayo (ELIEDA) fue
estandarizado para el cribado de esta infeccin bacteriana. Combinando
contra inmunoelectroforesis con un ensayo inmunoenzimtico, ELIEDA
requiere muestras de orina concentradas, una membrana de acetato de
celulosa, anticuerpos policlonales contra E. coli criados en conejos y
anticuerpos de oveja marcados con peroxidasa a la inmunoglobulina G (IgG)
de conejo. Esta tcnica ELIEDA se evalu con 244 muestras de orina, 76 de
ellas con E. coli, 47 con bacterias heterlogas y 121 sin bacterias. En
comparacin con los mtodos bacteriolgicos, la sensibilidad, la
especificidad y los valores predictivos positivos y negativos para ELIEDA
fueron de 93,4%, 98,2%, 95,9% y 97,1%, respectivamente. Los datos
obtenidos sugieren que este ensayo es til para la deteccin sistemtica de
diagnstico de IU causada por E. coli. Adems, puesto que las membranas
teidas con ELIEDA pueden ser almacenadas, este ensayo hace posibles
estudios retrospectivos. Las infecciones urinarias (ITU) estn entre las
infecciones ms comunes en los seres humanos. La mayora de los casos
son causados por un nmero limitado de gneros bacterianos; Las cepas de
E. coli, en particular, son responsables del 80% de los casos de UTI
observados en consultas ambulatorias (1). Estas cepas se encuentran en la
flora normal del tracto intestinal, la piel y la vagina. Sin embargo, bajo
condiciones predisponentes individuales pueden multiplicarse rpidamente
y son capaces de adherirse a las clulas uroepiteliales, produciendo
infeccin (1, 2). El diagnstico de IU bacteriana se ha realizado
generalmente mediante mtodos bacteriolgicos de aislamiento e
identificacin en orina anulada. Sin embargo, el uso de otros mtodos de
cribado puede tener ventajas. Los resultados se pueden obtener ms
rpidamente que con el mtodo de cultivo estndar, y la mayora de estos
otros mtodos son simples y fciles de realizar. Mientras que los mtodos
bioqumicos y automatizados se usan a menudo para el cribado de UTI, son
insensibles (2) o costosos (3). En Brasil, los mtodos automatizados son
demasiado caros para muchos laboratorios clnicos. Los mtodos
inmunolgicos se utilizan menos frecuentemente para diagnosticar
infecciones bacterianas. Sin embargo, se pueden detectar antgenos o
anticuerpos bacterianos en los fluidos biolgicos de pacientes infectados a
travs de ensayos inmunolgicos tales como la contrainmunoelectroforesis,
la coaglutinacin, la aglutinacin con ltex y los ensayos inmunoenzimticos
(4-16). Los laboratorios hospitalarios y de salud pblica de los pases en
desarrollo suelen utilizar sistemas de electroforesis o de
contrainmunoelectroforesis con fines diagnsticos (15, 16). Pinon y Dropsy
(14) combinaron la contraimunoelectroforesis (CIE) con tincin
inmunoenzimtica para crear el denominado ensayo de
inmunoelectrodifusin (ELIEDA). Este ensayo demostr ser ms sensible que
el CIE en el serodiagnstico de infecciones parasitarias y fngicas (17).
Antes de este estudio, el ELIEDA no se haba aplicado para la deteccin de

antgenos en las enfermedades infecciosas bacterianas. En el presente


estudio, este ensayo inmunoenzimtico se normaliz para detectar
antgenos del grupo E. coli en muestras de orina de pacientes ambulatorios
con E. coli U T I, utilizando un anticuerpo policlonal especfico. Este trabajo
tambin compar ELIEDA con mtodos bacteriolgicos convencionales.
MATERIALES Y MTODOS Especmenes de orina Se recolectaron y analizaron
un total de 244 muestras de orina entre febrero de 1993 y mayo de 1994 de
pacientes ambulatorios que estaban clnicamente sospechosos de infeccin
del tracto urinario. Los especmenes fueron recolectados en dos localidades
de la ciudad de So Paulo, Brasil, el Laboratorio de Microbiologa Clnica del
Departamento de Anlisis Clnicos de la Universidad de So Paulo y el
Hospital de la Universidad de So Paulo. Los pacientes ambulatorios tenan
una edad de 2 a 90; El 75% de ellos eran mujeres y el 25% eran varones.
Los especmenes fueron examinados por mtodos de cultivo cuantitativo
estndar (2), y los resultados fueron comparados con los obtenidos por
ELIEDA. Las muestras de orina que fueron negativas o positivas del cultivo
cuantitativo de orina se utilizaron como controles para las pruebas ELIEDA.
Los especmenes de orina utilizados como controles positivos fueron
positivos para E. coli; No se aislaron microorganismos en los controles
negativos. El serogrupo O6 de E. coli en suero hiperinmune se cultiv en
caldo de soja trptico (Difco Laboratories, Detroit, MI, Estados Unidos de
Amrica) durante una noche a 37C. En tres inoculaciones que contenan
formalina al 5% (primera inoculacin, 0,3 ml, segundo, 0,5 ml, tercero, 1,0
ml), un conejo macho de Nueva Zelanda de 3 meses recibi bacterias del
medio de cultivo completo y sus productos extracelulares. En tres
inoculaciones posteriores de 2,0 ml cada una, no se us formalina. Se utiliz
el mtodo de inoculacin de Ewing (18) y se recogi sangre 7 das despus
de la ltima inoculacin. Los sueros obtenidos se almacenaron a 220 C.
Los ttulos de anticuerpos se determinaron mediante una prueba de
aglutinacin sobre la placa de vidrio (18). La estabilidad del suero
hiperinmune se comprob a lo largo del perodo experimental, con la misma
prueba de aglutinacin cuantitativa. Se utiliz el ensayo de
inmunotransferencia (IBA) (19, 20) para caracterizar el suero policlonal,
utilizando especmenes de orina de siete de los pacientes ambulatorios
incluidos en el grupo de estudio. E. coli se aisl de dos de ellos; Otros tres
presentaron Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis y Streptococcus sp .; Y
los dos especmenes restantes eran totalmente negativos. Para el IBA, 20 ml
de muestra, 2,3% p / v; Glicerol 10% v / v; B-mercaptoetanol al 5% v / v) a
20 ml de orina centrifugada, y la preparacin se hirvi durante 5 min. La
electroforesis se llev a cabo en gel de SDS-poliacrilamida al 12%, se
transfiguraron las bandas antignicas a una membrana de nitrocelulosa de
0,45 mm (Millipore, Bedford, MA, Estados Unidos) y se incub la membrana
con suero hiperinmune (1: 2000 a E. Coli). Despus del lavado, la membrana
se incub con anticuerpo conjugado con peroxidasa (1: 2000) a
inmunoglobulina G de conejo (IgG) (Cappel-Organon Teknika Corp., West
Chester, PA, Estados Unidos) y se desarroll con diaminobencidina (DAB) ).
Ensayo de inmunoelectrodifusin unida a enzima (ELIEDA) El ELIEDA se
realiz como se describi anteriormente (14, 21), con algunas
modificaciones. Para cada ensayo, se centrifugaron 5 ml de orina recin
recogida en un tubo de vidrio cnico a 1 500 3 g durante 30 min. El

sedimento resultante ( 100 ml) se proces inmediatamente o se almacen


a 220 C. Se sumergi una tira de acetato de celulosa Cellogel (Chemetron,
Miln, Italia) en tampn de Tris-glicinfosfato 0,1 M, pH 8,5, durante 15 min.
La tira de acetato se retir entonces del tampn y se sec con papel de
filtro. Se aplic un volumen de 10 ml del concentrado de orina a la tira de
acetato de celulosa y se aadieron a la tira 5 ml de suero hiperinmune de
conejo no diluido a E. coli a una distancia de 1,5 cm de la orina. Usando el
mismo tampn Tris-glicina-fosfato, se llev a cabo la corrida eletrofortica
durante 60 min a 110 V y 1 mA / cm de ancho. La tira se lav en NaCl al
0,85% que contena Tween 80 al 1% durante 30 min, con agitacin. Para
obtener resultados ms especficos, la tira se trat con leche descremada al
5% en tampn fosfato 0,15 M (PBS), pH 7,2, que contena 0,05% de Tween
20, durante 30 min, con agitacin. Despus de lavar en PBS tres veces
durante 15 min cada una, la tira se incub con conjugado de peroxidasa de
IgG anti-conejo de oveja (Cappel-Organon Teknika Corp., West Chester, PA,
Estados Unidos) diluido a 1: 500 en PBS, durante 30 min A 37 C. Despus
de tres lavados ms de 15 min cada uno en PBS, la tira se incub a
continuacin en una mezcla de 0,5 mg / ml de DAB y 1 ml / ml de H2O2 al
30% en tampn Tris-HCl 0,1 M, pH 7,6, durante 5 min. sacudida. Se aadi
agua destilada para detener la reaccin. Despus de ser secada y
transparente, se almacen la tira. En este ensayo, los especmenes de orina
con varios serogrupos de E. coli desarrollaron una a cuatro lneas
precipitantes. La primera lnea cercana a la mancha hiperinmune srica
estaba presente de forma consistente en la orina de pacientes con IU de E.
coli, por lo que se consider que esta lnea era especfica. Las lneas
precipitantes ms distantes de la mancha srica hiperinmune se
interpretaron como correspondientes a lneas reactivas cruzadas o no
especficas (Figura 1). El ELIEDA se evalu en trminos de sensibilidad,
especificidad, concordancia y valor predictivo positivo y negativo
comparando sus resultados con los obtenidos por cultivo de orina, que se
utiliz como patrn oro (22). Se determin la reproducibilidad inter e intraensayo, as como la estabilidad de los antgenos bacterianos en la orina que
se haban almacenado a 220 C. RESULTADOS Cultivo de orina A travs de
los cultivos de orina, se aislaron bacterias de 123 muestras de orina; No se
encontr ningn microorganismo en los 121 ejemplares restantes. Se
consider que un cultivo de orina con 105 unidades formadoras de
colonias / mL (CFU / mL) era positivo, se consider que un cultivo con 104
pero <105 CFU / mL era limtrofe, y un cultivo con <104 UFC / mL
Considerado negativo. Todos los microorganismos cultivados en el cultivo se
identificaron mediante mtodos previamente descritos (23). De los 123
especmenes de orina infectados con bacterias, 71 fueron positivos para E.
coli, y otros 5 fueron limtrofes para E. coli. De los 47 ejemplares de orina
infectados restantes, 44 de ellos contenan una nica bacteria heterloga y
3 mostraban una asociacin de dos especies bacterianas diferentes. Las
concentraciones de las 50 bacterias heterlogas variaron de 1,3 a 104 UFC /
ml a 105 UFC / ml. De los 50, 35 de las bacterias heterlogas se encontraron
en el nivel positivo y 15 en el nivel fronterizo. Ensayo ELIEDA El ELIEDA fue
positivo para todos los 71 de los especmenes de orina en los que E. coli
haba sido identificado a una concentracin bacteriana superior a 105 UFC /
ml. Sin embargo, el ensayo ELIEDA dio resultados negativos para los 5

especmenes de orina con concentraciones de E. coli que oscilaban entre


1,2 3 104 y 5 3 104 UFC / ml. Estos valores inferiores a 105 UFC / ml se
consideran convencionalmente no significativos desde el punto de vista
clnico (10, 24). En una de estas 5 muestras de orina se observ una
asociacin de E. coli con P. mirabilis. El ELIEDA fue negativo para todos los
121 de los especmenes de orina para los cuales los cultivos haban dado
resultados negativos. El ELIEDA tambin fue negativo para los 44
especmenes de orina de los cuales se aislaron especies bacterianas
heterlogas mediante cultivo cuantitativo de orina. El ELIEDA fue positivo
para 3 muestras de orina de las cuales se aislaron especies bacterianas
heterlogas mediante cultivo cuantitativo de orina. Las tres bacterias que
fueron reactivas cruzadas con el suero anti-E.c o 1 i fueron K. pneumoniae,
Klebsiella oxytoca y P. mirabilis. Una comparacin de los resultados en la
deteccin de antgenos de E. coli por cultivo cuantitativo de orina y por
ELIEDA se da en la Tabla 1. Los rasgos diagnsticos de ELIEDA pueden
expresarse en trminos de sensibilidad, especificidad, acuerdo y valor
predictivo positivo y negativo. Los valores encontrados en este estudio
fueron: 93,4% (95% IC = 85,0% -97,2%), 98,2% (95% IC = 94,9% -99,4%),
96,7% (95% IC = 93,7% -98,3% 95,9% (IC del 95% = 88,7% -98,6%) y
97,1% (95% CI = 93,3% -98,7%), respectivamente. Un grupo de 29
muestras de orina almacenadas a 220 C no mostr diferencias en sus
resultados incluso despus de dos a cinco congelaciones-descongelaciones
consecutivas durante un perodo de 10 meses. El suero hiperinmune no
cambi en el ttulo de aglutinacin (1: 4 096) durante este periodo de
estudio. La reactividad del conejo hiperinmune
Se caracteriz por IBA para determinar la especificidad y la reactividad
cruzada entre los antgenos de E. coli excretados con orina, otros antgenos
enterobacterianos (K. pneumoniae y P. mirabilis) y los antgenos Gram
positivos ( Streptococcus sp.) Antgenos bacterianos. El suero hiperinmune
reaccion con todos los especmenes de orina estudiados. Sin embargo, se
detectaron bandas de 77, 66, 51, 43 y 21 kDa en muestras de orina
positivas para E. coli. Las muestras de orina que fueron positivas para
bacterias heterlogas mostraron una a cuatro bandas, que fueron
combinacin de bandas 77, 66, 51, 24 y 22 kDa. En dos muestras de orina
negativas, se visualiz una banda de 77 kDa. Para identificar cules de
estas bandas corresponden a las lneas de precipitacin de ELIEDA, el suero
hiperinmune debe ser absorbido con antgenos excretados concentrados de
E. coli y reexaminados en el IBA. Es difcil establecer una correlacin directa
entre las lneas de precipitacin de ELIEDA y las bandas te~nidas con IBA ya
que en el ELIEDA los antgenos bacterianos eran crudos, mientras que en el
IBA estos antgenos se trataron con b-mercaptoetanol. DISCUSIN En las
infecciones de las vas urinarias,
Las pruebas pueden proporcionar un diagnstico presuntivo ms rpido que
los mtodos bacteriolgicos convencionales. El ELIEDA para la deteccin del
antgeno de E. coli tiene algunas caractersticas interesantes. Por ejemplo,
los resultados estn disponibles dentro de las 4 horas de la recoleccin de
orina. Adems, las tiras de acetato de celulosa teidas se pueden almacenar
durante un largo perodo de tiempo despus de ser hechas transparentes.
Esto permite revisar los resultados y realizar estudios retrospectivos. Las
caractersticas diagnsticas del ELIEDA son prometedoras debido a la alta

sensibilidad y especificidad de la prueba y otros parmetros diagnsticos.


Cuando la concentracin de E. coli era superior a 105 UFC / ml, es decir,
clnicamente significativa, se observ un acuerdo del 100% entre ELIEDA y
el mtodo cuantitativo de cultivo de orina. La reproducibilidad del ELIEDA se
consider satisfactoria ya que 10 muestras de orina procedentes de
pacientes con IU dieron resultados positivos similares cuando se probaron
dos veces el mismo da, y otras 17 muestras de orina procedentes de
pacientes con IU dieron resultados positivos similares en tres das
diferentes. Los datos obtenidos en el presente estudio son mejores que los
obtenidos con el Bac-T-Screen, un mtodo de deteccin rpida utilizado con
frecuencia para determinar bacteriuria y / o pyuria inespecficos. En un
estudio realizado por Davis et al. (25), la sensibilidad, especificidad y valor
predictivo positivo y negativo de este mtodo fueron 93,2%, 77,2%, 69,2% y
95,5%, respectivamente, para 104 UFC / mL. Nuevos mtodos de cribado
recientemente reportados (26, 27) tienen menor sensibilidad que el ELIEDA
pero similar especificidad. Estos mtodos, sin embargo, generalmente
toman de 18 a 24 horas para proporcionar resultados, mucho ms largos
que las 4 horas que ELIEDA requiere. Como est estandarizado aqu, ELIEDA
proporciona datos que reflejan tanto la identificacin bacteriana como la
bacteriuria significativa. El criterio ms aceptado para la bacteriuria, 105
UFC / ml, se tom como referencia en el presente estudio, aunque este valor
puede variar segn las diferentes condiciones individuales (1, 2, 24). Cinco
muestras de orina en las que E. coli se identific por el mtodo
bacteriolgico, pero a concentraciones de 5 3 104 UFC / mL fueron
negativas con ELIEDA. Estos resultados implican que estas personas
estaban en la etapa inicial de la infeccin por E. coli o que sus muestras de
orina estaban contaminadas. La significacin de los recuentos bajos de E.
coli podra ser elucidada slo cuando se recogen nuevas muestras de orina
de los mismos pacientes ambulatorios.

En tres muestras de orina se observ una asociacin de dos bacterias en los


cultivos. Sin embargo, los P. mirabilis, S. saprophyticus y S. aureus
encontrados fueron probablemente contaminantes, ya que su conteo fue
mucho menor que 105 UFC / mL. Como una infeccin concomitante por dos
bacterias es infrecuente en las ITU, las bacterias asociadas con recuentos
bajos se interpretaron como contaminantes de las muestras de orina. UTI
con bacterias heterlogas se observ en 35 pacientes ambulatorios. Los 12
pacientes ambulatorios restantes fueron casos lmite; UTI podra o no haber
desarrollado, por lo que estos pacientes ambulatorios deben haber sido
objeto de seguimiento. El ELIEDA mostr alta especificidad, pero se observ
reactividad cruzada con tres enterobacterias: K. pneumoniae, K. o x y t o c
a, y P. mirabilis. A p re r p a r e n t l, la reactividad cruzada parece estar
relacionada con las cepas bacterianas en lugar de con las especies. Las

absorciones del suero hiperinmune no se llevaron a cabo con cepas


bacterianas reticuladas. Dado que la reactividad cruzada se produce slo en
algunas cepas bacterianas y no en especies, se piensa que las absorciones
son difciles. Los antgenos bacterianos de las muestras de orina
demostraron ser resistentes a varios ciclos de congelacin-descongelacin y
parecen ser polisacridos. Este aspecto est ahora bajo investigacin. La
reactividad del antisuero de conejo con antgenos de E. coli O6 y la
reactividad cruzada de IBA con otras bacterias no relacionadas puede
proporcionar una base para producir otros anticuerpos monoclonales para
inmunoensayos diseados para capturas de antgenos bacterianos. A pesar
de que ELIEDA an no est automatizado, es adecuado para los pases en
desarrollo ya que se puede adaptar fcilmente a cualquier laboratorio en el
que se lleve a cabo la electroforesis srica habitual. Para un laboratorio de
salud pblica, el costo sera de aproximadamente US $ 0,70 por muestra de
orina. Otra ventaja de ELIEDA es la posibilidad de almacenar tiras
manchadas durante un largo perodo de tiempo, permitiendo as estudios
retrospectivos. Los presentes hallazgos sugieren que el ELIEDA es til para
la deteccin diagnstica de laboratorio de ITU causada por E. Co l Sin
embargo, este ensayo podra mejorarse concentrando la orina, para obtener
resultados ms sensibles; Preparar una mezcla de suero hiperinmune
especfico para diferentes especies bacterianas; Y la identificacin y
caracterizacin de antgenos bacterianos en las excreciones urinarias.