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Bioseguridad y el ADN

Recombinante

ADN recombinante

Combinacin artificial de ADN


de diferentes fuentes
Aparece en 1972
Liberacin de primeros OGMs
en la dcada de 1980
Biologa sinttica aparece en
la dcada del 2000
Edicin de genomas CRISPR
aparece en la ltima dcada

http://www.shmoop.com/dna/recombinantdna.html

Creando ADN recombinante


Transformacin
Transformacin no
bacteriana
Transfeccin con fagos

Edicin de Genomas

Reconocimiento
basado en protenas

Zinc Finger Nucleases


(ZFNs)
TAL Effector
Nucleases (TALENs)
Homing
Endonucleases (HEs)

Reconocimiento
basado en ARN

Clusters of Regulatory
Interspaced Short
Palindromic Repeats
(CRISPRs)
http://osp.od.nih.gov/sites/default/files/1_Carroll.pdf

CRISPR-Cas9

Sistema de dos
componentes
Se basa en
reconocimiento
ARN-ADN
Cas9 es eficiente y
sitio-especfico
Puede usarse en
multiplex

Modificacin

http://osp.od.nih.gov/sites/default/files/1_Carroll.pdf

Organismos genticamente
modificados

Poseen genes de otras


especies
Genes han sido insertados
artificialmente

Usos

Phillips, T. (2008) Genetically modified organisms (GMOs): Transgenic crops and recombinant DNA technology. Nature Education 1(1):213

Opinin pblica

Argumentos para el rechazo


Se juega a ser Dios
Se manipula a la naturaleza
Es inmoral

Rechazo incrementa cuando se trata de animales


Se exige etiquetar alimentos que contienen OGMs

Regulacin
1972

Se publican detalles sobre la creacin intencional de ADN recombinante (ADNr). Se postergan investigaciones hasta
analizar posibles riesgos relacionados con el potencial de causar cancer de virus recombinantes (Swazey et al., 1978).
19721973 En varias conferencias se discute sobre los posibles riesgos de seguridad y lasd opciones de contencin relacionadas
con procedimientos de ADNr (Fredrickson, 2001).
1973
En la conferencia de Asilomar se discute la evidencia de riesgo de cancer y se consideran los problemas de seguridad en
el laboratorio y contencin relacionado con virus modificados genticamente
1973
Investigadores preparan una carta para el National Academy of Science (NAS) solicitando que se cree un comit que
examine los riesgos y beneficios de la investigacin sobre ADNr y que proponga guas para este tipo de investigaciones.
1974
Julio: Se presentan las recomendaciones del comit, incluyendo la postergacin de la investigacin con ciertos tipos de
ADN recombinante riesgosos; el establecimiento de un comit, por parte del National Institutes of Health (NIH), para la
prevencin, que evale los riesgos de este tipo de investigacin, desarrolle procedimientos que minimicen el riesgo y
desarrolle guas para la investigacin; y la convocatoria a una conferencia para discutir maneras de lidiar con los riesgos
de la investigacin con ADNr (Berg et al., 1974).
1974
Octubre: El NIH crea el Comit de Prevencin para el Programa de ADN Recombinante (Recombinant DNA Molecule
Program Advisory Committee) luego llamado Recombinant DNA Advisory Committee (RAC).
1975
Los participantes de una segunda reunion en Asilomar discute sobre la posibilidad de continuar con el moratorio en la
investigacin con ADNr. Se propone que la investigacin continue tomando en cuenta medidas de seguridad acorde con
los riesgos del tipo de investigacin especfica y con la condicin de que se desarrollen programas de educacin y
entrenamiento en mtodos de contencin (Berg et al., 1975).
1976
El NIH propone guas para la investigacin con ADNr y define las responsabilidades de los investigadores, instituciones
de investigacin y gobierno (Recombinant DNA research guidelines, 1976).
http://osp.od.nih.gov/sites/default/files/NIH_Guidelines.html#_Toc351276354
1980
El primer experiment de transferencia de genes con humanos es realizado por un investigador de Estados Unidos en
Italia e Israel. El investigador fue censurado por engaar a las agencias reguladoras y se le retire los fondos del NIH
(Rainsbury, 2000).
1982
Una comisin designada por el president publica el documento Splicing Life, que propone cambios en le supervicin de
la investigacin con ADNr (President's Commission, 1982).
1984
El RAC establece un grupo de trabajo en terapia gnica para revisar y responder al reporte de la comisin del president
y establecer procedimientos para la revision y aprobacin de investigacin de transferencia gnica.

1984
1985
1988
1990
1991
1992
1993
1995
1996
1997
1997
1999
2000
2000
2002
2003
2004
2013

La FDA determa que regular los productos de terapia gnica (Rainsbury, 2000).
Un gruipo de trabajo en terapia gnica presenta una primera version de puntos a ser considerados en el documento
Design and Submission of Human Somatic-Cell Gene Therapy Protocols (Points to consider, 1985).
El RAC aprueba su primer protocolo clnico de investigacin, para un studio con un marcador gnico, en medio de la
controversia pues el investigador se resiste a proveer la informacin sobre seguridad requerida (Rainsbury, 2000).
Investigadores emprenden el primer studio de transferencia gnica aprobado, pra un paciente con SCID
(Immunodeficiencia combinada severa) (Coutts, 2011).
El FDA emite un documento gua, Points to Consider in Human Somatic Cell Therapy and Gene Therapy, actualizado en
1998 (FDA, 1991, 1998).
El director del NIH aprueba una excepcin para el uso compasionado de transferencia gnica en ciertos pacientes, sin la
necesidad de una revision regular del protocolo.
La FDA publica una descripcin de sus mtodos para la regulacin de productos de terapia gnica.
El NIH y el FDA esbozan un acuerdo para que la FDA asuma la revision de protocolos de terapia gnica, siendo el RAC y la
FDA quienes decidan en conjunto cuales son los protocolos que requieren revision pblica por el RAC (Advisory
Committee to the Director, 2000).
El director del NIH propone la terminacin del RAC (Notice of intent, 1996).
Se confirma que el RAC pasa a ser una entidad de prevencin; el FDA es la nica entidad capaz de aprobar protocolos de
transferencia gnica y productos de terapia gnica (Advisory Committee to the Director, 2000; U.S. Congress, 2000).
Los informes del RAC (RAC minutes) incluyen tablas de resumen sobre los reportes de efectos adversos recibidos.
Jesse Gelsinger mientras participa en una prueba de transferencia gnica; investigaciones subsecuentes identifican
muchas deficiancias en la supervision de la investigacin.
La FDA anuncia nuevo plan para el monitoreo de pruebas clnicas en terapia gnica para fortalecer la proteccin para los
pacientes participantes.
El NIH rectifica sus guas y propone la revision de protocolos por parte del RAC antes de la revision de los Comits
Institucionales de Bioseguridad (ICB) y las Juntas de Revisin Institucionales (IRB) (Recombinant DNA research: Action
under the guidelines, 2000).
La unidad administrative del FDA que evala terapia gnica, cellular y tisular es elevada de division a oficina.
La FDA impone un moratorio temporal a los estudios de transferencia gnica usando vectores retrovirales en clulas
madre de sangre. El moratorio es levantado el mismo ao.
El NIH lanza GeMCRIS, una base de datos en la Web que permite el acceso pblico a informacin acerca de transferencia
gnica (NIH, 2004).
El NIH propone revisar las guas para remover el requerimiento de revision por el IBC de ciertos experimentos de
transferencia gnica de bajo riesgo que han sido aprobados por un IBC (NIH Guidelines], 2013).

Regulacin

Berg P, Mertz JE. Personal reflections on the origins and emergence of recombinant DNA technology. Genetics. 2010;184(1):917

Guas de la OECD para


bioseguridad en biotecnologa

OECD: The Organisation for Economic Co-operation and Development


Recombinant DNA Safety Considerations, 1986.
Safety Considerations for Biotechnology, 1992 .
Safety Considerations for Biotechnology. Scale-up of crop plants, 1993.
Safety Evaluation of Foods Derived by Modern Biotechnology Concepts and Principles,1993
Safety Considerations for Biotechnology. Scale-up of micro-organisms
as biofertilizers, 1995
Biotechnology for Clean Industrial Products and Processes. Towards
Industrial Sustainability, 1998

http://dbtbiosafety.nic.in/guideline/OECD.htm

Evaluacin de riesgos para OGMs

Organismo

Husped
Donante, caracterstica introducida
Vector
Informacin sobre el organismo

Uso potencial
Ambiente en el que ser liberado

Riesgos asociados con el husped

Susceptibilidad del husped


Patogenicidad de la cepa
husped, incluida la virulencia,
la infectividad y la produccin
de toxinas
Modificacin de la gama de
huspedes
Estado inmunitario del receptor
Consecuencias de la exposicin

Riesgos asociados con el donante

Determinar si el gen insertado contiene:


Toxinas
Citoquinas
Hormonas
Reguladores de la expresin
gnica
Factores de virulencia o
potenciadores de la virulencia
Secuencias oncognicas
Resistencia a antibiticos
Alrgenos

Aplicaciones del ADN


recombinante

Industria

Farmacuticos
Aditivos
Qumicos

Agricultura

Mejoramiento de calidad nutricional


Incrementar resistencia a temperatura
Incrementar resistencia a pestes y
enfermedades
Control biolgico

Ambiente

Control de contaminacin
Extraccin de metales pesados
Recuperacin de aceites

Etapas que presentan riesgo

Formacin.- Creacin del organismo


Lanzamiento.- Salida de los
organismos al ambiente
Proliferacin.- Multiplicacin,
transporte, modificaciones en el
ambiente, transferencia de
material a otros organismos
Establecimiento.- en un ecosistema
o en otro organismos
Efecto.- en humanos o el ambiente
debido a la interaccin del organismo
con un hospedero o factor ambiental

Etapas que presentan riesgo

Formacin y lanzamiento.- Se pueden evaluar


cuantificando las probabilidades asociadas con la
magnitud de las consecuencias
rboles de error
Simulaciones

Proliferacin y establecimiento.- Difcil de evaluar


las interacciones de los organismos con el ambiente
Transporte y destino en el ambiente
Interacciones en el ecosistema

Efecto.- Se pueden adaptar mtodos


convencionales de epidemiologa y toxicologa

Recomendaciones generales

Estandarizar tcnicas entre laboratorios


No hay base cientfica para crear leyes especficas para
la utilizacin de ADN recombinante
La aplicacin de guas no debera impedir el desarrollo
de la tecnologa
Poner nfasis en el desarrollo de mtodos, equipos y
conocimiento para minimizar las barreras entre pases y
maximizar contribuciones bilaterales
Procurar el entendimiento del pblico sobre las
tcnicas de ADN recombinante
Buscar formas de proteger propiedad intelectual

Recomendaciones para la
industria

Aplicaciones industriales a gran escala deberan


usar microorganismos de bajo riesgo.
Se debe manejar a los microorganismos bajo
Buenas Prcticas de Manufactura a Gran Escala
Para microorganismos de riesgo microbiolgico
medio y alto se deben usar mtodos de contencin
correspondientes
Hacer investigacin sobre mtodos de monitoreo y
contencin de organismos

Riesgos en la industria

Aerosoles

Presencia de microorganismos en el ambiente


Se usan generalmente microorganismos atenuados
Bacterias modificadas no incrementan el riesgo

Sanitarios

Infeccin
Alergia a microorganismos
Alergia a productos
Toxinas

ADN Recombinante

there is no scientific basis for specific legislation to regulate


the use of r-DNA organisms (OECD, 1986)

Recomendaciones para la
agricultura y ambiente

Para hacer evaluacin de riesgo se debe utilizar la


informacin disponible sobre los efectos de organismos
en humanos y el ambiente
Se debe hacer una evaluacin de riesgo previo a la
liberacin
El desarrollo de aplicaciones basadas en organismos
modificados debe hacerse de manera ordenada
(laboratorio, cmara de crecimiento, invernadero,
campo)
Se debe hacer investigacin para mejorar la prediccin,
evaluacin y monitoreo de la aplicacin de OGMs

Tarea

Escoger uno de los Experimentos cubiertos por las


guas del NIH y exponerlo en clase
http://osp.od.nih.gov/sites/default/files/NIH_Guideli
nes.html#_Toc351276354

Discusin

Cul es el verdadero riesgo agregado al trabajar


con tecnologa de ADN recombinante?

Trabajando con E. coli y fagos

Cepa&

Vector

Clasificacin* Regla** Comentario

K12 B o C No autotransmisible (tra-)

BSL 1

1. e, j

K12 B o C autotransmisible (tra-)

BSL 2

2. e, j

Otras

BSL 2

3. e, j

&K12

No autotransmisible (tra+)

Mayora de sistemas
comerciales

Algunos sistemas mini


Tn5

Si no se prueba lo
contrario, se debe
considerar a estas cepas
patognicas

Bury, J.; Dekeyser, R. 2004. Biosafety in the laboratory. Tercera Edicin. Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology

B o C son cepas de E. coli atenuadas, no patognicas


*Ejemplo, en caso de que el ADN insertado no sea peligroso
**Revisar Anexo

Superficies fciles de descontaminar


Trabajar cerca del mechero
Inactivar todo material antes de desechar [excepto K12 (mob-)con autorizacin
explcita]
Se debe revisar dos veces al ao si la cepa utilizada es la correcta

Ejemplo prctico

Clonar quimosina en pUC18 usando E. coli JM109 como


receptor para realizar procedimientos estndar a pequea
escala
Paso 1. La combinacin vector-receptor es adecuada para
clasificacin de riesgo 1? Determinar si:
E. coli JM109 es del grupo de riesgo 1
PUIC18 puede ser clasificado en grupo 1
Paso 2. Revisar la categora de contencin en el anexo 2
Paso 3. Determinar el riesgo del inserto (quimosina)
Paso 4 Revisar detalles sobre:
El ambiente que va a ser expuesto al organismo
Las actividades y nivel de bioseguridad de este
ambiente
Si se realizan procedimientos no estndar

Trabajando con levaduras no


patognicas modificadas
Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe y Pichia
pastoris son inocuas
Pueden ser utilizadas en laboratorios BSL1 si
los genes insertados no son peligrosos
Si se utiliza un gen peligros deben ser
manejados en BSL2
Las levaduras pueden esparcirse en el aire
donde sobreviven por largos e tiempo
Pueden contaminar otros cultivos
Pueden causar alergias
Todo desecho debe ser inactivado

Trabajando con lneas celulares


modificadas

Lnea celular

Vector

Clasif.*

Regla**

Comentarios

No se conoce

No es relevante

BSL2

NIH-3T3

Ninguno

SV40ori

BSL1

4. e, j

Se puede clasificar en un nivel


ms bajo solo si se tienen
pruebas de que no se producen
virus

HELA

E6E7 de HPV

SV40ori

BSL1

4. e, j

293

E1E2 de
adenovirus

Vector adenoviral sin


E1

BSL2

8. e, j

BSL2

Clulas primarias de
ratn

Inmortalizadas con
EBV

Sec. virales en
la lnea

EBV completo

No es relevante

*Ejemplo, en caso de que el ADN insertado no sea peligroso


**Revisar Anexo

No hay riesgo de formacin de


virus

Secuencias virales en vector y


receptor no producen partculas
virales
Secuencias virales en vector y
receptor pueden producir virus

La clasificacin corresponde a la
del virus en la lnea cel.

De acuerdo a su capacidad de producir agentes biolgicos peligrosos (virus)


Distincin entre lneas primarias y establecidas

Primarias: al menos BSL2


Establecidas: Producen virus?

Nunca trabajar con clulas autlogas pues no sern reconocidas por el sistema inmune

Trabajando con virus y vectores


virales modificados

Virus modificados se clasifican de igual manera que


su contraparte no modificada a menos que el inserto
incremente el riesgo
Se considera la combinacin entre virus y lneas
celulares
Para la generacin de adenovirus y retrovirus se
recomienda BSL2 y BSC clase II
Los desechos deben ser inactivados o tratados como
residuos mdicos peligrosos
Trabajo con diferentes tipos de virus no deben ser
realizados en el mismo laboratorio al mismo tiempo
Se debe desinfectar la cabina de bioseguridad antes
de empezar un nuevo experimento
Si el inserto es peligroso (e.g. oncogenes celulares
dominantes), se incrementar el nivel de
bioseguridad, hasta nivel 3 en algunos casos
Hay que tener especial cuidado con vectores virales
que son producto de la combinacin de ms de un
tipo de virus

Trabajando con Agrobacterium


transformada

Cepa

Vector

Clasif.* Regla**
BSL1

1. e, j

Comentarios

No
desarmada

Binario u otro vector


de transf. de plantas

BSL2

3. e, j

Son patognicas

BSL2

3. e, j

Desarmada

A.
rhizogenes

Binario u otro vector


de transf. de plantas

Binario u otro vector


de transf. de plantas

Presentan contencin
biolgica
Son patognicas

*Ejemplo, en caso de que el ADN insertado no sea peligroso


**Revisar Anexo

La mayora de experimentos se llevan a cabo con cepas desarmadas


Cuando no se puede evitar la formaci`on de aerosoles se debe usar un cabina de
bioseguridad clase II
Desechos deben ser esterilizados

Trabajando con plantas transgnicas

Cmaras de crecimiento no deben tener salida al


ambiente
Cuando se trabaja en invernadero con plantas que
florecen, se debe evitar el flujo de polinizadores y
el aire interno no debe estar en contacto con el
ambiente
Antes de desechar:
Esterilizar material que pueda
contener A. tumefaciens
Inactivar partes reproductivas
Inactivar semillas
Inactivar el suelo que pudo
tener contacto con semillas

Jamiepighin, 2003. The Science Creative Quarterly

Tarea

Existen leyes en la constitucin Ecuatoriana


relacionadas con OGMs?
Qu dicen estas leyes?
Consultar sobre un caso donde el uso de GMOs
haya sido perjudicial para el ser humano o el
ambiente

Discusin

Cules son los riesgos de liberar OGMs?

Riesgos

Exposicin a nuevos alrgenos


Transferencia de genes de resistencia a flora
intestinal
Transferencia horizontal de genes de resistencia a
herbicidas, pesticidas o antibiticos (bajo)
Transferencia vertical de genes (alto)
Monocultivos
Monopolios