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9. Qu estrategias utiliza la genoterapia para introducir genes funcionales?

La introduccin en una clula de material genmico forneo se denomina transferencia


gnica, transduccin o transfeccin. Los principales sistemas de transferencia pueden
agruparse en dos tipos: los mtodos fsico-qumicos y los vectores virales. Los mtodos
de transferencia gnica fsico-qumicos o no virales (Tabla 1) fueron los primeros en ser
desarrollados. En estos mtodos el ADN forneo o ex- geno est integrado en un
plsmido, que es una molcula de ADN que puede ser mantenida de manera epismica,
es decir, de forma estable e independiente del genoma de la clula husped. En general,
presentan las siguientes ventajas: son sencillos de preparar, lo que permite su
produccin de forma industrial; no tienen limitaciones en cuanto al tamao del ADN
que pueden transferir; son poco txicos; y no son inmunognicos.

Tabla 1. Mtodos fsico-qumicos de


transferencia gnica.
Microinyeccin
Precipitacin con fosfato clcico
Electroporacin
Bombardeo con microproyectiles
Inyeccin directa de ADN desnudo
Conjugados ADN-protenas
Conjugados ADN-adenovirus
Liposoma
Los inconvenientes de estos mtodos son su baja eficacia de transduccin de las clulas
diana y que algunos de ellos slo pueden utilizarse in vitro.
En la transferencia mediada por virus se sustituyen ciertos genes prescindibles del
vector por aquellos genes que se desea introducir en las clulas diana. La regin que
ocupan estos genes se denomina regin para insercin o cassette; su tamao (nmero
de kilobases: kb) depende del tamao del virus y de los genes que puedan ser
sustituidos y, obviamente, constituye un factor limitante a la hora de insertar las
secuencias gnicas de inters.
Actualmente, los virus (Tabla 2) constituyen la forma ms eficaz de transferir genes
teraputicos al interior de las clulas diana, y son los vectores ms utilizados en terapia
gnica. Los virus estn constituidos por pequeos cidos nucleicos (ADN o ARN)
encapsulados en envolturas proteicas que los protegen y les permiten entrar en las
clulas. Una vez en el interior de la clula, la informacin contenida en el cido
nucleico dirige la sntesis de protenas virales, aprovechando el sistema sintetizador
(ribosomas) y el aparato productor de energa (mitocondrias) de la clula husped; de
este modo se generan nuevos viriones.

Tabla 2. Vectores virales de transferencia gnica.


Adenovirus
Virus adenoasociados
Virus vaccinia
Herpesvirus
Retrovirus

Los vectores virales se obtienen por eliminacin de uno o ms genes indispensables


para la replicacin del virus, y su sustitucin por el gen teraputico. De esta forma, el
nuevo virus es defectivo, lo que significa que mantiene la capacidad de infectar las
clulas pero es incapaz de multiplicarse en ellas. Es decir, un virus puede ser
transformado estructuralmente mediante diversas tcnicas, dando lugar a un vector
recombinante relativamente seguro, siempre y cuando se sustituya los genes
responsables de su replicacin y virulencia por los genes teraputicos, manteniendo su
capacidad infectiva intacta.
Los vectores virales constituyen los sistemas ms eficaces para transferir genes, ya que
son capaces de infectar una elevada proporcin de las clulas diana, es decir, poseen
una elevada eficacia de transfeccin, que en algunos casos llega a ser incluso del 100%.
Existen, sin embargo, importantes limitaciones en el empleo de virus, derivados de la
transferencia y la expresin de secuencias virales. En consecuencia, la seguridad en el
empleo de los vectores virales constituye una importante preocupacin, bien porque
puede producirse una transferencia involuntaria del virus nativo patgeno, o bien
porque pueda activarse un virus patgeno o un oncogn debido a la posibilidad de
recombinacin gnica al insertarse un gen forneo en el genoma del husped. Otro
punto clave a considerar en la terapia gnica in vivo es la reaccin inmunitaria que el
organismo receptor pone en marcha, pudiendo eliminar el material gentico a travs de
la muerte de las clulas genticamente modificadas. Para contrarrestar esta reaccin
inmune se intenta eliminar el mayor nmero posible de genes vricos del vector, con el
fin de obtener una expresin ms estable del gen teraputico.
Por otra parte, un riesgo potencial de la terapia gnica es la posibilidad de aparicin de
complicaciones que requirieran la suspensin del tratamiento. Es por ello que se ha
desarrollado una alternativa consistente en el doble marcaje de la clula con genes
distintos de la secuencia de inters, es decir, la clula marcada lleva un gen forneo que
nos sirve de marcador, como el de resistencia a neomicina, que permite seleccionar in
vitro las clulas que han tomado el ADN exgeno o conocer in vivo el grado de
transfeccin, y el otro gen, como el de la enzima timidina cinasa del virus del herpes
simplex, que permite hacer una seleccin negativa in vivo de las clulas marcadas,
mediante la administracin de ganciclovir, el cual es fosforilado por la enzima y
activado, provocando la muerte celular; de este modo se elimina las clulas modificadas
si la situacin lo requiere debido a la toxicidad del tratamiento u otras complicaciones.

10. Qu es una vacuna recombinante?

Las vacunas recombinantes de tipo I (subunidad) se derivan de organismos recombinantes (los


que pueden ser una levadura, una bacteria o un virus) en los que se ha insertado un gen extrao
de un patgeno especfico. El organismo recombinante que transporta al gen insertado se
multiplica; y el producto del gen es cosechado, purificado y administrado como una vacuna. La
vacuna de subunidad ms exitosa en la medicina veterinaria es una vacuna recombinante contra
la enfermedad de Lyme. Un slo gen (que codifica la protena A de la superficie externa
[OspA]) obtenido de la Borrelia burgdorferi patognica (el agente causal de la enfermedad de
Lyme) se asla v se inserta en la Escherichia coli. Se propaga la E. coli y la protena de
subunidad se purifica y se prepara para ser administrada a los perros.

Esta protena se encuentra en la superficie externa de las espiroquetas y cuando es presentada


al sistema inmunolgico del animal vacunado provoca una respuesta humoral protectora
especfica, sin ninguno de los efectos adversos que se han presentado en vacunas que contienen
la espiroqueta muerta.

Las vacunas recombinantes de tipo II (de gen deletado) siguen un modelo que ocurre en el
laboratorio cuando los organismos son atenuados a travs del crecimiento bajo condiciones
consideradas poco ideales tales como temperatura variable, pasajes mltiples y medios
artificiales o huspedes restringidos. La atenuacin del organismo ocurre bajo estas condiciones
ya que algunos genes son alterados y como consecuencia ya no son expresados. Con las tcnicas
modernas de manipulacin gentica, genes especficos como los asociados con la virulencia o
patogenicidad, pueden ser deletados de un organismo patgeno. La delecin provoca que el
organismo tenga menos probabilidad de causar enfermedad mientras que retiene su habilidad de
estimular la inmunidad protectora. Las vacunas con genes deletados empleadas para controlar la
seudorrabia no contienen los genes especficos asociados con la induccin de anticuerpos
especficos, que permite que las personas encargadas de la erradicacin de enfermedades
puedan diferenciar entre los animales que fueron vacunados (y por lo tanto protegidos) de
aqullos infectados con el virus patognico virulento.

Las vacunas recombinantes de tipo III (vectoriales) consisten de organismos no patognicos o


de gen deletado en el que se inserta un material gentico especfico de un patgeno con el
propsito claro de estimular una respuesta inmunolgica protectora cuando el vector es
administrado al animal vacunado. Esta recombinacin toma lugar in vitro durante el cultivo en
conjunto del vector y un plsmido que contiene el gen a insertar. Se han usado
experimentalmente la Salmonella, Mycobacterium, adenovirus, lentivirus y poxvirus como
vectores de una respuesta inmunolgica. Los vectores ms exitosos han sido los poxvirus. Estos
virus tienen un genoma grande y pueden resistir mltiples manipulaciones sin afectar su
habilidad de replicarse. De hecho, uno de los vectores de vaccinia experimentales tuvo ms de
16 genes especficos deletados y an fue capaz de conferir excelente inmunidad contra la
enfermedad. Los vectores poxvirales son ms eficaces que las vacunas muertas, son altamente
especficos e inducen a una respuesta inmunolgica de largo plazo. Debido a que contienen

solamente gen(es) especfico(s) del organismo patognico, no pueden causar la enfermedad o


volver a ser virulentos, no pueden replicarse y no son difundidos en el ambiente.

1. Lazo PA.Terapia gnica humana:tendencias y problemas. Med Cln (Barc) 1996; 106:469
476.
2. Novelli G, Gruenert DC. Genome
millennium.Pharmacogenomics 2002; 3:15-18.

medicine:

gene

therapy

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the