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Manual de guiones experimentales para la enseanza y
aprendizaje del laboratorio de Toxicologa (clave 1614)
Segunda Edicin
ISBN: 978-607-02-7279-0

Alejandra Quijano Mateos Manuel Gutirrez Aguilar


Araceli Prez Vsquez Mara Elena Bravo Gmez
Bernardo Lucas Florentino Mariana Flores Torres
Carlos Prez Muoz Martha Leyte Lugo
Eduardo Hernndez Vzquez Paulina Del Valle Prez
Francisco Hernndez Luis Perla Carolina Castaeda Lpez
Francisco Snchez Bartez Silvia Graciela Dvila Manzanilla
Jorge Cornejo Garrido Sitlali del Rosario Olgun Reyes
Jos Alberto Rivera Chvez Sol Cristians Niizawa
Juan Francisco Palacios Espinosa Viridiana Morales Snchez

Autores

6HJXQGD edicin 2015 D.R. Universidad Nacional Autnoma de


Mxico. Ciudad Universitaria, Delegacin Coyoacn, C.P. 04510,
Mxico, Distrito Federal.
La publicacin de esta obra fue posible gracias al apoyo de la
Coordinacin de Comunicacin, a travs de los Departamentos de
Editorial, de Informacin (Taller de Imprenta) y de Diseo y Medios
Audiovisuales.
Responsable editorial: CME Brenda lvarez Carreo.
Diseo de portada: LDG Vianey Islas Bastida
Hecho en Mxico. Prohibida la reproduccin total o parcial por cualquier
medio, sin la autorizacin escrita del titular de los derechos patrimoniales.



Primera edicin: 2012


Segunda edicin: 2015
Fecha de la primera edicin: 15 de enero de 2012
Fecha de la segunda edicin: 20 de septiembre de 2015

D.R. 2015 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE


MXICO; Ciudad Universitaria, Delegacin Coyoacn,
C.P. 04510, Mxico, Distrito Federal

ISBN: 978-607-02-7279-0
Prohibida la reproduccin total o parcial por cualquier medio, sin la
autorizacin escrita del titular de los derechos patrimoniales.
Impreso y hecho en Mxico

Tamao: 3.30 MB
Tipo de impresin: PDF
Publicacin autorizada por el Comit Editorial de la Facultad de Qumica
Laboratorio de Toxicologa

NDICE

PRLOGO 3

REGLAMENTO DE HIGIENE Y SEGURIDAD PARA LOS LABORATORIOS DE LA


FACULTAD DE QUMICA 7

REGLAMENTO DE HIGIENE Y SEGURIDAD PARA LOS LABORATORIOS DEL


DEPARTAMENTO DE FARMACIA 11

REGLAMENTO PARA LOS ESTUDIANTES Y PROFESORES DE LOS CURSOS


EXPERIMENTALES DEL DEPARTAMENTO DE FARMACIA 13

REPORTE DE SEGURIDAD E HIGIENE 15

HOJA DE SEGURIDAD DE REACTIVOS 16

HOJA DE VALORACIN PARA LA EVALUACIN DEL BIENESTAR DE LOS


ANIMALES DE EXPERIMENTACIN 18

IDENTIFICACIN Y CUANTIFICACIN DE TXICOS NO VOLTILES EN UNA


MUESTRA PROBLEMA 19

CUANTIFICACIN DE CIANURO DE HIDRGENO, COMO TXICO VOLTIL, A


PARTIR DE GLUCSIDOS CIANOGNICOS 33

DETERMINACIN DEL MECANISMO DE ACCIN DE LA ACTIVIDAD


ANTIOXIDANTE DE COMPUESTOS DE ORIGEN NATURAL 43

DETERMINACIN DE MUTGENOS AMBIENTALES A TRAVS DE LA PRUEBA


DE AMES 58
EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD GENOTXICA DE LA CICLOFOSFAMIDA
UTILIZANDO LA TCNICA DE MICRONCLEOS EN MDULA SEA 72

EFECTO TXICO DE LA ADMINISTRACIN DE PLOMO EN RATAS 83

EFECTO DEL pH EN LA LIBERACIN DE PLOMO POR UTENSILIOS DE BARRO


VIDRIADO 97

DETERMINACIN DE ETANOL EN UNA MUESTRA PROBLEMA 103

GUIONES COMPLEMENTARIOS 111


EXTRACCIN Y CUANTIFICACIN DE TXICOS NO VOLTILES EN UNA
MUESTRA PROBLEMA 112
DETERMINACIN DE MALATIN RESIDUAL 126
PRODUCCIN DE METAHEMOGLOBINA POR NITRITOS Y EFECTO
PROTECTOR DEL AZUL DE METILENO IN VIVO 135

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEANZA


Laboratorio de Toxicologa

PRLOGO

A partir del semestre 2006-I se inici la implementacin gradual del mapa curricular del plan de estudios vigente
de la carrera de Qumica Farmacutico Biolgica (QFB).

En este mapa curricular, se ubic en el sexto semestre la asignatura terico-experimental de Toxicologa, con
clave 1614. El diseo del contenido programtico de la asignatura, consider revisar los conocimientos bsicos
de toxicologa como son citotoxicidad, bioactivacin txica, estrs oxidante, mutagnesis, carcinognesis y
teratognesis, para integrarlos al estudio del riesgo de exposicin, as como a la toxocintica y toxodinamia de
las reacciones adversas ocasionadas por xenobiticosfrmacos, metales pesados y sustancias de abuso.

Acorde a lo antes sealado, se consideraron guiones experimentales que permitieran la aplicacin e integracin
de los conocimientos adquiridos en diversas asignaturas de semestre previos y de manera importante, los
obtenidos en la clase terica de la asignatura. En el ao 2012 se contaba con el Manual de guiones
experimentales para la enseanza y aprendizaje del laboratorio de Toxicologa, constituido por diez guiones
experimentales diseados de acuerdo a la Reforma de la Enseanza Experimental. Dos de estos guiones se
implementaron con el apoyo del proyecto PE202006 a travs del Programa de Apoyo a Proyectos para la
Innovacin y Mejoramiento de la Enseanza (PAPIME), lo que permiti la adquisicin de equipos, materiales y
reactivos para la enseanza experimental de esta asignatura.

Posteriormente, el grupo de profesores de toxicologa, en forma colegiada, decidi continuar con la revisin del
curso prctico, incluyendo temas de inters actual en esta asignatura como toxicologa ambiental y estrs
oxidante; y rediseando dos de los guiones existentes con la finalidad de mejorar el aprendizaje hacindolos ms
completos e integrales. Con esta intencin, se implementaron tres guiones experimentales con apoyo de otro
proyecto (PE201111) del mencionado programa: a) Identificacin y cuantificacin de txicos no voltiles en
una muestra problema, b) Determinacin del mecanismo de accin antioxidante de compuestos de origen
natural y sinttico, ambos resultado del rediseo de prcticas incluidas en el manual del 2012; y c)
Determinacin de mutgenos ambientales a travs de la prueba de Ames para integrar el tema de toxicologa
ambiental.

Es as que los autores de esta segunda edicin presentamos el Manual de guiones experimentales para la
enseanza y aprendizaje del laboratorio de Toxicologa (clave 1614), constituido por once guiones
experimentales tres de los cuales estn incluidos en la seccin de Guiones experimentales complementarios,

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mismos que permiten reforzar los conocimientos en toxicologa analtica y en el caso de uno de ellos, evidenciar
efectos txicos. Cabe destacar que todos los guiones del Manual permiten cubrir las unidades temticas del curso
terico (Tabla 1) y propician tambin su aplicacin a la resolucin de problemas en esta rea. Asimismo, la
secuencia de los guiones experimentales est en concordancia con las clases tericas, lo que favorece el proceso
de enseanza-aprendizaje de los alumnos.

Tabla 1. Relacin entre las unidades temticas del curso terico y los guiones experimentales.
Curso laboratorio Curso terico
Guin experimental Unidad temtica
Identificacin y cuantificacin de txicos no voltiles
Introduccin a la toxicologa
en una muestra problema
Cuantificacin de cianuro de hidrgeno, como txico La biotransformacin de xenobiticos y su importancia
voltil, a partir de glucsidos cianognicos toxicolgica
Determinacin del mecanismo de accin antioxidante
El estrs oxidante
de compuestos de origen natural
Determinacin de mutgenos ambientales a travs de Mutagnesis, carcinognesis y teratognesis y
la prueba de Ames toxicologa ambiental
Cuantificacin de microncleos en eritrocitos de
Mutagnesis, carcinognesis y teratognesis
mdula sea como indicador de genotoxicidad
Efecto txico de plomo en ratas Toxicidad de metales pesados
Efecto del pH en la liberacin de plomo por utensilios
Toxicidad de metales pesados
de barro vidriado
Determinacin de etanol en una muestra problema Toxicidad de sustancias de abuso
Guiones complementarios
Extraccin y cuantificacin de txicos no voltiles en
Introduccin a la toxicologa
una muestra problema
La biotransformacin de xenobiticos y su importancia
Determinacin de malatin residual
toxicolgica
Produccin de metahemoglobina por nitritos y efecto La biotransformacin de xenobiticos y su importancia
protector del azul de metileno in vivo toxicolgica

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Cabe recordar que los guiones experimentales se elaboraron siguiendo los criterios establecidos por la Reforma
de la Enseanza Experimental,* donde la adquisicin del conocimiento se da a la luz de las evidencias
observables o medibles de los fenmenos que ocurren en el laboratorio. El estudiante es enfrentado a los mismos
a travs de un problema bien definido, el cual debe ser resuelto encontrando las relaciones causa-efecto a travs
del trabajo experimental.

Cada uno de los guiones est estructurado de la siguiente manera:

OBJETIVO ACADMICO
Se establece para reforzar y enriquecer los conocimientos adquiridos en el curso terico, as como el desarrollo
de habilidades en el manejo de materiales y empleo de tcnicas analticas usadas comnmente para determinar
y/o identificar la presencia de xenobiticos.

PROBLEMA
Se plantea con la intencin de enfrentar al estudiante a fenmenos de inters en el rea que le permitan adquirir
los conocimientos planteados en el OBJETIVO ACADMICO a travs del trabajo experimental; encontrando
las relaciones causa-efecto y relacionando estos hallazgos con el riesgo de intoxicacin y/o el potencial
toxicolgico.

DESARROLLO EXPERIMENTAL
Describe el procedimiento y tcnicas utilizadas para el desarrollo y obtencin de resultados que permitan
resolver el PROBLEMA.

CUESTIONARIO
Se incluye con la intencin de dirigir al estudiante hacia la resolucin del PROBLEMA, resaltando los aspectos
vivenciales de la experiencia en el laboratorio y, de esta forma, reforzar el proceso cognoscitivo.

APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS


Este apndice contiene un listado de los conceptos indispensables para que el estudiante comprenda el guin y
sea capaz de resolver el PROBLEMA planteado.

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APNDICE II: PREPARACIN DE REACTIVOS


En este apndice se indican las cantidades necesarias para la preparacin de los reactivos a emplear en el
DESARROLLO EXPERIMENTAL.

APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS


Considerando que en cada sesin de laboratorio se generan un nmero importante de residuos, se contempl la
necesidad de indicar puntualmente cada uno de ellos as como la manera en que debern ser confinados y
etiquetados para su posterior tratamiento.

Los autores consideramos importante tambin incluir el presente material:

Reglamento de Higiene y Seguridad de la Facultad y del Departamento de Farmacia, para concientizar a los
alumnos de la relevancia y carcter obligatorio de ambos, promoviendo de esta forma el desarrollo de
actitudes apropiadas para un profesional en el rea de las ciencias biolgicas y de la salud.

Formato de Reporte de Seguridad e Higiene y la Hoja de Seguridad de Reactivos, para que los alumnos se
familiaricen con el rombo de comunicacin de riesgos y de esta forma, puedan identificar el equipo de
proteccin personal para el manejo de sustancias qumicas y el grado de riesgo de sustancias peligrosas.

Hoja de valoracin para la evaluacin del bienestar de los animales de experimentacin, con base en la
recomendacin emitida por el Comit Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio
(CICUAL), misma que permitir realizar una revisin de la salud animal peridica posterior a la
administracin del xenobitico en los guiones en donde se emplean animales de experimentacin. Con esta
medida se evitar causarles sufrimiento innecesario y, en su caso, se aplicar adecuadamente el punto final
humanitario del experimento.

Finalmente, los autores agradecemos el apoyo brindado a travs del proyecto PAPIME Nm. PE201111 de la
Direccin General de Asuntos del Personal Acadmico (DGAPA) de la UNAM para la implementacin de tres
guiones experimentales y la elaboracin de esta segunda edicin. Asimismo, agradecemos a los becarios de este
proyecto: Carolina Rivera Santiago, Jos Guadalupe Becerril Vega, Valeria Abigail Rosales Zariana, Marcela
Alejandra Lpez Snchez y Rodrigo Hernndez por sus valiosas aportaciones y dedicacin para lograr el
desarrollo e implementacin de los nuevos guiones.

* Hernndez Luna, M. y Llano Lomas, M. Propuesta de Reforma de la Enseanza Experimental. Revista


del IMIQ, Ao XXV, vol. 07, 1994, pp. 5-7.

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Reglamento de Higiene y Seguridad para los Laboratorios de la Facultad de Qumica

ARTCULO 1. El presente Reglamento es aplicable en todos aquellos espacios de la Facultad de Qumica donde
se realice trabajo experimental, sea de docencia o de investigacin. Estos sitios, para efectos del presente
Reglamento, sern denominados laboratorios. Su cumplimiento es obligatorio para el personal acadmico,
administrativo y alumnos y no excluye otra reglamentacin que resulte aplicable. Deber exhibirse en un lugar
visible en cada laboratorio de la Facultad de Qumica.

ARTCULO 2. Es necesario que el personal que trabaja en cada laboratorio conozca los sistemas de alerta, las
zonas de menor riesgo, las rutas de evacuacin, el equipo para combatir siniestros y las medidas de seguridad en
cada laboratorio, as como los procedimientos establecidos para actuar en caso de presentarse una emergencia.

ARTCULO 3. Los laboratorios debern estar acondicionados, como mnimo, con lo siguiente:

a. Un control maestro para energa elctrica


b. Un botiqun de primeros auxilios
c. Extintores
d. Un sistema de ventilacin adecuado
e. Agua corriente
f. Drenaje
g. Un control maestro para suministro de gas en los lugares donde se utilice
h. Sealamientos de proteccin civil

Todos los laboratorios que trabajen con sustancias qumicas (NOM-018.STPS-2000)


http://www.stps.gob.mx/bp/secciones/dgsst/normatividad/normas/Nom-018.pdf, debern tener adems:

i. Regadera
j. Lavaojos
k. Polvo para derrames

ARTCULO 4. Cada uno de los Departamentos y Unidades Acadmicas de la Facultad debern nombrar al
menos a un responsable de seguridad.
ARTCULO 5. En los laboratorios de enseanza de Licenciatura, al realizar actividades experimentales, nunca
deber estar una persona sola. El nmero mnimo de personas deber ser de dos y al menos una de ellas deber

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ser parte del personal acadmico de la Facultad. En el caso de los laboratorios de investigacin el nmero
mnimo de personas que debern permanecer es de dos, sin importar su nombramiento.
ARTCULO 6. Para trabajar en los laboratorios, es obligatorio usar bata, lentes de seguridad y en caso de ser
necesario guantes; es responsabilidad del usuario contar con el equipo mencionado. Queda prohibido el uso de
lentes de contacto, pelo suelto y zapatos abiertos.
ARTCULO 7. Queda prohibido fumar y consumir alimentos o bebidas en los laboratorios.
ARTCULO 8. Todas las reas donde se realice trabajo con material radiactivo debern estar claramente
identificadas. Para poder manipular este material radiactivo, es indispensable aprobar el curso de capacitacin,
as como la obtencin del dosmetro correspondiente.
ARTCULO 9. Para poder realizar trabajo experimental con Organismos Genticamente Modificados (OGMs),
se deber informar a la Comisin Interna de Bioseguridad. El manejo y disposicin adecuada de estos
organismos, se llevar a cabo de acuerdo con el reglamento interno de cada Departamento.
ARTCULO 10. En caso de trabajar con compuestos que contengan azufre, selenio y fsforo o cualquier
sustancia olorosa se deber informar a la Coordinacin de Seguridad Prevencin de Riegos y Proteccin Civil
para su conocimiento. Para el manejo de las mencionadas sustancias debern seguirse las recomendaciones
establecidas en las hojas de seguridad correspondientes que estarn disponibles en cada laboratorio (NOM
018.STPS-2000). http://www.stps.gob.mx/bp/secciones/dgsst/normatividad/normas/Nom-018.pdf
ARTCULO 11. Las puertas de acceso y salidas de emergencia debern estar siempre libres de obstculos y en
posibilidad de ser utilizadas ante cualquier eventualidad. El responsable del rea deber verificar el
cumplimiento de este artculo.
ARTCULO 12. Las regaderas debern funcionar correctamente, contar con el drenaje adecuado, estar lo ms
alejadas posible de instalaciones o controles elctricos y libres de todo obstculo que impida su uso. El
responsable del rea deber verificar el cumplimiento de este artculo.
ARTCULO 13. La localizacin de los controles maestros de energa elctrica y suministros de gas en cada
laboratorio, deber estar sealada adecuadamente, de manera que puedan ser identificados con facilidad.
ARTCULO 14. Las tuberas de cada laboratorio debern estar sealadas de acuerdo con la norma oficial
mexicana correspondiente (Norma Oficial Mexicana NOM-0026 STPS 1998).
http://www.stps.gob.mx/bp/secciones/dgsst/normatividad/normas/Nom-026.pdf
ARTCULO 15. Cada laboratorio deber contar con un botiqun de primeros auxilios. Su contenido ser el
siguiente: apsitos estriles, vendas elsticas, tela adhesiva, abatelenguas, frulas de cartn de 15 x 50 cm,
mascarilla para respiracin artificial (tipo mascarilla nariz-boca con fuelle, sin contacto directo de boca a boca o
un equipo de funcin semejante), algodn, alcohol en gel o alcohol lquido desnaturalizado, termmetro axilar y
tijera recta. El responsable se har cargo de revisarlo peridicamente.

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ARTCULO 16. Los extintores de incendios debern ser de CO2 y de polvo qumico seco, segn lo determine el
Departamento de Prevencin y Combate de Siniestros de la UNAM. Debern ser recargados peridicamente de
conformidad con los resultados de la supervisin que se realiza regularmente o despus de haber sido utilizados.
En caso de que un extintor sea utilizado, deber informarse a la Coordinacin de Seguridad, Prevencin de
Riesgos y Proteccin Civil para obtener un extintor de reemplazo temporal. El extintor debe tener la fecha de la
ltima recarga y cuando se le debe de dar mantenimiento.
ARTCULO 17. Todo el personal acadmico, administrativo y estudiantes debern de tener conocimiento de los
procedimientos de seguridad establecidos para emergencias ocasionadas por incendios, derrames o personas
accidentadas. Estos procedimientos se deben de tener a la vista en cada laboratorio.
ARTCULO 18. Los sistemas de extraccin de gases debern mantenerse sin estorbos ni impedimentos para su
correcto funcionamiento. Se les deber proporcionar el mantenimiento preventivo o correctivo que solicite el
responsable de cada rea.
ARTCULO 19. Los sistemas de suministro de agua corriente y de drenaje, debern recibir el mantenimiento
preventivo o correctivo que solicite el responsable de cada rea, tan pronto como sea posible.
ARTCULO 20. Los lugares donde se almacenen reactivos, disolventes, equipos, materiales, medios de cultivo
y todo aquello relacionado o necesario para el funcionamiento correcto de los laboratorios, estarn sujetos a este
Reglamento en su totalidad.
ARTCULO 21. Queda prohibido desechar sustancias o materiales al drenaje, a la basura municipal o al medio
ambiente. Todos los laboratorios debern contar con procedimientos bsicos para la disposicin adecuada de los
residuos y del personal responsable de su tratamiento.
ARTCULO 22. Queda prohibido pipetear directamente con la boca cualquier lquido.
ARTCULO 23. Al finalizar las actividades cotidianas, el responsable o el profesor correspondiente en los
laboratorios de enseanza deber verificar que queden cerradas las llaves de gas, agua, vaco, etc., as como
apagar todos los equipos que se hayan utilizado. En caso de requerir que algn equipo trabaje continuamente,
debern indicarse tanto en el interior como en el exterior del laboratorio correspondiente, en forma claramente
visible y legible, las precauciones que deben seguirse, as como la informacin para localizar al responsable.
ARTCULO 24. Queda prohibido dejar experimentos bajo condiciones de calentamiento a reflujo toda la noche,
fines de semana y en periodo vacacional excepto cuando cuenten con un sistema de recirculacin de agua.
ARTCULO 25. En cada laboratorio de la Facultad debern exhibirse, visible y legiblemente, los telfonos de
emergencia a los cuales llamar en caso de requerirlo.
ARTCULO 26. Los anaqueles, libreros y muebles de oficina que puedan caerse, debern estar sujetos. Los
cilindros vacos o que contengan gases debern estar asegurados individualmente para prevenir accidentes.

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ARTCULO 27. Queda prohibido que menores de edad permanezcan en el laboratorio sin la autorizacin por
escrito del responsable del rea.
ARTCULO 28. El personal (acadmicos, administrativos o estudiantes) que labora, o realiza sus actividades en
los laboratorios, debe informar al responsable del rea o a su jefe inmediato si padece alguna enfermedad que
requiera atencin especial y pueda generar incidentes dentro del rea.
ARTCULO 29. A todas las Unidades, Centros o Departamentos que estn certificados se regirn por el
reglamento general y ser complementado por su reglamento interno.
ARTCULO 30. Todas aquellas cuestiones que no estn especficamente sealadas en el presente Reglamento
debern ser resueltas por la Coordinacin de Seguridad, Prevencin de Riesgos y Proteccin Civil, la cual se
apoyar en la Direccin de la Facultad.
ARTCULO 31. Cualquier alteracin de las condiciones de seguridad, o en el cumplimiento del presente
Reglamento, deber ser reportada la Coordinacin de Seguridad, Prevencin de Riesgos y Proteccin Civil.
ARTCULO 32. Las personas que sean sorprendidas haciendo mal uso de equipos, materiales, instalaciones,
etc., propias de los laboratorios, o de las sealizaciones instaladas para proteccin civil, sern sancionadas
conforme a la Legislacin Universitaria, segn la gravedad de la falta cometida.
ARTCULO 33. En el caso de los alumnos, las sanciones aplicables sern las que decida el H. Consejo Tcnico
de la Facultad, conforme a las disposiciones de la Legislacin Universitaria.
ARTCULO 34. Si se trata de personal acadmico o administrativo, se levantarn las actas correspondientes y
se dictarn las sanciones conforme a las disposiciones de la Ley Federal del Trabajo.
ARTCULO 35. Cada rea acadmica deber tener un Reglamento Interno de Higiene y Seguridad que ser
complementario al presente Reglamento, en tanto no lo contravengan.
ARTCULO 36. Se informar de este reglamento, as como de los particulares, a los usuarios de cada rea
acadmica, quienes debern firmar de enterado.

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Reglamento de Higiene y Seguridad de los Laboratorios del Departamento de Farmacia

ARTCULO 1. El presente Reglamento es complementario del Reglamento de Higiene y Seguridad, para


Laboratorios de la Facultad de Qumica de la UNAM, aprobado por el H. Consejo Tcnico el 28 de abril de
1994.
Su observancia es obligatoria para el personal acadmico, alumnos y trabajadores administrativos, y no excluye
otra reglamentacin que resulte aplicable.

ARTCULO 2. REGLAS DE SEGURIDAD


2.1 Seguir todas las indicaciones de seguridad que se sealan en cada equipo o reactivo, as como las sealadas
en cada prctica.
2.2 Queda prohibido correr dentro del laboratorio.
2.3 Todas las lesiones sufridas dentro del laboratorio, no importa qu tan insignificantes sean, debern darse a
conocer al coordinador del laboratorio.
2.4 Antes de desarmar o limpiar un aparato elctrico, debe asegurarse de que est desconectado de la corriente
elctrica. Nunca opere un equipo que desconoce, pregunte primero al laboratorista o al profesor.
2.5 No debe usarse material de vidrio roto o despostillado.
2.6 Si en su rea o equipo se va a efectuar algn servicio de mantenimiento, asegrese de dar aviso oportuno a
todos los involucrados y comunquelo a la Coordinacin de Seguridad.
2.7 El alumno que necesite salir por cualquier motivo, deber comunicarlo a los profesores.
2.8 El alumno que acta como supervisor de cada equipo de trabajo, deber verificar, al finalizar la prctica, el
orden y la limpieza de cubculos y equipos.
2.9 Al finalizar cada sesin prctica, los alumnos entregarn al profesor responsable de la asignatura o al
laboratorista en turno, los cubculos y equipos empleados, limpios y en buen estado; asimismo debern informar
cualquier defecto o anomala detectada en los mismos.
2.10 Deber colocar sus artculos personales en el sitio que para tal efecto se asignar en cada laboratorio.

ARTCULO 3. MANUFACTURA DE MEDICAMENTOS


3.1 Todo el personal involucrado en la manufactura de medicamentos deber cubrir totalmente su cabello con
una cofia limpia y en buen estado.
3.2 Deber usar guantes de cirujano y cubrebocas limpios, en buen estado, cuando el proceso lo indique (por
ejemplo, surtido y pesado de materias primas, etc.).

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3.3 De preferencia debe portar zapatos cerrados con suela antiderrapante.


3.4 Queda prohibido introducir alimentos, bebidas o golosinas, excepto cuando as se requiera (Biofarmacia).
3.6 Quedan prohibidas las visitas.
3.7 Las puertas de los cubculos deben permanecer cerradas.

ARTCULO 4. DISPOSICIN DE RESIDUOS BIOLGICOS


4.1 En caso de romper o derramar material contaminado, se deber agregar fenol al 5% y dejar actuar el
desinfectante por 10 minutos.
4.2 Queda estrictamente prohibido arrojar medio de cultivo, disolventes orgnicos o productos biolgicos, al
sistema de drenaje, as como a los colectores de basura; estos residuos se debern incorporar a recipientes que se
localizan en cada laboratorio, para ser dispuestos adecuadamente.
4.3 Los cultivos deben esterilizarse antes de ser desechados; si se encuentran en material desechable, ste debe
depositarse en los recipientes que se localizan en cada laboratorio. Estos residuos sern reciclados.
4.4 Otros desechos orgnicos (alimentos, animales, muestras biolgicas) se depositarn en los recipientes
etiquetados que para este propsito se encuentran en cada laboratorio.
4.5 El material de plstico se depositar en otro recipiente especial.
4.6 El material de vidrio se colectar aparte, en el recipiente indicado.
4.7 El papel limpio de desecho se depositar en otra caja para ser reciclado.

ARTCULO TRANSITORIO NICO. El presente Reglamento entrar en vigor al da siguiente de su


aprobacin por el H. Consejo Tcnico de la Facultad.

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REGLAMENTO PARA LOS ESTUDIANTES Y PROFESORES DE LOS CURSOS


EXPERIMENTALES DEL DEPARTAMENTO DE FARMACIA

Para realizar las actividades experimentales en los laboratorios del Departamento de Farmacia, se debern
observar las siguientes indicaciones:

1. Es indispensable que el alumno cuente con el Guin o Manual actualizados de los experimentos, el
Calendario de Prcticas y los tiles o materiales adicionales que le hayan sido solicitados por su
profesor(a).

2. Para tal efecto es necesario que los coordinadores de la asignatura enven, en el periodo sealado para
esta actividad, el Calendario de Prcticas que se elabor de manera colegiada y de acuerdo al formato
vigente que les enva la Coordinacin de Laboratorios de Docencia previo al inicio del semestre.

3. Las actividades que se registren en el calendario de prcticas deben estar asociadas a un espacio fsico en
donde se desarrollar la actividad. Si durante el semestre surge alguna modificacin en la ubicacin de
las actividades, se deber comunicar a la Coordinacin de los Laboratorios al menos una sesin antes de
que realice la actividad en la que hay modificaciones al calendario.

4. Al finalizar el curso prctico de cada asignatura los profesores subirn las calificaciones a la pgina de
escolares: escolares.quimica.unam.mx/profesor, en tiempo y forma de acuerdo con el Calendario de
Actividades vigente y con la forma en la que cada asignatura haya definido de manera colegiada la
forma en la que deben aparecer sin que quede duda entre los estudiantes. Los alumnos que adeudan
material ya estarn sealados en el recuadro correspondiente y solamente la Coordinacin de los
Laboratorios de Docencia podr eliminar la seal de adeudo. Se entregar en la Coordinacin una copia
del Acta de Calificaciones del grupo con las firmas de los profesores que impartieron la asignatura.

5. SOLICITUD DE MATERIAL
Al solicitar el material para las sesiones prcticas, y antes de firmar de conformidad la papeleta de
solicitud, el alumno, deber revisar el material cuidadosamente en la presencia del laboratorista y si es el
caso anotar las observaciones pertinentes en la papeleta. Al finalizar las actividades prcticas, el material
se entregar limpio y en el mismo estado en que se recibi. No olvide recoger la papeleta de
SOLICITUD DE MATERIAL que firm. En caso de haber roto material, el alumno deber llenar
correctamente, firmar y entregar al laboratorista un VALE DE ADEUDO DE MATERIAL. El material
roto y que sea irreparable se deber depositar en el contenedor identificado para tal funcin en cada uno
de los laboratorios.

6. REPOSICIN DE MATERIAL
Para la reposicin de material roto o extraviado, el estudiante deber comprarlo de las mismas
especificaciones y entregarlo, con la factura de compra, en la Coordinacin de los Laboratorios de
Docencia de Farmacia, a ms tardar en la siguiente sesin de laboratorio o en su defecto y de acuerdo
con el costo, la semana anterior a la entrega de calificaciones finales de las asignaturas Terico-

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Prcticas. La calificacin de la Enseanza Experimental no aparecer en listas hasta que se liquide el


adeudo de acuerdo a las especificaciones mencionadas en este reglamento.

7. SOLICITUD DE EQUIPO E INSTRUMENTOS


La solicitud del uso del equipo e instrumentos, as como la bitcora de uso, deber llevar la firma del
alumno y al menos uno de los profesores de la asignatura como co-responsable del equipo, quien deber
sealar a los estudiantes el uso de tales equipos e instrumentos y supervisar en todo momento que el
estudiante lo est utilizando adecuadamente. Al finalizar las actividades prcticas, los equipos e
instrumentos se entregarn en el mismo estado en que se recibieron. No olvide recoger la papeleta de
SOLICITUD DE MATERIAL que firm. En caso de haber perdido o roto alguno de los insumos del
equipo o instrumento, el alumno deber llenar correctamente, firmar y entregar al laboratorista un VALE
DE ADEUDO DE MATERIAL de acuerdo con las instrucciones que en su momento se le indique en la
Coordinacin de los laboratorios de docencia.

Atentamente: JEFATURA DEL DEPARTAMENTO DE FARMACIA

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REPORTE DE SEGURIDAD E HIGIENE


Fecha: Grupo : Equipo: Responsable:
Guin:
Integrantes:

UTILIZACIN DE REACTIVOS
Observaciones anormales
Cantidad empleada
Reactivo (contaminado, ms de una fase, coloracin
(por equipo)
anormal, precipitados)

VIGILANCIA DE EQUIPO
Observaciones
Condiciones de uso
1 (Sucio, no funciona
Hora de (Cantidad pesada , longitud de
2 3 4 adecuadamente, sin
inicio de onda , rpm , tiempo ,
Equipo 5 observaciones). Anotar el
uso/ temperatura , disolvente
6 7 nmero de equipo o inventario
trmino utilizado , aumento ,
8 cuando considere que requiere
volumen )
mantenimiento
1
Balanza
2
Espectrofotmetro
3,4
Centrfuga
3,4
Microcentrfuga
4,5
Estufa
5,6
Rotaevaporador
7
Microscopio
2
Lmpara de luz UV
4,5
Incubadora

TRATAMIENTO DE RESIDUOS
Observaciones
+
Residuo (R) (contenido, estado fsico, si hay ms de una fase o tiene CRETIB
precipitado)
CR E T I B
CR E T I B
CR E T I B
CR E T I B
CR E T I B
+
Marque con una X, la(s) letra(s) correspondiente de acuerdo al sistema CRETIB (Corrosivo, Reactivo,
Explosivo, Txico, Inflamable, Biolgico-Infeccioso)

_______________________________________________________________
(Nombre y firma del encargado de seguridad)

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HOJA DE SEGURIDAD DE REACTIVOS

Investigue los siguientes datos (MSDS, Merck Index) y complete las siguientes tablas para cada sustancia a
emplear. Posteriormente, en el Rombo de comunicacin de riesgos, indique el valor de 0 a 4, correspondiente a
cada riesgo (Salud, Inflamabilidad, Reactividad y Caractersticas especficas) de acuerdo con la Clasificacin y
grados de riesgo de las sustancias peligrosas (ANEXO 1 DEL REPORTE DE SEGURIDAD E HIGIENE).

Reactivo:
DL50/CL50 (rata):
Punto de ignicin:
Reactividad / Incompatibilidad:
Caractersticas especficas:
Equipo de proteccin personal:

Reactivo:
DL50/CL50 (rata):
Punto de ignicin:
Reactividad / Incompatibilidad:
Caractersticas especficas:
Equipo de proteccin personal:

Reactivo:
DL50/CL50 (rata):
Punto de ignicin:
Reactividad / Incompatibilidad:
Caractersticas especficas:
Equipo de proteccin personal:

Reactivo:
DL50/CL50 (rata):
Punto de ignicin:
Reactividad / Incompatibilidad:
Caractersticas especficas:
Equipo de proteccin personal:

Reactivo:
DL50/CL50 (rata):
Punto de ignicin:
Reactividad / Incompatibilidad:
Caractersticas especficas:
Equipo de proteccin personal:

En Equipo de proteccin personal indique la(s) letra(s) de identificacin correspondiente(s) con base en la
tabla del ANEXO 1.

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ANEXO 1 DEL REPORTE DE SEGURIDAD E HIGIENE


CLASIFICACIN Y GRADOS DE RIESGO DE LAS SUSTANCIA QUMICAS

LETRAS DE IDENTIFICACIN PARA EL EQUIPO DE PROTECCIN PERSONAL


Letra Equipo de proteccin personal
A Anteojos de seguridad
B Anteojos de seguridad y guantes
C Anteojos de seguridad, guantes y mandil
D Careta, guantes y mandil
E Anteojos de seguridad, guantes y respirador para polvos
F Anteojos de seguridad, guantes, mandil y respirador para vapores
G Anteojos de seguridad, guantes y respirador para vapores
H Gafas de seguridad para salpicaduras, guantes, mandil y respirador para vapores
I Anteojos de seguridad, guantes y respirador para polvos y vapores
Gafas de seguridad para salpicaduras, guantes, mandil y respirador para polvos y
J
vapores
Capucha con lnea de aire o equipo SCBA, guantes, traje completo de proteccin y
K
botas
Consulte con el supervisor las indicaciones especiales para el manejo de estas
X
sustancias

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Efecto txico de plomo en ratas
HOJA DE VALORACIN PARA LA EVALUACIN DEL BIENESTAR DE LOS ANIMALES DE EXPERIMENTACIN
Debido a que el trabajo experimental del guin se desarrollar en cuatro sesiones de laboratorio y en tres de ellas, los animales de
experimentacin sern administrados con acetato de plomo va intraperitoneal, por recomendacin expresa del CICUAL, se realizar la
revisin de los mismos posterior a la administracin del xenobitico. Para tal efecto, debern reportar las caractersticas enunciadas en los
recuadros presentados a continuacin, con la finalidad de identificar a los animales que puedan presentar dao provocado por una
inadecuada administracin del acetato de plomo. En caso de detectar cualquier dao se deber reportar a los profesores de laboratorio,
para que se realice la eutanasia1 del animal.

Fecha de inicio:_______________________ Fecha de trmino: ______________________________

Fecha
Macroequipo responsable
Hora
2
Actividad
3
Aislado
3
Pelo erizado
4
Frecuencia de respiracin
Acicalamiento en el punto de
3
administracin
Presencia de herida o irritacin
3
en la zona de aplicacin
Inquisitivo o alerta al momento
3
de sujetarlo
3
Orificios sucios (diarrea u orina)
3
Coloracin anormal de los ojos
3
Extremidades azules
Observaciones adicionales:

Nombre del revisor


1. Se recomienda recuperar 3 mL de sangre y guardarla en un tubo heparinizado.
2. En caso de que uno o varios animales presenten poca actividad con respecto a la del control, anote los nmeros de las ratas correspondientes.
3. En caso de que la respuesta sea S, anote el nmero de rata. Compare con los animales control.
4. (#Rata) + R = rpida; D = dbil. Compare con los animales control.
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IDENTIFICACIN Y CUANTIFICACIN DE TXICOS NO VOLTILES EN UNA MUESTRA


PROBLEMA

OBJETIVOS ACADMICOS

Que el alumno emplee mtodos de extraccin cida y bsica para separar txicos no voltiles de naturaleza
cida y bsica en una muestra problema.
Que el alumno emplee reacciones coloridas y cromatografa en capa fina (CCF) para la identificacin de
txicos no voltiles en una muestra problema.
Que el alumno cuantifique un txico no voltil en una muestra problema.

PROBLEMA

Separar e identificar escopolamina, paracetamol, cido 4-hidroxibenzoico y cido barbitrico de una muestra
problema; y cuantificar el cido barbitrico presente.

REACTIVOS

Hidrxido de amonio (NH4OH) Solucin de NaOH al 10%*


Metanol (MeOH) Acetato de etilo (AcOEt)
cido actico glacial (AcOH) Escopolamina
Reactivo de Dragendorff * Diclorometano (CH2Cl2)
Reactivo de Dille-Koppanyi * cido barbitrico
Paracetamol cido 4-hidroxibenzoico
cido tartrico * Solucin acuosa de cido actico 2 M*
Solucin saturada de nitrito de sodio (NaNO2) * cido clorhdrico (HCl) concentrado
cido clorhidrico 1N* Sulfato de sodio anhdro (Na2SO4)
Acetato de etilo (AcOEt) Solucin de NaHCO3 al 10%
*Ver APNDICE II

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EQUIPO
Rotaevaporador Bomba de aspersin
Lmpara de luz ultravioleta Espectrofotmetro
Parrilla de calentamiento

MATERIAL POR EQUIPO (Primera sesin)


Embudos de separacin de 250 mL 2 Agitador de vidrio 1
Embudos de cola corta 2 Probetas de 10 mL 2
Matraces Erlenmeyer de 125 mL 6 Pipetas graduadas de 10 mL 2
Matraces de bola de 50 mL 2 Anillos metlico 2
Vasos de precipitado de 250 mL 5 Tubos de ensayo 8
Vasos de precipitados de 100 mL 4 Anillos de corcho 2
Vidrios de reloj de 9 cm 2 Pipetas Pasteur 4

MATERIAL PARA LA CURVA (primera sesin)


Matraz volumtrico de 25 mL 1 Pipeta volumtrica de 4 mL 1
Matraces volumtricos de 10 mL 4 Micropipeta de 100- 1
Pipetas volumtricas de 5 mL 2

MATERIAL POR EQUIPO (segunda sesin)


Cromatoplacas 1 Tubos capilares 3
Vasos de precipitados de 100 mL 4 Pipetas graduadas de 10 mL 2

Nota: El profesor proporcionar las celdas para las lecturas.

DESARROLLO EXPERIMENTAL

El profesor proporcionar una muestra problema de 30 mL, la cual contiene los txicos no voltiles
escopolamina, paracetamol, cido 4-hidroxibenzoico y cido barbitrico.

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PRIMERA SESIN

A) EXTRACCIN CIDA

1. A 15 mL de la muestra problema se agrega una solucin acuosa de cido tartrico al 10% hasta llegar a
pH = 2. La muestra acidificada se trasvasa a un embudo de separacin y se extrae con dos porciones
de 15 mL de AcOEt; se colectan las fases orgnicas y se renen en un matraz. Guardar y etiquetar la fase
orgnica y la acuosa y tratar segn lo indicado en los incisos 2 y 3 respectivamente.
2. Tratamiento de la fase orgnica:
2.1 La fase orgnica se extrae con dos porciones de 15 mL de una solucin de bicarbonato de sodio
(NaHCO3) al 10%; reunir las fases acuosas en un matraz y tratarlas de acuerdo con lo indicado en el
inciso 2.3.
2.2 A la fase orgnica obtenida en el inciso 2.1 se le adiciona sulfato de sodio anhidro para eliminar el
exceso de agua en la muestra, posteriormente la fase orgnica se filtra a travs de algodn y se
concentra in vacuo; el residuo final se reconstituye con 2 mL de AcOEt. Etiquetar como fraccin A1.
2.3 La fase acuosa que se reuni en el inciso 2.1 se acidifica con HCl concentrado hasta llegar a un pH = 1 y,
posteriormente, se extrae con dos porciones de 15 mL de AcOEt; las fases orgnicas se renen en
un matraz, se elimina el exceso de agua adicionando sulfato de sodio anhidro y filtrando a travs de
algodn, finalmente la fase orgnica se concentra in vacuo y el residuo obtenido se reconstituye con
2 mL de AcOEt. Etiquetar como fraccin A2.

Nota:La fase acuosa se desecha de acuerdo con lo indicado en R0 (Apndice


disposicin de residuos).

3. Tratamiento de la fase acuosa:


3.1 Adicionar gota a gota (aproximadamente 5 gotas), una solucin de NaOH al 10% hasta pH = 10. La
solucin bsica se trasvasa a un embudo de separacin y se extrae con dos porciones de 15 mL de
CH2Cl2; las fases orgnicas se renen en un matraz, se seca sobre sulfato de sodio anhidro, se
concentra in vacuo y el residuo final se reconstituye con 2 mL de CH2Cl2. Etiquetar como fraccin A3.

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3.2 A la fase acuosa obtenida en el inciso 3.1, se adiciona gota a gota, HCl concentrado hasta llegar a
pH = 2. Etiquetar como fraccin A4.

4. Tomar 2 mL de la fraccin A4 y llevar a sequedad con ayuda de una parrilla de calentamiento; el residuo
obtenido se reconstituye con 2 mL de MeOH y se conserva para su posterior anlisis con las pruebas de
identificacin.
5. El remanente de la fraccin A4 se conserva para la cuantificacin de cido barbitrico de acuerdo al
procedimiento indicado en el apartado C (cuantificacin).

B) EXTRACCION BSICA

1. A 15 mL de la muestra problema se agrega gota a gota una solucin de NaOH al 10% hasta llegar a
un pH = 10 (aproximadamente 10 gotas). La solucin bsica se trasvasa a un embudo de separacin y se
extrae con dos porciones de 15 mL de CH2Cl2; se separan las fases orgnicas y renen en un matraz.
Guardar y etiquetar la fase orgnica y la acuosa y tratar segn lo indicado en los incisos 2 y 3,
respectivamente.
2. Tratamiento de la fase orgnica:
Adicionar sulfato de sodio anhidro para eliminar el exceso de agua, filtrar sobre algodn y concentra in
vacuo. El residuo obtenido se reconstituye en 2 mL de MeOH. Etiquetar como fraccin B3.
3. Tratamiento de la fase acuosa:
3.1 Adicionar gota agota una solucin de HCl 1N hasta pH = 7. La solucin resultante se trasvasa a un
embudo de separacin y se extrae con dos porciones de 15 mL de AcOEt.
3.2 A la fase orgnica obtenida se le adiciona sulfato de sodio anhidro, se filtra a travs de algodn y se
concentra in vacuo, el residuo final se reconstituye en 2 mL de AcOEt. Etiquetar como fraccin B1.
3.3 La fase acuosa neutra del inciso 3 se lleva a pH = 2 adicionando HCl 1N, se trasvasa a un embudo
de separacin y se extrae con dos porciones de 15 mL de AcOEt. A la fase orgnica obtenida se le
agrega sulfato de sodio anhidro, se filtra a travs de algodn, se concentra a presin reducida y el
residuo final se reconstituye en 2 mL de AcOEt. Etiquetar como fraccin B2.
3.4 La fase acuosa remanente de la extraccin anterior, se etiqueta como fraccin B4.
4. Tomar 2 mL de la fraccin B4 y llevar a sequedad con ayuda de una parrilla de calentamiento; el residuo
obtenido se reconstituye en 2 mL de MeOH y se conserva para su posterior anlisis.
5. El remanente de la fraccin B4 se conserva para la cuantificacin de cido barbitrico.

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Nota: El disolvente recuperado al final de la concentracin in vacuo se


depositar en el contenedor etiquetado como R1 para A3 y B3 y en R2 para A1-2
y B1-2. Los residuos de sulfato de sodio anhidro se depositan en el contenedor
etiquetado como R3.

C) CUANTIFICACIN DE CIDO BARBITRICO

PREPARACIN DE LA CURVA PATRN DE CIDO BARBITRICO

La curva patrn de cido barbitrico se prepara colocando en matraces volumtricos de 10 mL los volmenes de
la solucin patrn de cido barbitrico indicados en la Tabla 1 y llevando al aforo con agua destilada:

Tabla 1. Curva patrn de cido barbitrico.


Nm. de tubo Alcuota de la Concentracin
solucin patrn de cido barbitrico (mL) de cido barbitrico (mg/mL)
1 0.0 BLANCO
2 1.5 0.45
3 3 0.90
4 6 1.80
5 8 2.40

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TRATAMIENTO DE LAS FRACCIONES QUE CONTIENEN CIDO BARBITRICO: MUESTRA


PROBLEMA, CURVA PATRN Y BLANCO

1. Colocar en tubos de ensaye 1 mL de cada una de las fracciones que contienen cido barbitrico (muestra
problema, curva patrn y blanco).
2. Adicionar a cada uno de los tubos de ensaye 0.5 mL de la solucin saturada de NaNO2, 0.1 mL de la
solucin de AcOH 2M y 2.4 mL de agua destilada.
3. Determinar la absorbancia de cada una de las muestras en el espectrofotmetro a 530 nm, utilizando como
blanco el tubo nmero 1 de la curva (ver Tabla 1).
4. Despus de haber realizado la lectura de cada una de las muestras colocarlas en un contenedor etiquetado
como R12.

SEGUNDA SESIN

D) IDENTIFICACIN

Cromatografa en capa fina

Solicitar a los profesores 4 placas para cromatografa en capa fina (CCF). Los anlisis por CCF se realizan en
cromatoplaca de 5 cm X 2.5 cm, que consisten en placas de aluminio recubiertas con una capa de gel de slice
(slica Kieselgel 60 F254 Merck).

1. Previamente, se aplicar en el lado izquierdo de una cromatoplaca (placa 1) la referencia de escopolamina;


en la placa 2, la de cido barbitrico; en la placa 3, la referencia de paracetamol, y en la 4, la de cido 4-
hidroxibenzoico. Colocar la muestra de los residuos reconstituidos previamente aplicndolas en el lado
derecho de cada una de las placas de acuerdo col siguiente esquema.

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Lmite de elucin 0.3 cm

Rf= d1/d2

d2

d1

Ref Mta1 Mta2 0.5 cm

Ref = alcaloide o barbitrico


Mta = Reconstituido
Esquema 1. CCF de las muestras en estudio.

2. Para la identificacin de la escopolamina emplear como sistema de elucin una mezcla de CH2Cl2-MeOH-
NH4OH (9:1:0.1).

Nota: Para preparar este sistema de elucin es necesario mezclar el hidrxido de


amonio y metanol y, posteriormente, verter la mezcla resultante en el CH2Cl2.

3. Para la identificacin del cido barbitrico emplear como sistema de elucin una mezcla de
AcOEt-MeOH-AcOH glacial (7:2:1). Agitar vigorosamente la fase mvil antes de eluir la placa.
4. Para la identificacin de paracetamol utilizar como sistema de elucin una mezcla de CH 2 Cl 2 -
MeOH (9:1).
5. Para la identificacin de cido 4-hidroxibenzoico utilizar como sistema de elucin una mezcla de CH2Cl2-
MeOH (9:1) + 10 gotas de AcOH glacial, por cada 10 mL de mezcla.
6. Saturar las cmaras durante 10 minutos antes de eluir las muestras en las cromatoplacas.
7. Eluir hasta la lnea lmite de elucin indicada en el Esquema 1.
8. Visualizar la presencia de las sustancias con una lmpara de luz U.V. a 254 nm y posteriormente, revelar
las cromatoplacas utilizando la solucin etiquetada como solucin reveladora de reactivo de Dragendorff

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para el caso del alcaloide (escopolamina), con una cmara de yodo para el cido barbitrico, y con sulfato
crico amoniacal/H2SO4 para el paracetamol y cido 4-hidroxibenzoico.
9. Calcular el factor de retencin (Rf ) para cada sustancia de acuerdo con el Esquema 1 y comparar el valor
obtenido con el de la referencia correspondiente.
10. Una vez identificados las sustancias, desechar los sistemas de elucin de la siguiente forma: depositar la
mezcla CH2Cl2-MeOH-NH4OH (9:1:0.1) en el contenedor etiquetado como R4; depositar la mezcla
AcOEt-MeOH-AcOH glacial (7:2:1) en el contenedor etiquetado como R5; depositar las mezclas que
contengan CH2Cl2-MeOH-AcOH en el contenedor etiquetado como R6. Depositar las cromatoplacas en
una bolsa de plstico etiquetada como R7.

Identificacin por reacciones de color

Con el excedente de las fracciones reconstituidas realizar los ensayos respectivos.

Escopolamina: reactivo de Dragendorff

1. Colocar 10 gotas de la fraccin reconstituida correspondiente a escopolamina en un tubo de ensayo y


agregar 2 gotas de solucin reveladora de Dragendorff.
2. Realizar un control positivo con la muestra de referencia y un control negativo con CH 2Cl2 para esta
reaccin.

Barbitricos: reactivo de Dille-Koppanyi

1. Colocar 10 gotas de la fraccin reconstituida correspondiente a barbitricos en un tubo y agregar dos gotas
del reactivo A y una gota del reactivo B (Dille-Koppanyi).
2. Realizar un control positivo con la muestra de referencia y un control negativo con MeOH para esta
reaccin.
3. Una vez identificadas TODAS las fracciones desechar de la siguiente manera: depositar las fracciones A4,
B4 y los residuos de la reaccin de Dille-Koppanyi en el contenedor etiquetado como R8. Depositar las
fracciones A3, B3 y los residuos de la reaccin de Dragendorff en el contenedor etiquetado como R9.

Nota: Los residuos de paracetamol y cido 4-hidroxibenzoico se depositarn en los


contenedores etiquetados como R10 y R11, respectivamente.

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CUESTIONARIO

1. En el caso de emplear una muestra biolgica indique cul es el objetivo de adicionar cido tartrico
adems de ajustar el pH?

________________________________________________________________________________

2. Una vez desarrollado el guin, qu puntos del proceso y propiedades fisicoqumicas considera que son
crticos para la extraccin eficiente de un xenobitico?

________________________________________________________________________________

3. Reporte en la siguiente tabla los resultados que obtuvo en las pruebas de identificacin. Marque con una
cruz si la reaccin fue positiva y un guin si fue negativa.

Tabla 1. Resultados de las pruebas de identificacin.

Referencia Residuo Referencia Residuo


escopolamina reconstituido barbitrico reconstituido
de de cido
escopolamina barbitrico
Dragendorff Dille-Koppanyi
Rf Rf

4. Indique si su muestra contena cido barbitrico. Explique su respuesta.

________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________________

5. Indique si su muestra contena escopolamina. Explique su respuesta.

________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________________
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6. Indique si su muestra contena cido 4-hidroxibenzoico y paracetamol. Explique su respuesta.

________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________

7. En la extraccin en medio cido cul es la finalidad de utilizar la solucin de NaHCO3 al 10%?

________________________________________________________________________________________________

8. Cules son los puntos que considera crticos para la adecuada identificacin de los componentes en la
muestra problema? Explique su respuesta.

________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________

9. Reporte en la siguiente tabla los valores de absorbancia obtenidos e indique los valores de la regresin
lineal.

Tabla 1. Absorbancias de la curva patrn.


Concentracin de cido
Absorbancia
barbitrico [mg/mL]
0.0
0.45
0.9
1.8
2.4
Pendiente (m)
Ordenada al origen (b)
Coeficiente de correlacin (r)

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10. Interpole los valores de absorbancia en la curva y calcule la concentracin de cido barbitrico en la
muestra. Indique el procedimiento.
___________________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________________

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Clark E.E. Isolation and Identification of Drugs. Vol. I y II. Pharmaceutical Press, London, 1972.
Bowman W.C. y Rand M.J. Farmacologa. Bases Bioqumicas y Patolgicas. (2 ed). Ed. Interamericana,
Mxico, 1984. pp 42.25-42.32.
Blanke R.V. y Decker W.J. Analysis of Toxic substances. En Burtis C.A., Edward R.A. (Eds.) Textbook of
clinical chemistry. Saunders, Philadelphia, 1986. pp 1670-1744.
Benko A. (1985). Toxicological Analysis of Amobarbital and Glutethimide from Bone Tissue. Journal of
Forensic Sciences 30, 708-714,
Cochin, J., Daly, J.W. (1963). The Use of Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Drugs. Isolation and
Identification of Barbiturates and Nonbarbiturates Hypnotics from Urine, Blood and Tissues. Journal of
Pharmacology and Experimental Therapeutics 139, 154-159.
Bruneton J. Alcaloides, Generalidades. En: Farmacognosia. Fitoquimica, Plantas Medicinales. Ed. Acribia,
Zaragoza, Espaa, 2001, pp 775-792.
Aydn, A., Ercan ., Tacolu S. (2005). A novel method for the spectrophotometric determination of nitrite in
water. Talanta 66, 1181-1186.

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APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS

1. Efectos txicos de la escopolamina, cido barbitrico, cido 4-hidroxibenzoico y paracetamol.


2. Relacin del grado de disociacin de una sustancia con el pH del medio en el que se encuentra disuelto en
funcin del valor de su pKa.
3. Valores de pKa de la escopolamina, cido barbitrico, cido 4-hidroxibenzoico y paracetamol.
4. Forma ionizada y no ionizada de cada uno de ellos.
5. Solubilidad de una sustancia inica en medio acuoso y en un disolvente orgnico.
6. Densidad de los disolventes a emplear.
7. Fundamento de una extraccin mltiple y selectiva.
8. Sustancias que pueden precipitar protenas.
9. Especificar las especies qumicas que se encuentran en cada una de las fases obtenidas en los tratamientos
cido y bsico.
10. Objetivo de adicionar una solucin de NaOH 2.5 N en el proceso de extraccin cida.
11. Objetivo de adicionar una solucin de HCl 1 N en el proceso de extraccin bsica.
12. Fundamento y esquema de la reaccin de Dragendorff.
13. Fundamento y esquema de la reaccin de Dille-Koppanyi.
14. Fundamento de cromatografa en capa fina como herramienta de identificacin de sustancias qumicas
utilizando luz UV, yodo y reactivo de Dragendorff como agentes reveladores.
15. Reaccin involucrada en la cuantificacin de cido barbitrico.
16. Ley de Lambert y Beer.
17. Sugiera un esquema de separacin para la siguiente mezcla de sustancias no voltiles, indicando los
reactivos y disolventes utilizados, los valores de pH y la naturaleza de las sustancias durante las diferentes
etapas del proceso.

COOH HO OH
CH3
NH-CH3
O
HO OH CH3
OH

cido glico [A, pKa 3.0] cido propanico [B, pKa 4.36] Efedrina [C, pKa 9.36]

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APNDICE II: PREPARACIN DE REACTIVOS

Solucin de sulfato crico amoniacal en cido sulfrico

Pesar 12 g de sulfato crico amoniacal y adicionarlos lentamente y con agitacin constante sobre 350 g de hielo,
posteriormente, adicionar 12.5 mL de H2SO4 concentrado manteniendo la agitacin. Una vez obtenida la
solucin se filtra a travs de algodn. Guardar la solucin anterior en un frasco mbar.

Reactivo de Dragendorff (solucin reveladora)

Solubilizar 2.6 g de carbonato de bismuto y 7.0 g de yoduro de sodio en 25 mL de cido actico glacial, calentar
por 10 minutos a 40 oC para solubilizar el reactivo. Dejar reposar por 12 horas y posteriormente filtrar la
solucin. 20 mL del filtrado (solucin rojo-caf) se mezclan con 8 mL de acetato de etilo, la solucin anterior
guardarla en un frasco mbar (la cual es estable por 6 meses).

Reactivo A (Dille-Koppanyi)

Solubilizar 1 g de acetato de cobalto tetrahidratado en 100 mL de metanol absoluto.

Reactivo B (Dille-Koppanyi)

Mezclar 5.0 mL de isopropilamina con 95 mL de metanol absoluto

Solucin de hidrxido de sodio al 10%

Disolver 10 g de NaOH en 100 mL de agua destilada.

Solucin de cido clorhdrico 1 N

Colocar 83 mL de HCl concentrado en un matraz aforado y adicionar agua destilada hasta 1 L.

Solucin de cido tartrico al 10%

Colocar 10 g en 100 mL de agua destilada.

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Solucin patrn de cido barbitrico 3 mg/mL

Pesar 75.0 mg de cido barbitrico y transferir la pasada cuidadosamente a un matraz volumtrico de 25 mL,
llevar al aforo con agua destilada.

Solucin saturada de nitrito de sodio (NaNO2)

Pesar 82 g de NaNO2 y disolver en 100 mL de agua destilada.

Solucin de cido actico 2 M

Medir 1.14 mL de cido actico glacial (densidad 1.049 g/mL) y agregarlos a 5 mL de agua, vaciar en un matraz
volumtrico de 10 mL y aforar en seguida con agua destilada.

APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS

R0: Residuo acuoso extraccin cida. Desechar en la tarja.


R1: Residuos de escopolamina en diclorometano.
R2: Residuos de acetato de etilo.
R3: Sulfato de sodio anhidro.
R4: Mezcla CH2Cl2-MeOH (9:1) + 7 gotas de NH4OH.
R5: Mezcla MeOH-acetato de etilo-cido actico.
R6: Mezcla CH2Cl2-MeOH-cido actico.
R7: Cromatoplacas.
R8: Reactivo de Dille-Koppanyi, cido barbitrico (fracciones A4 y B4), acetona y MeOH.
R9: Reactivo de Dragendorff, escopolamina (fracciones A3 y B3), CH2Cl2 y MeOH.
R10: Residuos de paracetamol.
R11: cido 4-hidroxibenzoico.
R12: cido barbitrico, NaNO2, AcOH, acetona y MeOH.

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CUANTIFICACIN DE CIANURO DE HIDRGENO, COMO TXICO VOLTIL,


A PARTIR DE GLUCSIDOS CIANOGNICOS

OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno determine la cantidad de cianuro de hidrgeno liberado a partir de glucsidos cianognicos
presentes en muestras que forman parte de la dieta de humanos y animales, y relacione la concentracin con su
potencial toxicolgico.

PROBLEMA
Que el alumno cuantifique la concentracin de cianuro de hidrgeno presente en una serie de 2 muestras de
semillas o plantas, y concluya cul de estas muestras presentan riesgo de toxicidad para el humano, con base en
la cantidad de HCN que est presente en el consumo de 100 g de muestra.

REACTIVOS
Reactivo de Guignard * cido clorhdrico * (HCl)
Cianuro de potasio * (KCN) Cloroformo (CHCl3)
Carbonato de sodio (Na2CO3) cido pcrico
* VER APNDICE II

EQUIPO
Espectrofotmetro Termmetro
Estufa

MATERIAL POR EQUIPO


Tubos de ensaye 20 x150 con tapn de hule 3 Tijeras 1
Cajas Petri 1 Pinzas 1
Mortero con pistilo 1 Navaja (traer por equipo) 1
Tiras de papel filtro cualitativo (filtracin rpida) Matraces Erlenmeyer de 250 mL con tapn de
de 2 x 10 cm 3 hule 3
Pipeta volumtrica de 25 mL 1 Pipeta graduada de 1 mL 1
Probeta de 50 mL 1 Embudo de cola corta 3
Vasos de precipitado de 100 mL 3 Hielo (proporcionado por laboratorista)

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MATERIAL PARA LA CURVA


Matraces Erlenmeyer de 250 mL con tapn de hule 6
Matraces volumtricos de 25 mL 6
Pipeta graduada de 1 mL 1
Tubos de ensaye 20 x 150 con tapn de hule 6
Papel filtro (tiras de 2 x 10 cm) 6

Nota: El profesor proporcionar las celdas para las lecturas

MATERIAL DE ESTUDIO
Traer por equipo aproximadamente 1 g de una de las siguientes semillas: durazno, manzana roja, ciruela pasa,
lima, capuln, cerezas, mamey o pern.

DESARROLLO EXPERIMENTAL
Cada equipo trabajar con 2 muestras problema de semillas segn la lista mencionada, una de las cuales ser
proporcionada por el profesor.

Nota: La solucin patrn de cianuro de potasio, el cido clorhdrico 0.5 N y el agua


destilada deben de estar en bao de hielo antes de realizar la parte experimental.

PREPARACIN DE LA TIRA REACTIVA


1. Cortar 2 tiras de papel filtro de 2 x 10 cm. El equipo que prepare curva patrn de HCN deber preparar 6
tiras adicionales.
2. Sumergir las tiras de papel filtro en el reactivo de Guignard y escurrirlas, colocndolas para su secado
sobre una caja Petri.
3. Introducir las tiras en una estufa que se encuentre estable a una temperatura entre 50-55 oC, dejndolas
aproximadamente 10 min cuidando que estn humedecidas.

PREPARACIN DE LAS MUESTRAS

Nota: Antes de comenzar a triturar y pesar su muestra debern tener todos los
reactivos necesarios dentro del matraz, as como lista la tira reactiva, tanto para su
muestra como para la curva patrn.

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A cada una de las muestras se le realizar el siguiente procedimiento:


1. Medir 25 mL de agua destilada con pipeta volumtrica y agregarlos a un matraz Erlenmeyer de 250 mL,
colocar el matraz en bao de hielo.
2. Adicionar al matraz del inciso anterior 1 mL de solucin de HCl 0.5 N y dos gotas de CHCl3.
3. Poner con cuidado la tira reactiva de papel en el matraz como se indica en la Figura 1.
4. Tapar inmediatamente cada uno de los matraces Erlenmeyer con su tapn.
5. Pesar la cantidad de cada muestra de acuerdo al siguiente cuadro y colocarla en el mortero con la ayuda de
las pinzas de diseccin, posteriormente fragmentar las semillas con ayuda de una navaja y macerar la
muestra lo ms rpido posible.
Tabla 1. Pesos recomendados para la determinacin de cianuro en semillas o almendra.
Semilla o almendra Peso en mg
Manzana 250
Durazno 200
Pern 150
Capuln y cereza 30
Mamey 200
6. Colocar rpidamente la muestra fragmentada en el matraz Erlenmeyer de 250 mL y tapar
inmediatamente.
7. Introducir simultneamente en la estufa a 40C los matraces con las muestras problema y con los
correspondientes a la curva patrn de HCN durante 1 h. Agitar suavemente de manera oscilatoria cada 15
minutos.
TAPN DE HULE

PAPEL FILTRO
(TIRA REACTIVA)

MUESTRA

Figura 1. Preparacin de la muestra en el matraz y colocacin de la tira reactiva.


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PREPARACIN DE LA CURVA PATRN DE CIDO CIANHDRICO

La curva patrn de HCN se prepara colocando en matraces volumtricos de 25 mL los volmenes de la solucin
patrn de KCN indicados en la siguiente tabla y llevando al aforo con agua destilada:

Tabla 2. Curva patrn de HCN.


Alcuota de la solucin patrn Concentracin de HCN
de KCN (mL) (g/mL)
0.0 Blanco
0.1 0.4
0.2 0.8
0.3 1.2
0.4 1.6
0.5 2

1. Colocar con cuidado la tira reactiva en el matraz como se indica en la Figura 1 y agregar a cada
matraz 1 mL de la solucin de HCl 0.5 N y dos gotas de CHCl3, cuidando de no mojar la tira. Tapar
inmediatamente cada uno de los matraces Erlenmeyer con su tapn despus de concluir este
procedimiento.
2. Una vez preparadas las soluciones de la curva patrn, pasarlas inmediatamente a matraces Erlenmeyer de
250 mL, debidamente etiquetados y colocarlos en bao de hielo.
3. Introducir simultneamente en la estufa a 40C los matraces con las muestras problema y los
correspondientes a la curva patrn de HCN durante 1 h.

TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS PROBLEMA, CURVA PATRN Y BLANCO

1. Transcurrido el tiempo de incubacin, los matraces se sacan de la estufa y se dejan enfriar. Decantar el
contenido del matraz y colocar el residuo lquido en un contenedor etiquetado como R1. El material
vegetal se deja secar en la campana sobre papel peridico para ser desechado posteriormente.

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2. Introducir en un tubo de ensaye la tira reactiva positiva (procedente de muestra problema, curva estndar o
blanco) adicionar al tubo 20 mL de agua destilada con pipeta volumtrica, tapar el tubo y agitar
vigorosamente. Filtrar la solucin con papel filtro para eliminar residuos de la tira de papel. Colocar las
tiras en una bolsa de plstico etiquetada como R3.
3. Determinar la absorbancia de la muestra y de la curva patrn en el espectrofotmetro a 520 nm, utilizando
como blanco el primer punto de la curva.
4. Despus de haber realizado la lectura y una vez obtenido resultados, la mezcla se coloca en un contenedor
etiquetado como R2.

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CUESTIONARIO
1. Reporte en la siguiente tabla los valores de absorbancia obtenidos, e indique los valores de la regresin
lineal.

Tabla 1. Absorbancias de la curva patrn.


HCN
Absorbancia
[g/mL]
0.4
0.8
1.2
1.6
2
Pendiente (m)
Ordenada al origen (b)
Coeficiente de correlacin lineal (r)

2. Interpole sus valores de absorbancia en la curva y calcule la concentracin de HCN en mg/100g de


muestra, indicando el procedimiento realizado para esta determinacin.

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3. Reporte los resultados obtenidos en su grupo y llene la siguiente tabla:


Tabla 2. Resultados grupales.
Material Concentracin de HCN mg HCN/100 g de Riesgo de
Equipo
vegetal (g/mL) muestra toxicidad*

10

* alto 10 mg/100g de muestra; bajo < 10 mg/100g de muestra

4. Indique cules muestras representan un riesgo potencial en caso de consumo.


___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________

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5. Cmo podra eliminar la presencia de glucsidos cianognicos de sus muestras?


_________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

6. Proponga un mtodo para extraer txicos voltiles a partir de una muestra.


__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Conn, E.E. (1969). Cyanogenic glucosides. Journal of Agricultural and Food Chemistry 17, 519-526.
Conn, E.E.; Cyanogenic glucosides. En: Toxicants ocurring naturally in foods. (2 ed). National Academy of
Sciences, Washington, D.C., 1973, pp 290-308.
Eyjolfsson, R. (1970). Recent Advances in chemistry of cyanogenic glucosides. Fortschritte der Chemie
Organischer Naturstoffe 28, 74-108.
Fabre, R. Y Truhaht, R. Tratado de toxicologa. Vol. I. Paraninfo, S.A., Madrid, 1976, pp 311-332.
Francisco, I.A. y Pimenta-Pinotti M.H. (2000). Cyanogenic Glycosides in Plants. Brazilian Archives of Biology
and Technology 43, 487-492.
Harborne, J.B. Cyanogenic glucosides and their function. En: Phytochemical ecology. Academic Press, London,
1972, 104-123.
Linder, E. Toxicologa de los alimentos. Ed. Acribia, Zaragoza, 1978, pp 15-19.
Lucas, B. Sotelo, A. (1984). A simplified test for the quantitation of cianogenic glucosides in wild and cultivated
seeds. Nutrition Reports International 29, 711-719
Montgomery, R.D. Cyanogens. En: Toxic constituent of plant foodstuff, Liener, IE, (Ed.) Academic Press, New
York, 1980, 143-160.
Speijers, G.J. y Egmoad, H.P. Natural Toxins III. Inherent Plant Toxins. En: International Food Safety
Handbook: Science, International Regulation, and Control. Younes, M., Fishbein, L., Miller, S., (Eds.).
Marcel Dekker, Inc, New York, 1999, pp 368-380.
Vetter, J. (2000). Plant cyanogenic glycosides. Toxicon 38, 11-36.

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APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS

1. Estructura de un glucsido cianognico.


2. Hidrlisis enzimtica de un glucsido cianognico.
3. Importancia toxicolgica de los glucsidos cianognicos.
4. Reaccin de Guignard para la deteccin de HCN.
5. Importancia que tiene durante la prctica que la fragmentacin de la muestra se realice rpidamente y sea
colocada en bao de hielo.
6. Razn por la cual la tira reactiva no debe tocar la solucin en que se encuentra la muestra.
7. Razn por la cual se da una reaccin positiva sin que la tira reactiva est en contacto con la muestra.
8. Razn por la cual es necesario colocar las soluciones de cianuro de potasio y el HCl 0.5 N empleadas en la
preparacin de la curva patrn en bao de hielo.
9. Propsito de agregar HCl y CHCl3 a la muestra y a la curva patrn.
10. Propsito de calentar la muestra a 40C en la estufa.

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APNDICE II: PREPARACIN DE SOLUCIONES

Reactivo de Guignard

Colocar 2.5 g de cido pcrico en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y disolver con 200 mL de agua destilada.
Enseguida agregar 12.5 g de carbonato de sodio (Na2CO3) y agitar cuidadosamente para disolverlo. Llevar la
solucin a un volumen de 500 mL con agua destilada.

Nota: Manejar con cuidado el cido pcrico, ya que esta sustancia es cancergena y se
absorbe fcilmente por la piel.

Solucin patrn de cianuro de potasio (KCN)

Se pesa exactamente 12.05 mg de KCN transferir la pesada cuidadosamente a un matraz aforado de 50 mL,
disolver y aforar con agua destilada.

Nota: A pesar de que la concentracin utilizada de KCN en este guin es de


aproximadamente 0.24 mg/mL y esta concentracin est por debajo de la DL50 en
ratones, no deber descuidar las medidas de seguridad para su trabajo.

Solucin de cido clorhdrico 0.5 N (HCl)

Medir 42.5 mL de HCl concentrado (densidad: 36.46g/100 mL) y vaciar a un matraz volumtrico de 1000 mL
que contiene aproximadamente 500 mL de agua destilada, aforar enseguida con agua destilada.

APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS

R1: Solucin acuosa de HCl (0.5 N), KCl, KCN.


R2: Solucin de cido pcrico, Na2CO3, residuos de isopurpurina.
R3: Tiras de papel filtro impregnadas con cido pcrico.

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DETERMINACIN DEL MECANISMO DE ACCIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE


DE COMPUESTOS DE ORIGEN NATURAL

OBJETIVO ACADMICO

Que el alumno sea capaz de determinar el mecanismo de accin mediante el cual un compuesto de origen natural
ejerce efecto antioxidante.

PROBLEMA
Determinar el mecanismo antioxidante de una sustancia qumica a travs de la realizacin de las pruebas
de: 1. Inhibicin de la Xantina oxidasa, 2. Captura del radical superxido, 3. Captura de perxido de
hidrgeno y 4. Captura de radical hidroxilo.

REACTIVOS
Xantina (Xan) Solucin amortiguadora de carbonatos*
Xantina oxidasa (XO) cido etilendiaminotetraactico (EDTA)
Nitroazul de tetrazolio (NAT) Nitrato de cobre (II) (Cu(NO3)2)
Sulfato de amonio y hierro (II) hexahidratado Perxido de hidrgeno (H2O2)
(Fe(NH4)2(SO4)2 6H2O)
cido hexenico cido sulfrico (H2SO4)
Naranja de xilenol (NX) Butil hidroxitolueno (BHT)
Vainillina cido ferlico
Alopurinol
*Ver APNDICE II

MATERIAL POR EQUIPO DE 6 PERSONAS


Tubos Eppendorf de 1.5 mL 12 Gradilla para tubos Eppendorf 1
Micropipeta de 100-1000 l 1 Esptula de cromo nquel 1
Micropipeta de 10-100 l 1 Nave de pesado 1
Celda para la regin visible (desechable) 1 Matraces aforados de 250 mL 2
Celda para la regin U.V. (cuarzo) 1 Pipeta 1 mL 1
Matraces aforados de 10 mL 2 Pipeta 10 mL 1
Vasos de precipitados de 25 mL 2

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EQUIPO
Balanza analtica Bao Mara
Espectrofotmetro

DESARROLLO EXPERIMENTAL

A) Ensayo de inhibicin de la Xantina oxidasa empleando el sistema Xantina-Xantina oxidasa


(Xan-XO)

1. Los profesores indicarna cada equipo el antioxidante a evaluar.


2. Marcar 3 tubos Eppendorf como control negativo (C-), control positivo (C+), antioxidante, y blanco para
antioxidante.
3. Para los antioxidantes cido ferlico, alopurinol y vainillina preparar los tubos de acuerdo a la Tabla 1,
siguiendo el orden de adicin indicado en la columna titulada reactivo.

Tabla 1. Preparacin de los tubos problema y control.


Blanco para
Tubo Control negativo Control positivo Antioxidante
antioxidante
Reactivo ( L) ( L) ( L)
( L)
a. Xantina 1.5mM 100 100 100 100
b. EDTA 0.115mM 100 100 100 100
c. Solucin amortiguadora de
900 600 800 500
carbonatos 84 mM pH=10.19
d. Solucin acuosa de
- - 100 100
antioxidante 650 M
e. XO* - 300 - 300
VOLUMEN TOTAL 1100 1100 1100 1100
f. Agitar e Incubar ** 20 min 20 min 20 min 20 min
* Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversin, colocar
los tubos en una gradilla e incubarlos en bao mara a 27C durante 20 min.

4. Para el antioxidante BHT preparar los tubos de acuerdo a la Tabla 2, siguiendo el orden de adicin
indicado en la columna titulada reactivo.

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Tabla 2. Preparacin de los tubos problema y control para BHT.

Tubo Control negativo Control positivo Blanco para BHT BHT


Reactivo ( L) ( L) ( L) ( L)

a. Xantina 1.5mM 100 100 100 100


b. EDTA 0.115mM 100 100 100 100
c. Solucin amortiguadora de
850 550 800 500
carbonatos 84 mM pH=10.19
d. Metanol 50 50 - -
e. Solucin de BHT en
metanol/amortiguador de carbonatos - - 100 100
(1:2) 650 M
f. XO* - 300 - 300
VOLUMEN TOTAL 1100 1100 1100 1100
g. Agitar e Incubar ** 20 min 20 min 20 min 20 min
* Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversin,
colocar los tubos en una gradilla e incubarlos en bao Mara a 27C durante 20 min.

5. Transcurrido el tiempo de incubacin leer el contenido de los tubos a 295 nm con celda de cuarzo,
empleando el contenido del tubo Control negativo como blanco para medir el Control positivo. Para
mayor comprensin, leer espectrofotomtricamente el contenido de los tubos en el orden numrico que se
indica en la Tabla 3.

Tabla 3. Orden de lectura para la determinacin de cido rico.


Orden de lectura Blanco Muestra a leer
1 Control negativo (-)
2 Control positivo (+)
3 Blanco para antioxidante
4 Antioxidante

6. Interpretar los resultados obtenidos considerando que la absorbancia del control positivo representa el
100% de produccin de cido rico en el sistema Xan-XO de acuerdo a la siguiente frmula.
% inhibicin de la XO = 100 - [(AM) x 100/AC+]

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En donde:
AM= absorbancia de la muestra que contiene antioxidante
A C+= absorbancia del control positivo

7. Una vez obtenidos los resultados desechar el contenido de los tubos en un frasco etiquetado como R1.
8. Lavar las puntas de pipeta y tubos Eppendorf empleados con metanol, jabn y agua destilada; secarlos y
entregarlos al profesor. Depositar el agua y metanol empleado para enjuagar en el contenedor R1.

B) Ensayo de captura de radical superxido (O2-) empleando el sistema Xantina-Xantina


oxidasa-Nitroazul de tetrazolio (Xan-XO-NAT)

1. Marcar 3 tubos Eppendorf como control negativo (C-), control positivo (C+), y antioxidante.
2. Para los antioxidantes cido ferlico, alopurinol y vainillina preparar los tubos de acuerdo a la Tabla 4,
siguiendo el orden de adicin indicado en la columna titulada reactivo.
Tabla 4. Preparacin de los tubos problema y control para determinacin
de captura de radical superxido (O2-).
Control
Tubo Control Antioxidante
negativo
Reactivo positivo ( L) ( L)
( L)
a. Xantina 1.5Mm 100 100 100
b. EDTA 0.115Mm 100 100 100
c. Solucin amortiguadora de carbonatos 84
600 300 200
mM pH=10.19
d. NAT 0.1 M 300 300 300
e. Solucin acuosa de antioxidante 650M - - 100
f. XO* - 300 300
VOLUMEN TOTAL 1100 1100 1100
g. Agitar e Incubar ** 20 min 20 min 20 min
h. Cu(NO3)2 1.3 mM 200 200 200
VOLUMEN TOTAL FINAL 1300 1300 1300
* Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversin, colocar
los tubos en una gradilla e incubarlos en bao Mara a 27C.

3. Para el antioxidante BHT preparar los tubos de acuerdo a la Tabla 5, siguiendo el orden de adicin
indicado en la columna titulada reactivo.

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Tabla 5. Preparacin de los tubos problema y control para determinacin


de captura de radical superxido (O2-) empleando BHT.
Tubo Control Control Antioxidante BHT
Reactivo negativo ( L) positivo ( L) ( L)
a. Xantina 1.5mM 100 100 100
b. EDTA 0.115mM 100 100 100
c. Solucin amortiguadora de carbonatos 84 mM
550 250 200
pH=10.19
d. Metanol 50 50 -
e. NAT 0.1 M 300 300 300
f. BHT en metanol/amortiguador de carbonatos
- - 100
(1:2) 650M
g. XO* - 300 300
VOLUMEN TOTAL 1100 1100 1100
h. Agitar e Incubar ** 20 min 20 min 20 min
i. Cu(NO3)2 1.3 mM 200 200 200
VOLUMEN TOTAL FINAL 1300 1300 1300
* Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversin, colocar los tubos en una
gradilla e incubarlos en bao Mara a 27C.
Los profesores indicarn el antioxidante a evaluar

4. Transcurrido el tiempo de incubacin leer el contenido de los tubos a 560 nm empleando como blanco el
contenido del tubo etiquetado como control negativo.
5. Interpretar los resultados obtenidos considerando que la absorbancia del control positivo representa el
100% de formazn generado en el sistema Xan-XO-NAT de acuerdo a la siguiente frmula.
% de captura del radical superxido= 100 - [(AM) x100/AC+]

En donde:
AM= absorbancia de la muestra que contiene antioxidante
AC+= absorbancia del control positivo

6. Una vez obtenidos los resultados desechar el contenido de los tubos en un frasco etiquetado como R1.
7. Lavar las puntas de pipeta y tubos Eppendorf empleados con metanol, jabn y agua destilada; secarlos y
entregarlos al profesor. Depositar el agua y metanol empleado para enjuagar en el contenedor R1.

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C) Ensayo de Captura de perxido de hidrgeno (H2O2) y radical hidroxilo (-OH) empleando


el mtodo de FOX2 modificado.
1. Enjuagar con metanol los 5 tubos Eppendorf y marcarlos como blanco, control positivo H2O2, control
positivo - OH, Captura H2O2 y Captura -OH.
2. Preparar los tubos de acuerdo con la siguiente tabla, siguiendo el orden de adicin indicado en la columna
titulada reactivo.

Tabla 6. Preparacin de los tubos problema y control.


Control Captura H2O2 Captura -OH
Control
Tubo blanco positivo ( L) ( L)
positivo -
Reactivo ( L) OH
H2O2 ( L)
( L)
a. FOX-MeOH 900 900 900 - -
b. FOX-Antioxidante - - - 900 900
c. cido hexenico - - 40 - 40
d. H2O 100 80 40 80 40
e. H2O2* - 20 20 20 20
VOLUMEN TOTAL 1000 1000 1000 1000 1000
f. Agitar e Incubar ** 10 min 10 min 10 min 10 min 10 min
* Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversin, colocar los tubos en una
gradilla e incubarlos en bao Mara a 27C.

3. Transcurrido el tiempo de incubacin leer el contenido de los tubos a 560 nm empleando como blanco el
contenido del tubo etiquetado como blanco.
4. Interpretar los resultados obtenidos considerando que la absorbancia del tubo marcado como control
positivo de H2O2 representa el 100% del perxido de hidrgeno adicionado al sistema y el tubo marcado
como control positivo -OH representa el 100% del radical hidroxilo generado en el sistema.

% de captura de perxido de hidrgeno (H2O2) = 100 - [(AM) x100/AC+H2O2]

En donde:
AM= absorbancia del tubo marcado como Captura de H2O2
AC+H2O2 = absorbancia del tubo marcado como control positivo H2O2

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% de captura de radical hidroxilo (-OH) = 100 - [(AM) x100/AC+-OH ]


En donde:
AM = absorbancia del tubo marcado como Captura de -OH
AC+-OH = absorbancia del tubo marcado como control positivo -OH

5. Una vez obtenidos los resultados desechar el contenido de los tubos en un frasco etiquetado como R2.
6. Lavar las puntas de pipeta y tubos Eppendorf empleados con metanol, jabn y agua destilada; secarlos y
entregarlos al profesor. Depositar el agua y metanol empleado para enjuagar en el contenedor R2.

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CUESTIONARIO
1. Reporte sus resultados en la Tabla 1.
Tabla 1. Resultados por equipo.
Prueba Absorbancia Control Absorbancia de la muestra Porcentaje de
positivo (C+) antioxidante: ________________ actividad
antioxidante*
Inhibicin XO
Captura O2-
Captura H2O2
Captura -OH
*Calcular el porcentaje de inhibicin de XO o Captura de O20-, H2O2 o -OH segn sea el caso de acuerdo a las
ecuaciones presentadas en cada una de las secciones.

2. De acuerdo con los resultados de la Tabla 1, cul es el mecanismo de accin de la muestra de


antioxidante que analiz? Justifique su respuesta.
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________

3. Compare las absorbancias de los controles positivos para cptura de H2O2 y -OH. A qu proceso o
procesos atribuye la diferencia?
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________

4. Esquematice con reacciones su respuesta anterior.

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5. Recopile los resultados grupales y reprtelos en la Tabla 2.

Tabla 2. Resultados grupales.


% de inhibicin % de Captura
Equipo Antioxidante
de la XO O2- H2O2 -
OH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

6. Cul de los antioxidantes muestra mayor capacidad para inhibir a la XO?


_________________________________________________________________________________

7. Cul de los antioxidantes muestra mayor capacidad para capturar al radical O2-?
_________________________________________________________________________________

8. Cul de los antioxidantes muestra mayor capacidad para capturar al H2O2?


_________________________________________________________________________________

9. A qu atribuye este ltimo hallazgo?


__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
_____________________________________________

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10. Cul de los antioxidantes muestra una mayor capacidad para capturar al radical -OH?
________________________________________________________________________________

11. Considera que el consumo habitual de estos antioxidantes contribuira a disminuir el estrs oxidante?
Justifique su respuesta.
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Cadenas, E. Packer L. Handbook of Antioxidants. Marcel Dekker, Inc., New York, 2002.
Klaassen, C.D., Watkins, J.B. Manual de Toxicologa de Casarett & Doull: la ciencia bsica de los txicos. (5
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Concentrations by the Ferrous Oxidation-Xylenol Orange Assay in Conjunction with
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APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS

1. Definicin del proceso de estrs oxidante.


2. Concepto de radical libre y especies reactivas.
3. Concepto de antioxidante y ejemplos.
4. Reaccin de Fenton.
5. Concepto de peroxidacin de lpidos.
6. Importancia de la solubilidad de los antioxidantes en agua y metanol en funcin del procedimiento
experimental, prestar particular atencin a las tablas 2 y 5.
7. Analice las reacciones planteadas en el siguiente diagrama y describa o complete lo solicitado en los
incisos 7a-7c.

7a. Completar la longitud de onda a la que absorben las especies qumicas que se determinan
espectrofotomtricamente en las pruebas de inhibicin de la Xantina Oxidasa y de captura del radical
superxido, respectivamente.

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7b. Propsito de la adicin secuencial de: xantina, EDTA, solucin amortiguadora de carbonatos pH 10.2,
nitroazul de tetrazolio, XO y Cu(NO3)2 en las pruebas de inhibicin de la Xantina Oxidasa y de captura de
radical superxido.
7c. Identificar las especies reactivas de oxgeno, indicando si son radicales o no.

8. Analice las reacciones planteadas en el siguiente diagrama y describa lo solicitado en los incisos 9a-9c.

Mtodo de FOX2 modificado


H2O2 Naranja de Xilenol (NX)
FeII FeIII + OH + OH- FeIII-NX
(l=560 nm)

+L
(cido hexenico)

LOOH NX
FeII FeIII + OH + OH- FeIII-NX
(l=560 nm)
NX = Naranja de Xilenol
FeIII-NX = Complejo colorido de hierro III y Naranja de Xilenol
L= Lpido = cido hexenico
LOOH = Lpido hidroperxido producto de la peroxidacin de lpidos
en presencia de OH

9a. Propsito de la adicin de Naranja de Xilenol y H2SO4 en el reactivo de FOX2.


9b. Propsito de la adicin de H2O2.
9c. Propsito de la adicin de cido hexenico en los tubos de captura de radical OH-.
9d. Identifique la reaccin de Fenton en el diagrama.

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APNDICE II: PREPARACIN DE REACTIVOS

Nota: Las soluciones 17 y 18 se deben preparar al inicio de cada sesin. Todo el


material de vidrio para preparar los antioxidantes deber ser enjuagado previamente
con EDTA. Se recomienda que cada equipo prepare las soluciones acuosas o
metanlicas del antioxidante que el profesor les haya asignado a evaluar.

Xantina 1.5 mM

Pesar 11.3 mg de xantina, agregar Na2CO3 0.4 M hasta solubilizar y aforar a 50 mL con solucin amortiguadora
de carbonatos.

Solucin amortiguadora de bicarbonato de sodio-carbonato de sodio 84 mM, pH 10.2

Pesar 970 mg de NaHCO 3 y 1.01 g de Na 2 CO3 , disolverlos con agua destilada. Ajustar pH a 10.2 y
aforar a 250 mL.

Nitroazul de tetrazolio 0.1 M

Pesar 41 mg de nitroazul de tetrazolio y aforar a 50 mL con agua destilada. Guardar la solucin en un frasco
mbar en el refrigerador.

EDTA 0.1 mM

Pesar 33.6 mg de EDTA, disolver con agua destilada, aforar a 1 L.

Xantina oxidasa

La enzima se preparar durante la sesin de laboratorio de acuerdo a la indicacin de los profesores.

Nitrato de cobre 1.3 mM (Cu(NO3)2)

Pesar 12.2 mg de Cu(NO3)2 y aforar a 50 mL con agua destilada.

Solucin acuosa de vainillina 0.65 mM

Pesar 1 mg de vainillina y aforar a 10 mL con solucin amortiguadora de carbonatos pH 10.2

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Solucin acuosa de cido ferlico 650 M

Pesar 1.3 mg de cido ferlico y aforar a 10 mL con solucin amortiguadora de carbonatos pH 10.2

Solucin acuosa de Alopurinol 650 M

Pesar 2.2 mg de alopurinol y aforar a 25 mL con solucin amortiguadora de carbonatos pH 10.2

Solucin de BHT en metanol/amortiguador de carbonatos (1:2) 650 M

Pesar 1.4 mg de butil hidroxitolueno y disolver en 5 mL de metanol; aforar a 10 mL con solucin amortiguadora
de carbonatos pH 10.2

Solucin acuosa de H2O2 250 M

Tomar 0.1 mL de una solucin de perxido de hidrgeno al 50.4% y aforar a 10 mL con agua destilada; de esta
solucin tomar 17 L y aforar a 10 mL con agua destilada.

Solucin metanlica de vainillina 4.4 mM

Pesar 6.7 mg de vainillina y aforar a 10 mL con MeOH

Solucin metanlica de cido ferlico 4.4 mM

Pesar 8.5 mg de cido ferlico y aforar a 10 mL con MeOH

Solucin metanlica de Alopurinol 4.4 mM

Pesar 6.0 mg de Alopurinol y aforar a 10 mL con MeOH

Solucin metanlica de BHT 4.4 mM

Pesar 9.7 mg de BHT y aforar a 10 mL con MeOH

Reactivo de FOX2

Mezclar 33.6 mg de naranja de xilenol, 50.2 mg de Fe(NH4)2(SO4)26H2O y disolver en H2O destilada, agregar
695 mL de H2SO4 concentrado y aforar a 50 mL con agua destilada.

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Solucin FOX-MeOH

Mezclar 1 mL del reactivo de FOX2 con 9 mL de MeOH

Solucin FOX-Antioxidante

Mezclar 1 mL del reactivo de FOX2 con 9 mL de la solucin metanlica de antioxidante correspondiente.

Solucin acuosa de cido hexenico 500 M

Pesar 6.6 mg de cido hexenico y aforar a 50 mL con agua destilada, tomar de esta solucin 5 mL y
aforar a 10 mL con agua destilada.

APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS

R1: xantina, xantina oxidasa, EDTA, solucin amortiguadora de carbonatos pH 10.2, nitroazul de tetrazolio,
cido ferlico, vainillina, butil hidroxitolueno, alopurinol, Cu(NO3)2, azul de tetrazolio, formazn, cido rico,
H2O2, metanol.
R2: Naranja de xilenol, sulfato de amonio y hierro (II), H2SO4, cido hexenico, H2O, H2O2, vainillina,
alopurinol, butil hidroxitolueno, cido ferlico metanol.

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DETERMINACIN DE MUTGENOS AMBIENTALES A TRAVS


DE LA PRUEBA DE AMES

OBJETIVO ACADMICO
Determinar la presencia de compuestos mutagnicos en muestras de inters o de impacto ambiental empleando
la prueba de Ames.

PROBLEMA
Que el alumno obtenga a partir de muestras de inters ambiental, la fraccin que contiene los compuestos de
naturaleza orgnica y realice la prueba de Ames para determinar si las fracciones contienen compuestos con
potencial mutagnico.

MATERIAL BIOLGICO
Cultivo nutritivo de 16 horas a 37C de Salmonella typhimurium, cepa TA98, cuyos marcadores genticos son:
requerimiento de histidina (His-), sensibilidad al cristal violeta (mutacin en rfa), presencia del plsmido R
(resistencia a ampicilina), sensibilidad a la luz U.V. (mutacin en uvrB) y frecuencia de reversin espontanea.

MUESTRA AMBIENTAL POR EQUIPO


Traer por equipo de 6 personas una de las dos muestras siguientes:

a) Colillas de cigarro: Recolectar en una bolsa plstica limpia 20 colillas de cigarro a las que debern retirar
el papel envolvente y conservar nicamente el algodoncillo del filtro.
b) Residuos de escape automotriz: Recolectar con un algodn el holln remanente en el escape de un autobs
y guardarlo en una bolsa plstica limpia; si es necesario emplear unas pinzas largas para tener acceso hasta
el lugar en donde el holln se acumula.

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MATERIAL POR EQUIPO (6 personas)

Extraccin Prueba de Ames


Anillo metlico 1 Agitador vortex 1
Embudo de cola corta 1 Mechero Bunsen 1
Embudo de separacin 1 Mechero Fisher 1
Matraz de bola de 100 mL 1 Micropipeta 10-100L 1
Probeta de 100 mL 1 Micropipeta 100-1000L 1
Vaso de precipitados de 100 mL 1 Pipetas graduadas 2 mL estriles 4
Vidrio de reloj 1 Puntas desechables estriles para micropipetas
(6 amarillas + 1 azul) 8
Pedazos de papel filtro 7x7cm 2 Vaso de precipitados de 100 mL 1
1 Parrilla de calentamiento 1
10 Tubos de ensayo de plstico desechables de
5 mL estriles 10
Material para el conteo: Pinzas para tubos de ensayo 1
Plumn indeleble de punto fino 1 Termmetro 1
Lmpara 1 Hielo
Lupa 1 Bolsa de plstico para residuos 1
Cajas Petri con medio mnimo E 10
de Vogel-Bonner
Tubos de ensayo 16x150 mm con 15 mL de
agar de superficie 2
Tubo Eppendorf 1
Unidad Swinex (Millipore, 0.45 m) 1

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REACTIVOS

Extraccin

Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4)


Diclorometano (CH2Cl2)
Dimetilsulfxido (DMSO)

Prueba de Ames

Hipoclorito de sodio
Solucin L-histidina 0.5 mM / biotina 0.5 mM
Mezcla fraccin S9:
Amortiguador de fosfatos 0.2 M pH 7.4
Solucin de MgCl2 6H2O 0.4 M/ KCl 1.65 M
Glucosa 6-fosfato
NADP+
Medio mnimo de Vogel-Bonner (en cajas Petri)
Agar de superficie (15 mL en tubos de ensayo 16x150 mm)

EQUIPO
Incubadora
Refrigerador
Rotaevaporador
Lmparas

DESARROLLO EXPERIMENTAL PRIMERA SESIN

Nota 1. Antes de comenzar el trabajo experimental, los encargados de higiene y


seguridad deben verificar que todos los integrantes del equipo porten bata, guantes,
cubrebocas y lentes de seguridad.

Nota 2. Colocar las cajas de Petri con medio mnimo de Vogel-Bonner en la


incubadora a 37C al inicio de la clase.

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EXTRACCIN DE MUTGENOS A PARTIR DE MUESTRAS AMBIENTALES.


1. Preparar un sobre doble de papel filtro de aproximadamente 5 x 5 cm de longitud de acuerdo con la Figura 1.

Figura 1. Elaboracin de sobre doble de papel filtro.

2. Colocar el material de estudio en el sobre y depositarlo en un vaso de precipitado s de 250 mL,


aadir 100 mL de CH 2 Cl2 , tapar y agitar delicadamente 30 segundos. Macerar durante 30 minutos
(no agitar durante ese tiempo).
3. Filtrar por gravedad el extracto obtenido y recolectarlo en un vaso de precipitados.

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4. Colocar el sobre doble de papel filtro sobre papel peridico en la campana de extraccin. Al finalizar la
sesin los responsables de seguridad e higiene debern colocarlos en una bolsa de plstico, cerrar y
etiquetar como R1.
5. Adicionar al disolvente de extraccin del inciso 3 sulfato de sodio anhidro para eliminar la presencia de
agua en la muestra, posteriormente filtrarlo por gravedad a travs de algodn y concentrar in vacuo.
6. Reconstituir el residuo final con 500 L de DMSO.

PRUEBA DE AMES

Nota 3. Antes de montar el rea de trabajo es importante asegurarse que ya NO haya


disolventes orgnicos en las mesas.

1. Sanitizar el rea de trabajo limpiando con jabn e hipoclorito de sodio.


2. Enseguida sanitizar con etanol al 70%.
3. Adecuar el rea de trabajo a un ambiente estril de acuerdo con la Figura 2.

Figura 2. rea de trabajo ordenada y sanitizada.

4. En la parrilla de calentamiento, fundir con mucha precaucin los 15 mL de agar de superficie contenido en
el tubo de ensayo para evitar proyecciones y prdidas de reactivo.
5. Aadir 1.5 mL de solucin L-Histidina/Biotina.

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6. Mantener la mezcla anterior a 45C en bao Mara como indica la Figura 2.


7. Los encargados de seguridad prepararn para todo el grupo la mezcla S9 de acuerdo con las instrucciones
del APNDICE I. A los equipos que les corresponda utilizar dicha mezcla se les proporcionar en tubos
Eppendorf 1.3 mL de mezcla S9 para el bioensayo la cual deber mantenerse todo el tiempo en bao de
hielo.

Nota 4: Los pasos del 7 al 12 deben hacerse lo ms rpido posible para evitar riesgos
de contaminacin.

8. Tomar uno o dos tubos de ensaye de plstico estriles, segn el tratamiento que se est realizando,
quitarles la tapa por presin sin tocar los bordes y aadir a cada tubo 2 mL de agar de superficie
previamente tratado en el paso 4. Mantenerlos a 45C como los muestra la Figura 2.
9. Realizar slo los tratamientos expuestos en la Tabla 1 o 2 segn el equipo correspondiente, comenzando
por el control negativo. CADA REACTIVO DEBE AGREGARSE EN EL ORDEN INDICADO.
10. Desechar las puntas para micropipetas en la bolsa de residuos colocada a un costado del rea de trabajo y
etiquetada como R2.

Tabla 1. Prueba de Ames con la Cepa TA 98 para el equipo A.


Reversin
Sin S9
Tratamientos Control negativo espontnea
(por duplicado)
(por duplicado)
CDIGO C- RE1 RE2 S/S91 S/S92
Reactivo
1.- Agar de superficie* 2mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL
2.- Cultivo bacteriano - 100 L 100 L 100 L 100 L
3.- Mutgeno ambiental - - - 25L 25L

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Tabla 2. Prueba de Ames con la Cepa TA 98 para el equipo B.


Control negativo Slo mutgeno Con S9
Tratamientos
fraccin S9 (por duplicado) (por duplicado)
CDIGO C-S9 M2
M1 C/S91 C/S92
Reactivo
1.- Agar de superficie* 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL
2.- Cultivo bacteriano 100 L - - 100 L 100 L
3.- Mutgeno ambiental - 25L 25L 25L 25L
4.- Mezcla S9** 500 L - - 500 L 500 L
*Mantener siempre a 45C en bao Mara.
**Mantener siempre en hielo.

11. Sacar de la incubadora dos cajas Petri, etiquetar las cajas en la tapa segn el cdigo indicado en las Tablas
1 y 2, para cada tratamiento agregando el nmero de grupo y equipo.
12. Mezclar el contenido de cada tubo en el agitador vortex.
13. Verter el contenido de cada tubo en la caja de Petri con medio mnimo de Vogel-Bonner correspondiente.
14. Desechar los tubos de plstico en la bolsa de residuos colocada en un costado del rea de trabajo y
etiquetada como R2.
15. Distribuir cuidadosa y homogneamente el agar de superficie realizando movimientos circulares.
16. Dejar solidificar las cajas a temperatura ambiente en una superficie plana durante 10 minutos.
17. Repetir los pasos 7 al 15 para los otros dos tratamientos.

Nota 5: Recordar en todo momento que se est trabajando con compuestos con
posible actividad mutagnica y con un cultivo bacteriano que no es incuo.

18. Colocar el sobrante de la muestra ambiental en DMSO en el contenedor etiquetado como R3.
19. Fijar las tapas de las cajas Petri a su contraparte con cinta adhesiva e introducirlas de manera invertida a la
incubadora a 37C por 48 horas.
20. Una vez terminado el tiempo de incubacin, guardar las cajas de Petri invertidas en el refrigerador a 4C.

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DESARROLLO EXPERIMENTAL SEGUNDA SESIN


21. Antes de comenzar el conteo de colonias, verificar que el crecimiento sea homogneo, es decir, que las
colonias tengan las mismas caractersticas, de lo contrario informar al profesor para recibir instrucciones.
22. Identificar si existe algn tipo de contaminacin por hongos u otras bacterias. En caso de que las cajas
presenten estas condiciones, informar al profesor para rechazarlas.
23. Contar el nmero de colonias revertantes que crecieron en la caja con ayuda de una lmpara y una lupa,
marcndolas con un plumn indeleble de punto fino.
24. Registrar en la Tabla 3 los resultados obtenidos.
25. Una vez terminada la cuenta, recolectar las cajas de Petri y sujetarlas con cinta adhesiva, colocarlas en la
bolsa roja para RPBI y etiquetarlas como R4.

Nota 6: Se considera un resultado positivo cuando el nmero de revertantes inducidas


es igual o superior al doble del nmero de colonias revertantes espontneas.

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CUESTIONARIO
1. Anote el nmero de revertantes encontradas en la Tabla 3.
Tabla 3. Resultados con la cepa TA98.
Control Sin Con Slo
Control negativo Reversin fraccin fraccin mutgeno
Equipo Muestra: Repeticin
negativo fraccin S9 espontnea S9 S9

1 1
2
Promedio
2 1
2
Promedio
3 1
2
Promedio
4 1
2
Promedio
5 1
2
Promedio

2. En cul de las muestras evaluadas, el nmero de revertantes inducidas es igual o superior al doble del
nmero de colonias revertantes espontneas?
_________________________________________________________________________________

3. Considera que logr identificar la presencia de mutgenos en la muestra ambiental evaluada?


__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________

4. Qu tipo de mutaciones provocan?


__________________________________________________________________________________________

5. Cmo influye la biotransformacin en estos procesos?


__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________

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6. Qu caractersticas de solubilidad poseen los xenobiticos presentes en la muestra evaluada?


___________________________________________________________________________________________________

7. Qu importancia tiene la concentracin de los mutgenos en la muestra con respecto a la confiabilidad de


la prueba?
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________

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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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mutagenic chemical assay of PM10 extractable organic matter in Southwest Mexico City. Mutation
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APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS

1. Concepto de contaminacin atmosfrica.


2. Posibles compuestos mutagnicos existentes en las muestras seleccionadas.
3. Efectos generales que sobre el organismo tienen los contaminantes ambientales.
4. Caractersticas generales de solubilidad de dichos compuestos.
5. Fundamento de la prueba de Ames.
6. Concepto de revertante espontnea.
7. Caractersticas generales de las cepas Salmonella typhymurium utilizadas en la Prueba de Ames y
especialmente la cepa TA 98.
8. Utilidad del agar de superficie.
9. Importancia del bao de temperatura a 45C.
10. Finalidad de colocar en el medio una solucin que contenga histidina y biotina.
11. Caractersticas de la fraccin S9 y su utilidad.
12. Numero de colonias revertantes necesarias para considerar un resultado positivo.
13. Precauciones que se deben considerar para obtener resultados ptimos de la prueba en el laboratorio.

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APNDICE II: PREPARACIN DE REACTIVOS

a) Sales de Vogel-Bonner 50X.


En 600 mL de agua destilada tibia disolver las sales en el siguiente orden:

MgSO47 H2O 10 g
cido ctricoH2O 100 g
K2HPO4 anhdro 500 g
NaHPO44 H2O 175 g
Aforar a 1 litro. Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente.

b) Bacto-agar
En un matraz de 1 L colocar 15 g de Bacto-agar ms 500 mL de agua destilada. Esterilizar en autoclave el
material a anterior 121C durante 15 minutos.

c) Dilucin de las sales Vogel-Bonner 50x


En un matraz de 1 L colocar 20 mL de las sales de Vogel-Bonner 50x ms 500 mL de agua destilada. Esterilizar
en autoclave el material anterior a 121C durante 15 minutos.

d) Solucin de glucosa al 40% p/v


En un matraz de 125 mL colocar 20 g de glucosa ms 50 mL de agua destilada. Esterilizar en autoclave el
material anterior a 121C durante 15 minutos.

e) Cajas Petri con Medio mnimo E de Vogel-Bonner


En un matraz de 2 L limpio, seco y esterilizado en autoclave a 121C por 15 minutos, aadir los 500 mL de
bacto-agar, 500 mL de la dilucin de las sales Vogel-Bonner y 50 mL de solucin de glucosa al 40% p/v,
mezclar perfectamente y distribuir en cajas Petri de 15x100 estelizadas por rayos gamma hasta cubrir la base
(aproximadamente 30 mL/caja). Esta cantidad de medio alcanza para preparar aproximadamente 33 cajas.

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f) Solucin Histidina 0.5 mM/Biotina 0.5 mM


Pesar 0.0077 g de L-histidina, 0.0122 g de D-biotina, disolver con agua destilada y con calentamiento, aforar a
100 mL. Esterilizar por filtacin o autoclave. Almacenar a 4C en oscuridad.

g) Agar de Superficie
Pesar 0.6 g de Bacto Agar y 0.5 g de NaCl, agregar 100 mL de agua destilada. Alicuotar 15 mL de la mezcla en
tubos de 16x150 mm, cubrirlos con algodn, esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente.

h) Amortiguador de fosfatos 0.2 M pH 7.4


Solucin A. Disolver 2.84 g de Na2HPO4 en 100 mL de agua destilada.
Solucin B. Disolver 2.76 g de NaH2PO4H2O en 100 mL de agua destilada.
Para el amortiguador pH 7.4, tomar 81 mL de la Solucin A y 19 mL de la Solucin B. Almacenar a 4C.
Esterilizar la solucin final en autoclave.

i) Solucin de Cloruros: MgCl2 6H2O 0.4 M/ KCl 1.65 M


Disolver 8.1332 g de MgCl2 6H2O + 12.302 g de KCl en agua destilada, aforar a 100 mL. Esterilizar en
autoclave y almacenar a 4C.

j) Mezcla fraccin S9
Para preparar esta mezcla se requieren dos tubos estriles de 16 x 150 mm y descongelar previamente la fraccin
S9 en bao de agua con hielos (4C). Tomar las alcuotas indicadas en la Tabla 4 y mezclar siguiendo las
instrucciones posteriores. Pesar la glucosa 6P y el NADP+, usando aplicadores de madera para poder pesar los
reactivos, (con una navaja, una de las puntas del aplicador de madera se plana para poder tomar el reactivo y
pesarlo), vaciarlos cada uno a tubos Eppendorf de 1.5 mL.

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Tabla 4. Alcuotas para preparar la mezcla S9.


Reactivos Para 1 mL de Para 8 mL de mezcla S9
mezcla S9 (cantidad recomendada para
un grupo)
Amortiguador de fosfatos 0.2 M pH 7.4 0.9 mL 7.2 mL
Solucin de Cloruros: MgCl2 6H2O 0.4 0.02 mL 0.16 mL
M/ KCl 1.65 M
Glucosa-6-fosfato* 0.0013 g 0.0104 g
NADP+* 0.0030 g 0.024 g
S9 100 L 0.8 mL
*Antes de iniciar pedir al profesor que proporcione los tubos Eppendorf de 1.5 mL con la glucosa 6P y el
NADP+ pesados en la cantidad correspondiente, empleando para ello aplicadores de madera desechables.

En un tubo estril de 16x 150mm, aadir el amortiguador de fosfatos y la solucin de cloruros, mezclar en
vortex, tomar una alcuota de 500 L(con micropipeta) y aadirla en el tubo Eppendorf que contiene a la glucosa
6P para disolverla y agregarla al resto del tubo de 16 x 150 mm, mezclar nuevamente en el vortex. Tomar
nuevamente otra alcuota de 0.5 mL y aadirla al tubo Eppendorf que contiene el NADP+ para disolverlo,
agregar al resto del tubo de 16 x 150 mm. Mezclar la fraccin S9 y tomar la alcuota correspondiente para
aadirla al tubo de 16 x 150 mm, mezclar en vortex perfectamente y filtrar utilizando una unidad Swinex
(Millipore, 0.45 m), obteniendo el filtrado en otro tubo de 16x150 mm ESTRIL. Alicuotar 1.3 mL de la
mezcla para cada equipo en tubos Eppendorf.

Nota 7: Tomar en cuenta que la mezcla siempre debe estar en hielo.

APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS

R1: Sobre doble con muestra ambiental y disolvente CH2Cl2.


R2: puntas para micropipeta y tubos de plstico.
R3: Concentrado de muestra ambiental en DMSO, este extracto puede contener hidrocarburos aromticos
policclicos y otros compuestos mutagnicos.
R4: Cajas de Petri con cultivo bacteriano de Salmonella typhimurium, cepa TA98.

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EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD GENOTXICA DE LA CICLOFOSFAMIDA


UTILIZANDO LA TCNICA DE MICRONCLEOS EN MDULA SEA

OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno sea capaz de determinar la actividad genotxica de un xenobitico empleando la tcnica de
cuantificacin de microncleos en mdula sea de ratn.

PROBLEMA
Identificar la presencia de microncleos, inducidos por ciclofosfamida, en eritrocitos policromticos de mdula
sea murina.

REACTIVOS
Solucin salina isotnica (SSI) Colorante de Giemsa modificado
Aceite de inmersin Etanol (EtOH)
Solucin amortiguadora de fosfatos pH=6.8*

Solucin salina isotnica (SSI) Colorante de Giemsa modificado


Aceite de inmersin Etanol (EtOH)
Solucin amortiguadora de fosfatos pH=6.8*
*Ver APNDICE II

MATERIAL POR EQUIPO


Tijeras de diseccin 2 Portaobjetos 6
Pinzas de diseccin 2 Pipeta Pasteur 4
Bulbo para pipeta Pasteur 4 Contador de clulas 1
Microscopio de contraste 2

ANIMALES DE EXPERIMENTACIN
1 ratn ICR por equipo administrado 24 horas antes con ciclofosfamida con una dosis de 40 mg/Kg i.p. o un
ratn ICR control negativo no tratado.

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DESARROLLO EXPERIMENTAL

Nota: El siguiente protocolo requiere que no pasen ms de 30 minutos entre los


pasos 1 y 9.

1. Sacrificar al ratn por dislocacin cervical.

2. Una vez que se haya confirmado la muerte del animal de experimentacin fijarlo a la mesa de trabajo.
3. Dislocar la articulacin del fmur con la cadera, estirando las patas traseras del animal.

4. Diseccionar y extraer el fmur cortando por arriba de la cresta ilaca (en la cadera) y por debajo de la
rodilla.

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5. Limpiar cuidadosamente cada fmur con papel hasta eliminar totalmente el tejido muscular. Para facilitar
la eliminacin del tejido muscular, tomar la parte que queda debajo de la rodilla y rotarla al lado contrario
del movimiento natural de la articulacin de la rodilla y el fmur.

6. Una vez limpio, cortar cuidadosamente ambas epfisis y lavar el interior del fmur con 3 mL de SSI
empleando una jeringa de 3 mL con aguja del nmero 21. Recolectar y reunir en un mismo tubo de 13 x
100, la mdula de cada fmur.

7. Envolver los restos del animal de experimentacin en una hoja de papel peridico, colocarlos en la caja de
contencin para su posterior incineracin.
8. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 min el tubo que contiene la mdula (tubo del inciso 6), extraer el
sobrenadante cuidadosamente con una pipeta Pasteur y resuspender el botn en una gota de SSI. Depositar
el sobrenadante en una solucin de hipoclorito de sodio.
9. Realizar 4 extendidos de la siguiente manera: colocar en la orilla de un portaobjetos una gota de la
suspensin de mdula sea y un segundo portaobjetos justo atrs de la gota en ngulo de 45. Dejar que la
muestra se distribuya por capilaridad y deslizar suavemente para formar una delgada capa de clulas.

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10. Secar completamente los extendidos al aire.


11. Adicionar por goteo EtOH a las laminillas hasta cubrir la superficie y secar al aire. Repetir esta operacin
durante 5 minutos.

12. A cada laminilla adicionar dos o tres gotas de colorante Giemsa modificado. Dejar reposar un minuto y
adicionar agua en la misma proporcin que el colorante. Dejar reposar un minuto ms.

13. Enjuagar la laminilla con agua destilada.

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14. Cubrir la laminilla con solucin amortiguadora de fosfatos pH 6.8 durante 5 minutos.
15. Enjuagar la laminilla una vez ms con agua destilada y secar al aire.
16. Observar al microscopio con aceite de inmersin, y registrar los siguientes datos:
El nmero de eritrocitos policromticos por cada 200 eritrocitos totales.
El nmero de eritrocitos policromticos micronucleados por cada 1000 eritrocitos policromticos.

Eritrocito
Policromtico
Micronucleado

Eritrocito
Normocromtico

Eritrocito
Policromtico

Eritrocito
Normocromtico
Micronucleado

Nota: Debido a que el conteo de los microncleos se debe realizar al ciego, el alumno
no sabr hasta el final de la prctica si el animal de experimentacin proporcionado
ha sido tratado o no con ciclofosfamida.

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CUESTIONARIO
1. Con base en la experiencia adquirida, indique dos caractersticas que le permitan identificar un
microncleo y diferenciarlo de un artefacto producto de la tincin.
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_______________________________________________________________
2. Reporte sus resultados en la siguiente tabla:
Tabla 1. Resultados por equipo.
EPCa/ ETb EPCMNc/ EPC
Laminilla 1
Laminilla 2
Laminilla 3
Laminilla 4
Suma /200 ET /1000 EPC

a) EPC: Eritrocitos policromticos, b) ET: Eritrocitos totales, c) EPCMN: Eritrocitos policromticos


micronucleados

3. Reporte los resultados grupales en la siguiente tabla:


Tabla 2. Resultados grupales.
Ciclofosfamida
Equipo EPCa/ ETb EPCMNc/ EPC
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Promedio /200 ET /1000 EPC

Datos tericos de los individuos control


Control (-) n=3
Promedio 116/200 ET 5/1000 EPC
Cociente 0.58 0.005
SD 0.0006 0.0006
a) EPC: Eritrocitos policromticos, b) ET: Eritrocitos totales, c) EPCMN: Eritrocitos policromticos
micronucleados
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4. Realice una comparacin estadstica mediante la prueba de t-student, de una cola y con un 90% de
confianza, entre los dos grupos. Concluya si existen diferencias significativas como para considerar un dao
genotxico.
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__________________________________________________________________________________________
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5. Con el protocolo empleado y los resultados obtenidos Podra establecer si el dao genotxico ocasionado
por la ciclofosfamida fue clastognico o aneuploidgeno? Explique su respuesta.
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__________________________________________________________________________________________
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_________________________________________________________________________________________

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Andreoli, C., Gigante, D., Nunziata A. (2003). A review of in vitro methods to assess the biological activity of
tobacco smoke with the aim of reducing the toxicity of smoke. Toxicology in Vitro 17, 587594.
EPA (US Environmental Protection Agency), Health Effects Test Guidelines OPPTS 870.5395, Mammalian
Erythrocyte Micronucleus Test, Office of Prevention, Pesticides and Toxic Substances (7101) EPA 712-
C-98-226, August 1998. (Ver:
www.epa.gov/opptsfrs/publications/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/8
70-5395.pdf.)
Hessel, H., Radon K., Pethran A., Maisch, Bettina., Grbmair, S., Sautter, I., Fruhmann, G. (2001). The
genotoxic risk of hospital, pharmacy and medical personnel occupationally exposed to cytostatic drugs
evaluation by the micronucleus assay. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental
Mutagenesis 497, 101-109.
Kirsch-Voldersa M., Elhajoujia A., Cundaria E., Hummelenb P.V. (1997). The in vitro micronucleos test: a
multi-endpoint assay to detect simultaneously mitotic delay, apoptosis, chromosome breakage,
chromosome loss and non-disjunction. Mutation Research 392, 19-30.

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Laboratorio de Toxicologa

Konopacka, M. (1994). Evaluation of frequency of micronuclei in exfoliated cells from bladder of mice treated
with benzo(a)pyrene, 2-acetylaminofluorene and cyclophosphamide. Cell Biology International 18, 669-
672.
Krishna, G., Hayashi, M. (2000). In vivo Rodent Micronucleus Assay: Protocol, Conduct And Data
Interpretation. Mutation Research 455, 155-166.
Pastor, S., Gutirrez S., Creus, A., Cebulska-Wasilewska A., Marcos R. (2001). Micronuclei in peripheral blood
lymphocytes and buccal epithelial cells of Polish farmers exposed to pesticides. Mutation
Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 495,147-156.
Proudlock, R.J., Statham J., Howard W. (1997). Evaluation of the rat bone marrow and peripheral blood
micronucleus test using monocrotaline. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental
Mutagenesis 392, 243-249.

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEANZA 79


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APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS

1. Definicin de Eritropoyesis.
2. Concepto de microncleo y proceso de formacin.
3. Diferencia entre dao clastognico y aneuploidgeno y como se pueden diferenciar con la tcnica de
microncleos.
4. Fundamento de la tincin de Giemsa.
5. Coloracin que adquieren los eritrocitos maduros, inmaduros y micronucleados con el colorante Giemsa.
6. Mecanismo de accin genotxico de la ciclofosfamida.
7. Usos clnicos de la ciclofosfamida.
8. Propsito de adicionar: EtOH y solucin amortiguadora de fosfatos pH=6.8.
9. Se determin la actividad genotxica de la daunorrubicina y la apigenina en sangre perifrica de ratn,
administrando grupos de 15 animales para cada tratamiento. Los xenobiticos en estudio se administraron
a 2.5 mg/kg, mientras que el grupo control fue administrado con SSI, obteniendo los siguientes resultados:

Tabla 1. Promedio de nmero de microncleos por cada tratamiento.


Grupo Microncleos/1000 clulas
SSI 0.5 0.33
daunorrubicina 18.6 0.62
apigenina 1.6 0.80

Realice una comparacin estadstica mediante la prueba t-student, de una cola y con un 90% de confianza, de los
grupos tratados respecto al control. Concluya si existen diferencias significativas que sean indicativas de dao
genotxico.

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Tabla 2. t-student.
Grados 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.025 0.01 0.005
de
libertad
1 1.000 1.376 1.963 3.078 6.314 12.706 31.821 63.657
2 0.816 1.061 1.386 1.886 2.920 4.303 6.965 9.925
3 0.765 0.978 1.250 1.638 2.353 3.182 4.541 5.841
4 0.741 0.941 1.190 1.533 2.132 2.776 3.747 4.604
5 0.727 0.920 1.156 1.476 2.015 2.571 3.365 4.032
6 0.718 0.906 1.134 1.440 1.943 2.447 3.143 3.707
7 0.711 0.896 1.119 1.415 1.895 2.365 2.998 3.499
8 0.706 0.889 1.108 1.397 1.860 2.306 2.896 3.355
9 0.703 0.883 1.100 1.383 1.833 2.262 2.821 3.250
10 0.700 0.879 1.093 1.372 1.812 2.228 2.764 3.169
11 0.697 0.876 1.088 1.363 1.796 2.201 2.718 3.106
12 0.695 0.873 1.083 1.356 1.782 2.179 2.681 3.055
13 0.694 0.870 1.079 1.350 1.771 2.160 2.650 3.012
14 0.692 0.868 1.076 1.345 1.761 2.145 2.624 2.977
15 0.691 0.866 1.074 1.341 1.753 2.131 2.602 2.947
16 0.690 0.865 1.071 1.337 1.746 2.120 2.583 2.921
17 0.689 0.863 1.069 1.333 1.740 2.110 2.567 2.898
18 0.688 0.862 1.067 1.330 1.734 2.101 2.552 2.878
19 0.688 0.861 1.066 1.328 1.729 2.093 2.539 2.861
20 0.687 0.860 1.064 1.325 1.725 2.086 2.528 2.845
21 0.686 0.859 1.063 1.323 1.721 2.080 2.518 2.831
22 0.686 0.858 1.061 1.321 1.717 2.074 2.508 2.819
23 0.685 0.858 1.060 1.319 1.714 2.069 2.500 2.807
24 0.685 0.857 1.059 1.318 1.711 2.064 2.492 2.797
25 0.684 0.856 1.058 1.316 1.708 2.060 2.485 2.787
26 0.684 0.856 1.058 1.315 1.706 2.056 2.479 2.779
27 0.684 0.855 1.057 1.314 1.703 2.052 2.473 2.771
28 0.683 0.855 1.056 1.313 1.701 2.048 2.467 2.763
29 0.683 0.854 1.055 1.311 1.699 2.045 2.462 2.756
30 0.683 0.854 1.055 1.310 1.697 2.042 2.457 2.750
40 0.681 0.851 1.050 1.303 1.684 2.021 2.423 2.704
60 0.679 0.848 1.046 1.296 1.671 2.000 2.390 2.660
120 0.677 0.845 1.041 1.289 1.658 1.980 2.358 2.617
h 0.674 0.842 1.036 1.282 1.645 1.960 2.326 2.576

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APNDICE II: PREPARACIN DE REACTIVOS

Solucin salina isotnica (SSI)

Para preparar 100 mL, se pesan 0.9 g de NaCl y se disuelven en 100 mL de agua destilada; o bien, puede
utilizarse la solucin comercial.

Solucin amortiguadora de fosfatos

Na2 HPO4 .....................2.56 g


KH2 PO4........................6.63 g
Agua destilada (cuanto baste para un litro)

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EFECTOS TXICOS DE LA ADMINISTRACIN DE PLOMO EN RATAS

OBJETIVO ACADMICO

Que el alumno visualice el dao macroscpico ocasionado en hgado y bazo de ratas administradas de forma
sub-aguda con diferentes dosis de acetato de plomo por va i.p. Relacionar dicho dao con las alteraciones que se
presentan en la morfologa de los eritrocitos y en los valores del hematocrito (Hto), hemoglobina total (Hbt) y
hemoglobina libre (Hbl).

PROBLEMA
Identificar cul de las dos soluciones de acetato de plomo causa mayor dao en las ratas, al
relacionar los resultados encontrados macroscpicamente en el hgado y bazo, con los encontrados
microscpicamente en los eritrocitos y en la cuantificacin del Hto, Hbt, y Hbl.

REACTIVOS
Acetato de plomo (Pb(CH3COO)2) Etanol (EtOH)
Solucin salina isotnica (SSI) Ketamina
Xilacina

MATERIAL POR EQUIPO


Caja de contencin 3 jeringas para INSULINA con aguja intercambiable (traer por cada
sesin)
Algodn Marcadores de tinta permanente color rojo, negro y azul (traer por
cada sesin)
Perforador

ANIMALES DE EXPERIMENTACIN (POR EQUIPO PARA LAS CUATRO SESIONES)


3 ratas del mismo sexo y peso entre 180 y 300 g.

DESARROLLO EXPERIMENTAL
El trabajo experimental se desarrollar por equipos en 4 sesiones de laboratorio.

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PROCEDIMIENTO SESIN I (PRIMERA ADMINISTRACIN)


1. Cada equipo contar con 3 ratas.
2. Identificar mediante tincin en la cola y perforaciones en la oreja, previa anestesia con xilacina y ketamina
siguiendo las instrucciones de su profesor, a cada una de las ratas.

Nota: El profesor indicar el color con el que se deber marcar las colas de las ratas
en cada equipo y que numeracin se asignar a cada una de las ratas, de acuerdo con
el siguiente cdigo.

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10

Unidades = Oreja derecha


Decenas = Oreja izquierda

3. A cada equipo se le proporcionar 3 soluciones etiquetadas como solucin A, B, y SSI.


4. A cada rata se la administrar por va intraperitoneal, un volumen de 0.5 mL de la solucin que le
corresponda.
5. Una vez recuperadas de la anestesia colocarlas en su contenedor de transporte y llevarlas al bioterio.
6. Desechar las agujas en el contenedor para residuos peligrosos biolgico-infecciosos (RPBI) y la jeringa en
una bolsa de plstico etiquetada como R0.

PROCEDIMIENTO PARA LA SESIN II Y III (SEGUNDA Y TERCERA ADMINISTRACIN)


1. A cada rata se le administrar un volumen de 0.5 mL de la solucin que le corresponda por va
intraperitoneal.
2. Colocar a las ratas en su contenedor de transporte y llevarlas al bioterio.
3. Desechar las agujas en el contenedor para residuos peligrosos biolgico-infecciosos (RPBI) y la jeringa en
una bolsa de plstico etiquetada como R0.

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PROCEDIMIENTO PARA LA SESIN IV

MATERIAL POR EQUIPO


Navaja para bistur con porta bistur 1 Pinza de diseccin 1
Gradilla 1 Tubos de ensayo de 13 x 100 15
Tijeras de diseccin 1 Tabla de diseccin 1
Caja de contencin 1 Pipetas graduadas de 10 mL 2
Jeringas de 5 mL 5 Tubos de ensayo de 16 x 150 5
Tubos capilares 8 Vasos de precipitados de 100 mL 2
Portaobjetos 16 Algodn
Pipetas volumtricas de 5 mL 2 Celdas de vidrio 2
Vaso de precipitados de 250 mL 1 Cajas de Petri 4
Micropipeta 1 Pipeta graduada de 1 mL 1

REACTIVOS
Nuevo azul de metileno Reactivo de Drabkin
Solucin de heparina 1000 UI o EDTA al 10 % Xilacina
Colorante de Wrigth Ketamina
Solucin patrn de cianometahemoglobina (CNMHb) Etanol (EtOH)
Bencidina al 1%* Perxido de hidrgeno al 1% (H2O2)*
Solucin salina isotnica (SSI)*
*Ver APNDICE II

EQUIPO
Centrfuga para microhematocrito Espectrofotmetro
Microscopio de inmersin Centrfuga
Cmara de CO2

DESARROLLO EXPERIMENTAL
1. Preparar 3 jeringas con 0.1 mL de solucin de heparina o EDTA al 10%.

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2. Marcar 3 tubos de ensayo de 13 x 100 con el nmero de la rata que corresponda y agregar 0.1 mL de
heparina 0.5 mL de EDTA al 10 % como anticoagulante.
3. Anestesiar a cada rata administrando va i.m. 0.1 mL de Xilacina 20 mg/mL en el muslo izquierdo y 0.1 mL de
Ketamina 100 mg/mL en el muslo derecho. Esperar 10 minutos hasta que el animal se encuentre en
anestesia profunda verificando la ausencia de reflejos antes de proceder con el resto del protocolo.
4. Mediante puncin cardiaca obtener un volumen de 3 mL de sangre de cada una de las ratas.
5. Quitar la aguja de la jeringa y transferir la sangre inmediatamente al tubo de 13 x 100 correspondiente.
Mezclar perfectamente con el anticoagulante por inversin del tubo.
6. Desechar la aguja en el contenedor RPBI y colocar la jeringa en una solucin de hipoclorito de sodio al
10% durante 5 minutos antes de desechar.
7. Sacrificar la rata en cmara de CO2.
8. Llenar dos capilares con la sangre obtenida en el inciso 4 para calcular el hematocrito de acuerdo con lo
indicado en la seccin de tcnicas experimentales.
9. Realizar dos frotis de cada una de las muestras sanguneas con colorante de Wright de acuerdo con la
seccin de tcnicas experimentales.
10. Realizar dos frotis de cada una de las muestras sanguneas con colorante nuevo azul de metileno (NAM)
de acuerdo con la seccin de tcnicas experimentales.
11. Realizar la cuantificacin de hemoglobina total de acuerdo con la seccin de tcnicas experimentales. Una
vez realizadas las determinaciones anteriores, centrifugar cada uno de los tubos con la sangre restante a
2500 rpm x 5 min y separar el plasma del paquete celular. Determinar hemoglobina libre en plasma segn
la seccin de tcnicas experimentales. Colocar el tubo con el paquete celular residual en un contenedor
con hipoclorito de sodio.
12. Hacer una incisin en la parte media del abdomen y extraer el bazo y el hgado de cada rata. Colocar los
rganos en cajas de Petri con SSI, para evitar su deshidratacin. Observar y comparar los rganos con
respecto a la rata control.
13. Envolver los restos de los animales de experimentacin y los rganos extrados en una hoja de papel
peridico y colocarlos en la caja de contencin para su posterior incineracin.
14. Los animales que no fueron empleados debern devolverse a su contenedor de transporte y llevarse al
bioterio.

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TCNICAS EXPERIMENTALES

TCNICA DE MICROHEMATOCRITO

1. Llenar con sangre las 2/3 partes de un tubo capilar para cada muestra. Realizar esta operacin por
duplicado.
2. El extremo vaco se cierra con calor.
3. Colocar los capilares con el extremo cerrado hacia fuera en los surcos radiales de la centrfuga para
microhematocrito y centrifugar a 11000 rpm x 10 min.
4. Calcular el hematocrito midiendo la altura del paquete globular (M2) en relacin con la altura total de la
muestra (M1) y expresarla en %.

Hto = M2/M1 x 100

M
2

M1 _
_
M2 _
_
_
_
_
_
_
5. Una vez obtenidos los resultados, depositar los capilares en el contenedor para residuos peligrosos
biolgico-infecciosos (RPBI). X

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TINCIN DE WRIGHT

1. Hacer un frotis de cada muestra, de la siguiente forma:

Muestra de sangre 2
2

1 1 1

A. Poner una pequea B. Mediante un C. Para formar una


gota de sangre sobre el movimiento uniforme monocapa uniforme de
portaobjetos 1 y colocar el deslizar el portaobjetos 2 clulas.
portaobjetos 2 en frente sobre el 1.
de la muestra.

2. Dejar que los extendidos sequen al aire.


3. Adicionar por goteo EtOH a las laminillas hasta cubrir la superficie y secar al aire. Repetir esta operacin
durante 5 minutos.
4. Cubrir el portaobjetos por completo con el colorante de Wright. Transcurridos 5 minutos, enjuagar con
agua destilada y dejar secar. Depositar los residuos de la tincin en un frasco etiquetado como R1.
5. Observar los frotis al microscopio con el objetivo 100x, usando aceite de inmersin.

TINCIN CON NUEVO AZUL DE METILENO


1. Agregar con una pipeta Pasteur 3 gotas de sangre y 3 de colorante a un tubo de 13 x 100 y mezclar. Dejar
reposar a temperatura ambiente durante 5 min.
2. Colocar una gota de la mezcla anterior en un portaobjetos y hacer un frotis siguiendo la tcnica descrita en
la metodologa de la tincin de Wright. Dejar secar al aire.
3. Observar los frotis al microscopio con el objetivo 100x, usando aceite de inmersin.
4. Colocar los tubos en el contenedor con hipoclorito de sodio y lavar.

CUANTIFICACIN DE HEMOGLOBINA TOTAL

1. Preparar 5 tubos de acuerdo a la siguiente tabla, agitando cuidadosamente despus de la adicin de cada
reactivo y dejar reposar 10 min.

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Tabla 1. Cuantificacin de Hbt.


Tubo Blanco Referencia* A B SSI
REACTIVO (mL)
SOLUCIN DE REFERENCIA ---- 0.02 ---- ---- ----
MUESTRA ----- ---- 0.02 0.02 0.02
DRABKIN 5 5 5 5 5
*Consultar la concentracin de la solucin de referencia en la etiqueta del frasco

2. Ajustar la absorbancia a cero con el blanco y leer a 540 nm.


3. Calcular la concentracin de Hbt en g/dL empleando la siguiente frmula:
Hbt = Aprob*(Cref./Aref.)
Donde:
Cref. = concentracin de la solucin de referencia (g/dL)
Aprob = absorbancia del problema
Aref. = absorbancia de la solucin de referencia

4. Una vez ledos colocar el contenido de los tubos en un contenedor etiquetado como R2.

CUANTIFICACIN DE HEMOGLOBINA LIBRE EN PLASMA

1. Marcar 5 tubos de 16 x 150 y trabajar segn la siguiente tabla:


Tabla 2. Cuantificacin de Hbl.
A B SSI Solucin Blanco
Estndar*
Bencidina 1% 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL
Plasma 0.02 mL 0.02 mL 0.02 mL ------ ------
Estndar ------ ------ ------ 0.02 mL ------
Agua destilada ------ ------ ------ ------ 0.02 mL
H2O2 1% 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL
Mantener los tubos a temperatura ambiente durante 20 minutos
cido actico 10.0 mL 10.0 mL 10.0 mL 10.0 mL 10.0 mL
10%
*Preparar una solucin estndar de hemoglobina con una concentracin de 150 mg/L a partir
de la solucin estndar de hemoglobina total.
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2. Mezclar y dejar reposar 10 min a temperatura ambiente, leer a 515 nm.

Abs. del problema


Clculos: mg de Hbl = ----------------------------- * concentracin del estndar (mg/L)
Abs. del estndar

3. Una vez ledos colocar el contenido de los tubos en un contenedor etiquetado como R3.

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CUESTIONARIO
1. Reporte sus resultados en la siguiente tabla:

Hematocrito* (cm)
Rata Absorbancia Hbt Absorbancia Hbl M1 M2 M1 M2

SSI
A
B
*M1 = altura total de la muestras, M2 = altura del paquete globular

2. Con los datos de la tabla anterior, calcule segn la seccin de tcnicas experimentales: Hto, Hbt, Hbl y
reporte sus resultados en la siguiente tabla:

Rata rganos* Frotis* Hto Hbt Hbl Efecto*


Hgado Bazo Wrigth NAM % g/dL mg/L Txico
A
B
SSI
*En los espacios para hgado, bazo, frotis Wrigth, NAM y efecto txico, calificar con cruces el efecto txico,
siendo (++) para el de mayor efecto, (+) para el menor y (-) para la ausencia de efecto.

3. Cules fueron las diferencias en las alteraciones morfolgicas en hgado y bazo para cada tratamiento?
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________

4. Cules fueron las diferencias observadas en las clulas sanguneas con respecto al control utilizando las
tinciones de Wright y NAM?
__________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________

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Laboratorio de Toxicologa

5. Qu relacin observ entre las alteraciones morfolgicas de las clulas sanguneas y la proporcin de
reticulocitos?
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________

6. Qu relacin observ entre las alteraciones morfolgicas de las clulas sanguneas y los valores de
hematocrito encontrados en cada una de las ratas? Qu relacin observ entre la proporcin de
reticulocitos, los valores de Hbl y Hbt?
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________

7. Qu relacin observ entre la proporcin de reticulocitos con los valores obtenidos de Hto?Cmo afect
la dosis de la solucin A y B al valor de Hbl y Hbt con respecto al control?
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________

8. Qu relacin observ entre los valores de Hbt y Hbl con el Hto en cada una de las ratas?
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________

9. Concluya qu solucin provoc mayor efecto txico.


__________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________

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Laboratorio de Toxicologa

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Blanke R.V., Decker W.J. Analysis of toxic substances. Textbook of clinical chemistry. Ed. Saunders.
Philadelphia. 1986, pp 1670-1744.
Clark E.E. Isolation and Identification of Drugs. Vol. I y II. Ed. Pharmaceutical Press, London. 1972
Klaassen, C.D. Casarett y Doulls Toxicology. The Basic Science of Poisons. (6a ed.). McGraw Hill, New York.
2001, pp 827-834.
Public information office and Bureau of consumer health. Los peligros del plomo www.kdhe.state.ks.us

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APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS

1. Fundamento de la determinacin de hemoglobina total, por el mtodo de la cianometahemoglobina y el de


la hemoglobina libre, por el mtodo de la bencidina.
2. Fundamento de la determinacin del hematocrito, por la tcnica del microhematocrito.
3. Fundamento de la tincin de Wrigth y del nuevo azul de metileno.
4. Tejidos principales de distribucin y depsito del plomo en el organismo.
5. Efectos que ocurren en los eritrocitos cuando la concentracin de plomo rebasa el valor de 80g/dL y qu
es lo que provoca esta manifestacin.
6. Efectos que producen la anemia que se manifiesta por la intoxicacin por plomo.
7. Vida media del plomo en sangre y huesos. Papel que juegan los eritrocitos en la relacin de concentracin
plasma/orina en la eliminacin del mismo.

APNDICE II: PREPARACIN DE REACTIVOS

Solucin salina isotnica (SSI)

Puede utilizarse la solucin comercial o preparar una soluci n de cloruro de sodio al 0.9 %. Para preparar
100 mL, se pesan 0.9 g de cloruro de sodio y se disuelven en 100 mL de agua destilada.

Reactivo de Drabkin. (preguntar al profesor si ya est preparado)


Bicarbonato de sodio (NaHCO3) 1.0 g
Ferricianuro de potasio (K3[Fe(CN)6]) 0.20 g
Cianuro de potasio (KCN) 0.05 g
Saponina 0.1 g
Agua destilada c.b.p. 1000 mL

Nota: El reactivo de Drabkin y la solucin estndar de CNMHb contienen derivados


de CIANURO, los cuales son txicos, sin embargo las concentraciones de stos estn
por debajo de la dosis letal referida a un litro de solucin.

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Nuevo azul de metileno: (preguntar al profesor si ya est preparado)

Nuevo azul de metileno 0.5 g


Oxalato de potasio 1.40 g
Cloruro de sodio 0.80 g
Agua destilada c.b.p. 100 mL
Filtrar antes de usar

Solucin de bencidina al 1%

Solubilizar 1 g de bencidina en 100 mL de cido actico al 10%.

Nota: La bencidina es un reactivo considerado como carcinognico por lo que se


deben extremar precauciones en su manejo.

Perxido de hidrgeno al 1%

Calcular la cantidad adecuada para preparar la solucin de perxido de hidrgeno de acuerdo con la
concentracin de la presentacin comercial.

cido actico al 10%

Calcular la cantidad adecuada para preparar la solucin de cido actico de acuerdo con la concentracin de la
presentacin comercial.

Colorante de Wright (preguntar al profesor si ya est preparado)

Utilizar colorante de Wright comercial. Agregar alcohol poco a poco, unos cuantos mililitros cada vez, y mezclar
bien con la ayuda de 10 a 20 esferillas de vidrio. Conservar bien tapado para evitar la evaporacin, guardar en un
sitio oscuro durante dos o tres semanas, mezclar con frecuencia. Filtrar antes de usarlo.

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APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS

R0: Jeringas sin aguja que estuvieron en contacto con acetato de plomo.
R1: Colorante de Wright, sangre de rata, EtOH.
R2: Sangre de rata, NaHCO3, K4[Fe(CN)6], KCN, saponina.
R3: Plasma de rata, bencidina, H2O2, cido actico.

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EFECTO DEL pH EN LA LIBERACIN DE METALES PESADOS POR


UTENSILIOS DE BARRO VIDRIADO

OBJETIVO ACADMICO

Que el alumno determine cualitativamente la presencia de plomo en recipientes de cermica a diferentes valores
de pH.

PROBLEMA
Realizar un anlisis cualitativo comparativo de varios tratamientos de curado para vasijas de barro vidriado y
sugerir cul de ellos presenta mejores resultados para reducir el contenido de plomo en estos recipientes. Discutir
el riesgo de exposicin al plomo liberado por recipientes de barro vidriado en los seres humanos.

REACTIVOS

Agua destilada cido clorhdrico (HCl)


Hidrxido de sodio 1 N (NaOH) cido ntrico (HNO3)
Yoduro de potasio (KI)

MATERIAL POR EQUIPO

Vasija de barro vidriado * 6 Mechero 3


Tubos de ensayo 13x100 10 Rejilla de asbestos 3
Anillo metlico 3 Gradilla 1
Papel pH 3 Pipetas de 1 mL 3
Probeta de 100 mL 1 Pinza para tubos 1

*Este material debe ser nuevo y del mismo lote, se requiere la cantidad de 6 por cada dos equipos con una
capacidad mxima aproximada de 250 mL.

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DESARROLLO EXPERIMENTAL

1. Previo a la sesin, el profesor indicar a los alumnos los tratamientos de curado a realizar a 3 de las 6
vasijas:

Vasija 1 - Ajo: Untar ajo suficiente para cubrir la superficie del interior de la vasija de barro y dejar
reposar por un da antes de lavarla con jabn eliminando cualquier residuo que se haya formado, secar.

Vasija 2 - Vinagre: Llenar partes de la vasija con vinagre blanco y hervir durante 1 hora, reponiendo
el volumen perdido durante esta operacin. Lavar y secar.

Vasija 3 - Cal: Agregar una cucharada sopera de CaCO3 comercial por cada 100 mL de agua y hervir
durante 1 hora, reponiendo el volumen perdido durante esta operacin. Lavar y secar.

2. Marcar las vasijas no curadas como A, B y C y reunirlas con las vasijas curadas 1,2 y 3.
3. Colocar el volumen necesario en cada una segn el diseo de la siguiente tabla.
Tabla 1. Diseo experimental.
A B C 1 2 3

Solucin HCL, pH 2 X X X X
Solucin NaOH, pH 10 X
Agua destilada X

4. Calentar las vasijas a ebullicin y dejarlas hervir 30 minutos. En caso de que el contenido de agua
disminuya considerablemente reponer el volumen perdido con agua.
5. Agitar y raspar ligeramente las paredes de cada vasija con una esptula.
6. Colocar por separado 0.5 mL de solucin de cada vasija en tubos de ensayos.
7. Enfriar los tubos con ayuda del agua de la llave por la parte exterior, y medir el pH.
8. Agregar a cada tubo tres gotas de HNO3 concentrado.
9. Agregar a cada tubo, 1 mL de la solucin de yoduro de potasio procurando que la solucin caiga
directamente en el contenido del tubo. Agitar por unos segundos, dejar reposar en su gradilla y observar.

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10. Una solucin o precipitado amarillo indica la presencia de plomo. Emplee un control negativo con agua
destilada y proceda de la misma forma como se indica en los pasos 6 y 7.
11. Una vez obtenidos los resultados vaciar el contenido de los tubos en un contenedor etiquetado como R1.
12. Reunir el contenido de las vasijas con tratamiento cido (A, 1, 2, y 3) en el contenedor etiquetado como
R1.
13. Reunir el contenido de las vasijas con tratamiento neutro (C) y bsico (B) en un contenedor etiquetado
como R2.

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CUESTIONARIO
1. Reporte sus resultados en la siguiente tabla, indicando la presencia de plomo con cruces: negativo(-), bajo
(+), medio (++), alto (+++). Utilice el control negativo como referencia.
Tabla 1. Resultados.
Vasija pH inicial pH final Presencia de plomo
A HCl
B NaOH
C agua destilada
1 ajo
2 vinagre
3 cal

2. Compare los resultados obtenidos entre las vasijas A, B, y C. Concluya que mtodo de extraccin fue ms
eficiente.
_________________________________________________________________________________

3. Compare los resultados obtenidos en las vasijas 1, 2 y 3 con la vasija A e indique si hay alguna diferencia.
A qu la atribuye?
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________

4. Compare los resultados obtenidos entre las vasijas 1, 2 y 3. Concluya qu mtodo de curado fue ms
eficiente.
__________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
5. Considera usted que los alimentos contenidos en vasijas de barro podran ser una fuente de exposicin a
plomo?
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEANZA 100


Laboratorio de Toxicologa

6. Considera que el proceso de curado es suficiente para evitar la exposicin a plomo? Justifique su
respuesta.
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Blanke R.V. Decker W.J. Analysis of toxic substances. Textbook of clinical chemistry. Philadelphia, Saunders.
1986, pp 1670-1744.
C.D. Klaassen. PhD. Casarett y Doulls. Toxicology. The basic science of poisons. 6th edition. McGraw Hill.
2001, pp 827-834.
Clark E. E. Isolation and Identification of Drugs. Vol. I y II. Ed. Pharmaceutical Press, London, 1972.
L. Torres-Snchez, L. Lpez-Carrillo y C, Ros. Eliminacin del plomo por curado casero. Salud Pblica,
Mxico. 41:5106 5108 (1999).
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM- 009- SSA1- 1993. Salud ambiental. Cermica vidriada. Mtodos de
prueba para la determinacin de plomo y cadmio solubles.
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM- 010- SSA1- 1993. Salud Ambiental. Artculos de cermica vidriados.
Lmites de plomo y cadmio solubles.
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-231-SSA1-2002. Artculos de alfarera vidriada, cermica vidriada y
porcelana. Lmites de plomo y cadmio solubles. Mtodo de ensayo.
Public information office and Bureau of consumer health. Los peligros del plomo www.kdhe.state.ks.us

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APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS

1. Proceso de vidriado de utensilios de barro.


2. Reacciones que se llevan a cabo en las vasijas de barro vidriado A y B durante el proceso de extraccin e
identificacin.
3. Precauciones que se pueden aplicar en casa para reducir el riesgo de exposicin a plomo por consumo de
alimentos.
4. Cinco alimentos de alta acidez y cinco de baja acidez.
5. Lmite mximo permitido de plomo en utensilios de barro vidriado por la NOM vigente.

APNDICE II: PREPARACIN DE REACTIVOS

Solucin de HCl pH 2 y solucin de NaOH pH 10

Calcular la cantidad adecuada para preparar la solucin de pH = 2 con HCl y la solucin de pH 10 con NaOH.

Solucin de yoduro de potasio 16.5% (KI)

Pesar 16.5 g de KI, colocarlos en un matraz aforado de 100 mL, disolver en aproximadamente 25 mL de agua,
mezclar y aforar. Esta solucin es sensible a la luz.

APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS

R1: HCl, HNO3, PbI2, KI


R2: NaOH, PbI2

Nota: El responsable de residuos reunir el contenido de R1 y R2 al finalizar la sesin,


tomando las precauciones necesarias y etiquetando el recipiente final.

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DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE ETANOL EN UNA MUESTRA


PROBLEMA

OBJETIVO ACADMICO

Que el alumno realice la determinacin presuntiva y cuantitativa de etanol en muestras problemas mediante un
mtodo indirecto.

PROBLEMA

Cuantificar al menos el 80% de la concentracin de etanol en mg/dL en dos muestras problema y mediante los
resultados obtenidos indicar el grado de intoxicacin de los sujetos de los cuales provienen las muestras
analizadas.

REACTIVOS
Dicromato de potasio* (K2Cr2O7) Carbonato de potasio* (K2CO3)
cido sulfrico (H2SO4) Etanol (EtOH)
* Ver APNDICE II

EQUIPO
Espectrofotmetro
Estufa
Balanza analtica

MATERIAL

Cajas de Petri con centro de vidrio 2 Matraces volumtricos de 10 mL 3


Pipetas volumtricas de 2 mL 3 Pinzas para tubo de ensayo 3
Pipetas volumtricas de 1 mL 4 Papel filtro (2 x 5 cm) 1
Tubos de ensayo 16 x 150 6 Pipetas graduadas de 5 mL 3
Celdas de vidrio para espectrofotmetro 2 Pipetas graduadas de 1 mL 3
Pipetas volumtricas de 5 mL 5 Pipetas Pasteur con globo 4
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEANZA 103
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DESARROLLO EXPERIMENTAL
A cada alumno se le proporcionarn 2 muestras problema a las cuales se les realizar la determinacin
presuntiva y cuantitativa de etanol.

I. Determinacin presuntiva de etanol


1. Rotular 4 tubos como control positivo, control negativo, muestra 1 y muestra 2.
2. Al tubo control positivo agregarle 5 gotas de etanol.
3. Al tubo control negativo agregarle 5 gotas de agua destilada.
4. A los tubos muestra 1 y 2 agregarles 1 mL de cada una de las muestras problema respectivamente.
5. A cada uno de los tubos, adicionarles 0.5 mL de solucin de K2Cr2O7 (Solucin A).
6. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente y observar la coloracin de los tubos.
7. Reunir el contenido de los 4 tubos y confinarlos en un recipiente etiquetado como R1.

II. Determinacin cuantitativa de etanol

Centro de vidrio

Esquema 1. Cmara de Conway.

Cada una de las muestras se tratar de acuerdo con el siguiente procedimiento:


1. Colocar 2 mL de la solucin B de K2Cr2O7 en el recipiente B.
2. Adicionar 1 mL de solucin saturada de K2CO3 en el recipiente A, agitando suavemente.
3. Colocar 1 mL de la muestra problema en el recipiente A y tapar inmediatamente con el recipiente C, como
se muestra en el Esquema 1.
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEANZA 104
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4. Colocar la cmara de Conway en una estufa a 40 C, durante 45 minutos.


5. Una vez transcurrido el tiempo indicado, transferir el contenido del recipiente B a un matraz volumtrico
de 10 mL, lavando perfectamente dicho recipiente y la parte externa del recipiente A con un volumen
mximo de 5 mL para ambos recipientes. Finalmente, aforar a 10 mL con agua destilada (en ocasiones
puede aparecer un precipitado que desaparece al aforar con agua destilada).
6. Determinar la absorbancia a 450 nm, utilizando como blanco agua destilada.
7. Determinar la absorbancia de la solucin B de dicromato de potasio diluida 1 a 10, a 450 nm, utilizando
como blanco agua destilada. Esta solucin se utilizar como referencia para realizar los clculos
pertinentes.
8. Confinar el contenido del recipiente B y la solucin de referencia en el frasco etiquetado como R1.

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEANZA 105


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CUESTIONARIO

1. Reporte en la siguiente tabla sus resultados de la prueba presuntiva para cada muestra.
Tabla 1. Resultados presuntivos.
Muestra Coloracin Resultado (+/-)
1
2
Control negativo
Control positivo

2. Considera que la intensidad de color en la prueba presuntiva es un indicador de la concentracin de EtOH


en sus muestras?
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________

3. Proponga una modificacin a la tcnica presuntiva que le permita emplearla como prueba cuantitativa.
___________________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________________

4. Indique las lecturas de absorbancia obtenidas para cada muestra. Calcular la concentracin de etanol en la
muestra en mg/dL, desglosando los clculos realizados para cada una de las muestras tomando en cuenta
la lectura de absorbancia de la solucin de referencia. Considere todas las diluciones realizadas tanto de su
muestra como de la solucin de referencia.
Tabla 2. Resultados de la prueba cuantitativa.
Muestra Absorbancia Dilucin* Concentracin (mg/dL)
1
2
Solucin de referencia
*En caso de haberse realizado.

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5. Con los valores obtenidos en sus muestras relacione la sintomatologa en la siguiente tabla y concluya si
los valores se encuentran por encima del lmite legal establecido.

Tabla 3. Observaciones clnicas segn el grado de intoxicacin.


Concentracin Observaciones clnicas
(mg/dL)
50 a 150 Falta de coordinacin, tiempo de reaccin lento, y visin
borrosa.
150 a 300 Deterioro visual, tambaleo y lenguaje cercenado, hipoglucemia
intensa, sobre todo en nios.
300 a 500 Falta notoria de coordinacin, estupor, hipoglucemia y
convulsiones.
500 Coma y muerte, excepto en individuos tolerantes.

__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________

6. Cul es la concentracin mxima de EtOH que se puede determinar con este protocolo?
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________
7. Qu resultados esperara si la concentracin de EtOH en la muestra es mayor a la concentracin mxima
que puede determinar el protocolo?

__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________

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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Fister, H.J. Ethyl alcohol. Manual of standardized procedures for spectrophotometric chemistry. E-10a.1-E-
10b.3 (1950) U.S.A. Standard scientific supply corporation. U.S.A.
Hobbs, W.H., Rall, T.W., Verdoorn. T.A. Hipnticos y sedantes: etanol. En: Goodman & Gilman. Las bases
farmacolgcas de la teraputica. 1 9a ed. Ed. McGraw-Hill Interamericana, Mxico D.F., 1996, pp 411-
419.
Klassen, C.D. Watkins, J.B. Efectos de los solventes y vapores en Toxicologa Clnica. En: Casarett & Doull,
Manual de Toxicologa, la ciencia bsica de los txicos. (5 ed.) McGraw-Hill Interamericana, Mxico
D.F. 2001, pp 739-744, 934-935.
Pesce, A.J., y Kaplan, L.A. Alcohol por T. J. Schroeder. Methods in clinical chemistry. The C.V. Mosby
Company. U.S.A., 1987, pp 324-329.
Sunshine, I. Ethanol. Methodology for Analitical Toxicology. CRC Press, Inc., 1978, pp 145-154.

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APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS

1. Balanceo de la siguiente ecuacin:

CH3OH + K2Cr2O7 Cr3+ + R-COO -

2. Color de las soluciones que contienen cromo (VI) y cromo (III).


3. Especificidad de la prueba, tipo de sustancias que pueden dar un resultado falso positivo.
4. Longitud mxima de absorcin del K2Cr2O7 en el visible.
5. Fundamento de la prueba presuntiva.
6. Fundamento de la prueba cuantitativa.
7. Propsito de adicionar solucin saturada de K2CO3 e incubar.
8. Lmite mximo de EtOH en sangre legalmente establecido para conductores.
9. Calcular la concentracin de etanol en sangre de la siguiente muestra problema:
10. Solucin de referencia: 2 mL de una solucin 0.01 M de dicromato de potasio se diluyeron a 10 mL, de
esta solucin se tomaron 5 mL y se diluyeron a 10 mL. La lectura de absorbancia para la ltima solucin,
a 450 nm, fue de 0.205.
11. Muestra: 2 mL de la solucin 0.01 M de dicromato de potasio se colocaron en la celdilla B y se hicieron
reaccionar con 1 mL de muestra problema (celdilla A). Al trmino de 45 minutos de calentamiento, el
contenido de la celdilla B se diluy a 10 mL y se ley a 450 nm, dando una absorbancia de 0.23.
Respuesta: 60.72 mg de etanol/100 mL de sangre.

APNDICE II: PREPARACIN DE SOLUCIONES

Solucin A: Solucin de dicromato de potasio (K2Cr2O7)

Pesar 2.5 g de K2Cr2O7 y solubilizarlo en 20 mL de H2SO4 al 50 %, aforar a 100 mL con H2SO4 al 50%.

Solucin B: Solucin de dicromato de potasio (K2Cr2O7)

Disolver 0.5 g de K2Cr2O7 en 25 mL de agua destilada y agregar cuidadosamente 40 mL de H2SO4 concentrado,


dejar enfriar y diluir con agua destilada a 100 mL.

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Nota: El contacto con altas concentraciones de dicromato de potasio puede


resultar en ulceracin de manos, destruccin de membranas mucosas y
perforacin del tabique nasal.

Solucin saturada de carbonato de potasio (K2CO3)

Con agitacin, agregar la cantidad necesaria de K2CO3 en el volumen de agua destilada a preparar hasta su
saturacin (se observa que ya no se disuelve). Posteriormente filtrar.
PM del etanol: 46 g/mol
PM del K2Cr2O7: 294.7 g/mol
Densidad del etanol: 0.7893 a 20C

APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS

R1: EtOH, K2Cr2O7, H2SO4, CH3COOH, Cr(SO4)3, K2SO4, K2CO3

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GUIONES COMPLEMENTARIOS

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EXTRACCIN Y CUANTIFICACIN DE TXICOS NO VOLTILES EN UNA MUESTRA


PROBLEMA

OBJETIVO ACADMICO

Que el alumno emplee mtodos de extraccin cida y bsica para obtener eficientemente txicos no voltiles de
naturaleza cida y bsica en una muestra problema y concluya que mtodo de extraccin es el ms eficiente.

PROBLEMA

Establecer las condiciones ms adecuadas para realizar una extraccin mayor o igual al 90% de los txicos no
voltiles cidos y bsicos (cido acetilsaliclico [AAS] y cafena) presentes en una muestra problema. La muestra
deber trabajarla en medio cido y medio bsico.

REACTIVOS

cido tartrico Cafena


Hidrxido de sodio (NaOH) Cloroformo (CHCl3)
Nitrato frrico (Fe(NO3)3) Salicilato de sodio
cido clorhdrico (HCl) Cloruro mercrico (HgCl2)
Bicarbonato de sodio (NaHCO3) Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4)

EQUIPO

Espectrofotmetro Balanza analtica


Rotaevaporador Vrtex

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MATERIAL

MATERIAL POR EQUIPO


Gradilla 1 Piseta con agua destilada 1
Tubos de ensayo 13 x 100 4 Matraces de bola de 50 mL 2
Matraces aforados de 10 mL 2 Pipetas Pasteur 2
Matraces aforados de 25 mL 2 Probeta de 25 mL 1
Embudos de separacin de 250 mL 2 Esptula 1
Matraz Erlenmeyer de 250 mL 1 Pipetas graduadas de 10 mL 2
Matraces Erlenmeyer de 50 mL 2 Pipetas graduadas de 5 mL 2
Anillos metlicos 2 Pipeta graduada de 1 mL 1

MATERIAL PARA LA CURVA PATRN


Gradilla 1
Matraces volumtricos de 10 mL 5
Matraces volumtricos de 25 mL 5
Tubos de ensayo 10
Vaso de precipitado de 100 mL 1
Pipeta graduada de 1 mL 1
Pipeta graduada de 10 mL 1

Nota: El profesor proporcionar las celdas a los alumnos.

DESARROLLO EXPERIMENTAL

El profesor proporcionar 30 mL de muestra problema la cual deber dividirse en dos porciones de 15 mL para
realizar a una porcin la extraccin en medio cido y a la otra porcin la extraccin en medio bsico. La
cuantificacin de cido acetilsaliclico (AAS) y cafena se determinar siguiendo los apndices correspondientes.

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A) PROCESO DE EXTRACCIN EN MEDIO CIDO PARA TXICOS NO VOLTILES

1. Agregar cido tartrico hasta un pH = 2.

2. La solucin cida se extrae con 2 porciones de 15 mL de CHCl3, separando las fases orgnicas y reunindolas
en un matraz.

3. La fase acuosa se guarda, etiquetndola como fraccin A.

4. La fase orgnica se extrae con dos porciones de 10 mL de agua destilada y se renen las fases acuosas con la
fraccin A.

5. Tratamiento de la fase orgnica: esta fase se trata con 5 mL de una solucin saturada de NaHCO3, se separan
las fases. Etiquetar la fase acuosa como fraccin B. Tratar esta fraccin como se indica en el inciso C.

5.1. Extraer la fase orgnica con 5 mL de NaOH 0.1 N. La fase acuosa resultante, etiquetarla como fraccin C y
trabajarla como se indica en el inciso C. La fase orgnica resultante marcar como R1.

6. Tratamiento de la fraccin A. La fase acuosa obtenida del inciso 4 se alcaliniza hasta pH = 10 con NaOH 2.5 N.

6.1. Extraer con dos porciones de CHCl3 de 10 mL (2 x 10 mL CHCl3) y separar las fases. Desechar la fase
acuosa resultante en el contenedor etiquetado como R2.

6.2. Concentrar la fase orgnica hasta sequedad en rotaevaporador. Etiquetar como fraccin D y tratarlo como se
indica en el inciso D. El disolvente orgnico resultante que se encuentra en el matraz de condensacin debe ser
desechado en el contenedor etiquetado como R1.

B) PROCESO DE EXTRACCIN EN MEDIO BSICO PARA TXICOS NO VOLTILES

1. La muestra se ajusta a pH = 10 con NaOH 2.5 N.

2. Realizar la extraccin con dos porciones de CHCl3 de 15 mL, separando las fases.

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3. La fase orgnica se concentra hasta sequedad y el residuo se etiqueta como fraccin E y se trata como se
indica en el inciso D.

4. La fase acuosa se etiqueta como fraccin F y se trata segn el inciso C.

C) CUANTIFICACIN DE CIDO ACETILSALICLICO

Tratamiento de la muestra (Fracciones B, C y F)

1. Colocar 1 mL de las fracciones B, C y F en tubos de forma separada y adicionar a cada una 5 mL del reactivo
para desarrollar color (Apndice II), agite, espere 2 min.
2. Determinar la absorbancia a 540 nm. Si la lectura de absorbancia no cumple con la ley de Lambert y Beer,
realice las diluciones necesarias, repita el procedimiento y vuelva a realizar la lectura.
3. Calcular la concentracin de AAS presente en su muestra, interpolando la lectura de absorbancia en la curva
patrn.
4. Despus de haber realizado la lectura y una vez obtenidos los resultados, las fracciones B, C y F se renen y
desechan en el contenedor etiquetado como R3.

Curva patrn del AAS

1. Solucin patrn de salicilato de sodio (1000 g/mL): Pesar 25 mg de salicilato de sodio y disolverlo. Llevar
hasta 25 mL con agua destilada.
2. A partir de la solucin patrn de salicilato de sodio (1000 g/mL), preparar la curva patrn como se describe
a continuacin (realizar dos curvas patrn por grupo).

Alcuota de la
Aforo con agua
solucin patrn Concentracin (g/mL)
destilada
(mL)
0.5 10 50
1 10 100
3 10 300
5 10 500
7 10 700

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En un tubo de ensaye colocar 1 mL de las soluciones recin preparadas y adicionar 5 mL del reactivo para
desarrollar color (Apndice II), agitar la muestra en un vrtex durante 1 min, esperar 2 min y determinar la
absorbancia a una longitud de onda de 540 nm, ajustando a cero con un blanco (1 mL de agua y 5 mL del
reactivo para desarrollar color).

D) CUANTIFICACIN DE CAFENA

Tratamiento de la muestra (Fracciones D y E)

1. Disolver por separado los residuos de las fracciones D y E en 5 mL de NaOH 0.1 N. Transferirlo a un matraz
volumtrico de 25 mL y aforar con NaOH 0.1 N.
2. Determinar la absorbancia de la solucin anterior a 275 nm utilizando NaOH 0.1 N como blanco. Si la
lectura de absorbancia obtenida no cumple con la ley de Lambert y Beer, realice las diluciones necesarias con
NaOH 0.1N.
3. Calcular la concentracin de cafena presente en su muestra, interpolando la lectura de absorbancia en la
curva patrn.
4. Despus de haber realizado la lectura y una vez obtenidos los resultados, las fracciones D y E se renen y
desechan en el contenedor etiquetado como R2.

Curva patrn

1. Solucin patrn de cafena (100 g/mL). Disolver 10 mg de cafena anhidra en 10 mL de NaOH 0.1 N y
afore con la misma solucin a 100 mL.
2. A partir de la solucin patrn de cafena (100 g/mL) preparar la curva patrn como se describe a
continuacin. Por grupo realizar dos curvas patrn.

Alcuota de la
Aforo con NaOH 0.1
solucin patrn Concentracin (g/mL)
N
(mL)
1 25 4
2 25 8
3 25 12
4 25 16
5 25 20

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3. Determinar la absorbancia de la curva patrn a una longitud de 275 nm, ajustando a cero con un blanco
(NaOH 0.1 N).

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CUESTIONARIO

1. En el caso de emplear una muestra biolgica indique cul es el objetivo de adicionar cido tartrico
adems de ajustar el pH?

____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________

2. Una vez desarrollado el guin para una eficiente extraccin de un xenobitico qu puntos del proceso y
propiedades fisicoqumicas considera que son crticos?

____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________

3. Complete la siguiente tabla e indique los datos de la regresin lineal de cada curva.

Tabla 1. Curva Patrn.


Abs* Abs* Abs* Abs*
AAS cafena
curva curva curva curva
[g/mL] [g/mL]
1 2 1 2
50 4
100 8
300 12
500 16
700 20
Pendiente (m) Pendiente (m)
Ordenada al origen (b) Ordenada al origen (b)
Coeficiente de correlacin lineal Coeficiente de correlacin lineal
(r) (r)
*Abs: Absorbancia

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Tabla 2. Lecturas de Muestras.

Absorbancia de las fracciones


Equipo
B C F D E
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

4. Interpole los datos de absorbancia de cada una de sus fracciones y calcule la concentracin de AAS y/o
cafena en su muestra indicando el procedimiento que sigui para realizarlo.

5. Es necesario considerar el factor de dilucin para calcular la concentracin inicial de los xenobiticos en su
muestra? Justifique su respuesta.

________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

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6. Complete las siguientes tablas y de acuerdo con los resultados grupales concluya cul es el mejor mtodo de
extraccin para los xenobiticos analizados.

Tabla 3. Resultados grupales AAS.


Extraccin en medio cido Extraccin en medio bsico
Equipo Concentracin Concentracin
Rendimiento (%) Rendimiento (%)
(g/mL) (g/mL)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Tabla 4. Resultados grupales cafena.
Extraccin en medio cido Extraccin en medio bsico
Equipo Concentracin
Rendimiento (%) Concentracin (g/mL) Rendimiento (%)
(g/mL)
1
2
3

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7. En caso de no haber obtenido un rendimiento superior al 90% analice a que puede atribuirse el hecho.

__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Casarett, L.J. Caffeine biotransformation. En: Casarett & Doulls Toxicology: The basic science of poisons.
McGraw Hill, New York, 2001, p 1071.
Casarett, L.J. Salicylic acid, biotransformation. En: Casarett & Doulls, Toxicology: The basic science of
poisons. McGraw Hill, New York, 2001, p 203.
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body fluids and post-mortem material. Vol. 1. Pharmaceutical Press, London, 1974, p 3-15.
Clarke, E.G.C. Extraction Methods in Toxicology. En: Isolation and identification of drugs in pharmaceuticals
body fluids and post-mortem material. Vol. 1. Pharmaceutical Press, London, 1974, p16-30.
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mortem material. Vol. 1. Pharmaceutical Press, London, 1974, pp 123134.
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London, 1991, pp 1-11.
Goodman & Gilman. Las bases farmacolgicas de la teraputica. Vol I, (9 ed.) McGraw-Hill, Mexico, 1996,
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Goodman & Gilman. Las bases farmacolgicas de la teraputica. Vol I, (9 ed.) McGraw-Hill, Mexico, 1996,
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Klaassen, C.D., Analytic Toxicology. En: Toxicology the basic science of poisons. (5 ed.) McGraw-Hill, 1996,
pp 952-953.
Zubair, M.C., Hassan M.A. y Al-Meshal I.A. Caffeine. En: Analytical Profiles of drug substances, Vol. 15.
Florey, K. (Ed.). Academic Press Inc., London, 1991, p 71-150.

PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEANZA 121


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APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS

1. Efectos txicos del cido acetilsaliclico (AAS) y de la cafena.


2. Relacin entre el pKa de una sustancia con el pH del medio en el que se encuentra disuelto.
3. Estructura de la forma inica y no inica del AAS y de la cafena.
4. Reaccin de hidrlisis del AAS.
5. Valores de pKa del AAS, cido saliclico, cido tartrico, cido actico y de la cafena
6. Solubilidad de una sustancia inica en medio acuoso y disolvente orgnico.
7. Densidad de los disolventes a emplear.
8. Fundamento de una extraccin mltiple y selectiva.
9. Sustancias que pueden precipitar protenas.
10. Esquema de los procesos de separacin empleados tanto en medio cido como en medio bsico
especificando qu especies qumicas se encuentran en cada una de las fases.
11. Propsito de lavar la fase orgnica con dos porciones de agua destilada en la extraccin en medio cido.
12. Propsito de juntar las facciones acuosas obtenidas de la particin con CHCl3 con la fraccin A en el
proceso de extraccin en medio cido.
13. Objetivo de adicionar NaHCO3 y NaOH 0.1N en el proceso de extraccin cida.
14. Naturaleza de los compuestos obtenidos en cada una de las fracciones.
15. Dibujo de la reaccin de identificacin y cuantificacin del AAS.
16. Rango de absorbancia en el cual se cumple la ley de Lambert y Beer.
17. Razn por la cual se determinan la cafena y el AAS a diferentes longitudes de onda.
18. Forma de obtener el rendimiento de la extraccin de una sustancia.
19. El anlisis de una muestra biolgica de 20 mL para determinar la presencia de salicilatos y/o cafena arroj
las siguientes lecturas de absorbancia:

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Tabla 1. Absorbancia y volumen final de las fracciones B,C y D.

Absorbancia a Volumen Absorbancia a Volumen


= 540 nm (mL) = 275 nm (mL)
fraccin B = 0.613 15 fraccin D = 0.785 6
fraccin C = 0.456 7

Para la realizacin de los clculos considere el proceso de extraccin en medio cido descrito en el
guin experimental y tome en cuenta las diluciones necesarias.

Las lecturas de absorbancia de las curvas patrn para AAS y cafena son las que se muestran a
continuacin:
Tabla 2. Curva patrn.
AAS Cafena
Concentracin A = 540 nm Concentracin A = 275 nm
[g/mL] [g/mL]
50 0.060 4 0.184
100 0.133 8 0.484
300 0.421 12 0.684
500 0.713 16 0.885
700 0.970 18 1.000
-3 -3
b = 5.8 x 10 b = 9.2 x 10
-3
m = 1.409 x 10 m = 0.0566
r= 0.999 r =0.996

Calcule la concentracin de AAS y Cafena en la muestra inicial.

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APNDICE II: PREPARACIN DE REACTIVOS

Reactivo para desarrollar color:

Pesar 4 g de HgCl2 y disolverlo en 12 mL de HCl 1N. Adicionar 4 g de Fe(NO3)3 y agitar hasta su total
disolucin. Diluir con agua destilada a 100 mL (considerar cantidades adicionales para el blanco y curva patrn)

Solucin de hidrxido de sodio 2.5 N

Disolver 10 g de NaOH en 25 mL de agua destilada y aforar a 100 mL.

Solucin de hidrxido de sodio 0.1 N

Disolver 0.4 g de NaOH en 25 mL de agua destilada y aforar a 100 mL.

Solucin de cido clorhdrico 1 M

Colocar 83 mL de HCl concentrado en un matraz aforado y adicionar agua destilada hasta 1 L.

Solucin de cido tartrico al 10%

Colocar 10 g en 100 mL de agua destilada.

Solucin saturada de bicarbonato de sodio.

Colocar una cantidad aproximada de bicarbonato de sodio R.A., en 10 mL de agua destilada, hasta que no se
pueda disolver en fro.

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APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS

R1: Cloroformo (restos de cido acetilsaliclico y cafena)


R2: Solucin acuosa bsica de NaOH (pH = 10), tartrato de sodio y restos de cafena ionizada, cido
acetilsaliclico y cido saliclico.
R3: Solucin acuosa con HgCl2 y Fe(NO3)3.

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DETERMINACIN DE MALATIN RESIDUAL

OBJETIVO ACADMICO

Que el alumno sea capaz de extraer y cuantificar un xenobitico empleando sus propiedades cido-base y
reacciones de degradacin.

PROBLEMA

Cuantificar malatin residual en la superficie de vegetales comestibles y reportar un porcentaje de recuperacin


mayor o igual al 75% en la muestra control. Relacionar la cantidad de insecticida presente en ambas muestras
con el riesgo toxicolgico de su consumo.

MATERIAL VEGETAL
Traer por equipo 50 g de cscara de limn, calabaza o chayote; o bien 50 g de hojas externas de col o coliflor.

MATERIAL POR EQUIPO


Frascos de vidrio de boca ancha con
tapa (traer por equipo) 2 Probeta graduada de 25 mL 1
Pipeta volumtrica de 10 mL 1 Tubos de ensaye de 16 x 150 2
Pipetas graduadas de 1 mL 3 Vasos de precipitados de 100 mL 2
Pipetas graduadas de 5 mL 2 Propipeta 1
Pipetas graduadas de 10 mL 2 Soportes universales con anillos de fierro 2
Embudos de filtracin rpida 2 Embudos de separacin de 125 mL 2
Probeta graduada de 50 mL 1 Papel filtro

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MATERIAL PARA LA CURVA


Embudos de separacin de 125 mL 3 Pipeta graduada de 5 mL 1
Tubos de ensaye de 16 x 150 3 Vasos de precipitados de 100 mL 3
Embudos de filtracin rpida 3

REACTIVOS
Sulfato de sodio* (NaSO4) Malatin al 50%
Hidrxido de sodio* (NaOH) Fenoftalena*
Cloruro frrico* (FeCl3) Etanol (EtOH)
Sulfato cprico* (CuSO4) Tetracloruro de carbono (CCl4)
Acetona Disulfuro de carbono (CS2)
* Ver APNDICE II

DESARROLLO EXPERIMENTAL

1. Colocar 25 g del material de estudio (nicamente la cscara o superficie del vegetal) en un frasco de vidrio
de boca ancha y aadir 30 mL de CCl4, tapar y agitar vigorosamente durante 5 minutos.
2. Filtrar y recolectar cuando menos 20 mL (medir el volumen exacto con una probeta).
3. Desechar el material vegetal tratado con CCl4 colocndolo sobre un papel peridico, identificar como R1 y
colocar en la campana. Al finalizar la sesin los responsables de seguridad e higiene debern colocar R1 en
una bolsa de plstico y cerrarla.
4. Preparar un tubo problema con 10 mL del extracto filtrado midiendo con pipeta volumtrica. Adicionar a
cada tubo 0.2 mL de solucin de CS2 al 0.5% y 5 mL de etanol. Pasar esta mezcla a un embudo de
separacin y agitar suavemente.
5. Adicionar 15 mL de solucin cida de Na2SO4 al 9% y agitar cuidadosamente el embudo por 1 minuto.
6. Colectar la fase orgnica en un vaso de precipitado y filtrarla transfirindola nuevamente al embudo de
separacin enjuagado previamente con acetona. Etiquetar la fase acuosa como R2.

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7. Aadir 5 mL de etanol, agitar y aadir 0.2 mL de NaOH 6N. Agitar nuevamente por 5 minutos, dejar
reposar durante 1 minuto y adicionar 15 mL de solucin de Na2SO4 al 9%. Mezclar, separar las fases,
recolectar la fase acuosa y desechar la fase orgnica etiquetndola etiquetar como R3.
8. Aadir 5 mL de CCl4 a la fase acuosa y una gota de indicador fenoftalena al 1%. Neutralizar gota a gota
con HCl 6N con agitacin continua hasta la desaparicin del color azul violeta.
9. Aadir 0.2 mL de solucin de FeCl3, agitar y desechar la fase orgnica en el recipiente etiquetado como R3.
10. Aadir a la fase acuosa 5 mL de CCl4 y 0.3 mL de solucin de CuSO4 al 3.5% y agitar. Colectar la fase
orgnica y desechar la fase acuosa etiquetndola como R4.
11. Leer la fase orgnica en el espectrofotmetro a 416 nm, ajustando previamente a 100% de transmitancia con
CCl4.
12. Una vez que se obtengan los resultados finales desechar la fase orgnica etiquetndola como R5.

PROCEDIMIENTO PARA LA CURVA PATRN


Preparar la curva patrn de la siguiente forma:

Tabla 1. Procedimiento para la curva patrn de malatin.


Tubo Reactivos Concentracin
1 1 mL de solucin patrn de malatin + 4 mL de etanol 8 g/mL
2 2.5 mL de solucin patrn de malatin + 2.5 mL de etanol 20 g/mL
3 5.0 mL de solucin patrn de malatin 40 g/mL
Colocar el contenido de cada tubo en un embudo de separacin. Adicionar 10 mL de CCl 4 y 0.2 mL de solucin
de CS2 al 0.5%. Agitar suavemente y continuar el procedimiento como en la muestra a partir del inciso 5.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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Morifusa. E. Organophosphorus pesticides: Organic and Biological Chemistry. CRC Press, Cleveland, 1979,
pp 6277, 103, 196199.
Negherban, O.W. Handbook of toxicology: Insecticides. W. B. Saunders Comp., E.U.A., 1959, pp 451464.
Norris, M.V., Voil, W.A., Averall, P.R. (1954). Colorimetric estimation of malation residues. Journal of
Agricultural and Food Chemistry. 2, pp 570.
Robertson, W.O., Dreishbad, R.H. Manual de Toxicologa Clnica. Prevencin, Diagnstico y Tratamiento. El
Manual Moderno (6 ed.), Mxico, 1987, pp 95104.
White-Stevens, R. Pesticides in the Enviroment Part I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, 1971.

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CUESTIONARIO

1. Reporte sus resultados en la siguiente tabla:


Tabla 1. Resultados.
Malatin (g/mL) %Transmitancia Absorbancia
8
20
40
Muestra 1
Muestra 2
Pendiente (m)
Ordenada al origen (b)
Coeficiente de correlacin lineal (r)

2. Explique por qu se determinan las lecturas en transmitancia.

________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

3. Indique el procedimiento que sigui para realizar los clculos de concentracin de malatin en sus muestras.

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4. Reporte los resultados grupales en la siguiente tabla:

Tabla 2. Resultados grupales.


Equipo Material Malatin Rendimiento Malatin en la muestra Riesgo
vegetal (g/mL) (ppm) txico*
1
---
2
---
3
---
4
---
5
---
6
---
7
---
8
---
9
---
10
---

* Alto 8 ppm; bajo < 8 ppm

5. De acuerdo con los resultados obtenidos concluya si existe un riesgo toxicolgico por el consumo del material
vegetal analizado.

________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

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6. En caso de encontrar una baja concentracin en alguna de las muestras. Comente cmo influira cada uno
de estos factores en el resultado del anlisis:

A) estabilidad del compuesto:

________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

B) el desarrollo experimental realizado:

________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

C) cumplimiento de las normas de aplicacin del pesticida en cuestin:

________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

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APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS

1. Usos y propiedades biolgicas del malatin.


2. Ventajas que presentan los pesticidas organofosforados con relacin a los organoclorados.
3. Mecanismo de toxicidad del malatin en el insecto.
4. Mecanismo de potenciacin del efecto txico del malatin en insectos.
5. Enzimas involucradas en la destoxificacin del malatin en insectos y en mamferos.
6. Comparacin de los valores de DL50 para mamferos y para insectos.
7. Propsito de adicionar los siguientes reactivos: CCl4, CS2, EtOH, solucin cida Na2SO4 al 9%, NaOH,
solucin Na2SO4 9%, fenoftalena, HCl, FeCl3 y CuSO4.
8. Dibuje la reaccin que se lleva a cabo con el malatin en medio bsico y presencia de etanol .
9. Estructura del compuesto de coordinacin que se forma durante la prctica con los productos de la reaccin
anterior y el catin Cu2+. Relacin matemtica entre absorbancia y transmitancia.
10. Lmites permitidos de acuerdo a la NOM vigente para el malatin.

APNDICE II: PREPARACIN DE REACTIVOS

Solucin patrn de malatin 40 g/mL


Medir 0.1 mL de malatin al 50% y aforar con etanol a 100 mL. De esta solucin medir 8 mL y aforar a 100 mL
con etanol.

Nota: El malatin es inhibidor de la colinesterasa y se absorbe fcilmente por


piel y vas respiratorias, se debe extremar cuidado con su contacto directo. Sus efectos
agudos incluyen convulsiones, coma y fallo respiratorio.

Disulfuro de carbono al 0.5% (CS2)


Para preparar 100 mL, medir 0.5 mL de CS2 y aforar a 100 mL con CCl4.

Nota: El CS2 es altamente txico, se absorbe por piel y vas respiratorias. Sus
efectos txicos incluyen irritacin de membranas, nausea, vmito, prdida de
conocimiento y convulsiones.

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Sulfato de sodio al 9% (Na2SO4)


Para preparar 100 mL, pesar 9 g de Na2SO4 y aforar a 100 mL con agua destilada.

Solucin cida de sulfato de sodio


A 100 mL de solucin de Na2SO4 al 9% adicionar 3 mL de HCl concentrado.

Hidrxido de sodio 6N (NaOH)


Para preparar 100 mL, pesar 24 g de NaOH y aforar a 100 mL con agua destilada.

cido clorhdrico 6N (HCl)


Para preparar 100 mL, medir 48.5 mL de HCl concentrado y aforar a 100 mL con agua destilada.

Cloruro frrico al 5% (FeCl3)


Para preparar 100 mL, pesar 5 g de FeCl3 y disolver en 1 mL de HCl 6N, aforar a 100 mL con agua destilada.

Sulfato cprico al 3.5% (CuSO4)


Para preparar 100 mL, pesar 3.5 g de CuSO4 y aforar a 100 mL con agua destilada.

Fenolftalena al 1%
Para preparar 100 mL, pesar 1 g y aforar a 100 mL con EtOH.

APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS

R1: Material vegetal con CCl4


R2: Solucin cida de Na2SO4 al 9% y EtOH
R3: CCl4 y subproductos orgnicos de hidrlisis cida
R4: CuSO4, FeCl3, Na2SO4, fenoftalena, H2O
R5: CCl4 y compuesto de coordinacin de cobre

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PRODUCCIN DE METAHEMOGLOBINA POR NITRITOS Y EFECTO PROTECTOR DEL


AZUL DE METILENO IN VIVO

OBJETIVO ACADMICO

Que el alumno observe la formacin de metahemoglobina (MHb) como consecuencia de la administracin de


nitrito de sodio y el efecto protector del azul de metileno.

PROBLEMA

Determinar cuantitativamente, en ratas tratadas con NaNO2, la reduccin en el porcentaje de MHb debida a la
administracin de azul de metileno.

REACTIVOS

Heparina 1000 UI o EDTA al 10% (m/v) Solucin amortiguadora de fosfatos*


Cianuro de potasio* (KCN) Ferricianuro de potasio* (K3[Fe(CN)6])
Solucin salina isotnica (SSI) Azul de metileno*
cido actico glacial (CH3COOH) Nitrito de sodio* (NaNO2)
Hidrxido de amonio (NH4OH) Isofluorano
Xilacina Ketamina
*Ver APNDICE II

EQUIPO

Espectrofotmetro UV-Vis
Centrfuga
Balanza para pesar animales

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MATERIAL

Jeringas de insulina (traer por equipo) 3 Jeringas de 3 mL (traer por equipo) 3


Tubos de ensaye 13x100 10 Tijeras de diseccin 1
Pinzas de diseccin 1 Tabla de diseccin 1
Caja de contencin 1 Rejilla 1
Pipetas graduadas de 5 mL 2 Pipeta graduada de 1 Ml 1
Pipeta graduada de 0.1 mL 1 Tubos de ensaye 16 x 150 3

ANIMALES DE EXPERIMENTACIN

3 Ratas Wistar macho de 200-250 g (por equipo).

PARTE EXPERIMENTAL

1. Pesar cada uno de los animales e identificarlos como I, II y III.


2. Administrar a la rata III, por va intraperitoneal (i.p.) una dosis de 2 mg/Kg de la solucin de azul de
metileno y 15 minutos despus administrar por la misma va, 50 mg/Kg de la solucin de nitrito de sodio.
3. Administrar a la rata I por va i.p. 1 mL/Kg de SSI.
4. Administrar a la rata II por va i.p., 50 mg/Kg de la solucin de nitrito de sodio.
5. Dejar transcurrir 30 min despus de la administracin.
6. Preparar 3 jeringas con 0.1mL de solucin de heparina o EDTA y 3 tubos de ensaye con 0.3 mL del mismo
anticoagulante e identificarlos de acuerdo al nmero de rata correspondiente.
7. Anestesiar a cada rata administrando va i.m. 0.1 mL de Xilacina 20 mg/mL en el muslo izquierdo y 0.1 mL
de Ketamina 100 mg/mL en el muslo derecho. Esperar 10 minutos hasta que el animal se encuentre en
anestesia profunda verificando la ausencia de reflejos antes de proceder con el resto del protocolo.
8. Colocarla en la tabla de diseccin y extraer de cada una, por puncin cardiaca 1 mL de sangre.
9. Una vez obtenida la muestra sacrificar al animal en cmara de CO2.
10. Colocar la muestra sangunea en el tubo correspondiente. QUITAR LA AGUJA DE LA JERINGA
PARA EVITAR HEMOLIZAR LA MUESTRA SANGUNEA. MEZCLAR LOS TUBOS

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PERFECTAMENTE POR INVERSIN PARA EVITAR LA COAGULACIN DE LAS


MUESTRAS.
11. Depositar las jeringas y las agujas en el contenedor para residuos peligrosos biolgico-infecciosos (RPBI).
Envolver los restos de los animales de experimentacin en una hoja de papel peridico y colocarlos en la
caja de contencin para su posterior incineracin. Aquellos animales que no hayan sido administrados o
sacrificados debern colocarse en su contenedor de transporte para devolverlos al bioterio.
12. Determinar el contenido de metahemoglobina y hemoglobina total de cada muestra como se indica a
continuacin:
a) Colocar 4.9 mL de solucin amortiguadora de fosfatos pH 6.6 en un tubo de ensaye.
b) Agregar 0.1 mL de sangre. Conservar el resto de la muestra hasta el final de la determinacin y
despus desactivar con hipoclorito de sodio (NaClO).
c) Mezclar y dejar reposar durante 5 minutos.
d) Centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos.
e) Separar el sobrenadante.
f) Medir la absorbancia del sobrenadante a 630 nm (lectura A1), contra un blanco de solucin
amortiguadora de fosfatos.
g) Pasar la solucin a un tubo limpio.
h) Agregar una gota de la solucin neutralizada de KCN al sobrenadante y al blanco.
i) Mezclar y dejar reposar 2 minutos.
j) Determinar nuevamente la absorbancia a 630 nm (lectura A2). Recuperar la solucin en el mismo tubo.
k) Agregar una gota de NH4OH concentrado al tubo del inciso i y mezclar.
l) Transferir 2 mL de la solucin del tubo del inciso k, a otro tubo y agregar 8 mL de la solucin
amortiguadora y 0.1 mL de la solucin de K3[Fe(CN)6] al 20% en solucin acuosa. Desechar el
sobrante de la solucin proveniente del inciso k en el contenedor etiquetado como R1.
m) Preparar un blanco empleando 2 mL de agua destilada, 8 mL de solucin amortiguadora y 0.1 mL de
la solucin de K3[Fe(CN)6] al 20% en solucin acuosa.
n) Despus de 2 minutos agregar una gota de la solucin neutralizada de KCN a cada tubo (blanco y
problema).
o) Mezclar, esperar 10 minutos y determinar la absorbancia a 540 nm, contra su respectivo blanco (lectura
A3). Despus de haber realizado la lectura y una vez obtenidos los clculos, desechar el contenido de la
celda y el resto de la solucin del inciso n en el contenedor etiquetado como R1.

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Nota: Todo material de vidrio que estuvo en contacto con muestras sanguneas deber
ser inactivado con NaClO previamente a su lavado.

13. Clculos:

Hemoglobina total (Hbt) en g/100 mL = A3 x 37.4


Metahemoglobina total (MHbt) en g/100 mL = (A1 - A2) 23.4
Porcentaje de MHb en sangre total (%MHbt) = (MHbt/Hbt) x 100

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CUESTIONARIO
1. Reporte los resultados grupales en las siguientes tablas:
Tabla 1. Lecturas espectrofotomtricas.
Azul de metileno
SSI NaNO2
Equipo + NaNO2
A1 A2 A3 A1 A2 A3 A1 A2 A3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Tabla 2. Determinaciones de Hb y MHb totales.


SSI NaNO2 Azul de metileno + NaNO2
Eq Hbt MHbt Hbt MHbt Hbt MHbt
(g/100 mL) (g/100mL) (g/100 mL) (g/100mL) (g/100 mL) (g/100mL)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Prom
SD
%CV
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Tabla 3. Comparacin del porcentaje de MHb en los diferentes tratamientos.


SSI NaNO2 Azul de metileno + NaNO2
Equipo
%MHbt %MHbt %MHbt
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Prom
SD
%CV

2. Elaborar una grfica de barras con los resultados promedio de Hbt y MHbt para cada tratamiento.

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3. Elaborar una grfica de barras con los resultados porcentuales de MHbt para cada tratamiento.

4. Qu efecto observ en el %MHbt en la rata II? A qu lo atribuye?


__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________

5. Qu efecto observ en el %MHbt en la rata III? A qu lo atribuye?


__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________

6. Observ algn cambio en la cantidad de Hbt en funcin de los xenobiticos administrados? Por qu?
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________

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7. Por qu es necesario comparar la cantidad de MHbt en valores porcentuales?


__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Dreisbach, R. H. y Robertson, W.O. Tratamiento de los envenenamientos. En: Manual de toxicologa clnica,
prevencin diagnstico y tratamiento. Editorial El Manual Moderno (6 ed.), Mxico, D.F. 1988, pp
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Hall R., Malia, R.G. Investigation of hemolitic anaemias. Medical Laboratory Hematology. Ed. Butterworths,
Gran Bretaa. 1984, pp 327-333.
Klassen, C.D., Watkins, J.B. Casarett & Doull, Manual de Toxicologa. Ed. McGraw-Hill Interamericana (5
ed.), Mxico. 2001, pp 394-395.
Stahr, H. M. Inorganic and other Analisis. Analitical Methods in toxicology. Ed. John Wiley and sons, inc., USA.
1991, pp 5-7.

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APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS

1. Efectos txicos de una intoxicacin por nitritos.


2. Efectos txicos de una intoxicacin con azul de metileno.
3. Esquema que explique el efecto protector del azul de metileno en una intoxicacin por nitritos.
4. Fundamento de los mtodos analticos para determinar hemoglobina total y metahemoglobina en sangre.
5. Especies que se determinan en A1, A2 y A3.
6. Propsito de agregar la solucin amortiguadora de fosfatos pH 6.6, NH4OH en el paso k de su tcnica,
K3[Fe(CN)6] y KCN.

APNDICE II: PREPARACIN DE SOLUCIONES

Solucin amortiguadora de fosfatos pH = 6.6.


Realizar una primera solucin amortiguadora de fosfatos, disolviendo 3.8 g de fosfato disdico anhdro (Na 2PO4)
y 5.44 g de fosfato monopotsico anhdro (KHPO4) en 1000 mL de agua destilada. Mezclar una parte de la
solucin anterior con tres partes de agua destilada y ajustar el pH a 6.6.

Solucin de cianuro de potasio neutralizada.(KCN)


Mezclar una parte de una solucin de cianuro al 10% y otra parte de cido actico glacial al 12% (v/v).

Nota: Tanto el cianuro de hidrgeno como los cianuros slidos o en disolucin son
txicos por absorcin por la piel, ingestin e inhalacin.

Solucin de ferricianuro de potasio (K3[Fe(CN)6]) al 20%


Preparar 10 mL de esta solucin.

Solucin Salina Isotnica (SSI)


Preparar 50 mL de esta solucin o comprar una presentacin comercial.

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EDTA al 10% (preparar slo en caso de no haber heparina, consultar con el laboratorista o el profesor)
Pesar 1 g de EDTA y disolver en agua destilada, aforar a 10 mL.

Solucin de azul de metileno en SSI (4 mg/mL)


Preparar 10 mL de esta solucin, pesando 40 mg de nuevo azul de metileno y disolviendo en 10 mL de SSI.

Solucin de nitrito de sodio (NaNO2) en SSI (100 mg/mL)


Preparar 10 mL de esta solucin, pesando 1 g de NaNO2 y disolvindolos en 10 mL de solucin salina isotnica.

APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS

R1: Solucin amortiguadora de fosfatos pH 6.6, KCN, NH4OH, K3[Fe(CN)6] y residuos de sangre.

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Manual de guiones experimentales para la enseanza y aprendizaje del
laboratorio de Toxicologa (clave 1614)
Segunda Edicin es una obra editada por la Facultad de Qumica.

La publicacin de esta obra fue posible gracias al apoyo de la


Coordinacin de Comunicacin, a travs de los Departamentos Editorial
y de Informacin.

El cuidado de la edicin estuvo a cargo de


CME Brenda lvarez Carreo
Diseo de portada: LDG Vianey Islas Bastida.

Publicacin autorizada por el Comit Editorial de la Facultad de


Qumica.

Octubre de 2015