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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS ACADEMIA DE BIOQUÍMICA LIC. EN QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

BAS981800

MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA I

FECHA DE ACTUALIZACIÓN DICIEMBRE 2014

Contenido

 

Pag.

Presentación

3

Practica No.1

Explicación y manejo del material de laboratorio

4

Practica No.2

Bioseguridad

7

Practica No.3

Espectrofotometría

10

Practica No.4

Uso, calibración y manejo del potenciómetro

13

Practica No.5

Identificación de aminoácidos

16

Practica No.6

Disociación de aminoácidos

21

Practica No.7

Identificación y cuantificación de proteínas

24

Practica No.8

Propiedades químicas de las proteínas

28

Practica No.9

Análisis Enzimático Cualitativo; Efecto del calor sobre

la actividad de las enzimas

33

Practica No.10

Cinética Enzimática: Efecto del pH y temperatura sobre

la actividad enzimática

36

Practica No.11

Cinética Enzimática: Efecto de la concentración de sustrato

sobre la actividad enzimática

41

Practica No.12

Cinética Enzimática: Efecto de inhibidores

44

Practica No.13

Estudio del bombeo de protones por levaduras

48

Practica No. 14

Aislamiento de ADN

50

SESIÓN 1.

PRESENTACIÓN DEL DOCENTE

FORMAS DE EVALUACIÓN

ELABORACIÓN DE REPORTE

ASPECTOS GENERALES

En esta sesión, el docente se presenta y explica ampliamente el método de evaluación de laboratorio y la forma de elaboración, entrega y ponderación de los reportes de práctica, sin dejar de lado la bitácora, que es la prueba tangible del trabajo experimental. Este rubro es a consideración del maestro que imparte el laboratorio, el número de créditos de la materia, las horas de laboratorio y el maestro que imparte la materia.

Explicación del reglamento del laboratorio. Explicar a los alumnos que existen las normas oficiales de seguridad, los reglamentos internos de la UACJ (Universidad Autónoma de Ciudad Juárez) y el reglamento de la Academia de Bioquímica. Lo más importante el sentido común.

Destacar la asistencia al laboratorio como primordial, la entrega de reportes de práctica y el uso de la bitácora de laboratorio.

El uso de elementos de seguridad como la bata y demás accesorios como obligatorios.

El material del laboratorio es responsabilidad de quien lo utiliza, recomendar a los alumnos el buen uso de este.

Dar las indicaciones acerca de cómo se debe comportar en el laboratorio (como se recibe y como se entrega).

SESIÓN 2

PRACTICA # 1

EXPLICACIÓN Y MANEJO DEL MATERIAL DE LABORATORIO

OBJETIVO

Desarrollar destreza en el manejo tanto de material como de instrumentación aplicable a técnicas de experimentación en el área bioquímica.

PRERREQUISITOS

1.- Conocimientos sobre diluciones, soluciones y mezclas.

2.- Definición de ácido, base y amortiguador.

3.- Conocimiento básico del manejo del potenciómetro y el fotocolorímetro.

4.- Que es una solución Molar, Normal y % w/v

INTRODUCCIÓN

Para llevar a cabo con éxito un experimento en cualquier laboratorio es necesario que se manejen técnicas básicas de experimentación tales como:

- Técnicas de medición de líquidos.

- Técnicas de pesado de sólidos.

- Técnicas de mezclado de líquidos y sólidos.

Todas estas técnicas se relacionan con frecuencia con las actividades que cotidianamente se llevan a cabo en el laboratorio de Bioquímica. A continuación se dan algunos datos sobre cada una de estas técnicas.

Medición de líquidos: Los instrumentos de medición de líquidos más utilizados son:

pipetas, probetas y matraces volumétricos. Las pipetas sirven para medir volúmenes de hasta 25 ml. En este rango de volumen, las pipetas tienen un uso muy frecuente en el laboratorio por su exactitud y confiabilidad. Existen dos tipos generales de pipetas: las serológicas y las volumétricas.

La pipetas serológicas miden volúmenes diversos debido a que están graduadas en diferentes medidas, por ejemplo, una pipeta de 1.0 ml. esta graduada en décimas de mililitro y por lo tanto sirve para la medición de cualquier volumen menor de 1.0 ml. Las pipetas más frecuentemente usadas son de 1.0, 2.0, 5.0 y 10.0 ml.

Las pipetas volumétricas sólo miden volúmenes fijos ya que están graduadas para medir un solo volumen, por ejemplo, una pipeta volumétrica de 1.0 ml. solo servirá para medir este volumen.

Algunas pipetas están diseñadas para que al momento de liberar el líquido que se está midiendo quede una pequeña porción en la punta de las mismas, esta porción debe dejarse contenida en la pipeta porque de otra manera se introducirá un error en la

medición. La manera de reconocer este tipo de pipetas es por las letras TD (To Deliver) que se encuentran en la parte superior de la pipeta. Otras pipetas están diseñadas para liberar todo el volumen incluyendo la porción que se queda en la punta, este tipo de pipetas se reconocen por las letras TC (To Contain), en este caso, si no se libera el total del líquido medido se incurre en un error de medición.

Las buretas varían en tamaño, generalmente de 1 a 100 ml. El flujo del líquido es controlado por una llave de vidrio o de teflón. Si es de vidrio requiere lubricación. Las buretas deben llenarse por arriba de la marca de cero y posteriormente abrir la llave cuidadosamente para que fluya el líquido y el menisco se ajuste a cero. Dentro de los usos indicados para las buretas se encuentran las titulaciones y para medición de volumenes de líquidos tóxicos, ácidos, sustancias corrosivas, etc.

Las probetas son cilindros graduados que miden volúmenes por arriba de los 25 ml. todas ellas son usadas para medir volúmenes diversos, por ejemplo, con una probeta

de 50 ml. se pueden medir volúmenes de 26, 38 o 42 ml etc

denotan por marcas que se encuentran entre una graduación y otra. las probetas más

frecuentemente utilizadas son: 50, 100, 250, 500 y 1000 ml

una probeta se tiene que tomar en cuenta la siguiente regla: La superficie de un líquido dentro de una probeta siempre forma una curva o menisco. El diseño de la probeta esta

hecho para medir volúmenes exactos al igualar la parte inferior del menisco con la graduación. Si se mide el volumen con la parte superior del menisco, se incurrirá en un error.

Los matraces volumétricos, tambien llamados de aforación, sirven para medir volúmenes exactos y son usados cuando se hacen soluciones porcentuales y molares.

Los matraces más frecuentemente usados son de 50, 100, 500 y 1000 ml estos matraces sigue la misma técnica de medición que las probetas.

Todos los recipientes arriba mencionados son material de vidrio, por lo tanto, están expuestos a cambios de tamaño en altas y bajas temperaturas y esto puede modificar drásticamente la exactitud de la medición. El diseño de este material de cristalería está hecho para medir volúmenes a una temperatura promedio de 25°C.

Medición de sólidos: La balanza granataria y la balanza analítica son las más utilizadas

en la medición de reactivos químicos de textura sólida.

exactitud de aproximadamente una décima de gramo, se utiliza para pesar cantidades

mayores de un gramo y cuando la precisión no sea menor de 0.1 g.

La balanza analítica se utiliza cuando el peso deseado requiera una precisión menor de 0.1 g. Es uno de los instrumentos más sensibles y permite pesar hasta décimas de miligramo.

Sin embargo, el uso de ambos tipos de balanzas requiere de cuidados básicos comunes tales como: limpieza completa de todas las partes de la balanza; mantener la tara específica de la balanza antes de cualquier pesada y hacer pesadas racionales con respecto a la capacidad de la balanza.

Las balanzas de torción son útiles en el laboratorio de bioquímica como una herramienta para el buen uso de la centrífuga ya que para equilibrar los tubos de centrífuga siempre debe hacerse en base al peso y no al volumen del contenido.

Estos volúmenes se

Para medir volumen en

El uso de

La granataria tiene una

La centrífuga es un aparato que permite separar sólidos de líquidos. Es un instrumento que separa suspensiones a alta velocidad. El material sólido se queda en la base del recipiente (sedimento) y la porción líquida en la parte superior del recipiente (líquido sobrenadante).

Los recipientes utilizados en la centrífuga generalmente son tubos de ensayo y estos siempre deben balancearse en cuanto a peso y al ser colocados en la centrífuga siempre debe ser en direcciones opuestas.

Mezclado de líquidos y sólidos: Las soluciones normales, molares y porcentuales así como los diferentes tipos de diluciones son las mezclas más utilizadas en el laboratorio. Frecuentemente, las soluciones involucran mezclas de sólidos en líquidos o de líquidos en líquidos en tanto que las diluciones solo involucran mezclas líquidos en líquidos. De la destreza con que se lleven a cabo estas mezclas depende el éxito de la experimentación en el laboratorio.

El fotocolorímetro permite cuantificar concentración de sustancias en base al color desarrollado. La concentración de una sustancia en solución generalmente es determinada por una reacción de color, siendo el principio general que a mayor concentración de la sustancia en la solución mayor será la intensidad del desarrollo del color. Los fotocolorímetros son instrumentos que nos sirven para hacer estas determinaciones.

SESIÓN 3 Y 4

PRÁCTICA # 2

BIOSEGURIDAD

OBJETIVO

Que el alumno se familiarice con el material Peligroso Biológico infeccioso, su manejo y desecho adecuado, de acuerdo a las normas mexicanas NOM-087 y NOM-052.

INTRODUCCIÓN

Residuos peligrosos biológicos infecciosos

¿Qué son los residuos peligrosos biológicos infecciosos?

Los residuos peligrosos biológicos infecciosos en lo sucesivo (RPBI), son aquellos que se generan durante las actividades asistenciales a la salud de humanos o animales en los centros de salud, laboratorios clínicos o de investigación, bioterios, centros de enseñanza e investigación, principalmente; que por el contenido de sus componentes puedan representar un riesgo para la salud y el ambiente.

¿Cuáles son considerados los RPBI?

De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, son considerados los siguientes:

La sangre: La sangre y los componentes de ésta, sólo en su forma líquida, así como los derivados no comerciales, incluyendo las células progenitoras, hematopoyéticas y las fracciones celulares o acelulares de la sangre resultante (hemoderivados).

Los cultivos y cepas de agentes biológico-infecciosos: Los cultivos generados en los procedimientos de diagnóstico e investigación, así como los generados en la producción y control de agentes biológico-infecciosos. Utensilios desechables usados para contener, transferir, inocular y mezclar cultivos de agentes biológico-infecciosos.

Los patológicos: Los tejidos, órganos y partes que se extirpan o remueven durante las necropsias, la cirugía o algún otro tipo de intervención quirúrgica, que no se encuentren en formol. Las muestras biológicas para análisis químico, microbiológico, citológico e histológico, excluyendo orina y excremento. Los cadáveres y partes de animales que fueron inoculados con agentes enteropatógenos en centros de investigación y bioterios.

Los residuos no anatómicos

Son residuos no anatómicos los siguientes:

Los recipientes desechables que contengan sangre líquida.

Los materiales de curación, empapados, saturados, o goteando sangre o cualquiera de los siguientes fluidos corporales: líquido sinovial, líquido pericárdico, líquido pleural, líquido Céfalo-Raquídeo o líquido peritoneal.

Los materiales desechables que contengan esputo, secreciones pulmonares y cualquier material usado para contener éstos, de pacientes con sospecha o diagnóstico

de tuberculosis o de otra enfermedad infecciosa según sea determinado por la SSA mediante memorándum interno o el Boletín Epidemiológico.

Los materiales desechables que estén empapados, saturados o goteando sangre, o secreciones de pacientes con sospecha o diagnóstico de fiebres hemorrágicas, así como otras enfermedades infecciosas emergentes según sea determinado por la SSA mediante memorándum interno o el Boletín Epidemiológico.

Materiales absorbentes utilizados en las jaulas de animales que hayan sido expuestos a agentes enteropatógenos.

Los objetos punzocortantes

Los que han estado en contacto con humanos o animales o sus muestras biológicas durante el diagnóstico y tratamiento, únicamente: tubos capilares, navajas, lancetas, agujas de jeringas desechables, agujas hipodérmicas, de sutura, de acupuntura y para tatuaje, bisturís y estiletes de catéter, excepto todo material de vidrio roto utilizado en el laboratorio, el cual deberá desinfectar o esterilizar antes de ser dispuesto como residuo municipal.

¿Por qué representan un riesgo a la salud o al ambiente?

Por sus características, ya que pueden contener agentes biológicos infecciosos que se definen como “cualquier microorganismo capaz de producir enfermedades cuando esta presente en concentraciones suficientes (inóculo), en un ambiente propicio (supervivencia), en un hospedero susceptible y en presencia de una vía de entrada)”.

¿Existe regulación para los RPBI?

Con la finalidad de prevenir alguna situación de emergencia debida al mal manejo de los RPBI, la autoridad Ambiental (SEMARNAT) publicó el 7 de noviembre de 1995 la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-1995, Que establece los requisitos para la separación, envasado, almacenamiento, recolección, transporte, tratamiento y disposición final de los residuos peligrosos biológico-infecciosos que se generan en establecimientos que presten atención médica.

Debido a que esta Norma presentó algunos problemas de interpretación como en su aplicación, se gestiono en coordinación con la Secretaría de Salud, su modificación, derivándose el 1 de noviembre de 2001 el Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM- 087-SEMARNAT-SSA1-2000, Protección Ambiental - Salud Ambiental Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos Clasificación y especificaciones de manejo. De este proyecto se derivaron 370 comentarios, mismos que fueron contestados y publicados en el Diario Oficial de la Federación el día 20 de enero de 2003.

Finalmente el 17 de febrero de 2003 se publica en el Diario Oficial de la Federación la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, Protección Ambiental Salud Ambiental Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos Clasificación y especificaciones de Manejo.

¿A quines aplica la NOM-087-SEMARANT-SSA1-2002?

Con base en el campo de aplicación de esta norma es de observancia obligatoria a todos aquellos que por sus actividades generen los RPBI descritos en la Norma, sin importar el volumen de sus generación, aclarando que aquellos que su generación sea menor a 25 kilogramos al mes, podrán ubicarse como generadores de Nivel I, esto para el tiempo de almacenamiento de sus RPBI.

¿Existe otra Norma Oficial Mexicana donde aparezcan los RPBI?

Existe la Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005 que establece las características, el procedimiento de identificación, clasificación y los listados de los residuos peligrosos, sin embargo esta es de carácter General, por lo que para los RPBI prevalecen las condiciones establecidas en la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002.

¿Cuál es la infraestructura para el tratamiento de los RPBI?

A partir de la publicación de la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-1995, se desarrollo la infraestructura para el tratamiento de este tipo de residuos, con la condición de que dicha norma establece que los residuos denominados patológicos sean incinerados, por ese motivo se incremento el número de hornos para el tratamiento de los residuos, sin embargo han sido muchos equipos que han cerrado por no cumplir con los parámetros establecidos en la Norma Oficial Mexicana NOM-098- SEMARNAT-2002, Protección ambiental-Incineración de residuos, especificaciones de operación y límites de emisión de contaminantes. Actualmente la incineración es uno de los procesos de tratamiento más observados por las asociaciones no Gubernamentales por ese motivo se concluye que las empresas que actualmente cuentan con esta autorización son capaces de cumplir con los parámetros establecidos en la NOM-098.

SESIÓN 5 Y 6

PRACTICA # 3

EESSPPEECCTTRROOFFOOTTOOMMEETTRRÍÍAA

INTRODUCCIÓN:

La fotocolorimetría o espectrofotometría, es una técnica que permite medir la absorción de radiación electromagnética, ultravioleta y visible de numerosas especies químicas inorgánicas y orgánicas, para su análisis cualitativo y cuantitativo.

Las moléculas son capaces de absorber radiaciones electromagnéticas. Tanto la longitud de onda (λ) de la radiación absorbida como la eficiencia con que se absorbe dependen de la estructura de la molécula y del medio en que se halla.

La mayoría de los instrumentos espectroscópicos para medir las radiaciones UV- Visible e IR incluyen cinco componentes, una fuente estable de engría radiante, un selector de longitud de onda que aísla una región limitada del espectro para hacer la medición; uno o mas recipientes para la muestra; un detector de radiación que convierte la energía radiante en una señal eléctrica que puede medirse y un sistema que procesa y lee la señal que consta, actualmente de una computadora.

Cada especie molecular tiene la capacidad de absorber su propia frecuencia característica de la radiación electromagnética. Este proceso transfiere energía a la molécula y provoca una disminución en la intensidad de la radiación electromagnética incidente. Por consiguiente, la absorción de la radiación atenúa el rayo incidente de acuerdo con la ley de absorción que se describe como Lambert-Beer.

Esta ley proporciona información cuantitativa de cómo es que la atenuación de la radiación, depende de la concentración de las moléculas que la absorben y de la distancia que recorre el rayo en el medio absorbente. Cuando la luz atraviesa una solución de analito, la intensidad de la radiación disminuye como consecuencia de la excitación del analito.

A = λbc

Donde:

λ = Coeficiente de extinción molar

b = Grosor de la cubeta

c = Concentración

La ley de Beer se puede utilizar de distintas maneras. Pueden calcularse las absortividades molares de las especies si se conocen sus concentraciones. También se puede utilizar el valor de absorbancia medida para conocer la concentración si es que se conocen absortividades y la longitud de la trayectoria de la radiación. Así mismo se aplica a las soluciones que contienen más de un tipo de sustancia absorbente. Suponiendo que no haya interacción entre las distintas especies, la absorbancia total de un sistema con varias componentes es la suma de sus absorbancias individuales.

Un espectro de absorción es una representación grafica de la absorbancia de un analito (o de otra magnitud equivalente) en función de la longitud de onda de la de otro parámetro relacionado con la energía de la radiación utilizada). El máximo de absorbancia obtenido en el espectro de absorción de un analito, nos dará la longitud de onda que proporciona la mayor sensibilidad posible, y por tanto será lo

de un analito, nos dará la longitud de onda que proporciona la mayor sensibilidad posible, y

que se utilizará en el análisis cuantitativo de dicho analito. Todas las disoluciones que presentan color, absorben radiación electromagnética perteneciente al espectro visible.

OBJETIVO:

Aprender el uso del espectrofotómetro para determinar los espectros de absorción y curvas de calibración de dos sustancias coloridas.

MATERIAL:

Solución de H 2 SO 4 0.5M (bureta)

Solución de KMnO 4 4x10 -4 M

Solución K 2 Cr 2 O 7 1.6x10 -3 M

11 tubos de ensaye de 15x160mm

2

pipetas de 10mL

2

pipetas de 5mL

2

celdillas para espectrofotómetro

1

gradilla

Espectrofotómetro

METODOLOGÍA:

Experimento No. 1: Determinación de los espectros de absorción

Tomar alícuotas de aproximadamente 3mL de KMnO 4, y K 2 Cr 2 O 7 .

Colocar en celdillas por separado para medir la absorbancia de cada solución desde los 330nm a los 600nm en intervalos de 30nm; determinando así la longitud de onda de máxima absorbancia para cada solución.

En cada longitud de onda se deberá calibrar primero a cero con la solución de H 2 SO 4 (blanco).

Registrar las absorbancias de ambas soluciones a cada longitud de onda.

Experimento No. 2: Preparación de curvas de calibración para cada solución estándar

Tomar alícuotas de KMnO 4, y K 2 Cr 2 O 7 y muestras problema.

Preparar, a partir de las soluciones estándares de KMnO 4, y K 2 Cr 2 O 7 por separado, diluciones a 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16 de cada solución. Utilizando como diluyente H 2 SO 4 .

Leer y registrar las absorbancias de cada dilución a la longitud de onda que se haya registrado el máximo de absorción para cada solución estándar de KMnO 4, y K 2 Cr 2 O 7 . (Experimento anterior).

Leer y registrar absorbancias de las muestras problema a la longitud de onda correspondiente al analito de la misma.

Utilizar en todos los casos H 2 SO 4 como blanco.

Proporcionar muestra problema de concentración desconocida proporcionada por el maestro.

RESULTADOS:

Experimento No. 1 Representar en una tabla, las absorbancias obtenidas a las distintas longitudes de onda de ambas soluciones estándares de KMnO 4, y K 2 Cr 2 O 7 . Ilustrar de mejor manera esta tabla en una grafica de Espectro de absorción (Absorbancia contra longitud de onda) comparando el comportamiento de las soluciones. Determinar la longitud de onda a la cual se observo el máximo de absorción en cada solución estándar.

Experimento No. 2 Se reportaran tablas de las diluciones realizadas de cada estándar con sus respectivas absorbancias registradas y la concentración molar de cada dilución. De igual manera se medirán las absorbancias de muestras problemas de concentración desconocida proporcionadas en el laboratorio.

Realizar una curva de calibración para cada solución estándar de KMnO 4, y K 2 Cr 2 O 7 graficando absorbancia contra concentración molar.

Utilizar esta curva para determinar las concentraciones de las soluciones problema con su respectivo porcentaje de error:

%

Error

problema con su respectivo porcentaje de error: % Error valor real valor obtenido valor real 100

valor real valor obtenido

porcentaje de error: % Error valor real valor obtenido valor real 100 DISCUSIÓN: CONCLUSIÓN: BIBLIOGRAFÍA

valor real

de error: % Error valor real valor obtenido valor real 100 DISCUSIÓN: CONCLUSIÓN: BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA:

100

DISCUSIÓN:

CONCLUSIÓN:

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA:

CUESTIONARIO:

1) De acuerdo a sus datos, diga cual es el rango de concentraciones en el que podría utilizar su curva de KMnO 4 . ¿Por qué?

2) ¿Qué características nos indican que una curva de calibración es adecuada?

3) ¿Qué pasaría si intenta utilizar la curva realizada en esta práctica para calcular la concentración de una muestra problema conteniendo K 2 Cr 2 O 7 150 mM?

4) De acuerdo a sus datos, ¿Cuál es el coeficiente de extinción molar del K 2 Cr 2 O 7 ? (utilice las unidades adecuadas).

SESIÓN 7

PRÁCTICA 4

USO, CALIBRACIÓN Y MANEJO DEL POTENCIÓMETRO

OBJETIVO:

Que el alumno conozca el instrumento de medición, principios y fundamento para aplicarlo en las características ácido base de las soluciones.

INTRODUCCIÓN:

El potenciómetro, es un sensor utilizado en el método electroquímico como equipo de medición, en la cuantificación del potencial Hidrógeno (pH) de cualquier disolución.

La determinación del pH, consiste en medir el potencial que se desarrolla a través de una fina membrana de vidrio que separa dos soluciones, con diferente concentración de protones. En consecuencia, se conoce la sensibilidad y la selectividad de las membranas de vidrio ante el pH.

Un electrodo para medir el pH consiste en un par de electrodos, uno de calomel (mercurio, cloruro de mercurio) y otro de vidrio, sumergidos en la disolución en la que queremos encontrar el pH. El soporte del electrodo es de vidrio común y no es conductor, mientras que el bulbo sensible se encuentra formado por un vidrio polarizable (vidrio sensible de pH). Se llena el bulbo con la solución de HCl 0.1N saturado con AgCl. El voltaje en el interior del tubo es constante (pH 7) de manera que la diferencia de potencial solo depende del pH del medio externo. El alambre que se sumerge al interior (normalmente Ag/AgCl) permite conducir este potencial hasta un amplificador.

El pH metro es relativamente inmune a las interferencias de color, turbidez, material coloidal, cloro libre, substancias oxidantes y/o reductoras. La medición es afectada solo cuando la superficie de la membrana está sucia con grasa o material orgánico insoluble en agua, que le impide hacer contacto con la muestra, por lo que se recomienda la limpieza escrupulosa de los electrodos. Los electrodos deben ser enjuagados con agua destilada entre muestras (el uso adecuado de la pizeta es de vital importancia), posteriormente deberá secarse el electrodo preferentemente con papel klenex o papel sanitario de textura suave pero que no deje pelusa, nunca debe secarse con tela porque podría cargase electrostáticamente.

Como los electrodos de vidrio de pH cuantifican la concentración de H+ relativa a sus referencias, deben ser calibrados periódicamente para asegurar la precisión, es por eso que se utilizan soluciones específicas llamadas buffers de calibración (disoluciones reguladoras de pH conocido). Estas soluciones son: solución buffer (fosfato) de pH 7 color amarillo, solución buffer (biftalato) de pH 4 color rojo, solución buffer (borato) de pH 10 color azul.

El pHmetro digital portátil Conductronic pH 10, modelo 1024, electrodo y batería cuadrada. Debe mantenerse

El pHmetro digital portátil Conductronic pH 10, modelo 1024, electrodo y batería cuadrada. Debe mantenerse siempre humedecido.

Para su calibración a un punto:

Conecte el electrodo al instrumento y encienda la tecla ON.

Introduzca el electrodo en la solución patrón de pH 7 y permita la lectura que la lectura se estabilice (aproximadamente 30 seg).

Ajuste la perilla de compensación de temperatura temp oC a la temperatura de la solución patrón (buffer).

Ajuste la perilla de calibración calíbrate, hasta que el medidor indique el valor pH 7.0 de la solución patrón (buffer).

Retire el electrodo de la solución patrón (buffer) y enjuáguelo muy bien con agua destilada (pizeta), pero no seque el electrodo.

Ajuste la perilla de compensación de temperatura temp. oC a la temperatura a la temperatura de la solución a medir.

Introduzca el electrodo en la solución a medir y lea el valor pH del medidor. Si el valor de la solución no está entre ± 3 unidades de pH de la solución patrón (7.0 pH), se necesita hacer una calibración a dos puntos (con dos buffers de diferente pH, 7 y 4, o 7 y 10 dependiendo de las soluciones que vaya a manejar).

Después de cada medición, retire el electrodo y enjuáguelo muy bien con agua destilada (pizeta)

Calibración a dos puntos

Siga los pasos de calibración a un punto hasta el paso 5

Sumerja el electrodo en la segunda solución patrón de pH 4.00 o pH 10.00. La temperatura de esta solución patrón debe ser idéntica a la de la primera

Ajuste el control de pendiente slope, hasta que el medidor indique el valor del pH de la segunda solución patrón.

Retire el electrodo, enjuáguelo con agua destilada y proceda a efectuar las mediciones. No olvide enjuagar el electrodo muy bien con agua destilada (pizeta) después de cada medición.

Precauciones

El pHmetro debe siempre mantenerse en su estuche si no se está utilizando, con respecto al electrodo deberá mantenerse en la solución buffer de pH 4.0, misma que se encuentra en el pequeño recipiente en el que descansa el electrodo.

SESION 8 y 9

PRACTICA #5

IIDDEENNTTIIFFIICCAACCIIÓÓNN DDEE AAMMIINNOOÁÁCCIIDDOOSS

INTRODUCCIÓN:

Alrededor de 20 L-amoniácidos forman las unidades monoméricas de las cuales se constituyen las proteínas.

Solo los L-aminoácidos existen en las proteínas. Todos los aminoácidos contienen grupos funcionales amino y carboxilo; en un L-aminoácido, ambos grupos están unidos al mismo átomo de carbono, con la siguiente estructura:

al mismo átomo de carbono, con la siguiente estructura: A este se le llama carbono quiral

A este se le llama carbono quiral ya que tiene 4 sustituyentes diferentes, lo que confiere actividad óptica a los aminoácidos (con excepción de la glicina). El carbono quiral de los aminoácidos contiene un grupo carboxilo (COOH) y un grupo amino (-NH 2 ), un átomo de hidrógeno y un radical de composición variable, llamado cadena lateral, que permite diferenciar a los aminoácidos (R). Reacciones específicas con grupos funcionales de las cadenas laterales, se utilizan en diversas pruebas bioquímicas que permiten identificar aminoácidos específicos en muestras de suero sanguíneo, orina, etc.

Dependiendo del pH, un aminoácido puede tener carga negativa positiva, negativa o cero. Los aminoácidos portan por lo menos 2 grupos ácidos débiles ionizables, un -COOH y un -NH 3 + . En solución estos grupos tienen 2 formas, una con carga y otra sin carga.

RCOOH

R – COOH R – COO - + H +

RCOO - + H +

R-NH 3 +

R-NH 3 +

R-NH 2 + H +

El R-COOH y el R-NH 3 + representa las formas protonadas, acídicas y R-COO - y R-NH 2 las bases conjugadas de los ácidos correspondientes.

Al pH del plasma sanguíneo o del líquido intracelular (7.4 a 7.1 respectivamente), los grupos carboxilos existen enteramente como iones carboxilato, R-COO - a estos valores de pH, la mayor parte de los grupos amino están predominantemente en la forma R-NH 3 + . Por lo tanto, las especies iónicas prevalentes de los aminoácidos presentes en la sangre y en la mayor parte de los tejidos deben de presentarse de la siguiente forma:

de los tejidos deben de presentarse de la siguiente forma: Pueden aplicarse varias técnicas para aislar

Pueden aplicarse varias técnicas para aislar e identificar a los aminoácidos. La cromatografía es una de ellas. En todas las separaciones cromatográficas, las

moléculas son separadas dentro de una fase estacionaria y una fase móvil. La separación depende de la tendencia relativa de las moléculas en la mezcla, de asociarse con más fuerza a una u otra fase.

Básicamente en las cromatografías las muestras se aplican en una tira de papel o placa fina (fase estacionaria) y se suspenden en un recipiente que contiene el solvente cromatográfico (fase móvil), el cual avanza sobre la fase estacionaria, arrastrando los diferentes componentes de la muestra, a diferentes velocidades, dependiendo de alguna de sus características como polaridad, tamaño, etc.

OBJETIVO:

Aprender a utilizar reacciones específicas de cadena lateral y cromatografía en capa fina para identificar los aminoácidos presentes en una muestra problema.

MATERIAL:

1 gradilla

Equipo para cromatografia de capa fina

5

pipetas de 1.0mL - Pipetas Pateur

4

pipetas Pasteur

- Papel sanitario

5

pipetas de 5.0mL

1

pipeta de 10.0mL

1

bureta

METODOLOGIA:

Experimento No. 1: Identificación de aminoácidos

A) Prueba de Sullivan: Se toman alícuotas de agua destilada, cisteína o cistina, y dos muestras problema. Y en 3 tubos por separado y previamente etiquetados se les realiza la prueba de Sullivan como se describe en el siguiente cuadro:

Tubo

H 2 O dest (mL)

Cisteina (mL)

Muestra (mL)

NaCN (mL)

1

0.5

-

-

0.5

2

-

0.5

-

0.5

3

-

-

0.5

0.5

Se dejan reposar las soluciones en cada tubo por 10 minutos. Y se agrega a todos los tubos Nitroprusiato de sodio (2-3 gotas) e hidróxido de amonio (NH 4 OH) (2 gotas).

Comparar las coloraciones. Un color rojizo indicará prueba positiva, es decir, presencia de aminoácidos que en su radical contiene azufre.

B) Prueba de identificación de fenoles p_sustituidos (tirosina) con Nitrosonaftol: En 3 tubos por separado y etiquetados se realizan las soluciones siguientes:

Tubo

H 2 O dest

Tirosina (mL)

Muestra

Nitrosofaftol

1

0.5 mL

-

-

2-3 gotas

2

-

0.5

-

2-3 gotas

3

-

-

0.5

2-3 gotas

Mezclar y calentar en baño de ebullición durante 5minutos. Y por ultimo agregarle a todos los tubos 0.5mL de Acido Nitrico (HNO 3 ).

Comparar las coloraciones. La aparición de un color rojo es positiva (presencia de tirosina).

C) Prueba de la Ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno): En 4 tubos por separado y etiquetados se realizan las soluciones siguientes.

Tubo

H 2 0 dest

Prolina (mL)

Tirosina

Muestra

Ninhidrina

(mL)

(mL)

(mL)

1

0.5

-

-

-

0.5

2

-

0.5

-

-

0.5

3

-

-

0.5

-

0.5

4

-

-

-

0.5

0.5

Mezclar y calentar a ebullición 1 minuto. La aparición de un color azul violáceo es positiva con excepción de la prolina y la hidroxiprolina.

Experimento No. 2: Cromatografía en capa fina.

Se proporcionaran alícuotas que se colocaran en tubos por separado de estándares de distintos aminoácidos junto con dos muestras problemas a identificar.

1.- Trazar una línea con lápiz sobre la placa a un centímetro de la base de la placa (utilizar regla y guantes para manipular la capa fina).

2.- A esta altura, colocar una gota de cada uno de los estándares de aminoácido, así como de las muestras problema, manteniendo una separación suficiente entre cada gota (ver figura).

3.- Dejar secar al aire (no soplar).

4.- Mientras tanto añadir el solvente (fase móvil) de butanol:ácido acético;agua en proporciones de 40:10:50 respectivamente a la cámara cromatográfica y sellar ésta con vaselina.

5.- Colocar las placas de cromatografía en la cámara, cuidando de no empalmar una con otra. Las placas deben quedar con la muestra de aminoácidos en la parte inferior para hacer una cromatografía ascendente.

6.- Cerrar la cámara y dejar que ascienda el solvente por la placa hasta un poco antes que salga.

7.- Sacar las placas y marcar con lápiz hasta donde avanzó el solvente.

8.- Dejar secar la placa al aire durante unos minutos.

9.- Rociar toda la placa con la solución de ninhidrina y calentar ligeramente en la estufa hasta que se revele el color, indicando la presencia de los aminoácidos.

10.- Medir los frentes del solvente y del soluto para cada mancha y calcular sus respectivos Rf (relación de frentes).

Rf= frente del soluto/frente del solvente.

11.- Comparar el Rf de los aminoácidos estándares con los de las muestras problema para identificar los aminoácidos presentes en cada mezcla.

Frente de soluto
Frente de soluto

Esquema de una cromatografía ascendente en capa fina.

RESULTADOS:

Se reportarán y describirán los cambios de color presentes en las pruebas de Sullivan, ninhidrina y nitrosonaftol e indicar si las pruebas resultaron positivas o negativas, y que significa esto en cada caso.

Explicar la importancia del NaCN utilizado en la prueba de Sullivan.

En el caso de la cromatografia de capa fina, se reportarán los valores de Rf´s para cada aminoácido estándar y cada aminoácido presente en cada mezcla.

Utilizando los datos obtenidos a partir de las pruebas bioquímicas y a partir de la cromatografía, definir que aminoácidos están presentes en cada una de las muestras problema.

DISCUSION:

CONCLUSIONES:

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:

CUESTIONARIO:

1) Mencione dos enfermedades humanas cuyo diagnóstico requiere la identificación de aminoácidos en muestras de fluidos, y explique por que razón es importante dicha identificación.

2) ¿Como se calcula el punto isoeléctrico de los aminoácidos y que importancia tienen este valor?

3) ¿Consideraría adecuado utilizar los Rf calculados en esta práctica para determinar los aminoácidos presentes en una muestra problema, separada con una fase móvil diferente? ¿Y si la fase móvil fuera la misma, pero el experimento se realizara otro día, en otro laboratorio? Explique

4) En base a los resultados obtenidos por todo el grupo indique como se separarían los siguientes aminoácidos, de manera ascendente, utilizando las mismas condiciones que en el presente experimento:

Ala, Met, Phe, Tyr, His, Glu, Gln.

5) Si el Rf de la L-Gly es de 0.45 y el de la L-Ala es de 0.52, ¿cuales serían los valores de Rf para la D-Gly y D-Ala, respectivamente?

SESIÓN 10 y 11

PRÁCTICA # 6

DISOCIACIÓN DE AMINOÁCIDOS

OBJETIVO

Comprender el comportamiento de los aminoácidos como moléculas anfotéricas y correlacionar esta propiedad con las características de los grupo radicales.

FUNDAMENTO:

Los aminoácidos son moléculas que presentan la siguiente estructura química genérica:

 

H

|

R

-

C

-

COO -

 

|

+ NH 3

Los aminoácidos contienen un carbón asímetrico (con excepción de la glicina) llamado carbono alfa, al cual se le unen cuatro radicales que son:

- un grupo carboxilo (COO - )

- un grupo amino ( + NH 3 )

- un átomo de hidrógeno (H) y

un radical de composición variable que permite diferenciar a los aminoácidos (R), llamado cadena lateral. Debido a las caracteristicas fisicoquímicas de la cadena lateral, es posible relacionar su posición, dentro de la estructura proteíca ya que si es de caracteristicas no polares (hidrofóbico), al contacto con el agua tenderá a plegarse dentro de la cadena polipeptídica; o si es de características polares (hidrofílico), tenderá a interactuar con el agua. Desde luego, para saber cual es la estructura de la cadena lateral debemos de conocer cual es el pH de la solución ya que dependiendo del pH la cadena lateral estará protonada (H + ) o desprotonada, este parámetro se puede conocer utilizando los pKa de cada aminoácido y la ecuación de Henderson-Hasselbach lo cual permite determinar cual es la estructura predominante a un pH dado; por ejemplo:

 

H

H

H

|

pk 1

|

pK 2

|

R - C - COOH

-----> R - C - COO - ------> R - C - COO -

| |

l

+ NH 3

+ NH 3

NH 2

pH = ácido

pH = alcalino

Los cambios de carga observados en el aminoácido mostrado, dependen del pH en que se encuentre, como se observa en la figura anterior, bajo condiciones ácidas el aminoácido está totalmente protonado y en condiciones alcalinas está totalmente desprotonado, esto se debe a que los aminoácidos son ácidos débiles y por lo tanto tienen una constante de disociación por cada grupo o radical capaz de comportarse como ácido o base débil. Esto permite conocer el punto isoelétrico de un aminoácido, el cual se define como el pH en el cual la carga neta es cero (¿cómo se le llama a este estado del aminoácido?).

Los aminoácidos que son utilizados para la síntesis de proteínas son 20, los cuales se les ha identificado como aminoácidos naturales y los no naturales son los que aún cuando siendo aminoácidos, no forman parte estructural de las proteínas (no están representados en el código genético).

En esta práctica se revisará el comportamiento iónico de los aminoácidos en solución por medio de su disociación en función del pH.

MATERIAL

2 vasos de precipitados de 100 ml

1 bureta, soporte y pinzas

2 pipetas de 5 ml ó de 10 ml

piseta

PHmetro

Agitador magnético con imanes de agitación.

Soluciones:

glicina 0.1 M,

ácido aspártico 0.1 M,

NaOH 0.1 N

HCl 0.1 N.

METODOLOGIA

Cargar cada bureta con las soluciones de NaOH 0.1 N y HCl 0.1 N

Colocar 30 ml de la solución de glicina 0.1M en vaso con un imán de agitación, llevar al agitador y medir el pH; en agitación constante, agregar gota a gota la solución de NaOH 0.1N y registrar el pH, continuar el procedimiento hasta titular completamente (pH básico).

Repetir el procedimiento con un nuevo volumen de glicina 0.1 M y titular con la solución de HCl 0.1N.

Repetir todo el procedimiento con un volumen de 30 ml de ácido aspártico.

ANÁLISIS DE DATOS

a) Elaborar una curva de titulación para cada aminoácido, con los valores de pH en

el eje de las oredenadas y los volúmenes equivalentes del ácido y de la base en el eje de

las absisas.

b) Determinar en la gráfica de titulación los valores de pKa, punto isoeléctrico y las

zonas de amortiguamiento de cada aminoácido.

SESIÓN 12 y 13

PRÁCTICA # 7

IIDDEENNTTIIFFIICCAACCIIÓÓNN YY CCUUAANNTTIIFFIICCAACCIIÓÓNN DDEE PPRROOTTEEÍÍNNAASS

INTRODUCCIÓN:

La palabra proteína proviene del griego preemintente, que significa primero. Fue inicialmente propuesta por Berzelius en 1838 para referirse a una serie de compuestos orgánicos con cierta complejidad, nitrogenados, que se encuentran altamente distribuidos en la naturaleza y son la base estructural y funcional de todo organismo vivo.

Las proteínas están compuesta por aminoácidos naturales ordenados en una secuencia discreta, y unidos entre si por enlaces peptídicos que siempre involucran radicales amino y carboxilo de cada aminoácido de la siguiente manera:

Aminoácido 1: NH 2 -CH-CO OH
Aminoácido 1:
NH 2 -CH-CO
OH

R

Aminoácido 2:

H
H

-N-CH-COOH

H

R

Enlace peptídico:

Pérdida de Agua

2: H -N-CH-COOH H R Enlace peptídico: Pérdida de Agua La variabilidad de las proteínas se

La variabilidad de las proteínas se debe a una serie de aspectos tales como:

complejidad estructural, residuos aminoácidos que la forman, propiedades químicas y físicas de cada proteína en el organismo que la contiene.

Por tanto el análisis químico de las proteínas en base a sus propiedades es muy amplio.

Ya que la identificación de proteínas es muy importante en el campo medico, clínico y para su investigación, existen técnicas muy utilizadas con este objetivo. En esta ocasión consideramos algunas como: reacción de Xantoproteica, reacción con ninhidrina y reacción de Biuret.

Reacción Xantoproteica:

Esta reacción afecta la integridad estructural de los residuos aminoacídicos de las proteínas. Es debida a la formación de un compuesto aromático nitrado de color amarillo, cuando las proteínas son tratadas con ácido nítrico concentrado. La prueba es específica, y da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos bencénicos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali vira a un color anaranjado oscuro (anillo por esterificación).

Reacción de Biuret:

Entre las reacciones coloreadas específicas de las proteínas, que sirven por tanto para su identificación, destaca la reacción de Biuret. Esta reacción la producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos, ya que se debe a la presencia del enlace peptídico CO-NH que se destruye al liberarse los aminoácidos. En el reactivo de Biuret (CuSO 4 + NaOH), el Cu, en un medio fuertemente alcalino, se coordina con los enlaces peptídicos, formando un complejo de color violeta, cuya intensidad de color depende de la concentración de proteínas.

Reacción con Ninhidrina:

Al igual que las otras reacciones, esta forma un complejo color púrpura, para todas las sustancias o mezclas que presentan aminoácidos. No es específica como las anteriores, pero es de gran ayuda para la identificación “primaria” de proteínas, que después nos lleven a realizar más pruebas de identificación ya específica.

OBJETIVO:

Identificar proteínas por la presencia de enlaces peptídicos y grupos aromáticos, y cuantificarlas mediante la técnica de Biuret.

MATERIAL:

15 tubos de ensaye

1

gradilla

5

pipetas de 1.0mL

2

pipetas de 5.0mL

1

pipeta de 10.0mL

1

bureta

METODOLOGIA:

Experimento No. 1: Identificación de proteínas

A) Reacción Xantoprotéica

Colocar los mismos estándares en tubos por separado, como lo indica el siguiente cuadro:

Tubo

Estandar (mL)

Agua Dest. (mL)

HNO 3 (mL)

1

0.5

peptona

-

0.5

2

0.5

gelatina

-

0.5

3

0.5

albúmina

-

0.5

4

0.5

tirosina

-

0.5

5

(blanco)

-

0.5

0.5

Las soluciones anteriores, se llevan a ebullición por 5 minutos en baño maría previamente preparado en estufa.

Se deja reposar y enfriar por 10 minutos y se le agregan a todos los tubos algunas gotas de NH 4 OH por estratificación para observar los cambios de color y en algunos casos la formación de anillo de interfase.

B) Reacción de Biuret.

Colocar los mismos estándares de la prueba anterior en tubos por separado, como lo indica el siguiente cuadro:

Tubo

Estandar (mL)

Agua Dest. (mL)

Reactivo de Biuret

1

1

peptona

-

1

2

1

gelatina

-

1

3

1

albúmina

-

1

4

1

tirosina

-

1

5 (blanco)

-

1

1

Experimento II. Curva de calibración y cuantificación de proteínas.

1.- Es conveniente, antes de realizar la práctica, hacer los cálculos necesarios para preparar, a partir de un estándar de albúmina al 1%, soluciones de albúmina a las siguientes concentraciones: 0, 1, 2, 5 y 10 mg/mL.

2.- Una vez preparadas las soluciones con diferentes concentraciones de albúmina (estándares de calibración), tomar 2 mL de cada uno y colocarlos en tubos limpios y etiquetados (5 tubos).

3.- Tomar 2 mL de cada muestra problema y colocarlos en otros tubos.

4.- Agregar a cada tubo 2 mL de reactivo de Biuret.

5.- Colocar en reposo durante 15 minutos, a temperatura ambiente, esperando el cambio de color.

6.- Medir en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 595nm, utilizando como blanco agua destilada.

7.- Con las absorbancias medidas para cada uno de los estándares de calibración, realizar una curva de calibración que será utilizada para determinar la concentración de las muestras problema.

RESULTADOS:

Se reportan los resultados de las pruebas Xantoproteica, y Biuret, como la descripción de los cambios de colores en las soluciones de la siguiente forma: (++) color intenso, (+) cambio ligero, y (-) sin formación de color. Indicar que significa el cambio de color en cada reacción.

Se reportara una gráfica en la que se presenten las distintas concentraciones de albúmina (estándares) contra la absorbancia que presentan de modo que se obtenga una curva de calibración. Incluya una tabla con los valores de absorbancia de cada estándar y muestra problema.

Utilizar esta curva para determinar las concentraciones de las soluciones problema con su respectivo porcentaje de error:

%

Error

problema con su respectivo porcentaje de error: % Error valor real valor obtenido valor real 100

valor real valor obtenido

porcentaje de error: % Error valor real valor obtenido valor real 100 DISCUSIÓN: CONCLUSIONES: BIBLIOGRAFIA

valor real

de error: % Error valor real valor obtenido valor real 100 DISCUSIÓN: CONCLUSIONES: BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:

100

DISCUSIÓN:

CONCLUSIONES:

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:

CUESTIONARIO:

1) Describir y explicar mediante un esquema la reacción entre el reactivo de Biuret y los enlaces peptídicos.

2) Investigue otros dos métodos empleados comúnmente para cuantificar proteínas. Diga cual es el rango de concentraciones en el que se utilizan estos dos métodos, así como el método de Biuret. ¿Cuál de los tres métodos es el mas sensible?

3) Explique por qué razón en la presente práctica se utilizó una curva de calibración de albúmina para luego cuantificar muestras problema que no contenían albúmina.

SESIÓN 14 y 15

PRACTICA # 8

PPRROOPPIIEEDDAADDEESS QQUUÍÍMMIICCAASS DDEE LLAASS PPRROOTTEEÍÍNNAASS

INTRODUCCIÓN:

Las proteínas poseen diversas funciones biológicas y son importantes para el funcionamiento normal de la célula. Algunas de las funciones que tiene las proteínas dentro del organismo son las siguientes: actúan como enzimas (aceleran o retardan reacciones), tienen parte en el sistema inmunológico, tienen función estructural, transportan sustancias, participan como hormonas, también pueden funcionar como receptores, y tiene propiedades ácido-base.

Las proteínas en disoluciones muestran cambios profundos en su solubilidad en función de distintos factores: a) pH, b) fuerza iónica, c) propiedades dieléctricas del disolvente, y d) la temperatura. Estas propiedades suelen utilizarse para separar mezclas de proteínas, ya que cada proteína posee una composición de aminoácidos característica la cual determina su comportamiento como electrolito.

Precipitación Isoeléctrica:

El pH a la que una proteína muestra un mínimo de solubilidad es su pH isoeléctrico. Definido por aquel valor de pH al que una molécula no posee carga eléctrica y es incapaz de trasladarse en un campo eléctrico. En estas condiciones no existe repulsión electrostática, entre moléculas de proteína vecinas y tienden a precipitar.

Puesto que las diferentes proteínas poseen valores de pH isoeléctrico también distinto, debido a que difieren en el contenido de aminoácidos con grupos R o cadenas laterales ionizables, con frecuencia pueden separarse unas de otras mediante precipitación isoeléctrica. Cuando el pH de una mezcla de proteínas se ajusta a su pH isoeléctrico de alguno de sus componentes, la mayor parte o casi todos sus componentes precipitarán. La proteína precipitada permanece en su configuración nativa, y puede redisolverse en un medio de pH apropiado y concentración salina adecuada.

Solubilización y precipitación por Salado

Las sales neutras ejercen efectos pronunciados sobre la solubilidad de las proteínas globulares; a bajas concentraciones las sales incrementan la solubilidad de muchas proteínas, este fenómeno es llamado Solubilización por salado (salting-in). Por otra parte, a medida que la fuerza iónica aumenta, la solubilidad de una proteína comienza a disminuir. A una fuerza iónica lo suficientemente elevada una proteína puede ser casi completamente precipitada de su disolución, dicho efecto es llamado precipitación por salado (salting-out).

OBJETIVO:

Comprobar el efecto del pH, naturaleza y concentración de los iones, sobre la solubilidad de las proteínas; y determinar punto Isoeléctrico mediante precipitación.

MATERIAL:

1.- 13 tubos de ensaye de 10 x150 mm.

2.- 1 pipeta de 10ml.

3.- 6 pipetas de 5ml.

4.- 1 gradilla

METODOLOGÍA:

En esta práctica se trata de provocar cambios de solubilidad en las proteínas que se encuentran en el organismo, mediante la modificación de las propiedades de los solventes.

Experimento No.1 Determinación del punto isoleléctrico del albuminato de sodio por adición de un ácido

Preparar una serie de tubos como se indica a continuación (mL):

Tubo

Acetato de sodio 0.1 N

Ácido acético

Ácido acético

0.1 N

0.01 N

1

0.5

9.5

-

2 1

 

9

-

3 1.5

 

8.5

-

4 2

 

8

-

5 3

 

7

-

6 4

 

6

-

7 6

 

4

-

8 8

 

2

-

9 6

 

-

4

10 8

 

-

2

Agregar a cada tubo 1 mL de albuminato al 10%.

Mezclar bien y observar los cambios que se presente la solubilidad del albuminato en cada tubo.

Calcular el pH de cada tubo utilizando la ecuación de Henderson- Hasselbach y determinar el punto Isoeléctrico (PI) del albuminato (utilice la siguiente tabla).

TUBO

pH

PRECIPITACIÓN

1

   

2

   

3

   

4

   

5

   

6

   

7

   

8

   

9

   

10

   

Experimento No.2 Solubilización y precipitación por sales.

Preparar 9 tubos como se indica a continuación (mL) :

Tubo

NaCl 10 %

ZnSO4 10 %

Co(CH 3 COO) 2 10%

Etanol

H

2 O

1

1

       

2

0.5

     

0.5

3

0.1

     

0.9

4

 

1

     

5

 

0.5

   

0.5

6

 

0.1

   

0.9

7

   

1

   

8

   

0.5

 

0.5

9

   

0.1

 

0.9

10

     

1

 

11

     

0.5

0.5

12

     

0.1

0.9

Agregar a cada tubo 1 mL de albuminato al 1%. Agitar y observar precipitación. Asignar a cada tubo de manera arbitraria un “porcentaje de solubilidad”.

Calcular la fuerza iónica de cada tubo y representar sus resultados en la siguiente tabla.

   

Fuerza

 

TUBO

Sal

iónica

% Solubilidad

1

     

2

     

3

     

4

     

5

     

6

     

7

     

8

     

9

     

10

     

RESULTADOS:

Se reportara para el primer experimento una tabla con los valores de pH calculados para cada tubo, así como la cantidad de precipitado formado. Para ello se utilizarán cruces: (+++) muy precipitada (++) precipitación media (+) poca precipitación (-) completamente solubilizada. A partir de esta tabla, se determinará el punto isoeléctrico del albminato como aquel pH al cual exista el mayor precipitado.

En el experimento dos se reportará la tabla con fuerza iónica de cada tubo así como “porcentaje de solubilidad” asignado. NOTA: el porcentaje de solubilidad será inverso a

la cantidad de precipitado.

A partir de esta tabla, construya una grafica de %de solubilidad contra fuerza iónica,

utilizando una línea diferente para cada sal. O bien, construya tres gráficas de barras separadas, una para cada sal. NOTA: En el eje de las x, las fuerzas iónicas deben

estar ordenadas de menor a mayor.

DISCUSION:

Se compararán los valores obtenidos de punto isoeléctrico con los que presenta la bibliografía y se dará una explicación del por que de las diferencias encontradas (si las hay).

Explicar el comportamiento observado en las graficas de solubilidad contra fuerza iónica. Explicar las diferencias existentes entre el comportamiento de las tres sales (si las hay).

CONCLUSIONES:

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:

SESION 16 Y 17

Práctica # 9

AANNÁÁLLIISSIISS EENNZZIIMMÁÁTTIICCOO CCUUAALLIITTAATTIIVVOO:: EEFFEECCTTOO DDEELL CCAALLOORR SSOOBBRREE LLAA AACCTTIIVVIIDDAADD DDEE LLAASS EENNZZIIMMAASS

INTRODUCCIÓN:

Las enzimas son proteínas especializadas en la catálisis de las reacciones biológicas. Se encuentran entre las mas notables de las biomoléculas conocidas debido a su extraordinaria especificidad y a su poder catalítico, que es mucho mayor que la de los catalizadores hechos por el hombre.

Gran parte de la historia de la bioquímica es la historia de la investigación de las enzimas. El nombre enzima no se empleó sino hasta 1887, pero mucho antes ya se sospechaba que ciertos catalizadores biológicos intervenían en la fermentación del azúcar para formar alcohol (de aquí el nombre de fermentos). La primera teoría general sobre la catálisis química, publicada por J. J. Berzelius en 1835, incluía un ejemplo de lo que ahora conocemos como enzimas; como la diastasa de la malta, y señalaba que la hidrólisis del almidón se cataliza por el ácido sulfúrico con menor eficacia que con la diastasa.

La actividad e algunas enzimas dependen solamente de su estructura proteica, mientras que otros necesitan además, de uno más componentes no proteicos llamados cofactores. El cofactor puede ser un ion metálico o bien puede ser una molécula orgánica llamada coenzima. Algunas enzimas necesitan ambos.

Los cofactores son generalmente estables frente a la acción del calor, mientras que muchas proteínas enzimáticas pierden su actividad por la calefacción.

El complejo enzima-cofactor catalíticamente activo recibe el nombre de holoenzima. Cuando se separa el cofactor, la proteína restante por si sola es inactiva catalíticamente, recibe el nombre de apoenzima.

OBEJTIVO:

Determinar el efecto fisicoquímico que generan las enzimas sobre diferentes sustratos.

MATERIAL:

6

tubos de ensaye

3

pipetas de 1 mL

2

pipetas de 5mL

2

pipetas pasteur

2

gradillas

6

tapones

METODOLOGIA:

Experimento No. 1 Actividad de la ureasa

Preparar tres tubos como se indica en el siguiente cuadro.

Tubo

Semilla

Agua(ml)

vegetal

1

Pizca

0

2

Pizca

5

3

pizca

5

Mezclar y tratar de homogenizar el polvo de sandia. Colocar un tapón de algodón a los tubos 1 y 2 y poner en baño a ebullición durante 20min. (cuidar que no se acabe el agua del baño). Añadir a cada tubo lo que se indica a continuación:

tubo

Agua (ml)

Azul de bromotimol (gotas)

1

5.0

2

2

0

2

3

0

2

En caso de que la solución tenga color azul en algún tubo, añadir ácido débil (gotas), hasta obtener una coloración amarilla en todos los tubos.

Añadir a todos los tubos 5ml de urea. Mezclar rápidamente y tomar el tiempo que transcurre en cada tubo hasta alcanzar el vire de color amarillo a color azul.

Experimento No. 2 Determinación de la actividad de la renina

Preparar la siguiente serie de tubos como se muestra a continuación:

 

leche

oxalato de amonio

sol. de renina

tubo

(mL)

(mL)

(gotas)

1

3

0

3

2

3

0.5

3

3

3

0.5

3

Al tubo 1 agregar 0.5 mL de agua destilada.

Mezclar e incubar durante 10 minutos a 37 °C, y anotar los cambios observados.

Llevar a ebullición el tubo 3 y dejar enfriar.

Agregar a los tubos 2 y 3 10 gotas de CaCl 2 .

Anotar los cambios observados en todos los tubos y compararlos entre sí.

RESULTADOS:

Para el primer experimento, mostrar la coloración inicial de cada tubo, así como la cantidad de ácido requerida para alcanzar la tonalidad amarilla. Lo más importante:

indique el tiempo aproximado o relativo que le llevó a cada tubo virar de amarillo a azul, una vez añadida la urea.

En el segundo experimento se reportara la aparición de cuajo, así como la proporción en la que aparece éste en cada tubo.

Presente sus datos en forma de tablas y dibujos, pero no olvide describirlos. Indique bien claramente, para ambos experimentos, cual es la enzima y cual es el sustrato. No confunda con los indicadores y/o cofactores, sobre todo en el experimento 1.

DISCUSION Y CONCLUSIONES:

Primer experimento

Explique claramente cual es la reacción catalizada por la ureasa. Explique el papel del ácido débil y del azul de bromotimol y explique claramente a que se deben los cambios de color observados. (Recuerde, el cambio importante es el vire de amarillo a azul ¿Por qué?)

Analize finalmente el efecto del calor (ebullición) sobre la ureasa.

Segundo experimento

Analizar el efecto del oxalato de amonio y calcio sobre la actividad de la enzima renina. Analizar el efecto de la ebullición sobre la misma.

Explicar el porque de sus resultados en ambos experimentos.

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:

SESION 19 Y 20

Práctica #. 10

CINETICA ENZIMATICA: EFECTO DEL PH Y TEMPERATURA

OBJETIVOS:

El alumno analizará el efecto del pH y de la temperatura sobre la actividad enzimática en una reacción. Basado en:

Discutirá el efecto sobre el comportamiento catalítico de una enzima al variar el pH de la mezcla de reacción.

Discutirá los cambios que se presentan en la cinética enzimática al variar la temperatura de reacción.

Determinará las condiciones óptimas de reacción en función de estos dos factores ( pH, temperatura).

PRE-RREQUISITOS:

Describir el efecto del pH sobre la estabilidad y actividad de una enzima.

Describir el efecto de la temperatura sobre la estabilidad y actividad de una enzima.

Describir el sitio activo y sitio de enlace de una enzima.

Describir los agentes desnaturalizantes y su mecanismo de acción sobre una enzima.

Explicar los conceptos de pH y temperatura óptimos de una enzima en una reacción catalizada.

INTRODUCCION:

Es lógico pensar que el pH de una solución influye sobre la velocidad de una reacción catalizada por enzimas. El sitio activo y el sitio de enlace de una enzima generalmente están compuestos por grupos ionizables que deben presentarse con una forma iónica apropiada o específica, de tal manera, que se pueda mantener la conformación adecuada de estos sitios en la enzima y pueda llevarse a cabo la unión del sustrato y su transformación hacia productos.

Igualmente puede existir un sustrato con grupos ionizables y debe contener una forma iónica específica para que pueda unirse a la enzima y posteriormente se realize la catálisis. Los efectos de pH sobre la estabilidad de una enzima se debe tomar en cuenta en cualquier estudio de efecto de pH sobre la catálisis de sustrato.

Se observa que el pH óptimo de la reacción enzima -sustrato es a 6.8 según la gráfica de la curva A, sin embargo, no nos indica porque declina la velocidad por arriba y abajo de este valor.

En la curva B se observa que la preincubación de la enzima entre pH de 5.0 - 8.0 no tiene efecto sobre la actividad medida a pH 6.8. Por lo tanto, la interpretación de las 2 gráficas nos indica que la caída en la actividad entre 6.8 - 8.0 y entre 6.8 - 5.0 es el

resultado de la formación de una estructura iónica impropia de la enzima y/o sustrato o los dos.

Cuando la enzima es preincubada a pH entre 5.0 - 8.0, se mantiene la actividad completa de la enzima a 6.8. Por arriba o abajo de este valor de pH resulta en inactivación de la enzima.

La estabilidad de la enzima depende de varios factores, por ejemplo, temperatura, fuerza iónica, naturaleza del amortiguador, concentración de iones metálicos, concentración de sustratos o cofactores y concentración de enzima.

El último factor es muy importante ya que existen algunas enzimas que a bajas concentaciones se disocian en monómeros y que son menos estables.

Otro de los factores que afectan la velocidad de una reacción es la temperatura, de tal suerte que un incremento de temperatura proporciona mayor energía cinética a las moléculas reactantes, dando como resultado choques más productivos por unidad de tiempo. La actividad catalítica de las enzimas resulta de una estructura altamente ordenada. Si la molécula absorbe mucha energía, la estructura se rompe y la enzima se desnaturaliza y por lo tanto pierde su actividad catalítica.

Si se grafica velocidad vs. temperatura se obtiene una curva en forma de campana, en el cual el pico se conoce como temperatura óptima. La estabilidad a la temperatura, de una enzima depende del pH, fuerza iónica del medio, así como de la presencia o ausencia de metales. La mayoría de los sustratos ejercen un efecto de protección a la enzima contra la desnaturalización por temperatura. Las enzimas de bajo PM compuestas de cadenas sencillas y que poseen enlaces disulfuro son más estables al calor que las de alto PM. Las enzimas obtenidas de un extracto crudo libre de células son más estables al calor por la alta concentración de otras proteínas (efecto protector).

MATERIAL :

1.- 14 tubos de ensaye

2.- 1 gradilla

3.- Celdas de fotocolorímetro

4.- Fotocolorímetro

5.- Baños de agua de temperatura controlada

6.- 3 Pipetas de 1.0 ml

7.- 2 pipetas de 5.0 ml

METODOLOGIA:

Efecto del pH

Tubo

1

2

3

4

5

6

7

8

Sacarosa 0.3 M

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

Amortiguador pH =

0.5

0

0

0

0

0

0

0

2.5

Amortiguador pH =

0

0.5

0

0

0

0

0

0

2.5

Amortiguador pH =

0

0

0.5

0

0

0

0

0

3.5

Amortiguador pH =

0

0

0

0.5

0

0

0

0

4.5

Amortiguador pH =

0

0

0

0

0.5

0

0

0

5.5

Amortiguador pH =

0

0

0

0

0

0.5

0

0

6.5

Amortiguador pH =

0

0

0

0

0

0

0.5

0

7.5

Agua

0

0

0

0

0

0

0

1.0

Mezclar e incubar a 37° C durante 2 min.

Agregar 0.5 mL de Enzima (Invertasa) a todos los tubos.

Mezclar e incubar a 25°C durante 20 min.

Agregar 1 mL de Dinitrosalicilato a todos los tubos.

Mezclar y calentar en baño de agua a ebullición durante 5 min. Enfriar y leer a 540 nm ajustando a cero con el tubo No. 8

Efecto de la Temperatura

Tubo

1

2

3

4

5

6

7

Sacarosa 0.3 M

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

Amortiguaor pH = 4.7

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

Invertasa

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

0

Agua

0

0

0

0

0

0

1.0

Temperatura °C

4

26

37

45

60

100

25

Mezclar e incubar 5 min a la temperatura indicada.

Agregar 1 mL de Dinitrosalicilato a todos los tubos.

Mezclar y calentar en baño de agua a ebullición durante 5 min. Enfriar y leer a 540 nm ajustando a cero con el tubo No. 7

RESULTADOS :

1.- Grafique los resultados obtenidos de velocidad vs pH.

2.- Grafique los resultados obtenidos de velocidad vs temperatura.

3.- Indique cuales son los valores de pH y temperatura óptimos obtenidos.

CUESTIONARIO :

1.- La pepsina presenta su máxima actividad a un pH » 1. Mencione cuáles podrían ser los grupos funcionales presentes en el sitio activo y sobre cuales residuos de aminoácidos rompe los enlaces peptídicos.

2.- Si la concentración de sustrato en una reacción enzimática es igual a un 1/3 de Km. Cuál será la velocidad inicial de la reacción.

3.- De acuerdo a la clasificación de las enzimas a que clase pertenece una enzima que participa en la conversión de un azúcar de tipo aldosa a un azúcar de tipo cetosa.

4.- En esta práctica se ha observado como influye el pH en la actividad de invertasa, a una concentración de sacarosa dada. La estaquiosa es un tetrasacárido y es un sustrato para esta enzima y se ha observado que es hidrolizado a una velocidad igual al 5% de la sacarosa, bajo las mismas condiciones de concentración y pH. Cómo explicaría esta velocidad máxima tan baja en relación al pH de la reacción. ( a-Gal-a- Gal-a-Glu-ß-Fru ).

5.- Cuando las soluciones enzimáticas son calentadas, hay una pérdida progresiva de la actividad catalítica con el tiempo. Así, una solución de hexocinasa incubada a 45°C durante 12 minutos pierde el 50% de su actividad; pero cuando la hexocinasa se incuba a 45°C, en presencia de altas concentraciones de glucosa durante el mismo tiempo,

solamente se pierde un 3% de su actividad. Explique el porque de la variación desnaturalizante de la hexocinasa por efecto de la temperatura en ausencia y presencia del sustrato.

SESION 21 Y 22

Práctica #. 11

EEFFEECCTTOO DDEE LLAA CCOONNCCEENNTTRRAACCIIÓÓNN DDEE SSUUSSTTRRAATTOO SSOOBBRREE LLAA AACCTTIIVVIIDDAADD EENNZZIIMMÁÁTTIICCAA

INTRODUCCION:

Los principios generales de la cinética química pueden ser aplicados a las reacciones catalizadas por las enzimas, pero éstas muestran también una característica que no se observa en las reacciones no enzimáticas: la saturación con

el sustrato. A una concentración de sustrato baja, la velocidad de una reacción

enzimática es proporcional a la concertación de sustrato, por lo tanto, es aproximadamente de primer orden con respecto al mismo. Sin embargo, a medida que la concentración de sustrato aumenta, la velocidad de la reacción deja de aumentar proporcionalmente a la concentración de sustrato, en esta zona el orden se

dice mixto. Con un aumento posterior de la concentración de sustrato, la velocidad de

la reacción llega a ser independiente de la concentración del sustrato y se aproxima

asintóticamente a una velocidad constante. En este intervalo de concentración de sustrato la reacción es de orden cero esencialmente y se dice entonces que la enzima se halle saturada con sustrato. El efecto de saturación condujo a algunos investigadores a formular la teoría de que la enzima y el sustrato reaccionan de forma reversible para formar un complejo como una primera etapa esencial de la reacción

catalizada.

L. Michaelis y M. Menten desarrollaron una teoría del análisis cinético de las reacciones catalizadas por enzimas, la cual se amplió posteriormente por G.E. Briggs y B.S. Haldane. En esta teoría se supone primero la formación del complejo enzima sustrato ES, que, a continuación se escinde para formar la enzima libre y el producto P:

k 1 k -1
k 1
k -1
k 2 k -2
k 2
k -2

E + S

Con el objeto de definir una expresión matemática que relacione la velocidad inicial de la reacción enzimática, la cual es igual a la velocidad de la ruptura del complejo enzima sustrato, con la concentración inicial de sustrato libre, propusieron el siguiente modelo, que hasta la fecha aún se utiliza para describir la actividad de las enzimas y estudiarlas bajo diferentes condiciones:

ES

E + P

V

o

S S
S
S
y estudiarlas bajo diferentes condiciones: ES E + P V o S S K V max

K

V

max

M

Ecuación de Michaelis-Menten

Donde K M y V max son dos parámetros aproximadamente constantes que caracterizan a cada enzima determinada.

OBJETIVO:

Determinar los parámetros V max y K M de la enzima invertasa.

MATERIAL:

Tubos de ensaye

Una gradilla

Pipetas de 1 mL

Pipetas de 5 mL

Un baño de agua a 37 grados centígrados

Un baño de agua a ebullición

METODOLOGIA:

La invertasa es una enzima hidrolítica que actúa sobre la sacarosa (un disacárido) liberando glucosa y fructosa. La actividad de la enzima se detiene al añadir una disolución alcalina y el poder reductor de los productos se mide haciéndolos reaccionar en el reactivo de dinitrosalicilato.

     

SACAROSA (M)

 

TUBO

ENZIMA

AMORTIGUADOR

0.02

0.03

0.05

0.1

0.3

AGUA

1

1mL

0.5mL

1mL

0mL

0mL

0mL

0mL

0mL

2

1mL

0.5mL

0mL

1mL

0mL

0mL

0mL

0mL

3

1mL

0.5mL

0mL

0mL

1mL

0mL

0mL

0mL

4

1mL

0.5mL

0mL

0mL

0mL

1mL

0mL

0mL

5

1mL

0.5mL

0mL

0mL

0mL

0mL

1mL

0mL

6

1mL

0.5mL

0mL

0mL

0mL

0mL

0mL

1mL

Mezclar e incubar a 35 ° C por 20 minutos.

Añadir a todos los tubos 1 mL de dinitrosalicilato.

Mezclar y calentar en baño de agua a ebullición durante 5 minutos. Enfriar y leer a 540 nm ajustando a cero con el tubo no.6

Para el segundo día, repetir el experimento anterior, solo que se preparará un duplicado de cada tubo. Leer absorbancia de la primera serie de tubos a los 10 minutos y de la segunda serie a los 20 minutos.

RESULTADOS:

Reportar los valores de absorbancia en cada tubo, con sus respectivas concentraciones de sustrato y tiempo en que se midió. Presentar una tabla como la siguiente.

[Sacarosa] (M)

Abs/10 min

Abs/20min

0

   

0.02

   

0.03, etc.

   

En base a ésta, calcule la actividad de la enzima (velociad inicial, Vo) como el cambio en unidades de absorbancia por unidad de tiempo. Hay dos formas de hacerlo: 1) Graficando Abs vs. Tiempo, donde Vo = pendiente de la región recta de la gráfica. 2) Si se cuenta con un solo dato de Abs a un solo tiempo, Vo = Abs/tiempo (min).

Con los valores de actividad en unidades de absorbancia/min y las concentraciones construya la grafica de Michaelis-Menten y la de Linewaver-Burk, y en base a estas determine los parámetros cinéticos de la enzima.

DISCUSION Y CONCLUSIONES:

Explique claramente la forma en que se calculó la velocidad inicial. Compare sus resultados de ambos días y de motivos para las diferencias (si las hay). Lo mismo para el cálculo de Km y Vmax. Compare estos parámetros con valores encontrados en alguna referencia. Explique la reacción catalizada por la enzima y su importancia.

1.- La velocidad inicial de una reacción enzimática es dependiente exclusivamente de la cantidad de sustrato presente? si, no por qué?

2.- Cual es la diferencia entre los cambios de energía libre que existen entre un proceso catalizado por una enzima y el mismo proceso no catalizado.

3.- Por qué a concentraciones de sustrato mucho mayores que el valor de la Km la velocidad de la reacción es independiente de la concentración de sustrato?

4.- La Km de una enzima varía con la concentración de enzima? si, no, por qué?

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:

SESION 23 Y 24

CINÉTICA ENZIMÁTICA.

INTRODUCCION:

PRACTICA No. 12

EFECTO DE INHIBIDORES

Algunos compuestos reaccionan con las enzimas disminuyendo su actividad catalítica. Este efecto se utiliza para preparar fármacos o insecticidas que inhiben selectivamente ciertas enzimas en las bacterias o insectos, sin afectar al hospedero.

La inhibición puede ser reversible o irreversible, sin embargo, la inhibición reversible es generalmente más útil para regular la actividad de las enzimas. Los estudios logrados en base a inhibidores, han contribuido a la información actual sobre cinética enzimática y mecanismos tanto metabólicos como clínicos.

Los dos tipos principales de inhibición reversible son: La inhibición competitiva y la “no competitiva”. En la primera, el compuesto inhibidor interacciona con el sitio catalítico, compitiendo con el sustrato por la unión con dicho sitio. En este caso el grado de inhibición depende directamente de la concentración del inhibidor, con respecto al sustrato específico, por lo tanto, si la concentración de sustrato es mayor que la del inhibidor, no se presentará el efecto inhibitorio. Más aún, si a una enzima bajo el efecto de un inhibidor competitivo se le adiciona mayor cantidad de sustrato, casi siempre desaparecerá el efecto inhibitorio.

La

mayoría

de

los

inhibidores

competitivos

tienen

una

estructura

química

semejante a la del sustrato natural por lo tanto son muy específicos.

La inhibición “no competitiva” es aquella, donde el inhibidor se combina con la enzima uniéndose a un sitio diferente al sitio catalítico de manera que la enzima puede unirse al sustrato y al inhibidor simultáneamente. La inhibición ocurre porque al unirse el inhibidor provoca cambios moleculares en la enzima que disminuyen su actividad. De acuerdo al modo en que el inhibidor se une a la enzima y al efecto cinético que tiene sobre ella, esta inhibición se subdivide en Acompetitiva y Mixta. Dentro de los inhibidores mixtos se incluyen los clásicos no-competitivos.

Los inhibidores no competitivos son a veces inespecíficos o sea que un mismo inhibidor puede afectar a varias enzimas a la vez. Existen inhibidores muy complejos como el pentacloruro de mercurio, el benzoato de sodio o muy simples como los iones metálicos plata, cobre, plomo y cianuro. Algunos de estos inhibidores son reversibles y otros irreversibles.

OBJETIVO:

Determinar el tipo de inhibición ejercida por CuSO 4 sobre la actividad de la enzima invertasa.

MATERIAL :

1.- 21 tubos de ensaye

2.- 2 gradillas

3.- 2 Celdas de fotocolorímetro

4.- Fotocolorímetro

5.- Baños de agua de temperatura controlada

6.- 3 Pipetas de 1.0 ml

7.- 2 pipetas de 5.0 ml

METODOLOGIA:

Primer día:

Preparar los siguientes tubos:

Tubo

Sacarosa

Agua

Amortiguador

Arabinosa

Invertasa

0.02 Molar

1

2

mL [0.02]

2

mL

1 mL

----

2

mL

2

2

mL [0.03]

2

mL

1 mL

----

2

mL

3

2

mL [0.05]

2

mL

1 mL

----

2

mL

4

2

mL [0.10]

2

mL

1 mL

----

2

mL

5

2

mL [0.30]

2

mL

1 mL

----

2

mL

6

2

mL [0.02]

----

1 mL

2

mL

2

mL

7

2

mL [0.03]

----

1 mL

2

mL

2

mL

8

2

mL [0.05]

----

1 mL

2

mL

2

mL

9

2

mL [0.10]

----

1 mL

2

mL

2

mL

10

2

mL [0.30]

----

1 mL

2

mL

2

mL

11

 

0

1

mL

0.5 mL

1

mL

1

mL

Mezclar e incubar a 35°C.

A los diez minutos tomar 3.5 mL de cada uno de los tubos 1-10 y pasarlos a 10 tubos

limpios y etiquetados. Usar para ello una pipeta de 5 mL y enjuagar con agua destilada

entre tubo y tubo.

Agregar a cada tubo nuevo 1 mL de dinitrosalicilato (DNS) agitar y poner a ebullición durante 5 minutos. Dejar enfriar.

A los veinte minutos sacar todos los tubos y repetir el procedimiento anterior. (1 mL DNS,

mezclar, poner a ebullición y enfriar)

Medir Abs de todos los tubos a 540 nm, utilizando como blanco el tubo 11

Segundo día:

Preparar los siguientes tubos:

Tubo

Sacarosa

Agua

Amortiguador

Arabinosa

Invertasa

0.01 Molar

1

2

mL [0.02]

2

mL

1 mL

----

2

mL

2

2

mL [0.03]

2

mL

1 mL

----

2

mL

3

2

mL [0.05]

2

mL

1 mL

----

2

mL

4

2

mL [0.10]

2

mL

1 mL

----

2

mL

5

2

mL [0.30]

2

mL

1 mL

----

2

mL

6

2

mL [0.02]

1

ml

1 mL

1 mL

2

mL

7

2

mL [0.03]

1

mL

1 mL

1 mL

2

mL

8

2

mL [0.05]

1

mL

1 mL

1 mL

2

mL

9

2

mL [0.10]

1

mL

1 mL

1 mL

2

mL

10

2

mL [0.30]

1

mL

1 mL

1 mL

2

mL

11

 

0

1

mL

0.5 mL

1 mL

1

mL

Repetir el procedimiento del primer día.

RESULTADOS:

Deberá calcular las Vo para cada tubo, del primero y segundo día.

Los tubos 1 al 5 de ambos días son los controles de velocidad en ausencia de inhibidor. Haga un promedio de las Vo obtenidas el primero y segundo día. Con el promedio de velocidades construya una gráfica de Michaellis-Menten.

Los tubos 6 al 10 de ambos días son los datos de velocidad en presencia de inhibidor. Los del primer día son en presencia de Arabinosa 0.02 Molar y los del segundo día son en presencia de Arabinosa 0.01Molar. Construya gráficas de Michaellis para cada concentración de inhibidor.

En una misma gráfica de Lineweaver-Burk represente los recíprocos de:

a) Vo en ausencia de inhibidor

(tubos 1-5, promedio de los dos días)

b) Vo con Arabinosa 0.02 Molar (tubos 6-10 día 1)

c) Vo con Arabinosa 0.01 Molar (tubos 6-10 día 2)

Calcule parámetros cinéticos (Km y Vmax) de la enzima, reales y aparentes, para cada condición.

Determine, de acuerdo a esta gráfica y a los parámetros calculados, que tipo de inhibición presenta la Arabinosa.

DISCUSION Y CONCLUSIONES:

Compare sus velocidades control contra las de la práctica 6. Explique las diferencias basándose en todos los factores que modifican la actividad enzimática. Explique claramente que tipo de inhibidor es la Arabinosa e indique de que forma se unirá a la enzima. Busque en bibliografía usos de la arabinosa y efectos sobre algún tipo de enzima (no necesariamente la invertasa) o incluso sobre microroganismos. Compare la estructura del inhibidor con la del sustrato para apoyar mas su conclusión sobre tipo de inhibodor.

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:

SESION 25 y 26

PRACTICA # 13

ESTUDIO DEL BOMBEO DE PROTONES POR LEVADURAS

(Práctica adaptada del Manual de prácticas de laboratorio, Bioquímica y Biología Molecular Departamento de Bioquímica Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México.)

Objetivo.- Analizar el metabolismo celular por medio de la variación en los parámetros fisicoquímicos del medio

FUNDAMENTO Las levaduras Saccharomyces cerevisiae son organismos unicelulares que en la membrana plasmática tienen una ATPasa de H + que acopla la hidrólisis del ATP con el bombeo de protones hacia afuera de la célula. Esta enzima es semejante desde un punto de vista estructural y funcional a la ATPasa de Na + /K + de las células animales y, al igual que ésta, se inhibe con concentraciones micromolares de vanadato. Como resultado de la actividad de la ATPasa de H + en la levadura, se genera un gradiente electroquímico de protones que se utiliza para impulsar el transporte de nutrientes al interior de la célula por sistemas de transporte simportadores o uniportadores. La ATPasa de H + consume hasta un 25 % del ATP que se sintetiza en la célula. Además de esta ATPasa de H + de la membrana plasmática, las levaduras tienen otra bomba de protones en la membrana interna de las mitocondrias, la ATP sintasa, que se encarga de la síntesis del ATP. En contraste con la enzima de membrana plasmática, el flujo de protones a través de la ATP sintasa induce la síntesis de ATP. Uno de los inhibidores más efectivos de esta enzima es la oligomicina. El ciclo de ATP en la levadura se completa cuando el ATP que se sintetiza en la mitocondria por medio de la ATP sintasa, se consume a nivel de la membrana plasmática, cuando la ATPasa de H + lo hidroliza para bombear protones al exterior de la célula. El objetivo de esta práctica es correlacionar el consumo de glucosa por las levaduras, con la variación en pH extracelular, como una medida del bombeo de protones que ocurre durante el proceso.

Material

• Tres vasos de precipitados de 100 ml.

• Pipetas de 5 y 10 ml.

Potenciómetro.

• Levadura (Saccharomyces cerevisiae) 200 mg/ml.

• Solución de glucosa (10%).

• Solución de dinitrofenol 40 mM en

etanol.

• Solución de azida de sodio 400 mM.

Experimento 1 (control)

1 .Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada.

2. Determinar el pH de la solución y repetir la medición dos veces más con intervalos

de 3 minutos para obtener la línea basal.

3. Adicionar 5 ml de glucosa a 10 %, agitar y medir el pH.

4.

Determinar el pH de la solución cada 5 minutos, 4 veces, y luego cada 10 minutos 2

veces más.

EXPERIMENTO 2 (DINITROFENOL)

1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada.

2. Añadir por decantación (no pipetear) 0.2 ml de la solución de dinitrofenol 40 mM para

una concentración final de 200 μM.

3. Determinar el pH de la solución y repetir la medición dos veces más con intervalos

de 3 minutos para obtener la línea basal.

4. Incubar 5 minutos

5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control.

EXPERIMENTO 3 (AZIDA)

1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada.

2. Añadir por decantación (no pipetear) 0.5 ml de la solución de azida de sodio 400

mM, concentración final de 5 mM. Agitar con cuidado.

3. Determinar el pH de la solución y repetir la medición dos veces más con intervalos

de 3 minutos para obtener la línea basal.

4. Incubar 5 minutos.

5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Llenar la siguiente tabla

   

pH

TIEMPO (min)

GLUCOSA

DINITROFENOL

AZIDA DE SODIO

0

     

5

     

10

     

15

     

20

     

30

     

40

     

1. Realizar una gráfica de ejes cartesianos para cada uno de los experimentos; con los

valores de pH en función del tiempo. 2. Analizar el significado de los cambios de pH en el experimento control, con dinitrofenol como desacoplante y con azida de sodio com inhibidor de la cadena de transporte de electrones de la mitocondria.

Bibliografía Manual de prácticas de laboratorio, Bioquímica y Biología Molecular Departamento de Bioquímica Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México. 2006 Nelson DL, Cox MM 2006. Lehninger: Principios de Bioquímica. Cuarta Edición. Editorial Omega.

SESION 28 Y 29

PRACTICA No. 14

AISLAMIENTO DE ADN PLASMIDICO POR LISIS ALCALINA.

Objetivo.- Aprender los fundamentos para el aislamiento y el análisis de la molécula de ADN.

FUNDAMENTO

Los plásmidos o vectores son moléculas de ADN extracromosómico circular que se replican y transcriben independientemente del ADN cromosómico. Se encuentran normalmente en bacterias y en algunas ocasiones en levaduras. Su tamaño puede ir desde 1 hasta 250 kb, y en número de copias puede haber desde 1 hasta 100, dependiendo del tipo de plásmido.

Los plásmidos usados en ingeniería genética son llamados vectores. Son herramientas importantes y normalmente son usados para multiplicar o expresar genes específicos. El gen de interés es insertado en las copias de este plásmido, el cual además contiene genes que le dan una resistencia especifica a algún antibiótico, y un sitio múltiple de clonación (polilinker); esta es una región corta que contiene varios sitios en los que puede cortarse por enzimas de restricción, y permite la fácil inserción de fragmentos de ADN. Posteriormente el plásmido es insertado en una bacteria mediante un proceso llamado transformación, estas bacterias son crecidas en grandes cantidades y listas para lisarse (mediante lisis alcalina) para aislar el plásmido de interés.

MATERIAL

Soluciones:

Solución I: Buffer GET (glucosa 20mM, tris base 25mM, EDTA 10mM)

Solución II: mezcla lítica (SDS 1%, NaOH 0.2N)

Solución III: acetato de sodio 3M pH 4.8

METODO:

De un cultivo de 10 ml centrifugar 10 minutos a 14000 rpm, descartar el sobrenadante.

Añadir 1 ml de buffer GET para re suspender y pasar a un tubo eppendorf de 1.5 ml. Centrifugar a 14000 rpm por 2 minutos, descartar el sobrenadante.

Agregar 100 microlitros de solución GET y resuspender, incubar 10 minutos a T. amb.

Añadir 5 ul de RNAsa y dar vórtex

Agregar 200 microlitros de solución II e incubar en hielo por 10 minutos

Añadir 150 microlitros de solución III e incubar en hielo por 20 minutos, centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos

Pasar el sobrenadante a otro tubo y añadirle un volumen igual de isopropanol

Mezclar y centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos

Descartar el sobrenadante

Agregar 500 microlitros de etanol 75% mezclar y centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos

Descartar el sobrenadante y dejar secar

Re suspender en 40 microlitros de agua

Almacenar a -20°C, correr en gel de agarosa al 1%

Preparación de gel de agarosa 1%

Pesar 0.35 g de agarosa, pasarlo a un matraz y agregar 35 ml de buffer TAE 1X (Tris, Acido acético, EDTA).

Calentar para disolver la agarosa (hasta que quede transparente la solución).

Dejar enfriar un poco y añadir 4-5 gotas de bromuro de etidio.

Vaciar al molde, colocar el peine y dejar enfriar completamente.

Mezclar 3ul de DNA con 1microlitro de buffer de carga. Cargar la muestra en el pozo.

Dejar correr a 100 volts por aproximadamente 30 minutos.

Ver en el transiluminador y tomar foto.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Identificar en el gel el plásmido y correlacionar su tamaño con los marcadores de pares de bases.

Bibliografía

Russell, David W.; Sambrook, Joseph 2001. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory.