MAKALAH

ANALIS FARMASI

VALIDASI METODE ANALISA

Oleh :
1. NURNUL SUKMA (14144)
2. RINDA SEPTY A (14161)
3. ZULYA VINDY (14206)
4. FRISQILLA CLAUDIA (14074)
5. MUALIFATUL LAILIA(14127)
6. JULIATI WAHYU NINGSIH (14095)
7. HESTY NUR ISNAINI (14081)
8. TRI UTARI (14183)
9. FEBRIANTO (14060)

AKADEMI FARMASI PUTRA INDONESIA MALANG
NOVEMBER 2016

VALIDASI METODE ANALISA
1. Definisi
Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter
tertentu berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter
tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004). Validasi
merupakan suatu proses evaluasi kecermatan dan keseksamaan yang dihasilkan oleh
suatu prosedur dengan nilai yang dapat diterima. Validasi memastikan bahwa suatu
prosedur tertulis memiliki detail yang cukup jelas.
Definisi validasi:
a. Menurut SK Menkes RI No.43/MENKES/SK/1998 tentang CPOB adalah
tindakan pembuktian dengan cara yang sesuai bahwa bahan, prosedur, kegiatan,
sistem, perlengkapan atau mekanisme dalam produksi dan pengawasan
senantiasa mencapai hasil yang diinginkan.
b. Menurut ISO (International Standarts Organization) 17025 validasi adalah
konfirmasi dengan pemeriksaan dan penyediaan bukti obyektif bahwa
persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus yang terpenuhi.
c. Menurut Quality Assurance Standarts for Forensic DNA Testing Laboratories,
validasi adalah proses dimana prosedur dievaluasi untuk menentukan kemanjuran
dan keandalan untuk analisis, untuk menunjukkan metode tersebut cocok untuk
tujuan yang dimaksudkan.
d. Menurut USP, validasi metode fdilakukan untuk menjamin bahwa metode
analisis bersifat akurat, spesifik, reprodusible dan tahan pada kisaran analitik
yang akan dianalisis.
Istilah validasi pertama kali dicetuskan oleh Dr. Bernard T. Loftus, Direktur
Food and Drug Administration (FDA) Amerika Serikat pada akhir tahun 1970-an,
sebagai bagian penting dari upaya untuk meningkatkan mutu produk industri farmasi.
Hal ini dilatar belakangi oleh berbagai masalah mutu yang timbul pada saat itu yang
mana masalah-masalah tersebut tidak terdeteksi dari pengujian rutin yang
dilaksanakan oleh industri farmasi yang bersangkutan.

biasanya tidak perlu dilakukan validasi namun hanya verifikasi. Validasi metode 4. 4. validasi metode adalah persyaratan peraturan. Pentingnya Validasi Validasi metode sangat diperlukan karena beberapa alasan yaitu validasi metode merupakan elemen penting dari kontrol kualitas. Untuk menghasilkan hasil analisis yang paling baik. validasi membantu memberikan jaminan bahwa pengukuran akan dapat diandalkan. 2. 2. Kesesuaian system (system suitability) . Biasanya validasi digunakan untuk metode analisa yang baru dibuat dan dikembangkan. Validasi metode analisis bertujuan untuk memastikan dan mengonfirmasikan bahwa metode analisis tersebut sudah sesuai untuk peruntukannya. Proses validasi Proses validasi dilakukan dengan 4 langkah: 1. Dalam beberapa bidang. Tujuan Adapun tujuan validasi metode analisi adalah sebagai berikut: 1. 3. Validasi perangkat keras/ instrumen (instrumen/ hardware validation) 3. Verifikasi adalah konfirmasi ulang dengan cara menguji suatu metode dengan melengkapi bukti-bukti yang objektif dan sudah memenuhi persyaratan. Validasi perangkat lunak (software validation) 2.ASTM) namun metode tersebut baru pertama kali akan digunakan di laboratorium tertentu. Sedangkan untuk metode yang memang telah tersedia dan baku (misal AOAC.

Parameter Validasi Menurut USP beberapa langkah dalam validasi metode analisis sebagai berikut: 1. Batas deteksi dan batas kuantitasi 6. Ketangguhan metode 7. Presisi 3. Selektifitas (spesifisitas) 4.5. Akurasi (ketepatan) 2. Kekuatan metode . Linearitas dan rentang 5.

lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar analit yang ditambahkan (kadar yang sebenarnya). Tetapi bila tidak memungkinkan membuat sampel plasebo karena matriksnya tidak diketahui seperti obat-obat an paten. 1996). Metode simulasi (spiked-placebo recovery) Dalam metode ini. Dalam metode penambahan baku. 2004).120% dari kadar analit yang diperkirakan). Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahakan. AKURASI 1. Definisi Akurasi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. sejumlah analit bahan murni (senyawa pembanding kimia CRM atau SRM) ditambahkan ke dalam plasebo (semua campuran bahan pembawa sediaan farmasi). 2. yaitu: a. Kesulitan utama dalam evaluasi akurasi adalah fakta bahwa kandungan sesungguhnya analit yang akan diuji tidak diketahui. persen perolehan kembali dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya. cairan biologis) kemudian ditambah analit dengan konsentrasi tertentu (biasanya 80% . % perolehan kembali dapat ditentukan dengan cara membuat sampel placebo (eksepien obat. Akurasi merupakan derajat ketepatan antara nilai yang diukur dengan nilai sebenarnya yang diterima (Gray. kemudian dianalisis dengan metode yang akan di validasi (Harmita. Metode akurasi Akurasi dapat ditentukan melalui beberapa cara. 1996). Selisih kedua hasil dibandigkan dengan kadar yang sebenarnya (hasil yang diharapkan). Dalam kedua metode tersebut. atau karena analitnya berupa suatu . Jika nilai replika analisis semakin dekat dengan sampel yang sebenarnya maka semakin akurat metode tersebut (Khan. Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Akurasi merupakan kemampuan metode analisa untuk memperoleh nilai benar setelah dilakukan secara berulang. sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit yang diperiksa ditambahkan ke dalam sampel dicampur dan dianalisis lagi.

misalnya analit yang ditambahkan menyebabkan kekurangan pereaksi. pengukuran blanko tidak diperlukan lagi. Perhitungan perolehan kembali dapat juga ditetapkan dengan rumus sebagai berikut: (C 1−C 2) % perolehan kembali (recovery) = C3 C1 = konsentrasi dari analit dalam campuran contoh + sejumlah tertentu analit. Biasanya persyaratan untuk recovery adalah tidak boleh lebih dari 5%. C3 = konsentrasi dari analit yang ditambahkan ke dalam contoh.senyawa endogen misalnya metabolit sekunder pada kultur kalus. Metode adisi ( penambahan baku ) Pada metode penambahan baku. mengubah pH atau kapasitas dapar. Kedua metode tersebut recovery dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yan sebenarnya. maka dapat dipakai metode adisi (Harmita. C2 = konsentrasi dari analit dalam contoh. 2004). b. Metode ini tidak dapat digunakan jika penambahan analit dapat mengganggu pengukuran. .

Tabel: Analit pada matriks sampel Recovery yang diterima (%) 10 < A ≤ 100 (%) 98 – 102 1 < A ≤ 10 (%) 97 – 103 0.Niali persen recovery berdasarkan nilai konsentrasi sampel.1 < A ≤ 1 (%) 95 – 105 0.1 (%) 90 – 107 100 ppb < A ≤ 1 ppm 80 – 110 10 ppb < A ≤ 100 ppb 60 – 115 1 ppb < A ≤ 10 ppb 40 – 120 NB : recovery adalah persen perolehan kembali .001 < A ≤ 0.

Reproducibility (ketertiruan) adalah keseksamaan metode jika dikerjakan pada kondisi yang berbeda. maupun waktunya. Repeatibility dinilai melalui pelaksanaan penetapan terpisah lengkap terhadap sampel-sampel identik yang terpisah lengkap terhadap sampel-sampel identik yang terpisah dari batch yang sama. Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi). c. Biasanya analisis dilakukan pada laboratorium-laboratorium yang berbeda menggunakan peralatan. presisi harus dilakukan pada 3 tingkatan yang berbeda yaitu: a. Definisi Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual. Ketertiruan merujuk pada hasil-hasil dari laboratorium yang lain. PRESISI (KESEKSAMAAN) 1. jadi memberikan ukuran keseksamaan pada kondisi yang normal. diukur melalu penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogeny (Harmita. tempatnya. baik orangnya. Presisi antara yaitu ketepatan (precision) pada kondisi percobaan yang berbeda. Reapitibility (keterulangan) adalah keseksamaan metode jika dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi sama dalam interval waktu yang pendek. Kesesuaian dengan ICH. pereaksi dan analis yang berbeda. Analisis dilakukan terhadap sampel-sampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang sama. pelarut dan analis yang berbeda pula. Keseksamaan dapat dinyatakan sebagai keterulangan (repeatability) atau ketertiruan (reproducibility). Reproducibility dapat juga dilakukan dalam laboratorium yang sama dengan menggunakan peralatan. pereaksi. 2009) . (Gandjar dan Rohman. peralatannya. 2004). Keterulangan yaitu ketepatan (precision) pada kondisi percobaan yang sama (berulang) baik orangnya. peralatannya. b. tempatnya maupun waktunya.

2009). jadi memberikan ukuran keseksamaan pada kondisi yang normal. Keterulangan dinilai melalui pelaksanaan penetapan terpisah lenglap terhadap sampel-sampel identik yang terpisah dari batch yang sama.5 log c) untuk metode keterulangan sebagai berikut: RSD < 2 (1-0. secara umum diterima bahwa RSD harus lebih dari 2% (Harmita. Reprodusibilitas biasanya dilakukan ketika akan melakukan uj banding antar laboratorium (Gandjar dan Rohman. Pada metode yang snagat kritis. pereaksi. dan pada kadar part per billion (ppb) adalah 32%. standart deviasi relatif antara laboratorium adalah sekitar 2.67 . 2004). Kriteria seksama diberikan jika metode meberikan simpangan baku relatif atau koefisien variasi 2% atau kurang. Analis dilakukan terhadap sampel-sampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang sama. dan kondisi laboratorium. Pada kadar satu per sejuta (ppm) RSDnya adalah 16%. Biasanya analisis dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang berbeda menggunakan peralatn. jumlah sampel. Pengujian presisi pada saat awal validasi metode seringkali hanya menggunakan 2 parameter pertama yaitu keterulangan dan presisi antara. Ditemukan bahwa koefisien variasi eningkat dengan menurunnya konsentrasi analit.5 log c) x 0. Akan tetapi kriteria ini sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa.5% ada pada satu per seribu adalah %%. pelarut dan analis yang berbeda pula. keterulangan adalah keseksamaan metode jika dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi sama dan dalam interval waktu yang pendek. Untuk menentukan metode ketertiruan sebagai berikut: RSD < 2 (1-0. Menurut Harmita (2009). Pada kadar 1% atau lebih. Sedangkan yang dimaksud ketertiruan adalah keseksamaan metode jika dikerjakan pada kondisi yang berbeda.

..001) (Harmita.. Menurut American Pre-veterinary medical association (APVMA) (2004) tingkat presisi yang sebaiknya dipenuhi berdasarkan konsentrasi analit yang dianalisis dapat dilihat pada tabel dibawah ini: Jumlah komponen terukur dalam sampel Tingkat presisi (y) ..1% = 0...... 3. x2.... x3. Demikian juga harus disiapkan sampel untuk menganalisis pengaruh pengotor dan hasil degradasi terhadap keseksamaan ini (Harmita....xn maka simpangan bakunya adalah: 2. Simpangan baku relatif atau koefisisen variasi (KV) adalah: Percobaan seksama dilakukan terhadap palig sedikit enam replika sample yang diambil dari campuran sampel dengan matriks yang homogen. 2004).. Hasil analisis adalah x1.. Keseksamaan dapat dihitung dengan cara sebagai berikut: 1. Sebaiknya keseksamaan ditentukan terhadap sampel sebenarnya yaitu berupa campuran dengan bahan pembawa sediaan farmasi (plasebo) untuk melihat pengaruh matriks pembawa tterhadap keseksamaan ini. x4.. 2004).... c = konsentrasi analit sebagai fraksi desimal (contoh: 0.

X ≥ 10. Tujuan Uji presisi dilakukan untuk mengetahui kedekatan atau kesesuaian antara hasil uji yang satu dengan yang lainnya pada serangkaian pengujian presisi hasil pengkuran digambarkan dalam bentuk persentase Relative Standart Deviation (%RSD).10% y ≤ 20% 2.00% y ≤ 10% X ≤ 0.00 % y ≤ 2% 0.00 % y ≤ 2% 1.10% ≤ x ≤ 1.00% ≤ x ≤ 10. .

2004). Pada metode analisis yang melibatkan kromatografi. hasil urai. senyawa asing lainnya atau pembawa plasebo dengan hasil analisis sampel tanpa penambahan bahan-bahan tadi. hasil urai. dan Differential Scanning Colorimetry. analisa kelarutan fase. Derajat kesesuaian kedua hasil analisis tersebut merupakan ukuran selektifitas. yaitu uji identifikasi dan uji spesifitas ditunjukkan dengan kemurnian atau pengkuran. Untuk tujuan uji kemurnian dan tujuan pengukuran kadar. Metode selektivitas ditentukan dengan membandingkan hasil analisis sampel yang mengandung cemaran. spesifitas ditunjukkan oleh daya pisah 2 senyawa yang berdekatan (sebagaimana dalam kromatografi). 2004). Untuk tujuan identifikasi. Definisi Selektivitas adalah kemampuan yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Jika cemaran dan hasil urai tidak dapat diidentifikasi atau tidak dapat diperoleh. ICH membagi spesifisitas dalam 2 kategori. senyawa sejenis. spesifisitas ditunjukkan dengan kemampuan suatu metode analisis untuk membedakan antar senyawa yang mempunyai struktur molekul hampir sama. selektivitas ditentukan melalui perhitungan daya resolusinya (Rs) (Harmita. maka selektifitas dapat ditujukan dengan cara menganalisis sampel yang mengandung cemaran atau hasil uji urai dengan metode yang hendak diuji lalu dibandingkan dengan metode lain untuk pengujian kemurnian seperti kromatografi. Selektivitas sering kali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran. SELEKTIFITAS (SPESIFISITAS) 1. senyawa asing lainnya dan dibandingkan terhadap hasil analis yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan (Harmita. Penyimpangan hasil jika ada merupakan selisih dari hasil uji keduanya (Harmit. 2004). senyawa sejenis. Senyawa- .

2009). terutama untuk senyawa-senyawa yang terelusi secara bersama- sama. .senyawa tersebut biasanya adalah komponen utama atau komponen aktif dan suatu pengotor. untuk memperoleh spesifisitas adalah dengan menggunakan detekstor selektif. Penentuan spesifisitas metode dapat diperoleh dengan 2 jalan. detektor elektrokimia atau detektor fluoresen hanya akan mendeteksi senyawa tertentu. Pertama (paling diharapkan) adalah dengan melalukan optimasi sehingga diperoleh senyawa yang dituju terpisah secara sempurna dari senyawa-senyawa lain (resolusi senyawa yang dituju ≥ 2). Jika dalam suatu uji terdapat suatu oengotor (impurities) maka metode uji harus tidak terpengaruh dengan adanya pengotor ini (Ginandjar dan Rohman. Penggunaan detektor UV pada panjang gelombang yan spesifik juga merupakan cara yang efektif untuk melakukan pengukuran selektifitas (Gandjar dan Rohman. sementara senyawa lainnya tidak terdeteksi. Sebagai contoh. 2009). Cara kedua.

Perlakukan matematik dalam pengujian linearitas adalah melalui persamaan garis lurus dengan metode kuadrat terkecil antara hasil analisis terhadap konsentrasi analit. Sebagai parameter adanya hubungan linear digunakan koefisien korelasi r pada analisis regresi Y = a + bX. 2004). data yang diperoleh diolah melalui transformasi matematik dulu sebelum dibuat analisis regresinya (Harmita. . LINEARITAS DAN RENTANG 1. untuk memperoleh hubungan proporsional antara hasil pengukuran dengan konsentrasi analit. Parameter lain yang harus dihitung adalah simpangan baku residul (Sy) (Harmita. Dalam praktek. sering ditemukan rentang konsentrasi yang digunakan antara 0 – 200%. Linearitas biasanya dinyatakan dalam istilah variansi arah garis regresi yang dihitung berdasarkan persamaan matematik data yang diperolh dari hasil uji analit dalam sampel dengan berbagai konsentrasi analit. 2004). Definisi Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang meberikan respon yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi yang baik. keseksamaan. Jumlah sampel yang dianalisis sekurang-kurangnya delapan buah sampel blanko. Hubungan linear yang ideal dicapai jika nilai b + 0 dan r = +1 atau -1 bernatung pada arah garis. Di dalam pustaka. Dalam beberapa kasusu. prporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. digunakansatu seri larutan yang berbeda konsentrasiya antara 50 – 150% kadar analit dan sampel. Sedangkan nilai a menunjukkan kepekaan analisis terutama instrumen yang digunakan.2004). Rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan. dan linearitas yang dapat diterima (Harmita.

.

2004).Keterangan: Dimana ý1 = a + bx Sy Sx0 = b Sx0 = standart deviasi dari fungsi Sx 0 Vx0 = x V x0 = koefisien variasi dari fungsi (Harmita. .

Batas deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui regresi linear dari kurva kalibrasi. Batas kuantitasi merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan eksama (harmita. Pada analisis yang tidak menggunakan instrumen batas tersebut ditsentukan dengan mendeteksi analit dalam sampel pada pengenceran bertingkat. Penentuan blangko 3. BATAS DETEKSI DAN BATAS KUANTITASI 1. Kurva kalibrasi Dimana: Q = LOD (batas deteksi) atau LOQ (batas kuantitasi) k = 3 untuk batas deteksi atau 10 untuk batas kuantitasi Sb = simpangan baku respon analitik dari blanko Sl = arah garis linear (kepekaan arah) dari kurva antara respon terhadap konsentrasi = slope (b pada persamaan garis y= ax + bx). Penentuan batas deteksi suatu metode berbeda-beda tergantung pada metode analisis itu menggunakan instrumen atau tidak. Cara menentukan LOD dan LOQ ada 3 cara. yaitu: 1. ( Harmita. Batas deteksi merupakan parameter uji batas. Signal-to-noise 2.2004). Pada analisis intrumen batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon blanko beberapa kali lalu dihitung simpangan baku respon blanko dan formula di bawah ini dapat digunakan untuk perhitungan (Harmita. 2004). 2004). Definisi Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blanko. Nilai pengukuran akan sama dengan nilai b pada persamaan garis .

maka 3 Sy / x Q= S1 2) Batas kuantitasi (Q) 310 Sy / x Q= S1 (Harmita. 2004). sedangkan simpangan baku blanko sama dengan simpangan baku residual (Sy/x). 1) Batas deteksi (Q) Karena k = 3 atau 10 Simpangan baku (Sb) = Sy/x.linear y = a +bx. .

suhu. KETANGGUHAN METODE 1. dll. Derajat ketertiruan hasil uji kemudian ditentukan sebagai fungsi dari variabel penentuan. . Ketangguhan biasanya dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh perbedaan operasi atau lingkungan kerja pada hasil uji. 2004). dan lingkungan yang berbeda tetapi menggunakan prosedur dan parameter uji yang sama. Ketertiruan dapat dibandingkan terhadap keseksamaan penentuan di bawah kondisi normal utuk mendapatkan ukuran ketangguhan metode. Definisi Ketangguhan metode adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari analisis sampel yang sama dlam berbagai kondisi uji normal. Ketangguhan metode ditentukan dengan menganalisis beningan suatu lot sampel yang homogen dalam lab yang berbeda oleh analis yang berbeda menggunakan kondisi operasi yang berbeda. instrumen. Ketangguhan metode merupakan ukuran ketertiruan pada kondisi operasi normal antara lab dan antar analis (Harmita. bahan pereaksi. Perhitungannya dilakukan secara statistik ANOVA (Harmita. hari yang berbeda. analisis. 2004). seperti laboratorium.

Definisi Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode perlu dibuat perubahan metodologi yang kecil dan terus menerus dan mengevaluasi respon analitik dan efek presisi dan akurasi. perubahan yang dibutuhkan untuk menunjukkan kekuatan prosedur HPLC dapat mencakup (tapi tidak dibatasi) perubahan komposisi organik fase gerak (1%). pH fase gerak (± 0. KEKUATAN METODE 1.2 unit). . Perubahan lainnya dapat dilakukan bila sesuai dengan laboratorium (Harmita. 2004). dan perubahan temperatur kolom (±2- 3oC). Sebagai contoh.

Metode speaking buta nol Pendekatan metode speaking buta nol melibatkan analisis tunggal menggunakan suatu metode yang akan divalidasi untuk melakukan analisis suatu sampel yang mengandung level analit tertentu yang sudah diketahui . yaitu : a. PENDEKATAN METODE VALIDASI Ada beberapa pendektan untuk melakukan metode validasi.

DAFTAR PUSTAKA http://farmasiindustri.pdf?x83221 BUKU VALIDASI DAN VERIFIKASI METODE UJI http://chemistry.uii.id/BUKU%20PAK%20RI/2.pdf .ac.com/wp- content/uploads/2016/03/validasi_dan_verifikasi_metode.%20Buku%20Validasi %20Metode%20ok.