Corso di Valutazione di Impatto Ambientale

Tossicologia
La scienza che studia le
interazioni tra composti chimici e
i sistemi biologici al fine di
determinare i possibili effetti
avversi causati da agenti chimici
e fisici in organismi viventi e di
comprendere la natura,
l’incidenza, il meccanismo
d’azione e la reversibilità di tali
effetti, valutando
quantitativamente le alterazioni
biologiche indotte

Fattori della Tossicità
Una sostanza chimica diventa tossica solo quando, attraverso
un’idonea via di contatto riesce a superare le barriere naturali
dell’organismo e a raggiungere gli organi o tessuti bersaglio ad
una concentrazione o dosi in grado di determinare effetti
dannosi.

RELATIVI AL TOSSICO: RELATIVI AL TEMPO DI CONTATTO:
DOSE DURATA
FREQUENZA DELL’ESPOSIZIONE
FORME DI TOSSICITÀ: VIE E SITI DI ESPOSIZIONE
ACUTA TOSSICITÀ IMMEDIATA
SUBACUTA SU BASE GENETICA
CRONICA TOSSICITÀ TARDIVA

Fattori della Tossicità FARMACOCINETICI TOSSICITÀ FETALE ASSORBIMENTO DIRETTA DISTRIBUZIONE INDIRETTA METABOLIZZAZIONE ESCREZIONE .

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Tossicologia Tossicologia clinica: studia situazioni patologiche nell’uomo indotte da sostanze tossiche Tossicologia forense: si occupa degli aspetti medico- legali derivati da intossicazione acuta accidentale o volontaria Tossicologia sperimentale: studia e realizza prove di tossicità indispensabili per la valutazione del rischio per l’uomo e l’ambiente da esposizione a sostanze chimiche .

Tossicologia Tossicologia descrittiva (prove di tossicità e valutazione rischio) Tossicologia molecolare o dei meccanismi(meccanismi di tossicità) Tossicologia normativa o regolatoria (protocolli per la valutazione del rischio) Tossicologia forense (aspetti medico legali) Tossicologia clinica Reazioni avverse da farmaci Farmacodipendenza Tossicologia nutrizionale/alimentare Tossicologia industriale o occupazionale(tossicità nell’ambiente di lavoro) Tossicologia ambientale(impatto potenzialmente deleterio di sostanze) Ecotossicologia (effetti su popolazioni di organismi in ecosistemi definiti) Tossicologia bellica (armi chimiche/biologiche e fisiche) .

a seconda della dose e delle circostanze possono agire terapeuticamente o nuocere come veleni .DEFINIZIONI MEDICO LEGALE DI VELENO Per veleno si può intendere “ogni sostanza che introdotta nell’organismo cagiona uno stato di malattia ed eventualmente la morte con meccanismo chimico o biochimico” “Veleno è ogni sostanza che provoca avvelenamento” Molte sostanze.

Tossicologia .

Tossicogenomica .

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In particolare si interessa di: •PROPRIETÀ CHIMICO-FISICHE •EFFETTI •MECCANISMO DI AZIONE TOSSICA Di sostanze chimiche. endogene ed esogene. di interagire e danneggiare in maniera reversibile e/o irreversibile gli organismi viventi . capaci. in particolari condizioni e circostanze.

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provoca un effetto tossico (Aspetto quantitativo) PRESENZA di tossico ≠ Avvelenamento . usata in certe condizioni.Definizioni TOSSICITÀ: Capacità di una sostanza di produrre un effetto deleterio sull’organismo (Aspetto qualitativo) RISCHIO: Probabilità con la quale una determinata sostanza.

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non ne esiste una che non sia un veleno La giusta dose differenzia un veleno da un rimedio” Philippus Aureolus Theophrastus Bombastus von Hohenheim detto Paracelsus o Paracelso 1493-1541 La tossicità è funzione della concentrazione .Tossico o Veleno “Tutte le sostanze sono dei veleni.

o non biologica .antropogenica .origine biologica Sostanza tossica .Sostanze tossiche e tossine Tossina .

ecc.C. antimonio. piombo. Giobbe 6:4 Descrive veleni per frecce 370-286 a.C.C. oppio. digitale. Dioscoride scrive il De materia Medica dove descrive e classifica veleni vegetali animali e minerali 82 a. Teofrasto nel De historia plantarum include numerose piante 40-90 d.C.C. Shen Nung Scrisse Pen ts'ao ching su 365 sostanze 1500 a. belladonna. Ippocrate descrive Tossicologia clinica con la biodisponibilità nella terapia e sovradosaggio 400 a.C.Una disciplina che affonda le proprie radici nel tempo (1) 2695 a. Antica Roma avvelenamenti largamente praticati da richiedere la Lex Cornelia de sicariis et veneficis . 400 a. aconito. rame. Papiro di Ebers contenente 811 ricette del periodo Amenofi I (o Amenhotep I) su: cicuta.C.

succesivamente resta lo stato confusionale e un vuoto riempito da confabulazioni L’antidoto si pensa fosse Galanthus nivalis Amarillidacee (Bucaneve) contenente.(Odissea): “Ulisse prese aglio come antidoto del veleno di Circe” Il veleno si pensa fosse Daturastramonium.Una disciplina che affonda le proprie radici nel tempo (2) Omero scriveva nel 600 A. o"erba delle streghe". allucinazioni e delirio. la galantamina un inibitore reversibile della colinaesterasi .Glialcaloidi(l-josciaminaescopolamina) inducono una forma di estasi psichica.C. nei bulbi. amnesia.

nel topo) Cleopatra Aspide egiziana per suicidi Lucrezia Borgia Arsenico 100-300 mg di As3+letale .Tossicologia «storica» Cicuta bevanda >>Socrate Dose letale uomo 2-4 g di frutti verdi Coniina LD50= 1 mg/kg (orale.

metotressato) sostanza che non presenta alcun effetto benefico Sostanza con basso coefficiente terapeutico (rapportoLD50/ED50) sostanza che presenta gravi azioni tossiche per dosi molto piccole (μg o mg) .Tossico o veleno Tossina: sostanze tossiche di origine naturale (stricnina. nicotina. tossina botulinica) Sostanza tossica: direttamente o indirettamente antropogenica (diossina.

Interazioni delle diverse aree della tossicologia .

Fonte: Tossine naturali. . sostanze di sintesi Effetto: Mutazione.Classificazione degli effetti tossici Organo bersaglio: Fegato. ecc. cancro. solvente. sistema immunitario. sistema ematopoietico. danno renale. ecc. danno epatico. rene. fitofarmaco. addittivo alimentare. Uso: Farmaco. ecc.

Risposte graduali per nutrienti ed essenziali .

Relazione Dose-Effetto .

Curva Dose-Risposta .

Classificazione UE .

Scale di tossicità .

Classificazione delle sostanze tossiche in relazione al loro potenziale .

Interazione Tossico Bersaglio .

Tossicocinetica tossicodinamica .

Vie di Esposizione Cutanea Potenziale tossico Orale Intradermica Intramuscolare Sottocutanea Intraperitoneale Inalatoria Endovenosa .

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Effetto Farmacologico • inefficacia • efficacia medicamentosa • tossicità .

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C. D > A • C = D solo al Dl50 • D>ABC Efficacia • A = C stessa pendenza .Potenza ed efficacia tossicologica Potenza: • B.

Valutazione della tossicità Gli effetti tossici di una sostanza risultano significativamente correlati alla durata dell’esposizione STUDI DI TOSSICITÀ A BREVE TERMINE STUDI DI TOSSICITÀ A MEDIO TERMINE STUDI DI TOSSICITÀ A LUNGO TERMINE .

Valutazione della tossicità .

Curva Dose-Risposta .

Tossicità Acuta La dose a cui reagisce il 50% degli individui è usata come misura della tossicità (DT50) o della letalità (DL50) della sostanza in esame Quando la via di esposizione è quella inalatoria. si parla di concentrazione letale (CL50) e di tempo letale (TL50) .

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Dalle «cavie» all’uomo .

LD50 .

La tossicità dei pesticidi .

Tossicità Cronica NOAEL (No Observable Adverse Effect Level): Livello più alto di dose che non produce effetto tossico LOAEL (Lowest Observable Adverse Effect Level): Livello più basso di dose che produce effetto tossico .

Endpoint di Tossicità Cronica .

Effetti di Tossicità Cronica Sono effetti cronici: Cancerogenicità: insorgenza di forme tumorali Genotossicità: alterazioni genetiche (DNA) Mutagenicità: mutazioni genetiche (DNA) Teratogenicità: alterazioni dello sviluppo embrionale test in vivo su animali da laboratorio test in vitro su colture cellulari o su organi bersaglio .

Questo tipo di danno è coinvolto nella cancerogenesi e nello sviluppo di anomalie fetali e malattie congenite Riassorbimento: è espressione della morte del prodotto del concepimento Tossicità fetale: può manifestarsi o come riduzione del peso corporeo o come aumento del numero dei feti non vitali .Effetti Teratogeni Classificazione degli effetti teratogeni: Aberrazioni (rottura e riarrangiamento): difetti morfologici che coinvolgono strutture interne e/o esterne. nonché anomalie funzionali.

Meccanismi di tossicità NON VI È DIFFERENZA SOSTANZIALE FRA L’AZIONE DI: FARMACI VELENI SOSTANZE BIOATTIVE IN GENERALE .

Risposte graduali (nutrienti e microlementi) .

si considera come rispondente un soggetto la cui risposta è superiore al limite fissato.. es.Elaborazione Curve dose risposta La risposta è del tipo ‘tutto o nulla’. presenza di anticorpi ad antigeni specifici si misura la frequenza di risposta alle diverse dosi. morte. cioè la percentuali di soggetti in cui compare la risposta Le curve dose-risposta graduali possono essere trasformate in curve quantali fissando un limite minimo di intensità della risposta. comparsa di tumori. .

Elaborazione Curve dose risposta .

.Le “vittime” Artemia salina Daphnia spp.

D.Daphnia magna.pulex e le altre .

Variabilità individuale .

Curve di risposta quantali Riportando in un grafico cartesiano la % di soggetti che rispondono in funzione della dose si ottiene una curva dose-risposta cumulativa. ma anche i soggetti che rispondono a dosi più basse . cioè. ad ogni dose corrispondono non solo i soggetti che rispondono solo a quella dose.

Indice Terapeutico Indice terapeutico: DL50/DE50 è un indicatore approssimativo della sicurezza di un farmaco. non tiene conto delle pendenze delle curve Margine di sicurezza: DL1/DE99 è un indicatore migliore della sicurezza del farmaco .

dosi soglia uguali pendenze diverse Curve con uguale DE50 ma pendenze e dosi soglia diverse .Confronti tra curve Dose-Risposta DE50 diverse.

Tossicocinetica e tossicodinamica .

Esposizione a sostanze tossiche .

Durata dell’Esposizione .

Rischi reali e percepiti .

Attività e Rischio *Il Rischio è espresso come probabilità di morte per un anno di esposizione arrotondato per eccesso .

La percezione del Rischio .

Estrapolazione Sostanze cancerogene -genotossiche .

Estrapolazione .

) che può essere assunta giornalmente dall’uomo per tutta la vita senza apprezzabile rischio per la salute: corrisponde alla centesima parte della quantità risultata senza effetti tossici sugli animali da laboratorio misurata in mg/Kg di peso corporeo.Concetto di Dose DGA: Dose Giornaliera Ammissibile ADI: Acceptable Daily Intake TDI: Tolerable daily intake TDC: Tolerable daily concentration ADI è la quantità di sostanza (espressa in mg/kg p.c. 2000 mg/kg Animale 20 mg/Kg Uomo .

Human 0.Animal Risk Assessment (MeHg) 2.25 μg/kg .NOAEL (animals) 0.025 μg/kg .Sensitive populations Fattore di sicurezza 10 –100 -1000 .5 μg/kg .

Dal NOAEL all’ADI .

monossido di carbonio Allergeni/sensibilizzanti: causano reazioni allergiche che possono anche essere fatali (anafilassi) .Classificazione di Tossici per effetto Asfissianti: prevengono l’arrivo dell’ossigeno ai vari tessuti - es.isocianati. metalli pesanti Carcinogeni: causano tumori-benzene Teratogeni: tossine che possono danneggiare il feto - diossine Mutageni: tossine che possono interferire o danneggiare il materiale genetico . organofosfati.

ma….) .Fattori che condizionano gli effetti tossici Fattori dell’ospite Differenze intra e interspecie glicol etilenico (acido ossalico): gatto>ratto>coniglio anilina (o-aminofenolo): gatto>cane>ratto>criceto acetilatori lenti e rapidi Sesso: barbiturici più potenti nelle femmine che nel maschio di ratto Età: neonati (piombo e DDT) ed anziani Fattori ambientali Temperatura (colchicina e digitale tossiche ratto>rana.

TOSSICITÀ SELETTIVA Risposte multiple allo stesso composto tossico principalmente dovute a Differenze nella superficie di esposizione Differenze nell’accumulo Tassi di trasformazione (“biotransformazione”) Differenze nei percorsi biochimici .

HCl.Tossicologia locale e sistemica Locale sostanze chimiche irritanti (es. NH3) se inalate producono effetti tossici locali ai polmoni Sistemica Molte sostanze tossiche esercitano i loro effetti negativi su organi lontani da quello attraverso il quale è avvenuta l’assimilazione Solitamente un tossico è particolarmente nocivo su alcuni organi in particolare che per questo motivo sono detti “organi bersaglio” .

Tossicità immediata e ritardata
Immediata - HCN, CO, H2S

Ritardata - phosgene, tri-orthocresyl phosphate

Lunga Latenza – i composti cancerogeni hanno
molto spesso un periodo di latensa di 20-30 anni

Meccanismi di Tossicità
Le sostanze chimiche assorbite possono agire sia
come tossici di tipo sistemico per l’intero
organismo, oppure possono attaccare organi
(target) specifici.

Differenze nei meccanismi possono essere
dovute a:
1. Differenze nelle caratteristiche chimiche che ne
condizionano la capacità di attraversare le membrane
cellulari
2. Solubilità differente nei diversi tessuti
3. Vie preferenziali sanguigne verso tessuti specifici
4. Differenze nelle reattività chimiche

BIOTRASFORMAZIONE
• Le trasformazioni chimiche che avvengono negli
organismi possono dare origine a composti “figli” più o
meno tossici
• alcol etilico viene detossificato dall’ossidazione a gruppo
aceticilico che può essere “inserito” nel normale corso del
metabolismo cellulare (ciclo dell’acido citrico)
• l’alcol metilico (metanolo) ossidato dallo stesso enzima dà
origine alla formaldeide che è più tossica dell’alcol di
partenza.

• la velocità di queste trasformazioni metaboliche cambia
da individuo ad individuo e da specie a specie
(Tossicità Selettiva).

Differenze nei percorsi biochimici MALATHION (relativamente inattivo) Lenta (insetti) Rapida (insetti) Rapida (mammiferi) Lenta (mammiferi) Ossidazione (enzimi microsomiali) Idrolisi binding MALAOXON Sottoprodotti (attivo) (inattivi) Idrolisi (A-esterasi) Lenta (insetti) Rapida (mammiferi) .

Tossicità sede / reversibilità .

Tossicità ambientale • Degradabilità • Mobilità • Bioaccumulo • Bioincremento .

) possono presentare il fenomeno della bioconcentrazione e biomagnificazione: le loro concentrazioni aumentano progressivamente nel passaggio attraverso i diversi anelli della catena biologica alimentare Per esempio le ostriche e i mitili possono contenere livelli di mercurio e di cadmio 100.000 volte superiore a quelli presenti nelle acque in cui vivono .Bioaccumulo Le sostanze tossiche (metalli. DDT. ecc.

Biomagnificazione .

fitoterapico. additivo alimentare. associato all’uso della sostanza. sottoponendola a test appropriati per far emergere il livello di pericolosità del contatto . fitofarmaco) è sicuro (cioè assolutamente senza rischio): ogni sostanza può indurre effetti sfavorevoli (o nocivi o tossici. cosmetico. in base alla dose). è quindi importante arrivare a determinare la stima del rischio.Studi di tossicità I test di tossicità non sono finalizzati a dimostrare che un dato composto chimico (farmaco.

asp?id=7https://eurl-ecvam.eu/ . specialmente durante la sperimentazione a lungo termine da parte Organismo preposto al Benessere Animale (OpBA).jrc. Locali di stabulazione e personale addetto sono soggetti ad approvazione da parte del Ministero della Sanità Legislazione: Gazzetta Ufficiale D. sono previste visite periodiche di un veterinario responsabile.it/ricerca/sperimentazione-animale/ceisa http://www.nc3rs.unich.ec. 116. http://www.org.Uso degli animali da esperimento Il modello animale (mammifero) rappresenta il sistema di massima complessità biologica a rappresentazione dell’impatto clinico L’animale è insostituibile ad un certo livello della sperimentazione: nessun protocollo di sperimentazione di una nuova molecola prevede. solo test “In vitro” Esistono comunque norme etiche che devono guidare la sperimentazione: rispetto della vita e moderazione della sofferenza degli animali durante l’esperimento e al momento della soppressione (sacrificio). 26 Protocolli sperimentali controllati: devono seguire le norme di legge vigente o essere approvati in caso di deroghe. per ora. DIRETTIVA 2010/63/UE e successivamente nel DECRETO LEGISLATIVO del 04 marzo 2014 N.1992 e successive.2. 18.L. suppl.uk/page.europa. n.

adeguati Consente di studiare. anche in Prevede un’ampia variabilità biologica delle rilevazioni tempi prolungati.Sperimentazione in vivo Vantaggi Svantaggi Valuta effetti sistemici. teratogenesi. Ha un costo elevato Permette di monitorare più Presenta la necessità di strutture parametri biologici e processi di stabulazione contemporaneamente. processi sperimentali biologici complessi: cancerogenesi. Non permette di ottenere alcuna informazione sul fine comportamento meccanismo d’azione a livello Tiene conto dei meccanismi di molecolare tossicocinetica .

capaci di dare origine a qualsiasi tipologia di differenziazione) . differenziate ma labili) Linee “immortalizzate” (in grado di proliferare all’infinito) Cellule tumorali (linee cellulari da ceppi specifici) Cellule staminali (totipotenti.Metodi alternativi all’animale Simulazioni al computer modelli matematici complessi che non sono comunque in grado di considerare tutte le variabili di una matrice biologica Saggi biochimici che rappresentano una semplificazione di sistema Colture cellulari: Colture primarie (estemporanee da tessuto.

Impossibilità di rappresentare minima variabilità biologica processi biologici complessi (es. tossicocinetica) Uniformità genetica (elevata riproducibilità) Difficoltà ad estrapolare i risultati “in vivo” Possibilità di manipolazione Non perfetta rappresentatività genetica delle cellule “immortali” (anche Predittività dei meccanismi umane) rispetto a quelle d’azione a livello molecolare differenziate Possibilità di impiego di materiale umano .Sperimentazione in vitro Vantaggi Svantaggi Facilità di reperibilità dei dati.

teratogenicità. lattazione tossicità mutagena tumori.Prove di tossicità precliniche da 2 a 5 anni. mutazioni batteriche . 40 milioni di euro per farmaco commercializzato tossicità acuta dose singola (LD50) tossicità subacuta tre dosi tossicità cronica 1-2 anni (durante la sperimentazione clinica) tossicità riproduttiva fertilità.

Test di Tossicità Generica Particolare Tossicità acuta Mutagenesi Tossicità sub-acuta Cancerogenesi Tossicità sub-cronica Teratogenesi Tossicità cronica Sensibilizzazione (effetti allergogeni) .

strumentali.Sperimentazione animale Animale = uomo mg/m2 differenze di specie stesse vie di esposizione esami clinici. autoptici Maggiore esposizione = maggiore incidenza alte dosi ridotto numero di animali .

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Dose/Superficie

Tossicità acuta
Obiettivi
Identificazione degli organi bersaglio e di altre
manifestazioni cliniche a rapida insorgenza
Informazioni sul meccanismo d’azione tossica
Durata degli effetti
Reversibilità dell’effetto tossico
Valutazione della letalità (DL50)
Stima dei livelli di dose da utilizzare negli studi
successivamente

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Studi di tossicità sull’animale Acuta Sistemica (almeno 2 vie) 2 o + specie. esame autoptico DL50 Supertossici: < 5mg/kg Non tossici: > 15 g/kg Locale cutanea oculare Sensibilizzazione allergica somministrazione cutanea o intradermica sostanze adiuvanti . reversibilità. organi bersaglio osservazione per 14 giorni.

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Fattori che possono far variare la DL50 Numero degli animali considerati Specie (e in certi casi il ceppo. topi nude) Sesso Età Peso Dieta Temperatura ambientale (e altre variabili dell’ecosistema) Periodo stagionale (cronobiologia) . es.

90 giorni dosi come nella subacuta individuazione di NOAEL e LOAEL .Studi di tossicità sull’animale Subacuta 3-4 somministrazioni tre dosi tossica (letale ≈ 10%) non tossica intermedia Subcronica via di esposizione umana.

Obiettivi degli studi di tossicità sub-cronica Definire: la relazione tra intensità degli effetti e dose assunta gli organi bersaglio degli effetti tossici la reversibilità/irreversibilità degli effetti Indicazioni (dosaggi) per gli studi a lungo termine .

Tossicità cronica .

Essere indotte da agenti chimici o fisici – mutazioni indotte .Mutagenesi Mutazioni geniche o puntiformi: alterazioni in una o poche coppie di basi Mutazioni cromosomiche: alterazione della struttura dei cromosomi (accorciamento. alterazione della forma…) Mutazioni genomiche: alterazioni nel numero dei cromosomi Le mutazioni possono: insorgere in modo spontaneo –mutazioni spontanee.

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Cancerogenesi chimica
Nel 1775 osservazione: un considerevole aumento
nell’incidenza del carcinoma dello scroto tra i soggetti
che in gioventù avevano esercitato il mestiere di
spazzacamino

Nel 1873 osservazioni sull’incidenza dei tumori cutanei
tra gli addetti alla lavorazione del catrame

1970) . Baltimora.Cancerogenesi virale All'inizio degli anni '60 i virologi hanno dimostrato che: Il fenotipo tumorale poteva essere conferito a cellule normali in coltura in seguito ad infezione con un virus (Dulbecco. 1963) Questi virus erano capaci di integrarsi nel genoma cellulare tramite la trascrittasi inversa (Temin.

raggi cosmici) Raggi X Raggi gamma Radioisotopi per uso diagnostico–Radioisotopi contaminanti (Chernobyl Cesio 134 e 137) .Cancerogenesi fisica Cancerogenesi da corpi estranei Protesi dentarie difettose Calcolosi Fibre di Asbesto Cancerogenesi da RADIAZIONI Ultravioletto Radiazione Solare UV per uso cosmetico Ionizzanti Radiazione ambientale (Radon.

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con legame di gruppi chimici alle basi azotate: effetto degli agenti alchilanti Inserimento o delezione di basi: agenti intercalanti .Mutazioni indotte Le lesioni premutazionali sono dovute a Reazioni di deaminazione ossidativa: da acido nitroso a nitrosamine Formazione di epossidi/radicali liberi Formazione di legami covalenti tra le basi: effetto dei raggi UV Reazioni di alchilazione.

permettendo così al batterio di risintetizzare l’aminoacido essenziale istidina .Test di Ames Screening per gli agenti chimici che si sospettano capaci di mutagenicità e cancerogenicità utilizzando ceppi di Salmonella typhimurium Si basa appunto sulla forte correlazione esistente tra mutagenicità e cancerogenicità Stabilisce la capacità della sostanza di indurre mutazioni in un ceppo di salmonelle (in genere istidina +) in cui è compromessa la via biosintetica dell’istidina per mutazione selettiva sul gene corrispondente ad un enzima chiave della biosintesi (istidina -) Il mutageno può determinare con alta probabilità una nuova mutazione corrispondente nel gene compromesso (reversione).

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Esistono elementi sufficienti per ritenere verosimile che l’esposizione dell’uomo ad una sostanza possa provocare lo sviluppo di tumori in base a: • adeguati studi a lungo termine effettuati su animali • altre informazioni specifiche Categoria 3 – Sostanze da considerare con sospetto per i possibili effetti cancerogeni sull’uomo per le quali. Esistono alcune prove ottenute da adeguati studi sugli animali che non bastano tuttavia per classificare la sostanza nella categoria 2. tuttavia. le informazioni disponibili non sono sufficienti per procedere ad una valutazione soddisfacente. Esistono prove sufficienti per stabilire un nesso causale tra l’esposizione dell’uomo ad una sostanza e lo sviluppo dei tumori Categoria 2 – Sostanze che dovrebbero considerarsi cancerogene per l’uomo. .Classificazione UE sostanze cancerogene Categoria 1 – Sostanze note per gli effetti cancerogeni per l’uomo.

rivelano i caratteri acquisiti nella fase precedente . pur in assenza dell’agente cancerogeno (che inizialmente le aveva trasformate). subiscono delle trasformazioni che non si evidenziano fenotipicamente. se sottoposte a determinati stimoli.La cancerogenesi È un processo più complesso di quello che deriva dalla semplice mutazione genetica È caratterizzata da due processi successivi: Fase di iniziazione le cellule bersaglio subiscono l’azione dell’agente cancerogeno. o si evidenziano con difficoltà Fase di promozione le cellule trasformate nella fase precedente.

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benzopirene). idrocarbuti aromatici policiclici (PAI. barbiturici Agenti ormonali: estrogeni (tumori ormonosensibili) Immunosoppressori: ciclosporina A. plastiche Gli idrocarburi policlicici sono sia iniziatori che promotori dei tumori e si definiscono perciò cancerogeni completi .Esempi di promotori chimici Induttori enzimatici: pesticidi organoclorurati (DDT). azatioprina. es. diossina Solidi cancerogeni: asbesto (amianto).

Inibitori della promozione Retinoidi: analoghi della vitamina A Vitamina A Carotenoidi: β-carotene. precursore della vitamina A Favoriscono la differenziazione dei tessuti epiteliali .

chemioterapici Inibizione dei segnali inibitori della crescita Immortalizzazione Evasione dal programma di morte cellulare per apoptosi Acquisizione di vasi sanguigni (angiogenesi) Capacità invasiva Capacità metastatica Perdita della differenziazione Alterazione della proliferazione .Progressione Acquisizione di segnali proliferativi autonomi (benigni) Diminuzione della sensibilità agli ormoni. fattori di crescita.

Slope factor Risk assessment Procedura per stimare la probabilità che una esposizione possa costituire un pericolo per la salute Slope factor Incremento del rischio di tumore misurato sull’aspettativa di vita in risposta a una esposizione .

Modelli per estrapolazione Rischio .

Modelli per estrapolazione Rischio .

Modelli matematici utilizzati per l’estrapolazione del rischio .

Modelli matematici utilizzati per l’estrapolazione del rischio Curva dose-risposta secondo il modello Weibull Estrapolazione alle basse dosi basata su 6 diversi modelli matematici .

è coerente con quella derivata da studi epidemiologici .la curva della relazione dose-risposta diventa quasi lineare . derivata da una esposizione discontinua nel ratto a 1 ppm.5 x 10-4).la stima di rischio (UR = 2.Modelli matematici utilizzati per l’estrapolazione del rischio Relazione dose-risposta per esposizione a vinilcloruro – la curva supralineare mette in relazione la dose inalata con la frequenza di angiosarcomi epatici – l’estrapolazione lineare è corretta solo nel tratto lineare della curva dose-effetto .

Il risk assessment è l’uso di procedure per stimare la probabilità che una esposizione possa costituire un pericolo Lo slope factor misura l’incremento del rischio di insorgenza del tumore durante l’intero arco di vita associato a una determinata dose di esposizione .

Alterazioni morfologiche .

Atipie biochimiche e del metabolismo Comparsa di proteine fetali: alfa-fetoproteina antigene carcino-embrionale Sintesi ectopicadi ormoni ed enzimi non presenti nei tessuti che hanno dato origine alla neoplasia Diminuzione di enzimi di superficie come glicosiltransferasi. adenilatociclasi Diminuzione degli enzimi della catena enzimatica microsomale Aumento degli enzimi difensivi Aumento del metabolismo glicolitico Aumento metabolismo di proteine e grassi .

Alimentazione e cancro: procancerogeni
Affumicati/grigliati (presenza di benzopireni): attenzione ai cibi
affumicati e cotti su griglia, brace, barbecue (zone carbonizzate)
Fritti: trasformazione di grassi animali e oli di semi a basso punto di
cracking (rapido inscurimento)
Bevande alcoliche: etanolo →acetaldeide
Nitrati-Nitriti/Nitrosamine: cibi proteici + nitroderivati usati come
conservanti
dal 1990 è obbligatorio aggiungere Ac. Ascorbico agli insaccati
contenenti nitrati per impedire la trasformazione a nitriti e
nitrosamine
Tabacco: alcaloidi (nicotina) →nitrosamine
catrami-PAI (benzopirene) →derivati epossidici

Importanza modelli in vitro
Limiti degli studi a lungo termine nell’animale
Costi elevati
Specificità di specie e di ceppo
Peculiarità nelle vie di somministrazione
Difficoltà nell’estrapolazione all’uomo
Pochissimi dati su miscele complesse

Pressioni dell’opinione pubblica per la riduzione
dell’uso di animali nella sperimentazione
tossicologica
Costo elevato degli studi in vivo tradizionali
Difficile estrapolazione dei risultati ottenuti negli animali
all’uomo

Modelli in vitro
VANTAGGI
rapidità, economicità, riproducibilità
controllo delle variabili sperimentali
valutazione delle relazioni dose-risposta
identificazione di parametri critici per gli effetti
avversi
studio dei meccanismi biochimici e molecolari alla
base degli effetti biologici
screening preliminare di nuovi materiali

Modelli in vitro LIMITI Non sono valutabili parametri fondamentali nella azione biologica • Assorbimento • Distribuzione • Metabolismo Possibilità di falsi positivi Modelli non direttamente correlabili con l’organo target .

Colture cellulari .

rigido controllo numero e struttura cromosomi Alterazione del ciclo cellulare Alterazioni morfologiche e proprieta’ antigeniche . alcune attivita’ enzimatiche.Colture cellulari Vantaggi Controllo condizioni ambientali e plasticità dei modelli Caratterizzazione ed omogeneità Economicità e rapidità risposta Riduzione sperimentazione in vivo Svantaggi Perdita di funzioni organo-specifiche.

Colture cellulari Linee stabilizzate – popolazioni omogenee di cellule in coltura “immortalizzate” – crescita rapida – Numero di divisioni in coltura indefinito Cellule altamente differenziate – Colture primarie – Linee cellulari specializzate .

Colture cellulari COLTURE PRIMARIE – costituite da cellule che provengono direttamente dai tessuti prelevati dagli animali COLTURE SECONDARIE – sono costituite da cellule che provengono da una coltura primaria e che si sono divise in vitro o sono state propagate in vitro .

Colture Cellulari .

Trasformazioni cellulari screening test di secondo livello per cancerogenesi screening test per cancerogeni non genotossici sostituzione di test in vitro di mutagenesi con attività predittiva simile o inferiore .

Trasformazioni cellulari .

Il modello BALB/c 3T3 Il modello: – Descrive la tossicità della miscela – Analizza la potenzialità cancerogena – Individua relazioni dose-risposta – Adatto allo studio di miscele complesse ambientali I fibroblasti murini BALB/c 3T3 crescono in un monostrato ordinato sensibile alla densità (inibizione da contatto) Il trattamento con cancerogeni (singoli composti o miscele complesse) determina l’insorgenza di cloni di cellule trasformate (foci) che crescono disordinatamente in pluristrato .

Inibizione da contatto Le cellule normali proliferano in coltura finché raggiungono la confluenza. continuano a proliferare indipendentemente dalla densità . al contrario. A questo punto le cellule diventano quiescenti Le cellule tumorali.

Inibizione da contatto La migrazione di fibroblasti normali è inibita dal contatto fra le cellule così che essi formano un monostrato orientato ordinatamente sulla superficie della piastra di coltura Le cellule tumorali non risentono dell’inibizione da contatto. migrano l’una sull’altra e crescono disordinatamente in pluristrato .

MODELLO BALB/c 3T3 .

MODELLO BALB/c 3T3 .

MODELLO BALB/c 3T3 .

Il modello BALB/c 3T3 Il test di trasformazione cellulare misura un endpoint facilmente individuabile rappresentato dal focus trasformato • Il numero dei foci maligni è direttamente correlato con la dose .

Il modello di trasformazione cellulare Caratteristiche di un focus maligno (tipo III) nel modello BALB/c 3T3 – Forte basofilia – Densa sovrapposizione di cellule – Orientamento casuale delle cellule alla periferia del focus – Cellule fusiformi (spindleshaped) – Formazione di criss-cross alla periferia del focus – Infiltrazione del focus ramificato nel monostrato adiacente .

Test in vitro a medio termine Il Modello BALB/C 3T3: – Uno modello in grado di verificare le capacità trasformanti di composti singoli e miscele complesse e di predire la potenza cancerogena – Comprende differenti test che consentono di descrivere il ruolo e il peso della miscela in esame nel processo di cancerogenesi Test di citotossicità Test di trasformazione in cellule BALB/c 3T3 Test di trasformazione in 2 fasi: iniziazione/promozione Test delle comunicazioni intercellulari GJIC – Valutazione dell’impatto di promoventi sulla interazione cellula- cellula Test di chemiotassi/chemioinvasione – Valutazione delle tappe tardive della cancerogenesi multifasica Test di apoptosi .

Il rischio delle sostanze chimiche e il regolamento REACH .

Il modello BALB/c 3T3: Modulazione della comunicazione intercellulare mediata da gap junctions (GJIC) .

Il modello BALB/c 3T3: Morte cellulare programmata (apoptosi): un endpoint per descrivere l’attività tossicologica delle miscele ambientali .

Teratogenesi Si assiste allo sviluppo di malformazioni strutturali e/o comportamentali irreversibili presenti alla nascita o rilevabili in periodo perinatale (ecografia intrauterina o primi anni di vita) Tossicità embrio-fetale Si assiste a ritardo di sviluppo psicofisico senza evidenza di malformazioni. Le alterazioni possono essere permanenti o reversibili (es. crisi di astinenza per tossici o farmaci) .

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Test di teratogenesi .

Sostanze teratogene per l’uomo .

Sostanze teratogene per l’uomo .