You are on page 1of 14

SPEKTROFOTOMETRI UV/VIS

I. TUJUAN PERCOBAAN
Setelah melakukan percobaan ini, mahasiswa diharapkan dapat:
1. Menggunakan alat spektrofotometri sinar tampak (ViIS) dan
Ultraviolet
2. Menganalisis cuplikan secara spektrofotometri.

II. DASAR TEORI
Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis yang
didasarkan pada pengukuran serapan sinar makromatis oleh suatu
lajur larutan berwarna pada panjang gelombang spesifik dengan
menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan
fototube atau tabung foton hampa. Alat yang digunakan adalah
spektrofotometer, yaitu suatu alat yang di gunakan untuk menentukan
suatu senyawa baik secara kuantitatif maupun kualitatif dengan
mengukur transmitan atau absorbansi dari suatu cuplikan sebagai
fungsi dari konsentrasi. Pada titrasi spektrofotometri, sinar yang
digunakan merupakan satu berkas yang panjangnya tidak berbeda
banyak antara satu dengan yang lainnya, sedangkan dalam
kalorimetri perbedaan panjang gelombang dapat lebih besar. Dalam
hubungan ini dapat disebut juga spektrofotometri adsorbsi atomic
(Hardjadi, 1990).
Spektrofotometer menghasilkan sinar dan spectrum dengan
panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur
intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi. Kebetulan
spektrofotometer dibandingkan dengan fotometer adalah panjang
gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi dan ini diperoleh
dengan alat pengurai seperti prisma, grating, atau celah optis. Pada
fotometer filter dari berbagai warna yang mempunyai spesifikasi
melewatkan trayek panjang gelombang tertentu. Pada fotometer filter
tidak mungkin diperoleh panjang gelombang 30-40 nm. Sedangkan
pada spektrofotometer, panjang gelombang yang benar-benar
terseleksi dapat diperoleh dengan bantuan alat pengurai cahaya

seperti prisma. sel pengabsorbsi untuk larutan sampel blanko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan absorbsi antara sampel dan blanko ataupun pembanding (Khopkar. tetapi hanya pada sistem-sistem terkonjugasi. Prinsip Kerja Spektofotometer UV-Vis Prinsip kerja spektrofotometer UV-Vis adalah interaksi yang terjadi antara energi yang berupa sinar monokromatis dari sumber sinar dengan materi yang berupa molekul.Prinsip kerja spektrofotometer berdasarkan hukum Lambert Beer. Serapan tidak terjadi seketika pada daerah ultraviolet-visible untuk semua struktur elektronik. struktur elektronik dengan adanya ikatan π dan non bonding elektron . Sinar yang melewati suatu larutan akan terserap oleh senyawa- senyawa dalam larutan tersebut. dan sebagian lagi dipancarkan (It). Makin tinggi konsentrasi suatu senyawa dalam larutan. monokromator. sebagian dipantulkan (Ir). Besar energi yang diserap tertentu dan menyebabkan elektron tereksitasi dari keadaan dasar ke keadaan tereksitasi yang memiliki energi lebih tinggi. konsentrasi dan tebal atau panjang larutan tersebut. makin banyak sinar yang diserap. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum tampak yang kontinyu. 2002). . maka sebagian cahaya tersebut diserap (Ia). Intensitas sinar yang diserap tergantung pada jenis senyawa yang ada. yaitu bila cahaya monokromatik (Io) melalui suatu media (larutan).

Diantaranya adalah sebagai berikut: 1. hijau. Macam-macam spektrofotometri dan perbedaannya: Spektrofotometri terdiri dari beberapa jenis berdasar sumber cahaya yang digunakan. Spektrofotometri Vis (Visible) Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar atau energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya variable termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. merah. Detektor menerima cahaya dari sampel secara bergantian secara berulang-ulang. selanjutnya perhitungan dilakukan dengan komputer yang sudah terprogram. selama ia dapat dilihat oleh mata. apapun itu. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380-750 nm. Sampel yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memiliki warna. 22 o Tungsten memiliki titik didih yang tinggi (34 C) dibanding logam lainnya. diubah ke digital dan dilihat hasilnya. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible. Skema prinsip kerja spektrofotometer UV-Vis Cara kerja alat spektrofotometer UV-Vis yaitu sinar dari sumber radiasi diteruskan menuju monokromator. Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Maka sinar tersebut termasuk dalam sinar tampak (visible). Oleh karena itu. Karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolform merupakan unsur kimia dengan simbol W dan nomor atom 74. Sinyal listrik dari detektor diproses. biru. Cahaya dari monokromator diarahkan terpisah melalui sampel dengan sebuah cermin berotasi. Sehingga semua sinar yang didapat berwarna putih. untuk sampel yang tidak memiliki warna harus terlebih dahulu dibuat berwarna .

sampel keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau sentifungi. Deuterium disebut juga heavy hidrogen. sementara hidrogen hanya memiliki satu proton dan tidak memiliki neutrron. deuteras yang berarti dua. Bahkan sampel dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Alat ini digunakan mengukur serapan sinar ultra violet atau sinar tampak oleh suatu materi dalam bentuk . Oleh karena itu. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium. mengacu pada intinya yang memiliki 2 partikel. sampel tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagen tertentu. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sampel harus jernih dan larut sempurna. Nama deuterium diambil dari bahasa Yunani. dengan menggunakan reagen spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Dia merupakan isotop hidrogen yang stabil yang terdapat berlimpah dilaut dan daratan. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar- benar stabil. Spektrofotometri UV (Ultraviolet) Berbeda dengan spektrofotometri visible. 2. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Inti atom deuterium mempunyai satu proton dan satu neutron. 3. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi dengan mata kita maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sampel dengan sinar UV. Tidak ada partikel koloid/ suspensi. Spektrofotometri UV- Vis Merupakan alat dengan teknik spektrofotometer pada daerah ultra-violet dan sinar tampak. Reagen yang digunakan harus benar-benar spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. bening dan transparan. Namun perlu diingat.

1986). warna yang diserap oleh suatu senyawa atau unsur adalah warna komplementer dari warna yang teramati. Pada spektro IR meskipun bisa digunakan . hukum Lamber beer dapat menyatakan hubungan antara serapan cahaya dengan konsentrasi zat dalam larutan. Cahaya inframerah terbagi menjadi inframerah dekat. Spektrofotometri Inframerah Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa spektrofotometri ini berdasar pada penyerapan panjang gelombang inframerah. akan secara selektif sedangkan radiasi yang tidak diserap akan diteruskan (Day dan Underwood.b. inframerah pertengahan dan jauh.c Dimana : A = Absorbans T = Transmitan ε = absorvitas molar (Lcm-4 . Dalam hal ini. maka radiasi tersebut pada panjang gelombang tertentu. mol-1) c = panjang sel (cm) b = konsentrasi zat (mol/jam) Pada spektrofotometer UV-Vis. Dibawah ini adalah persamaan Lamber beer: A = . Inframerah pada spektrofotometri adalah inframerah jauh dan pertengahan yang mempunyai panjang gelombang 25-1000 µm. Namun apabila larutan berwarna dilewati radiasi atau cahaya putih.log T = ε. 4. Hal tersebut dapat diketahui dari larutan berwarna yang memiliki serapan maksimum pada warna komplementernya. Konsentrasi larutan yang dianalisis sebanding dengan jumlah sinar yang diserap oleh zat yang terdapat dalam larutan tersebut. larutan.

Terdapat juga satu jenis spektrofotometri IR lainnya yang berdasar pada penyerapan sinar IR pendek. Umumnya memiliki waktu 1000 jam pemakaian b. Spektrum radiasianya berupa garis lengkung. Sumber cahaya Sumber cahaya pada spektrofotometer harus memiliki pancaran radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi. Untuk identisifikasi. Lampu Deuterium Lampu ini dipakai pada panjang gelombang 190-380 nm. Aplikasi NIR banyak digunakan pada industri pakan dan pangan guna menganalisa BB yang rutin dan cepat. terhadap panjang gelombang. Monokromator . Lampu ini digunakan untuk mengukur sampel pada daerah tampak. Karena bila tidak. Spektrofotometri disebut Near Infrared Spectrogotometry (NIR). 1986). signal sampel akan dibandingkan dengan signal standar. Sumber cahaya pada spektrofotometer UV-Vis ada dua macam : a. Memiliki panjang gelombang antara 350-2200 nm. dan digunakan untuk mengukur sampel yang terletak pada daerah uv. Perlu juga diketahui bahwa sampel untuk metode ini harus dalam bentuk murni. 2. Memiliki waktu 500 jam pemakaian. untuk mengidentisifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa. Bentuk lampu ini mirip dengna bola lampu pijar biasa. gangguan dari gugus fungsi kontaminan akan mengganggu signal kurva yang diperoleh (Day dan Underwood. Lampu Tungsten (Wolfram). terutama senyawa organik. Sistem Peralatan Spektrofotometri Uv – Vis 1. Hasil analisa biasanya berupa signal kromatogram hubungan intensif IR. Spektrum energy radiasinya lurus. Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan adanya suatu gugus fungsi spesifik.

Sel itu haruslah meneruskan energi cahaya dalam daerah spektral yang diminati: jadi sel kaca melayani daerah tampak. maka radiasi akan dirotasikan melalui prisma. d. Prisma Prisma akan mendispersikan radiasi elektromagnetik sebesar mungkin supaya di dapatkan resolusi yang baik dari radiasi polikromatis. c. Kuvet (sel ) Adalah tempat disimpannya larutan sampel yang akan diukur serapannya. Filter Berfungsi untuk menyerap warna komplementer sehingga cahaya yang diteruskan merupakan cahaya berwarna yang sesuai dengan panjang gelombang yang dipilih. hasil dispersi akan lebih baik. sehingga diperoleh panjang gelombang yang diharapkan. b. Bagian-bagian monokromator. Dispersi sinar akan disebarkan merata. yaitu : a. Grating (kisi difraksi) Kisi difraksi memberi keuntungan lebih bagi proses spektroskopi. kuvet ini diletakkan pada jalan cahaya dari monokromator. 3. dengan pendispersi yang sama. Wadah Sampel (Kuvet) Kebanyakan spektrofotometri melibatkan larutan dan karenanyan kebanyakan wadah sampel adalah sel untuk menaruh cairan ke dalam berkas cahaya spektrofotometer. yaitu : o Tidak berwarna (agar dapat mentransmisikan semua cahaya) o Permukaannya sejajar . Celah optis Celah ini digunakan untuk mengarahkan sinar monokromatis yang diharapkan dari sumber radiasi. sel kuarsa atau kaca silica tinggi istimewa untuk daerah ultraviolet. Adapun syarat khusus yang harus dipenuhi . Monokromator adalah alat yang akan memecah cahaya polikromatis menjadi cahaya tunggal (monokromatis) dengan komponen panjang gelombang tertentu. Selain itu kisi difraksi dapat digunakan dalam seluruh jangkauan spectrum. Apabila celah berada pada posisi yang tepat.

Gunanya agar dapat melewatkan daerah panjang gelombang yang digunakan. VIS dan UV-VIS menggunakan kuvet sebagai tempat sampel. IRTRAN atau kristal dari senyawa ion Bahan Panjang gelombang Silika 150-3000 Gelas 375-2000 Plastik 380-800 Tabel Bahan Kuvet Sesuai Panjang Gelombang UV. Detektor . Umumnya pada pengukuran di daerah UV. • UV : fused silika. kuarsa • Visible : gelas biasa. Oleh karena itu. bahan kuvet dipilih berdasarkan daerah panjang gelombang yang digunakan. Hal ini disebabkan yang terbuat dari kaca dan plastik tidak dapat menyerap UV sehingga penggunaannya hanya pada spektrofotometer sinar tampak (VIS). digunakan kuvet yang terbuat dari bahan kuarsa atau plexiglass. 4. Cuvet biasanya berbentuk persegi panjang dengan lebar 1 cm. Kuvet kaca tidak dapat mengabsorbsi sinar uv. silika atau plastik • IR : KBr. namun kuvet dari kuarsa yang terbuat dari silika memiliki kualitas yang lebih baik. sehingga tidak digunakan pada saat pengukuran di daerah UV. NaCl. o Inert (tidak bereaksi terhadap bahan kimia) o Tidak rapuh o Tidak menyerap cahaya o Terbuat dari gelas silikat biasa (kaca korex untuk daerah UV) o Ukuran diameter 1 cm dengan volume 5ml o Bentuk sederhana ( persegi panjang atau silinder ) Terdapat berbagai jenis dan bentuk kuvet pada spektrofotometer. Kuvet biasanya terbuat dari kuarsa atau gelas.

Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang.000 hambatan listrik IR 5. Jenis-jenis detektor berdasarkan panjang gelombang Jenis detektor λ range (nm) Sifat pengukuran Penggunaan Phototube 150 – 1000 arus listrik UV Photomultiplier 150 – 1000 arus listrik UV/Vis Solid state 350 – 3000 - Thermocouple 600 – 20. Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut. Pelarut menyerapnya. menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang dibawah 190 nm. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV.000 arus listrik IR Thermistor 600 – 20. Detektor akan menangkap sinar yang diteruskan oleh larutan. . Misalnya. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan. anda sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut. Visual display/recorder Merupakan system baca yang memperagakan besarnya isyarat listrik. anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap. menyatakan dalam bentuk % Transmitan maupun Absorbansi. Tetapi berbeda. Detector dapat memberikan respons terhadap radiasi pada berbagai panjang gelombang Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Sinar kemudian diubah menjadi sinyal listrik oleh amplifier dan dalam rekorder dan ditampilkan dalam bentuk angka-angka pada reader (komputer). metanol. Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet. senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.

Proses inilah yang menjadi dasar pengukuran absorbansi dalam spektrofotometer. Kemungkinan pertama adalah cahaya ditangkap dan kemungkinan kedua adalah cahaya discattering. Kromofor-kromofor organik seperto karbonil. dan karboksil mampu menyerap sinar ultraviolet dan sinar tampak. dan amina. Tiga jenis elektron yang terlibat adalah sigma. Panjang gelombang maksimumnya dapat berubah sesuai dengan pelarut yang digunakan. Ketika cahaya melewati suatu larutan biomolekul. azo. Terkaitnya gugus kromofor akan mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke panjang gelombang yang lebih besar dan disertai dengan peningkatan intensitas. terjadi dua kemungkinan. nitrat. Penyerapan sinar UV-Vis dibatasi pada sejumlah gugus fungsional atau gugus kromofor yang mengandung elektron valensi dengan tingkat eksutasi rendah. Bila energi dari cahaya (foton) harus sesuai dengan perbedaan energi dasar dan energi eksitasi dari molekul tersebut. metoksi. alkena. dan elektron bebas. phi. Tabel Panjang Gelombang Warna dan Warna Komplementer Panjang Warna warna yang Warna komplementer gelombang (nm) diserap (warna yang terlihat) 400 – 435 Ungu Hijau kekuningan 435 – 480 Biru Kuning 480 – 490 Biru kehijauan Jingga 490 – 500 Hijau kebiruan Merah 500 – 560 Hijau Ungu kemerahan 560 – 580 Hijau kekuningan Ungu 580 – 595 Kuning Biru 595 – 610 Jingga Biru kehijauan . Auksokrom adalah gugus fungsional yang mempunyai elektron bebas seperti hidroksil.

warna larutan encertembaga sulfat adalah biru yang sangat terang. seperti anion tertentu atau ligan. Tirosin. c. . Larutan ion logam transisi dapat berwarna (misalnya. tidak semua pelarut yang cocok untuk digunakan dalam spektroskopi UV. Senyawa organik. Sebagai contoh. a. 610 – 800 Merah Hijau kebiruan Keuntungan Spektrometer Uv-Vis Spektrometer Uv-Vis dapat digunakan misalnya untuk mengukur kadar logam. Ethanol menyerap sangat lemah di paling panjang gelombang.).Polaritaspelarut dan pH dapat mempengaruhi penyerapan spektrum senyawa organik. (Pelarut organik mungkin memiliki penyerapan sinar UV yang signifikan. UV / Vis spektroskopi secara rutin digunakan dalam kuantitatif penentuan larutan dari logam transisi ion dan sangat dikonjugasikan senyawa organik. Sementara kompleks transfer biaya juga menimbulkan warna. Hukum Beer-Lambert menyatakan bahwa absorbansi larutan berbanding lurus dengan konsentrasi spesies menyerap dalam larutan dan panjang jalan. juga menyerap cahaya pada daerah UV atau terlihat dari spektrum elektromagnetik. menambahkanamonia meningkat dan perubahan warna panjang gelombang serapan maksimum (λ max ) b. Pelarut untuk penentuan ini sering air untuk senyawa larut dalam air. peningkatan penyerapan maksimum dan koefisien molar kepunahan ketika pH meningkat 6-13 atau ketika polaritas pelarut berkurang. misalnya. atau etanol untuk senyawa organik yang larut. terutama mereka yang memiliki tingkat tinggi konjugasi. warna sering terlalu kuat untuk digunakan dalam pengukuran kuantitatif. Warna larutan ion logam sangat dipengaruhi oleh kehadiran spesies lain. menyerap cahaya) karena elektron dalam atom logam dapat tertarik dari satu negara elektronik lainnya.

Memasukkan λ berikutnya ( misal 460 nm. 8. 100. 3. Memindahkan larutan di atas sejumlah masing-masing 0. dan 50 ml  Gelas kimia 500 ml  Pipet ukur 25 ml  Pipet tetes  Bola karet  Corong gelas b. Mencatat absorbansi pada 450 nm tersebut. Menghitung konsentrasi dari tiap-tiap larutan di atas. Memasukkan λ minimum ( 450 nm ) menekan F6 ( done ) 4.927 gram CuSO45H2O dalam labu takar 500 ml. memilih single WL / λ tunggal.20.5.30. Menekan F7 ( sampel ). menekan enter. dengan kuvet 2 (larutan standar. Mengganti kuvet. ALAT DAN BAHAN a.25. Memasukkan kuvet ( larutan blanko ) pada tempat kuvet pada alat spektrofotometer . Menekan F1 ( tasks ). Alat yang digunakan  Spektrofotometri Agilent  Kuvet/sel  Labu takar 250. menekan F8 ( blank ) 5. Menghidupkan alat spektrofotometer UV-VIS 2. Bahan yang digunakan  Kristal CuSO45H2O  Larutan H2SO4  Larutan Amoniak Pekat  Sampel IV. menekan enter 3. Menekan F2 ( setting ). menambahkan 5 ml H2SO4 pekat. memilih ┴ wavelength. misal Cs = 100 ppm ) 6. Melarutkan 3.15. PROSEDUR KERJA A.35 ml ke dalam masing-masing labu dengan 5 ml NH3 pekat dan mengencerkan dengan air aquadest sampai tanda batas. mengencerkan sampai tanda batas dengan menambahkan air aquadest 1 ml = 2 mg Cu2+ 2. dengan interview 10 nm ).10. Pembuatan larutan standar (larutan kalibrasi) 1. B.III. 7. menekan F6 ( done ) . Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ( λ maks ) 1.

Menekan F7 memilih band rate 38400 bits 8 dan parity even. menekan confiruge/F2 dan memilih Spektofotometer 5. menekan F7 ( sampel )  Mengulangi langkah ( 2 ) dan ( 3 ) untuk keseluruhan sampel  Menekan F6 ( done ) F. Menekan F1/Tasks dan Memilih Spektrum 3. 10. Memasukkan larutan blank sebagai standar nol ( konsentrasi nol ) dengan menekan F7. lalu menekan done 2x 13. menekan enter 12. Memasukkan nilai 0 ( pada concentration ) dan besi nama analyte menekan next atau F7. memasukkan nilai konsentrasinya 9. menekan enter 3. Mengganti kuvet yabg berisikan larutan standar ( mulai dari larutan standar dengan konsentrasi terkecil ) lalu menekan F7. 6. menekan enter  Memilih yes  Menunggu proses inisialisasi selesai . Mencetak hasilnya dengan menekan F6. Menekan done E. Mengganti grafik yang berisi larutan standar dan menekan sampel/F7 10. Menekan system/F5. Mengisi kuvet dengan larutan blanko kemudian meletakkan di tempat kuvet dan menekan F8 9. Menekan tasks atau menekan F1 2. Membaca kursor ke STDI dan menekan enter 7. memilih peaks lalu menekan enter 11. memilih set up. Menekan graphic/F6.C. Menekan F6/done 7. Memilih quantification. Mengulangi langkan ( 4) dan ( 5) sampai semua larutan standar selesai diukur. Cara mematikan alat  Menekan system ( F5 )  Menekan tombol m  Memilih restart. Memasukkan nilai range pengukuran panjang gelombang. 8. 4. Menggambar grafik kurva maksimum 1. Menganalisa sampel  Menekan F4 / sampel  Memasukkan kuvet 1 ( larutan blanko ) menekan F8 ( blank )  Mengganti dengan kuvet 2 ( larutan sampel 1 ). Untuk larutan standar 2. Menekan spectrum/F5 8. Memilih tipe pengukuran Absorbance 4. 5. Menekan enter D. misal 350-750 nm 6. menekan mark/F7. Menghidupkan alat. Mengulangi langkah ( a ) sampai semua larutan standar dimasukkan nilai konsentrasinya. menunggu sampai proses inisialisasi selesai 2. Pembuatan kurva kalibrasi larutan standar 1.

 Menekan tombol power ke off .