Magíster en Ciencias con mención en Microbiología Seminario I

“Analysis of tissue invasiveness of adherent strains of Listeria monocytogenes by in vivo mouse assay”
Kalpana Kushwaha – Peter Muriana

Roberto A. Riquelme Neira Concepción, 7 de Julio 2010

Introducción
- Listeria monocytogenes
- Intracelular, Gram +, bacilo, anaerobio. fac. - ETA  Listeriosis (grupo de riesgo) - Intestino > LN > “Hígado” – Bazo

- Virulencia (evaluación)
- DL50% - Recuento bazo e hígado

- Plantas de Procesamiento
- Relación adherencia – invasividad (in vitro)

Objetivo

“Confirmar la invasividad observada en ensayos de cultivo celular, con ensayo in vivo en ratones”

Materiales y Métodos
1.- Cepas Bacterianas
- 6 aisladas (venta de salchichas - CW) - 2 aisladas (venta de carne molida) - Almacenamiento - Cultivo BHI > centrifugado > BHI + glicerol > 1ml -76°C

2.- Cepa de Ratón
- Hembras A/J de 5 a 6 semanas (6 x grupo)

Materiales y Métodos
3.- Paso de cepas L. monocytogenes a través de ratones
- Recuperación de bacterias (higa. y bazo) - 3 días post inoculación oral ~ 1*108 UFC - Identificación reaislados - Crecimiento agar MOX y sec. PCR - Fenotipo, ensayo adherencia en microplaca

4.- Preparación del inóculo
- Reaislados cultivados BHI > diluciones cultivadas ½ fase log. > DO – placa (extrapolación recuentos)

Materiales y Métodos
5.- Experimento preliminar determinación dosis
- 104- 106- 108 UFC/ml – cepa de fuerte adherencia - Post inoculación día 3 -5 -7 extracción tejido - Hígado y bazo 104- 106 UFC – riñones 108 UFC

6.- Inoculación ratones
- 1* 109 UFC/ml > 0.1ml (~ 108) > intragástrica - 6 ratones por grupo – 2 controles (PBS) (104- 106- 108 UFC)

Materiales y Métodos
7.- Recuperación de L. monocytogenes hígado – bazo
- Eutanasia > hígado – bazo > recuento cel. viables - Homogenización > diluido PBS > TSA recuento - Agar MOX y sec. PCR

8.- Examen histopatológico de ratones infectados
- Hígado y bazo adherencia fuerte y débil 108 UFC (1) - Necropsia 4° día > 48 h fijación > cortes 5µm > tinción (H y E)

Materiales y Métodos
9.- Ensayo de adhesión fluorescente en microplaca (*)
- Caracterización adherencia cepas L. monocytogenes

10.- Análisis estadístico
- Test Tukey, deter. diferencias promedio UFC/g h y b tratados con cepas fuerte y débil

Resultados
- Determinación de dosis ratones
-Exp. preliminar - 2 dosis + bajas - Día 3 y 5 – Ø 7 (h – b) - Bazo > hígado

Resultados
- Tiempo óptimo de recolección de tejido
- 2 cepas ≠ adherencia - Día 3 a 5

Resultados
- Comparación de invasividad de tejidos entre múltiples cepas con adherencia fuerte y débil utilizando dosis y condiciones de recolección óptimas

- Bazo - Fuerte: 4,4 – 5,4 log UFC/g - Débil: 3,8 – 4,5 log UFC/g
- Hígado - Fuerte: 3,8 – 4,6 UFC/g - Débil: ND

Resultados
-Análisis histopatológico muestras de hígado

Discusión
- Diferencias adherencia fuerte y débil (fluorescencia, 2007) - 108 UFC/pocillo - 103 UFC/pocillo - Problema cepas “adherencia fuerte y plantas procesamiento” - Inoculación intragástrica altas dosis 108 UFC o + - Relación dosis – eficiencia de penetración - Aislados clínicos (5* 101 – 4,4* 105) - Altos niveles de bacteria recuperados desde bazo con ambos conjuntos de cepas v/s las recuperadas desde hígado

Discusión
- Correlación entre el grado de invasividad, con el nivel de adherencia a superficie abiótica (múltiples factores) - Factor de virulencia externo - Inhabilidad de cepas débiles para infectar hígado - Insuficiente tamaño de muestra, Histopatología - Datos se complementan con otro estudio

“invasividad demostrada por cepas de fuerte adherencia, ha sido consistentemente mas invasiva in vitro e in vivo, que las cepas de adherencia débil”

Conclusión
“Potencial de contaminación, en plantas procesadoras”
“Potencial de infección en consumidores”

BHI
- NCCLS (National Committee on Clinical Laboratory Standards) para
preparar el inóculo para las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana.

-

En este medio la infusión de carne de corazón y de cerebro de ternera así como la peptona proveen la fuente de carbono, nitrógeno sulfuro y vitaminas. - La dextrosa actúa como fuente de energía. - El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico del medio. - El fosfato disódico actúa como buffer.

MOX
- Es diferencial para Listeria spp. debido a que el producto de la hidrólisis de esculina en presencia de iones férricos forma un compuesto fenólico de color negro. - La selectividad para Listeria spp., se obtiene por el agregado del suplemento selectivo para Agar base Oxford modificado, debido a que contiene antibióticos que inhiben total o parcialmente el desarrollo de la flora acompañante presente en la muestra

Internalin A (InlA) and InlB mediate the attachment of L. monocytogenes to the surface of host cells, and listeriolysin O (LLO) lyses the phagosomal membrane. The actin-assembly-inducing protein (ActA) is expressed in a polarized manner and catalyses actin polymerization, which propels bacteria through the cell and into neighbouring cells. To escape the secondary vacuole in the newly invaded cell, L. monocytogenes expresses the phosphatidylcholine-specific phospholipase PlcB, a secreted zinc metalloproteinase (Mpl) and LLO.