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Herramientas

diagns.cas para la
determinacin de alrgenos en
alimentos


Mgr., Bqca. Patricia Silvina Knass
Romer Labs La:n America Adviser
Resumen de la presentacin

Porqu vamos a analizar?


Qu vamos a analizar?
Cuales son las tcnicas disponibles?
Cuales son las fortalezas y debilidades de
algunos mtodos?
Errores y problemas comunes en el anlisis de
alrgenos
Cuando analizar
Validacin
Porqu vamos a analizar?

Las verdaderas alergias alimentarias presentan una


respuesta inmunolgica a protenas especcas de
algunos alimentos.
Los mtodos anal:cos pueden determinar las protenas
de inters o el material gen:co que produce esas
protenas (DNA)
El mtodo anal:co debe ser lo ms especco posible
para el producto de inters.
El mtodo anal:co debe ser capaz de detectar el/los
analito/s de inters bajo una gran variedad de
circunstancias (procesos a los que se somete al alimento,
incluyendo el tratamiento trmico)
Determinacin de Alrgenos: Tendencias
Proteccin de la mercado Allergen-free
marca
Inters de los medios
Legislacin y
estndares

Retiro de
Productos

Alrgenos alimentarios
= riesgo para la inocuidad alimentaria
Cual es el escenario para el analista?

Niveles umbral

Toma de
Test kits
muestra
Unidades y Calibracin
deniciones

Validaciones & El anlisis es solo


Aprobaciones una pequea parte
Qu vamos a analizar? (donde buscar alrgenos)

Ingredientes o materias primas.


Productos terminados.
Muestras ambientales.
Limpieza
o Supercies en contacto con alimentos
o Agua de enjuague
o Primera porcin de la produccin
Qu vamos a analizar? Analitos: alrgenos/
marcadores
Protena no
Protenas involucrada en la
reaccin adversa,
involucradas pero
en las caracters:ca del
reacciones alimento
adversas considerado
como alergnico

Marcado Qu marcador
res DNA estamos utilizando?
Cules son las tcnicas disponibles?
Mtodos inmunoqumicos:
o ELISA
o Disposi.vos de Flujo lateral (FLD)
o Mul.plex
Mtodos de biologa molecular:
o PCR
o Mul.plex
Espectrometra de masas
Genricos/No especcos (limpieza)
o Protenas
o ATP
o Inspeccin visual
Otros mtodos
Seleccin de un mtodo para detectar alrgenos

Propsito
Tipo de muestra
Matriz o producto
Efecto del Procesamiento
Tiempo de Respuesta
Disponibilidad de recursos
ELISA
Deteccin de la protena especca
(u otra asociada) por medio de
an:cuerpos
ELISA Sndwich es ms comn en
mtodos para alrgenos
1 a 2 horas para el anlisis
Cualita:vo o Cuan:ta:vo
Empleado para ingredientes,
productos nales, muestras
ambientales, hisopos, agua de
enjuague.
Ventajas y Limitaciones del ELISA

Ventajas Limitaciones
Sensible (ppm) Entrenamiento /Seguir el
Cuantitativo o protocolo
semicuantitativo Muestreo
Anticuerpos que detectan Extraccin
protenas alergnicas o Matriz (polifenoles, pH,
marcadoras procesamiento, aceites)
Relativamente rpido Tipo de protena
Poco equipamiento Falta de matrices de
Nivel de habilidad: medio referencia
Necesidad de validacin
in house
Y adems. (cuando monitoreamos despus
de la limpieza)
Cuando la protena alergnica se desnaturaliza
(detergentes, procesos) se presentan falsos
nega:vos.
En presencia de leche de soja, no se detecta gluten
con el an:cuerpo R5 cuando se extrae con EtOH 60%
La prueba inmunoqumica puede verse afectada por
la presencia de residuos de detergentes o
desinfectantes.

Mtodos alterna.vos!!!!!!
FLD (.ras)
Dispositivos basados en la tecnologa ELISA. (Cualitativos / Semi-
cuantitativos)
Se visualiza con la aparicin de una lnea de color
Muestras ambientales, verificacin de limpieza, screening de
alimentos.
Rpidos (10) / In Situ
PCR
Mtodo cualita.vo

DNA, primers, dNTPs,
polimerasa, termociclador
Desnaturalizacin (95C)
Unin del primer
Sntesis de DNA (DNA-
polimerasa 72C)
Siguiente ciclo


Electroforesis en gel de
agarosa
PCR
Mtodo para la deteccin del DNA especfico de la especie
(no la protena alergnica)
Es un mtodo cualitativo donde se amplifica el DNA
especfico y luego se detecta.
Es til cuando los resultados de ELISA son cuestionables
(protenas liofilizadas, para aceites problemas con la
extraccin acuosa-, lecitina de soja en leche en polvo)
Se requiere de habilidad y equipamiento ms costoso.
Real.me PCR
Mtodo cuan.ta.vo

Sonda adicional de ADN


(TaqMan probe)


Ciclo umbral

Realtime PCR
PCR en Tiempo Real es un mtodo
cuan:ta:vo
Se adiciona una sonda especca de ADN
Cuando la sonda encuentra el target, se
elimina el quencher y se emite una seal
uorescente.
Durante la reaccin se mide la uorescencia
en el termociclador.
La cuan:cacin se lleva a cabo a par:r del
ciclo umbral (Ct value).
La can:dad original de DNA se calcula con
estndares internos.

Mar:n Rder, Stefan Vieths, Thomas Holzhauser, Sensi:ve and specic detec:on of poten:ally allergenic almond (Prunus dulcis) in complex
food matrices by Taqman real-:me polymerase chain reac:on in comparison to commercially available protein-based enzyme-linked
immunosorbent assay, Analy:ca Chimica Acta, Volume 685, Issue 1, 24 January 2011, Pages 74-83,)
Espectrometra de Masas

Detecta protenas y pp:dos
Extraccin, cleanup, ionizacin, separacin de las protenas/pp:dos
ionizados, deteccin
Alto grado de sensibilidad y resolucin
Provee informacin de la composicin proteica, estructura y
secuencia.
Deteccin y conrmacin de la protena en un solo paso
Deteccin y cuan:cacin de pp:dos sencilla.
Ventajas y Limitaciones de MS
Ventajas
Identificacin y Limitaciones
cuantificacin certera de Mucha experiencia
las protenas alergnicas Equipamiento costoso
Mtodo muy sensible Laborioso y gran inversin
Mtodo de eleccin para de tiempo
la confirmacin Se requiere de extraccin
y cleanup
No es til para los
procedimiento de rutina

hpp://www.intechopen.com/books/a-comprehensive-survey-of-interna:onal-soybean-research-gene:cs-
physiology-agronomy-and-nitrogen-rela:onships/proteomics-and-its-use-in-obtaining-superior-soybean-genotypes
Antes de los mtodos no especcos.
Validacin y Vericacin
Los procedimientos de limpieza requieren de ambos: de
validacin y vericacin

Validacin que la limpieza ser efec:va


Vericacin que la limpieza fue efec:va

Validacin y Vericacin
Mtodos de Validacin Mtodos de Vericacin
ELISA Pruebas rpidas para
alrgenos
Microbiologa tradicional Bioluminiscencia de ATP
Mtodos PCR (DNA) Protenas (colorimetra)
Toma de muestra para validar la limpieza
Debe asegurar la recuperacin de los residuos de
alrgenos de la supercie o del producto nal, y el
nivel de recuperacin y repe:bilidad debe ser
suciente para cumplir con los criterios denidos
para considerar efec:va la limpieza.
Donde, cuando y como deben tomarse las muestras
puede inferir en el resultado de la validacin.
Toma de muestras: Aguas de lavado y enjuague
Agua de enjuague: solo cuando no pueda accederse al equipo (CIP)
Agua de lavado: si se recicla o si es comn (lavado de bandejas o
utensilios.
Agua de pre-enjuague y de enjuague (para vericar la reduccin del
alrgeno)
Material de purga: limpieza a seco (industria farmacu:ca)
Anlisis de agua de enjuague y primer producto para determinar man (4 limpiezas/3 muestras)
Etapa de la limpieza ELISA para man (ug/ml) Test de Bradford (ug/ml) Resultado
Agua de enjuague
Pre-lavado 98,5 1.379 85,9 917,6 posi:vo
Luego de limp. alc. ND ND nega:vo
Luego de limp. Ac. ND ND nega:vo
Producto
Luego de limpieza ND 1,1 ND nega:vo
Stephan et al (2004)
Toma de muestras: Supercies
Hisopos pre-humedecidos (compa:bles con el mtodo anal:co
seleccionado)
Enjuague de partes con una can:dad conocida de solucin de
extraccin.
En caso de polvos alrgenos (harinas) permi:r que se asiente antes
de tomar la muestra.
Toma de muestras: Producto nal

Primer producto del lote (luego de la limpieza)


Vericar que las materias primas no contengan alrgeno
Mtodo no especco: Bioluminiscencia de ATP

Efec.vidad de la sani.zacin
Detecta ATP proveniente de fuentes biolgicas
Hisopos convencionales de ATP (higiene)
Hisopos de alta sensibilidad (residuos de alimentos)
Ventajas:
rpido (< 30 segundos)
Ms econmico que ELISA
La prueba se lleva a cabo in situ (:empo real)

Limitaciones: Aplicacin (limpieza hmeda de supercies)


Puede tomar ATP de la fuente de suministro de agua
Mide la presencia de ATP, no de alrgenos
Indicador de alrgeno: solamente validando y correlacionando con
prueba alrgeno-especca
Mtodo no especco: Protenas totales

Efec.vidad de la sani.zacin
Ventajas:
rpido (< 30 segundos)
Ms econmico que ELISA
Mide protenas

Limitaciones: Aplicacin (limpieza hmeda de


supercies)
Determina todas las protenas (no solo alrgenos)
Desacos en la deteccin de alrgenos

Falta de materiales de referencia


Sin estandares cer.cados disponibles
Qu an.cuerpo detecta la protena correcta??

For:cacin diwcil
Extracto de la protena (que se detecta?)
Alrgeno (alimento)
For:car extracto
For:car muestra
Cuando analizar alrgenos?

Inves:gacin de reclamos
Validacin de mtodos de limpieza
Validacin de materias primas
(Anlisis del producto terminado?)
Herramientas diagns.cas para la
determinacin de alrgenos en
alimentos


Mgr., Bqca. Patricia Silvina Knass
Romer Labs La:n America Adviser