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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS


ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

TEMA: AISLAMIENTO, SELECCIÓN E IDENTIFICACION Y PRESERVACIÓN DE


CEPAS DE GIBBERELLA FUJIKUROI PRODUCTORAS DE ACIDO GIBERÉLICO.

PROFESOR: Dra. Blanca E. Bravo

INTEGRANTES: Galeas Paul

Guamangallo Raúl

Portilla Arnulfo

Porras Diego

Pusdá Guillermo

2010
Contenido
1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................................4

2. OBJETIVOS: ..........................................................................................................................................4

2.1. OBJETIVO GENERAL .........................................................................................................................4

2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS: ..............................................................................................................4

3. MARCO TEÓRICO:...............................................................................................................................4

3.1. Gibberella fujikuroi .................................................................................................................................4

3.2. Acido Giberélico .....................................................................................................................................5

3.3. Fermentación en extracto seco. ..........................................................................................................5

4. MARCO METODOLÓGICO.................................................................................................................6

4.1. Muestreo……… .....................................................................................................................................6

4.2. Aislamiento ……………………………………………………………………………………………………………………………...…6

4.2.1. Aislamiento en suelo. .................................................................................................................6

4.2.2. Aislamiento en espiga. ...............................................................................................................7

4.3. Purificación:. ...........................................................................................................................................7

4.4. Aislamiento selectivo de upm. .............................................................................................................8

4.5. Identificación Morfológica. ....................................................................................................................8

4.6. Conservación: ........................................................................................................................................8

4.7. PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO GIBERÉLICO ...................................9

4.7.1. Materiales….. ................................................................................................................................9

4.7.2. Método……....................................................................................................................................9

4.7.2.1.Microorganismo. ..........................................................................................................................9

4.7.2.2.Inoculo…….. ...............................................................................................................................10

4.7.2.3.Inducción a la esporulación. ....................................................................................................10

4.7.2.4.Medio de Cultivo. .......................................................................................................................10

4.7.2.5..Fermentación. ...........................................................................................................................10

4.7.3. Determinación de Ácido Giberélico. .....................................................................................10

4.7.3.1. Separación y purificación. .......................................................................................................10

4.7.3.2. Determinación Cualitativa. ......................................................................................................10


4.7.3.3. Determinación Cuantitativa. ....................................................................................................10

5. RESULTADOS ....................................................................................................................................11

6. DISCUSIONES ....................................................................................................................................11

7. CONCLUSIONES ................................................................................................................................11

8. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................................12

9. ANEXOS….. .........................................................................................................................................13

9.1. Tabla A1……. ..............................................................................................................................13

9.2. Tabla A2……. ..............................................................................................................................13


1. INTRODUCCIÓN
La utilización de fitohormonas para el mejoramiento de ciertos cultivos agrícolas, ha traído
ciertas investigaciones nacionales como por ejemplo en trabajos de grado realizados en la
Facultada de Agronomía de la Universidad Central del Ecuador.

En la Universidad Javeriana sede Colombia se realizó la investigación sobre la producción de


acido giberélico un metabolito secundario de la fermentación con el hongo Gibberella Fujikuroi.
Se estudió la inmovilización de Gibberella fujikuroi en sílicagel, carbón activado y vidrio
sinterizado. Los biocatalizadores obtenidos se emplearon en fermentaciones sumergidas que se
desarrollaron en un tiempo total de 10 días, que incluía la preparación de los inóculos, obteniendo
rendimientos de hasta 0.055 mg ácido giberélico/g medio nutritivo. El crecimiento del micelio sobre
los soportes inertes se verificó mediante microscopía electrónica de barrido.

La Gibberella fujikuroi es un hongo aislado por primera vez en cultivos de arroz en la India como
un microorganismo patógeno pero que no ha sido estududiado con claridad sus beneficios que
puede presentar.

En el país no existe la comercialización de cepas de Gibberella fujikuroi, ni se han realizado


investigaciones para el aislamiento y la exportación de estas cepas resulta muy costoso, igual
por tanto no existe la venta ni producción de ácido giberélico.

La utilización de esta fitohormona es beneficiosa para el desarrollo de ciertas variedades de


cultivo, por tanto es muy solicitada por los agricultores y su costo es muy elevado, siendo esta
investigación de vital importancia para la producción del acido giberélico a bajo costo, mediante la
utilización de cepas de Gibberella fujikuroi aisladas de nuestro medio.

El objetivo de esta investigación es el aislamiento selección y preservación de la Gibberella


fujikuroi y posteriormente por el proceso de fermentación con este hongo obtener ácido
giberélico.

2. OBJETIVOS:

2.1. OBJETIVO GENERAL


 Aislar, seleccionar y caracterizar cepas de Gibberella fujikuroi, productoras de acido
giberélico.

2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS:


 Aislar las cepas de Gibberella fujikuroi a partir de muestras suelo y semillas frescas de
cultivos de arroz.
 Identificar y caracterizar morfológicamente a la cepa.
 Establecer un método de preservación.
 Formular un procedimiento para producir ácido giberélico utilizando las cepas de
Gibberella fujikuroi.

3. MARCO TEÓRICO:

3.1. Gibberella fujikuroi


La Gibberella fujikuroi es un hongo (ascomiceto) aislado por primera vez en cultivos de
arroz, en estudios realizados en la India, llamándose así cuando se encuentra en su forma exacta
y denominado también como Fusarium moniliforme (hongo imperfecto) en su forma más estable.
La característica más importante de este hongo es la formación de micro conidios falciformes y
micro conidios mono celulares además es productor de un color violeta-salmón.

En la actualidad este hongo ha sido aislado en diversas plantas como arroz, maíz, caña etc.
como Fusarium moniliforme, siendo reconocido como patógeno cuando se encuentra un contaje
alto en el maíz, el causante de enfermar al arroz por su exagerado crecimiento y posterior muerte
por no soportar su propio peso y además asociado al declinamiento de espárragos donde
produce, amarillamiento y retardo en su crecimiento.

Entre los diversos compuestos producidos por este tipo de hongo se encuentran alrededor de 25
giberelinas, que son un tipo de hormonas que regulan el crecimiento de las plantas y que entre
estas se encuentra la giberelina GA3 que es denominado ácido giberélico.

Algunos hongos del genero Fusarium son capaces de sintetizar ácido giberélico como producto
de su metabolismo secundario siendo el F. moniliforme el que ha dado resultados positivos en la
obtención de este tipo de fitohormona.

3.2. Acido Giberélico


El ácido giberélico (A3, AG, y AG3) es una fitohormona que se encuentra en plantas. Su
fórmula química es C19H22O6, es un polvo cristalino blanco a pálido amarillo, soluble en etanol y
algo soluble en agua.

El AG, ácido giberélico es una simple giberelina, que promueve crecimiento y elongación celular.
Afecta la descomposición vegetal y ayuda a su crecimiento si está en bajas proporciones, aunque
eventualmente la planta desarrolle tolerancia al compuesto.

El ácido giberélico es una muy potente hormona cuya presencia natural en plantas controla su
desarrollo. Sabiéndose de su poder regulatorio, las aplicaciones de muy bajas concentraciones
pueden resultar en profundos efectos, mientras que muy altas pueden dar el efecto opuesto. Se lo
usa generalmente en concentraciones de 0,01 a 10 mg/L .

3.3. Fermentación en extracto seco.


Se han usado distintas técnicas de fermentación a nivel de laboratorio, desde
fermentaciones sumergidas, pasando por las investigaciones con células inmovilizadas, hasta
llegar a los ensayos de inmovilizaciones basadas en fibras poliméricas y diversos sistemas de
fermentación en fase sólida.

La fermentación es estrato sólido se asemeja a su hábitat natural del microorganismo en


concerniente a su crecimiento, así como la formación del producto en la superficie de los
materiales sólidos con bajo contenido de humedad tales como, diferentes productos agrícolas,
arroz, cebada, trigo y soya.

Por otra parte también pueden ser de interés ciertos sub-productos de origen industrial, agrícola,
forestales y procesamiento de alimentos que sirven como soportes y pueden contribuir con
nutrientes para el microorganismo.

La fermentación se ha encontrado quela influencia de varios factores como el cultivo alimentado


“Feed Bach” la temperatura, la oxigenación, control de pH, la humedad, determinan la facilidad de
operación y capacidad de productividad.

La inoculación de esporas en un medio, con soportes, nutrientes necesarios y condiciones


ambientales (aireación principalmente) necesarias para lograr la eficiencia, al contrario de lo que
presenta la fermentación sumergida que presenta inconvenientes debido al incremento de
viscosidad y por tanto disminución de fenómenos de transferencia.

4. MARCO METODOLÓGICO

4.1. Muestreo
Se tomó muestras de cultivos de arroz, ubicados en el cantón Quinindé, provincia de
Esmeraldas.

La técnica de muestreo está basada en los métodos utilizados en el INIAP de la siguiente manera.

Finca I Finca II
Puntos de
muestreo Numero de muestras

Suelo 4 4

Espiga 2 2

Total de muestras 6 6

Peso de muestra 800 g.

4.2. Aislamiento
4.2.1. Aislamiento en suelo.
Se procedió a homogenizar cada muestra de los diferentes cultivos de arroz.
Procedimiento.

0.1 ml 0.1 ml

10-3 10-5

10 g. muestra + 90 ml
de agua de peptona
0.1 ml 0.1 ml

Siembra en agar PDA con


Acido lactico por extension

Colonias de mohos y levaduras observadas después de los cinco días de siembra

Upm y levaduras en la caja petri sembrada

4.2.2. Aislamiento en espiga.


 Se tomaron granos de arroz de cada muestra, y se sumergieron en Hipoclorito de Sodio al
1% durante un 15 minutos, luego se colocaron en toallas absorbentes.

 Se sembró por duplicado de cada muestra, tres granos de arroz por caja y se incubo
durante 5 días a 25°C.

4.3. Purificación:
Identificación de las upm de Gibberella fujikuroi (fusarium moniliforme)

Mediante consulta bibliográfica y de otras investigaciones de aislamiento en PDA el hongo


presenta las siguientes características:
A. Micelio de color blanco.
B. Ligero color rosado
C. Vista del reverso de la caja presenta un color mezcla entre violeta y salmón.

A,B -Upm de F. moniliforme, vista frontal C- Upm de F. moniliforme, vista invertida

4.4. Aislamiento selectivo de upm.


La colonia obtenida se sembró en PDA con ácido láctico.

Upm pura de F. moniliforme (Gibberella fujikuroi) Colonia de Gibberella luego de un repique de la mejor colonia

4.5. Identificación Morfológica.


Para observar al microscopio se utilizó fushina ácida al 0,1% en acido láctico.

La identificación se realizó comparando con fuentes bibliográficas su taxonomía.

 Microconidios en cadenas filiales simples.


 Ausencia de clamidosporas (diferencia del fusarium oxysporum)
 Mínima presencia de macro conidios.

4.6. Conservación:
La conservación de las cepas se precedió a realizarse en aceite mineral.
Procedimiento

Agragar aceite
Inoculacion de cepa mineral

Refrigeracion a 4 °C

Colonia de Fusarium
Moniliforme

Agar saboureab

4.7. PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO GIBERÉLICO

4.7.1. Materiales.
Microorganismo( inóculo esporulado)
Soporte (salvado de trigo y masilla de malta)
A1
Solución Salina
A2
CMC (con CaCO3)
Acetato de etilo
Acido acético
Cloroformo
Etanol ácido (pH2.5)
Metanol
Acido Clorhídrico
Estándar de ácido giberélico
Frascos erlenmeyer de 250ml
Sistema de agitación y control de temperatura

4.7.2. Método.

4.7.2.1. Microorganismo.
La cepa de Gibberella fujikuroi tiene que ser seleccionada y apta para el experimento, esta
tiene que haber sido conservada o mantenida viable en resiembras periódicas en agar PDA
incubadas a 28°C y luego conservadas a 4°C.
4.7.2.2. Inoculo.
Se prepara a partir de esporas, estas presentan mayor uniformidad en cuanto a tamaño,
forma y estado fisiológico, resultando así más sencilla la estandarización del inóculo.

4.7.2.3. Inducción a la esporulación.


A los cultivos de agar inclinado de Gibberella fujikuroi adicionar 7ml de solución salina
estéril, y agitar con una varilla de agitación.

Tomar 2ml del cultivo suspendido y adicionar 3ml de CMC suplementando con CaCO3 al 1%,
colocar a 28°C durante 96 horas con agitación constante.

Se procede a hacer un conteo para estimar la población.

4.7.2.4. Medio de Cultivo.


Se puede utilizar salvado de trigo y masilla de malta, colocar en matraces erlenmeyer y
humedecer con soluciones minerales y luego homogenizar.

Esterilizar los matraces a 121°C por 30 min al igual que las soluciones minerales y el aceite de
linaza esterilizar con calor seco a 170°C y el resto de componentes esterilizar por filtrado.

Dividir por partes para la alimentación de cada día.

4.7.2.5. Fermentación.
El medio de cultivo se inocula con 3ml de cultivo esporulado de G. fujikuroi en caldo
Czapex Dox.

Se procede en matraces erlenmeyer de 250 ml, incubar a temperatura ambiente en aerobiosis,


con una humedad de 60% y un pH entre 3.5 -5.5 que es el rango que se ha encontrado mayores
resultados. Todo el proceso se lleva durante 8 días.

4.7.3. Determinación de Ácido Giberélico.

4.7.3.1. Separación y purificación.


A cada matraz añadir solución de etanol al 10% acidificado con HCl hasta un pH de 2.5 en
relación 1 de cultivo y 5 de solvente.

Homogenizar y agitar durante una hora a 25°C para posteriormente filtrar en gasa y papel Watman
numero 41.

Evaporar el agua en un rotavapor y luego el residuo recuperar con metanol y conservar a 4°C.

4.7.3.2. Determinación Cualitativa.


Se realiza por capa fina con estándares de Ácido Giberélico al 1%, con eluyentes como:
Cloroformo, acetato de etilo y ácido acético (5;4;1) .

El revelado se realiza con vapores de ácido clorhídrico por 30 minutos, posteriormente se calienta
a 110°C por 10 minutos y observar con luz UV.

4.7.3.3. Determinación Cuantitativa.


La determinación y cuantificación del producto se puede realizarse por la técnica HPLC
utilizando estándares de Ácido Giberélico CAS 77-06-5.
Tiempo de retención del ácido en la columna de sílica gel a 28°C, aproximadamente 4 min.

5. RESULTADOS
Colonias aisladas:

6. DISCUSIONES
 Para el aislamiento y selección de la cepa sería más conveniente realizar un muestreo en
distintos suelos tropicales para verificar en cuál de estas zonas es más susceptible el
crecimiento y adaptación de la mejor cepa de Gibberella fujikuroi, así como también en
otros cultivos.

 Es conveniente buscar un medio de cultivo más selectivo para obtener mejores resultados
en el aislamiento, debido a la presencia de muchas especies de hongos que se
presentaron en la primera siembra.

 El cuidado en el aislamiento tiene que ser riguroso, ya que puede existir contaminación por
otras especies de hongos del ambiente.

 Las pruebas realzadas para la identificación de su morfología fueron microscópicas, pero


sería aconsejable realizar la identificación con medios tecnológicos como PCR.

 Sería importante plantear y realizar el estudio de la obtención del acido giberélico por
distintos métodos con la finalidad de ejecutarlos y obtener mejores resultados a nivel de
laboratorio.

7. CONCLUSIONES
 Las cepas aisladas son de Gibberella fujikuroi, ya que presentan las características
morfológicas perteneciente s a esta especie.

 Los mejores resultados del aislamiento están en suelos de cultivo de arroz en suelo seco y
semillas.

 El mejor método para preservar la cepa es mediante la siembra en pico de flauta y cubierto
con aceite mineral estéril.

 La fermentación en estrato solido permite obtener mejor rendimiento en la obtención de


ácido giberélico, mayor facilidad de manejo y buena factibilidad en nuestro medio.
8. BIBLIOGRAFÍA
 SAMSON, Robert A. HOEKSTRA, Ellen S; Introduction to Food - Borne Fungi,
Departamento de Biotecnología de U. Dinamarca, Cuarta edición 1995. Pag. 85

 Guía práctica; Curso de Micotoxinas y Micotoxicosis, Quito, 1998.

 Ñacato LLumiquinga, Pedro. Evaluación de tres dosis de ácido giberélico en dos


estados de botón de rosas. Facultad de Ciencias Agronómicas. 2003.

 Rivera Trujillo Jaime Javier. Evaluación del ácido giberélico para mejorar la calidad del
botón de rosas. Facultad de Ciencias Agronómicas. 2004.

 http://redalyc.uaemex.mx/pdf/499/49911204.pdf

 http://www.inia.es/gcontrec/pub/11.WOLCAN_LORI_1048156253125.pdf

 http://www.biotecnologica.com/paginas/TratamieEl_curso0i72742300d1115244052005.php
9. ANEXOS

9.1. Tabla A1
COMPONENTES DE LOS SOPORTES SÓLIDOS USADOS EN LA
FERMENTACIÓN

Componentes Masilla % Salvado %


Proteína 23,4 16,9
Grasa 6,4 4,6
Fibra 16,1 10
Extracto libre de Nitrógeno 42,5 55
Cenizas 3,9 5
9.2. Tabla A2
COMPONENTES DE LA SOLUCIÓN SALINA
ZnSO4.7H2O 70ppm
CuSO4.5H2O 70ppm
FeSO$.7H2O 70ppm
HCl 16%

Fotografías de F. moniliforme.