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CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN EN ESPECIE ASNAL

Sebastián Osorio Martínez
Alejandro Patiño Pérez
Juan Pablo Valencia Gómez
Estudiantes de Tecnología Agropecuaria

Juan David Montoya Páez
Ing. Agropecuario, M.Sc Ciencias Agrarias
Docente

Juan Esteban Duque
Ing. Agropecuario, M.Sc Ciencias Agrarias
Docente

Informe Práctica #3: Evaluación de Semen equino para su posterior
criopreservacion
Politécnico J.I.C

POLITECNICO COLOMBIANO JAIME ISAZA CADAVID
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
MEDELLÍN – ANTIOQUIA
2016
INTRODUCCIÓN
En Colombia, la especie equina es cada día más importante, debido a su
amplia participación en el trabajo, en actividades deportivas y de
exposición, de acuerdo a los diferentes andares. La reproducción juega
un papel fundamental en el mejoramiento genético de dicha especie,
por lo cual, la posibilidad de disponer de material seminal de excelente
calidad para procedimientos, como la inseminación artificial, permite
alcanzar altos estándares de eficiencia reproductiva (Restrepo G. et, al.
2013).
El uso de la inseminación artificial (IA) en equinos ha progresado en las
últimas décadas debido al desarrollo de diferentes metodologías para la
preservación de semen, tanto en estado fresco, refrigerado como
congelado. A pesar de esto, las tasas de preñez que se obtienen cuando
se utiliza semen equino criopreservado frente a semen fresco o
refrigerado, son inferiores y las investigaciones actuales se enfocan
mayoritariamente a obtener mejores resultados (Prado Acuña J.P. 2011).
La criopreservación de semen es uno de los procedimientos más
importantes en el desarrollo de biotecnologías para la reproducción
asistida, como la inseminación artificial (IA) y la transferencia de
embriones. Esta tecnología permite una máxima distribución y una
adecuada disponibilidad de material germinal de ejemplares de interés
mediante su conservación a largo plazo lo cual favorece el mejoramiento
genético para rasgos de valor comercial en la especie, a través de la
selección y de los cruzamientos dirigidos. Para la especie equina es aún
limitado el uso de semen criopreservado, debido a una considerable
reducción post-descongelación de su capacidad fecundante respecto al
semen fresco (Usuga A. et, al. 2014).
Actualmente la criopreservación seminal equina se realiza mediante el
uso de nitrógeno líquido (NL). Las ventajas de usar semen congelado
para ser utilizado en IA son: disminución de los costos de transporte
(más barato es trasladar un contenedor de NL que un semental); menor
estrés y costo de transporte de la yegua. Cuando se utiliza NL, se logran
temperaturas de -196°C, donde no hay reacciones bioquímicas dentro
de la célula y no se ha comprobado que pueda haber cambios de índole
genético. Los principales daños que se generan cuando se congelan
células son la formación de cristales de hielo intracelular y la
descompensación de electrolitos y solutos (Prado Acuña J.P. 2011).
La composición de los diluyentes para la criopreservación del semen
equino es determinante en la criotolerancia y la capacidad fecundante
post-descongelación de las células espermáticas. Se han explorado
numerosas alternativas para mejorar la fertilidad del semen equino
criopreservado. Se han evaluado crioprotectores alternativos como el
glicerol, el etilenglicol u otras moléculas que por su bajo peso molecular
penetran con mayor facilidad las membranas y, por lo tanto, poseen
menor toxicidad osmótica, como la metilformamida (MF) y la
dimetilformamida (DMF). Asimismo, se ha estudiado la suplementación
de los diluyentes con sustancias proteicas que actúan como
crioprotectores extracelulares, tales como la yema de huevo, la
albúmina sérica bovina, el suero equino, el suero bovino, la proteína de
soya, el alcohol polivinílico y la leche descremada ultra-pasteurizada
(Usuga A. et, al. 2014).
Tradicionalmente, la evaluación del semen se ha basado en el trabajo
manual de personas que, debido a su capacitación y su experiencia, han
obtenido resultados prácticos y satisfactorios. Con el fin de predecir la
fertilidad del semen equino, el análisis de rutina es basado en la
evaluación macroscópica-física del eyaculado y en la evaluación por
microscopía de los espermatozoides; sin embargo, el análisis
convencional ha sido poco efectivo en la predicción de la fertilidad del
semen. El análisis de semen asistido por computador (CASA) ha
permitido una medición objetiva de muchos parámetros de la movilidad
y la morfología de semen, ofreciendo mediciones más confiables,
imparciales y repetibles, respecto al examen visual, pero la aplicación
práctica del sistema CASA, como parte del mejoramiento en la calidad
de los análisis del semen del caballo, se ha visto limitada por aspectos,
como la carencia de valores estándar definidos, para lo que es normal y
anormal en el movimiento del espermatozoide, al uso de referentes
seleccionados sin criterios estadísticos (Restrepo G. et, al. 2013).
Es conocido que los procedimientos de congelación y descongelación
inducen una serie de efectos nocivos en las células espermáticas y
consecuentemente una baja tasa de preñez. En equinos, se ha
demostrado que en la etapa de post-descongelación es importante
utilizar procedimientos de selección de espermatozoides que permitan
recuperar una población espermática altamente funcional y condiciones
indispensables para lograr tasas óptimas de concepción (Cabrera P. et,
al. 2014).
Tanto la refrigeración como el almacenamiento de semen en NL, pueden
generar daños irreversibles en la membrana plasmática, causando ya
sea muerte celular o cambios parecidos a los que se ven durante la
capacitación espermática, que dificultan o impiden su capacidad para
interactuar con el ovocito (Prado Acuña J.P. 2011).
METODOLOGIA
La práctica de criopreservacion se realizó el 14 de octubre del 2016 en el
Politécnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid sede bello, ubicado en el
barrio cabañas. Donde se tomaron los parámetros necesarios para la
criopreservacion del semen equino.
En primer lugar se realizó la colecta del semen en una especie asnal
llamado cachirulo, campeón nacional (Ver foto 1). Esta colecta tuvo lugar
en la finca la primavera, vereda el cabildo, municipio de Girardota donde
se desarrolló la colecta por medio de vagina artificial, no se maneja
electroyaculador, mano enguantada como se observada en las otras
especies recolectadas anteriormente. Funcionalmente es más fácil la
colecta y el animal está acostumbrado a la misma.
FOTO #1. Asno criollo cachirulo, campeon nacional.
Se empezó adecuando la vagina artificial con agua a una temperatura
de 40°C, se instaló un filtro y una bolsa donde llega el eyaculado (Ver
foto 2). También se realizó el lavado y secado del pene con agua tibia
para evitar contaminación en la colecta del semen, contiguo se dispuso
a la yegua amarrada y con la cola vendada para evitar lastimar el pene
del asno a la hora de la monta. (Ver foto 3)

FOTO #2. Vagina artificial
FOTO #3. Asno desarrollando el proceso de recolección seminal
Obtenido el volumen final se analizaron las características
macroscópicas del eyaculado (Ver foto 4) y se ejecutaron dos procesos,
el primero fue una pajilla para un envío donde se agregó diluyente
equipro, con una concentración mínima de 500 millones de
espermatozoides teniendo en cuenta que la temperatura del diluyente
debía de ser igual a la temperatura del semen. Terminado el proceso se
empaco en una nevera de icopor para su posterior viaje.

FOTO #4. Semen en fresco observado en el microscopio durante la
colecta en campo
El segundo proceso fue el transporte del semen para desarrollar la
criopreservacion, en dispositivo utilizado para el transporte de semen
equino llamado equitainer a una temperatura de 8-10°C para su
siguiente proceso. Estando en el laboratorio, se realizan las pruebas
microscópicas del eyaculado, como movilidad, vitalidad, morfología,
integridad de membrana. Luego se realizaron cálculos para que cada
muestra tuviera la concentración necesaria de 10 pajillas y se centrifugo
a 3000 rpm durante un periodo de 30 minutos para separar los
espermatozoides del diluyente de conservación (Ver foto 5).

FOTO #5. Semen centrifugado durante 30 minutos a 3000 rpm
Posteriormente se agregó el diluyente de conservación (yema de huevo
5%, DMF 5%, diluyente base 90%) y se llevó a la máquina de empaque y
sellado de pajillas con un volumen de 0.5 ml. Terminado este proceso se
revisaron las pajillas obtenidas, ya que algunas no llenaron y otras
quedaron mal selladas (Ver foto 6).

FOTO #6. Máquina de empaque y sellado de pajillas
Teniendo las pajillas, se desarrolla la congelación mediante dos métodos.
El primero fue una congelación rápida con vapores de nitrógeno en el
cual se utilizó una nevera de icopor con un poco de nitrógeno, donde se
introdujeron las pajillas con una base metálica para evitar directamente
el contacto con el líquido. Después de empezado este método, durante
periodos de 5 minutos se destapaba la nevera y se soplaban los vapores.
El segundo método fue un congelador programable marca Crysalys, un
instrumento que nos permite bajar la temperatura del semen de una
manera controlada evitando un cambio brusco del semen, el cual nos
puede afectar (Ver foto 7). Por último se llevó a un contenedor para
conservación de semen y se deja el tiempo necesario hasta su
utilización (Ver foto 8).

FOTO #7. Congelador programable marca Crysalys.
FOTO #8. Contenedor para la congelación de semen.
Para la descongelación se pararon las pajillas a un baño María por un
tiempo de 1 minuto, y se realizaron pruebas microscopias de pos-
congelación, morfología y movilidad.
RESULTADOS
1. resultados del análisis arrojado por el sistema CASA del semen fresco.

Animal: , Cachirulo
Especie: Asnal
Referencia: 0360
Fecha (día/mes/año): 14/10/2016
Centro: Laboratorio de Biotecnología Animal

Orden (14/10/2016 10:45:45a.m.)

Concentración
104,22 M/mL 260,55 M/muestra Volumen ( mL): 2, 50

Concentración
Total Porcentaje (%)
M/mL M/muestra
Móviles 779 87,33 91,02 227,54

Concentració
Progresividad Total Porcentaje (%) n
M/muestra
M/mL
Progresivos (PR) 592 66,37 69,17 172,92
No progresivos (NP) 187 20,96 21,85 54,62
Inmóviles (IM) 113 12,67 13,20 33,01

Concentració
Velocidad Total Porcentaje (%) n
M/muestra
M/mL
Rápidos 560 62,78 65,43 163,58
Medios 119 13,34 13,90 34,76
Lentos 100 11,21 11,68 29,21
Inmóviles (IM) 113 12,67 13,20 33,01

Concentració
Velocidad y progresividad Total Porcentaje (%) n
M/muestra
M/mL
Rápido progresivo 101 11,32 11,80 29,50
Medio progresivo 491 55,04 57,37 143,42
No progresivo 187 20,96 21,85 54,62
Inmóvil 113 12,67 13,20 33,01
12,67% 12,67% 12,67%
Velocidad y progresividad
11,32%
20,96% 11,21% 20,96%

66,37% 13,34% 62,78% 55,04%

Progresivos (PR) Rápidos Rápido progresivo

No progresivos (NP) Medios Medio progresivo
Inmóviles (IM) Lentos No progresivo

Inmóviles (IM) Inmóvil

Progresividad Velocidad

Media Inmóviles (IM) Lentos Medios Rápidos Unidades
Área de la cabeza 28,76 29,36 28,20 26,37 29,23 mm2

Media de velocidad Media Lentos Medios Rápidos Unidades
Velocidad curvilínea (VCL) 141,93 32,50 62,74 178,88 mm/s

Velocidad lineal (VSL) 53,33 11,92 25,49 66,94 mm/s
Velocidad media (VAP) 112,44 20,06 45,02 143,87 mm/s
Índice de linealidad (LIN) 37,57 36,69 40,62 37,42 %
Índice de rectitud (STR) 47,43 59,45 56,62 46,53 %
Índice de oscilación 79,22 61,71 71,75 80,43 %

Media de otros parámetros Media Medios Rápido Unidades
progresivo
Amplitud lateral de la cabeza (ALH) 3,96 2,66 4,36 mm
Frecuencia de batida (BCF) 6,13 6,03 6,11 Hz

Total Porcentaje M/mL M/muestra
(%)
Hiperactividad 163 18,27 19,04 47,61
Comentarios:
Analista: INVESTIGACION ANIMAL, GRUPO
Total Concentración
Porcentaje
Células redondas 0,98 M/mL

Recorridos circulares 548 61 ,43 %

2. resultados del análisis arrojado por el sistema CASA del semen post descongelación.
Animal: , Cachirulo
Especie: Asnal
Referencia: 0360
Fecha (día/mes/año): 14/10/2016
Centro: Laboratorio de Biotecnología Animal

Orden (14/10/2016 02:08:56p.m.)

Concentración
41,54 M/Ml 103,86 M/muestra Volumen ( mL): 2, 50

Concentración
Total Porcentaje (%)
M/mL M/muestra
Móviles 542 60,83 25,27 63,18

Concentració
Progresividad Total Porcentaje (%) n
M/muestra
M/mL
Progresivos (PR) 320 35,91 14,92 37,30
No progresivos (NP) 222 24,92 10,35 25,88
Inmóviles (IM) 349 39,17 16,27 40,68

Concentració
Velocidad Total Porcentaje (%) n
M/muestra
M/mL
Rápidos 263 29,52 12,26 30,66
Medios 98 11,00 4,57 11 , 42
Lentos 181 20,31 8,44 21,10
Inmóviles (IM) 349 39,17 16,27 40,68

Concentració
Velocidad y progresividad Total Porcentaje (%) n
M/muestra
M/mL
Rápido progresivo 182 20,43 8,49 21,22
Medio progresivo 138 15,49 6,43 16,09
No progresivo 222 24,92 10,35 25,88
Inmóvil 349 39,17 16,27 40,68
Concentración
Células redondas 2,15 M/mL

39,17% 35,91% 39,17% 29,52% 39,17%
Velocidad y progresividad
20,43%

15,49%
24,92% 20,31% 11,00% 24,92%

Progresivos (PR) Rápidos Rápido progresivo
No progresivos (NP) Medios Medio progresivo
Inmóviles (IM) Lentos No progresivo
Inmóviles (IM) Inmóvil
Progresividad Velocidad

Total Porcentaje (%
Recorridos circulares 233 26 ,15 %

Media Inmóviles (IM) Lentos Medios Rápidos Unidades
Área de la cabeza 27,38 29,24 26,87 26,82 26,88 mm2

Media de velocidad Media Lentos Medios Rápidos Unidades
Velocidad curvilínea (VCL) 92,13 29,41 66,62 142,34 mm/s
Velocidad lineal (VSL) 60,38 10,41 39,18 99,87 mm/s
Velocidad media (VAP) 78,30 17,60 51,98 126,91 mm/s
Índice de linealidad (LIN) 65,54 35,40 58,80 70,16 %
Índice de rectitud (STR) 77,11 59,16 75,36 78,69 %
Índice de oscilación 84,99 59,84 78,03 89,16 %

Media de otros parámetros Media Medios Rápido Unidades
progresivo
Amplitud lateral de la cabeza (ALH) 2,60 2,10 2,76 mm
Frecuencia de batida (BCF) 7,78 6,52 8,23 Hz

Total Porcentaje M/mL M/muestra
(%)
Hiperactividad 95 10,66 4,43 11 , 07

Comentarios:
Analista: INVESTIGACION ANIMAL, GRUPO
La relación de los resultados de las evaluaciones del seminal en fresco y
post descongelación no mostró significantes diferencias, solo una
diferencia del 27% en movilidad y un 30% en vitalidad (aun así son
resultados ampliamente óptimos para su utilización).

DISCUSIÓN
Se encuentran resultados muy similares a los de miró et al (2009) en su
evaluación de los efectos de dilución y centrifugación en la vitalidad y la
estructura de motilidad en semen congelado de burro catalán por medio
del software de análisis SAS statical package reporto movilidades de
semen hasta del 72% 24 horas después y 42% 72 horas después del
tratamiento de centrifugación y dilución. Brinsko et al informó
centrifugación y la eliminación parcial de plasma seminal que es
beneficioso en el almacenamiento refrigerado de semen de caballo,
especialmente para eyaculados con mala refrigeración y la tolerancia de
almacenamiento. Llevándolo a colación con los resultados de este
estudio muestra que la vitalidad de los espermatozoides del burro
colectado después de almacenamiento es mayor cuando es diluida o
cuando el plasma seminal es parcialmente eliminado por centrifugación.
Montoya et al (2016). Estudio la congelación de semen de asnos criollos
colombianos de 5 distintos predios dedicados a la cría de asnos criollos
colombianos, un total de 5 animales y un total de 10 muestras de
eyaculado recogidos por animal. Analizados por medio del sistema
CASA. Doy una movilidad mayor en este caso de 92%, una vitalidad del
88% y una integridad altamente superior de 63%.

Toscano et al (2014). Realizo evaluaciones de congelación de semen de
burro mexicano, caracterizando mejores resultados en dilución con
equipro centrifugado, dando resultados semejantes, en fresco con
vitalidad y movilidad progresiva de 76% y post descongelación una
vitalidad del 67% y movilidad del 35%. Rota et al (2008) indicaron que la
remoción del plasma seminal en burros Amiata, durante la
criopreservación no parece ofrecer ninguna ventaja sobre el uso del
semen diluido, lo que concuerda con los resultados del presente trabajo.
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA.
 Alexandra Usuga Suarez, Juan David Montoya Páez, Álvaro David
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Evaluación de dos diluyentes para la criopreservación de semen
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Scielo.org Base de datos.

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