You are on page 1of 6

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan
Berdasarkan praktikum Isolasi DNA Plasmid yang telah dilakukan,
diperoleh hasil pengamatan sebagai berikut:
NO PERLAKUAN HASIL
1 Meresuspensi Pelet dengan solution I Suspensi pelet
2 Menambahkan solution II, dihomogenkan, Suspensi pelet
diiamkankan 5 menit, dan tidak di vorteks
3 Menambahkan solution III, dihomogenkan, Campuran suspensi pelet
dan disimpan di ice box selama 5 menit
4 Campuran tersebut disentrifugasi 12000 rpm Supernatan yang jernih
selama 5 menit
5 Supernatan dipindahkan ke tabung 0,3 ml supernatan
mikrosentrifugasi yang baru
6 Menambahkan PCI sebanyak volume 2 lapisan cairan (kuning di
supernatan, lalu divorteks 3 menit bawah dan putih di atas)
7 Lapisan atas diambil dan dimasukkan ke Supernatan dan pelet
tabung baru dan diperoleh 0,25 ml, lalu
ditambahkan dengan etanol p.a dan 3 M Na
asetat dengan perbandingan 2,5 : 0,1,
diamkan 30 menit lalu disentrifugasi
8 Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan Etanol dan lapisan pelet
etanol 70% lalu disentrifugasi
9 Etanol dibuang, tabung mikrosentrifugasi Pelet
ditutup dengan kertas parafilm yang
dilubangi. Tabung dimasukkan ke desicator
vacum untuk dikeringkan
10 Diresuspensi dalam buffer TE dan disimpan Suspensi pelet untuk
dalam suhu 4oC praktikum selanjutnya

4.2. Perhitungan Etanol p.a dan Na Asetat

2,5
Etanol p.a = 2,6 x 200 µL = 192,307 µL

692 µL 4. Escherichia coli dapat menghasilkan keturunan yang banyak dalam waktu singkat. Selain itu. 0.1 Na Asetat = 2.3 Pembahasan Praktikum yang berjudul “Isolasi DNA Plasmid” ini bertujuan untuk mengisolasi DNA plasmid dari bakteri Escherchia coli. Biakan Escherichia coli ini mengandung plasmid yang sudah disisipi gen kanamisin (golongan antibiotika bakterisidal aminoglikosida).. . Kanamisin aktif terhadap Neisseria sp. Prinsip yang digunakan adalah melakukan isolasi plasmid dengan sentrifugasi dan presipitasi. Kemudian ekstrak sel dipurifikasi sehingga dihasilkan pellet sel yang mengandung plasmid (Blackwell 1997).5 ml biakan bakteri (atau disama ratakan untuk ketiganya).5 ml yang kemudian akan dibagikan kedalam 3 buah tabung sentrifuge dan masing-masing tabung sentrifuge diberi 1. Bakteri yang digunakan adalah Escherichia coli pET 30 sedangkan media yang digunakan adalah media LB (Luria Bertani). Hal ini dilakukan dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan. Bakteri ini juga memiliki jumlah plasmid yang banyak. Bakteri yang digunakan untuk diambil plasmidnya adalah bakteri Escherchia coli dikarenakan bakteri ini mudah didapatkan. sedangkan biakan yang tidak mengandung gen kanamisin akan mati. aeruginosa.6 x 200 µL = 7. Kanamisin adalah suatu antibiotika makrolida yang memiliki aktivitas antimikroba untuk bakteri gram negatif yang aerob. Shigella. P. Biakan yang diperoleh dalam praktikum isolasi dan pemurnian DNA plasmid ini berjumlah 4. Langkah pertama untuk mendapatkan DNA plasmid adalah menumbuhkan sel-sel bakteri (house) dalam sebuah media. E. Secara garis besar prinsip yang digunakan dalam mengisolasi DNA plasmid adalah sama dengan isolasi DNA/RNA dari suatu sel. Nama plasmid yang digunakan adalah plasmid rekombinan pETads/ Pet 30 vektor. dan RNA. Biakan yang sudah mengandung DNA rekombinan berupa suatu gen yang menyandi kanamisin tersebut akan tetap hidup dalam media LB yang sudah ditambah kanamisin. DNA.coli.

Solution II terdiri atas NaOH 0. terutama indera pendengaran (tuli atau bunyi berdenging). Kanamisin mempengaruhi 30 S subunit ribosom yang menyebabkan mutasi dan mencegah translasi RNA. tentu akan mengganggu kehidupan sel inang (host) dan muncul sebagai efek samping yang toksik. sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. kemudian ditambahkan 100 µl SolutionI yang terdiri atas150 mM glukosa. dan 10 mM EDTA pH 8 dan meresuspensinya dengan cara memipet naik-turun beberapa kali hingga tersuspensi menjadi satu larutan (agak keruh). 25 mM Tris-Cl pH 8. Solution II digunakan untuk mengendapkan dinding sel bakteri. Isolasi DNA plasmid dapat dilakukan dengan menggunakan prosedur sebagai berikut. lisis dinding dan membran sel. kemudian terbentuk supernatan dan pelet. Tahap selanjutnya adalah menambahkan 200 µl Solution II ke dalam campuran larutan tadi kemudian tabung dibolak balik secara perlahan sebanyak 6- 8 kali dan didiamkan selama 5 menit (jangan divortex). Sifat kanamisin seperti ini dan bersifat kurang selektif hanya terhadap bakteri saja. yaitu: isolasi sel. EDTA dapat menghambat DNAse yang dapat mendenaturasi DNA sebagai pengkelat Mg2+ yang berperan merusak stabilitasmembran plasma sehingga membran plasma menjadi tidak stabil. Kemudian pelet dari ketiga tabung sentrifuge digabung menjadi satu tabung mikrosentrifuge. Tris-HCl juga berfungsi untuk menjaga pH larutan. purifikasi. Isolasi sel dilakukan dengan cara sentrifugasi pada 12000 rpm selama 2 menit. Solution I ini berfungsi untuk memecah dinding sel dan mensuspensikan pellet sampai larut. dan lain sebagainya. Selain itu. ekstraksi dalam larutan. SDS dalam larutan ini berfungsi untuk menghancurkan membrane sel dan mendenaturasi protein. sedangkan NaOH berfungsi untuk mendenaturasi DNA genomic dan mulai menghidrolisis . organ ginjal dan reaksi alergi. Sel dari bakteri Escherichia coli akan berada pada pelet sehingga supernatan harus dibuang. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar. dan presipitasi.2 M dan SDS 1% (dibuat baru).Proteus.

Setelah disentrifugasi. Pada percobaan ini diperoleh volume supernatan (lapisan atas dan bawah) sebanyak 0. menarik. Fenol/kloroform berfungsi untuk menghilangkan protein dan pengotor-pengotor lain dalam larutan.5 ml asam asetat glasial. Kemudian disimpan pada ice box selama 5 menit. etanol p. dan mempresipitasi protein sehingga fase air yang terpisah akan mengandung DNA (Sambrook & Russell 2006). Pada isolasi DNA kromosom tidak ditambahkan NaOH karena jika ditambahkan maka NaOH akan mendenaturasi DNA dan menghidrolisis RNA yang kita inginkan.1 . ditambahkan 150 µl Solution III ke dalam campuran larutan dan dihomogenkan dengan cara dibolak balik sebanyak 6-8 kali secara perlahan (jangan divortex). Setelah 5 menit. terlihat akibat dari penambahan fenol/kloroform. yaitu DNA plasmid berada pada lapisan atas. Pada percobaan ini diperoleh volume supernatan lapisan .30 ml. dan Na asetat. sehingga pada isolasi DNA kromosom tidak ditambahkan NaOH (Chang 2009). Metode dalam tahap ini memiliki perbedaan dengan isolasi pada DNA kromosom.5 : 0. buffer TE.a dan 3M Na asetat dengan perbandingan 2. adanya pembentukan KDS (kalium dodesisulfat) yang tidak larut menyebabkan SDS mudah terbuang. Penambahan Solution III juga berfungsi untuk mempertahankan pH agar DNA plasmid tidak rusak. 11.Supernatan dipindahkan. Na-asetat dengan pH 4. Supernatan yang diperoleh tidak berwarna.a. Kemudian supernatan yang jernih tersebut di pindahkan ke dalam tabung mikrosentrifuge yang baru dan ditambahkan campuran etanol p. Sentrifugasi kembali dilakukan setelah penambahan ketiga solution di atas sehingga diperoleh sedikit pelet dan supernatan. Sentrifugasi dilakukan selama 5 menit pada suhu 4°C dengan kecepatan 12000 rpm. Solution III berisi 60 ml 5M potasium asetat.RNA. Fenol/kloroform akan mengikat. Selain itu.5 ml aquadest serta ditambahkan PCI (phenol/chloroform/isoamilalkohol).8 akan mengakibatkan terjadinya renaturasi plasmid dan mengendapnya single strand DNA karena molekulnya yang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan kadar garam yang tinggi. dan ditambahkan dengan PCI (fenol/kloroform). menunjukkan bahwa brismolekul sudah terendapkan dengan sempurna sehingga tidak mencemari supernatan. 28.

Jika di dalam air. sedangkan pada pH basa dan konsentrasi garam rendah. maka ion-ion seperti kation Na+ akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif.a dan Na asetat. Setelah ditambahkan etanol p.5). gaya elektrostatik antara ion positif (Na+) dan negative (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air. Penambahan etanol absolut bertujuan untuk mengendapkan plasmid karena adanya perbedaan polaritas. Setelah itu etanol dibuang dan menutup tabung mikrosentrifuge dengan . Etanol absolut ditambahkan pada lapisan paling atas yang berisi DNA plasmid. Supernatan dibuang. supernatan tersebut didiamkan dalam freezer selama 1 jam untuk presipitasi. Metode lain yang biasa digunakan dalam deproteinase selain menggunakan fenol-klorofrom adalah metode pengikatan dengan silika. Air memiliki konstanta dielektrik yang tinggi. sehingga penambahan pelarut organic seperti etanol dapat menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi (Brown 2010).atas yang jernih sebesar 0. Prinsip pengendapan dengan menggunakan etanol absolute dingin. Garam chaotropik berfungsi untuk merusak jaringan ikatan hidrogen dalam air dan protein sehingga membuat protein-protein yang merupakan kotoran-kotoran pada DNA denaturasi atau lisis.25 ml sehingga etanol yang ditambahkan sebanyak 240 µl dan Na asetat 3M sebanyak 9. DNA akan diserap oleh silika.6 µl. Pada larutan asam (pH < 7. DNA secara efisien akan dipisahkan dari silika (Gregory & Funnell 2004). Tujuan penambahan etanol yaitu untuk membersihkan sisa-sisa larutan yang digunakan untuk mengendapkan plasmid sebelumnya sehingga diperoleh plasmid yang murni. yaitu pada saat penambahan garam yaitu Na-asetat yang berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA. Penambahan etanol absolut harus dilakukan pada keadaan dingin dengan tujuan agar banyak DNA plasmid yang mengendap. Prinsip kerja dari metode ekstraksi DNA dengan silika adalah menyerap DNA dengan menggunakan silika dan garam chaotropik. pelet yang diperoleh dicuci dengan 1 ml etanol 70 % kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit pada suhu 4°C dengan kecepatan 12000 rpm. kemudian disentrifugasi selama 1 menit pada suhu 4°C dengan kecepatan 12000 rpm.

Yogyakarta: Kanisius.kertas para film. 2004.176-177 2. Gregory Phillips G. Plasmid biology. 3. The Condensed Protocols From Molecular Cloning: A Laboratory Manual. ISBN 978-1-4051-8173-0.Hal. 4. ISBN 978-0- 632-03792-6. Funnell BE. Wiley-Blackwell. Kertas tersebut dilubangi dengan jarum dan memasukkan tabung kedalam desicator vacum untuk mengeringkan peletnya selama 10 menit. 2010. Sambrook. Washington: ASM Press. Brown Terry A. Kemudian diresuspensi dalam buffer TE dan disimpan pada suhu 4°C untuk analisis selanjutnya DAFTAR PUSTAKA 1. 35-36. Bioetika sebuah pengantar. 5. 1997. New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press. 2009. Chang W. Blackwell Wiley.1-6. Russell. Hal. . Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction. ISBN 978-1-55581-265-2. Route maps in gene technology. 2006.Hal.