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INVESTIGACIÓN DE LA BIO-REMOCIÓN DE HIDROCARBUROS POR LAS

BACTERIAS INDÍGENAS AISLADAS

SUELOS CRUDOS CONTAMINADOS

resumen

El presente estudio describe la capacidad de degradación de hidrocarburos de
dos cepas bacterianas aisladas de suelos contaminados con petróleo crudo. Se
aislaron dos cepas bacterianas nativas (Bs1 y Bs2) de suelos contaminados
alrededor de los depósitos de petróleo, Ahvaz, Irán. Se investigaron sus
capacidades para degradar diferentes hidrocarburos, incluyendo aceite de
oliva, petróleo crudo y alquitrán de hulla, utilizando la medición del carbono
orgánico total (TOC) suplementado como única fuente de carbono en el medio
mineral. Para identificar los aislamientos bacterianos, morfología y
características bioquímicas junto con 16S rDNA análisis fueron considerados.
Los resultados mostraron que la cepa Bs1 pudo consumir más del 34% de
alquitrán de hulla, 61% de crudo y 81% de aceite de oliva durante 14 días de
incubación. La capacidad de degradación de hidrocarburos de Bs _ {2} fue de
24, 39 y 68% en presencia de alquitrán de hulla, aceite crudo y aceite de oliva,
respectivamente, como única fuente de carbono. Además, su cultivo mixto de
dos aislamientos llevó a un aumento del 5% en su eficacia de biodegradación.
La posterior caracterización morfológica y bioquímica y los análisis
filogenéticos mostraron la estrecha relación de Bs1 y Bs2 (aproximadamente
98 y 99%) con las cepas de Pseudomonas aeruginosa de CMG581 y BM8,
respectivamente.

Introducción

La industria del petróleo es la columna vertebral de la economía de Irán, lo
reconoce como uno de los pocos países con una gran cantidad de depósitos
subterráneos de petróleo. Por lo tanto, las actividades relacionadas con la
exploración, refinación y transporte de petróleo dan lugar a derrames y
acumulación de grandes cantidades de petróleo crudo y otros contaminantes
del petróleo en los ambientes marinos y terrestres (Hassanshahian et al., 2012;
Zolfaghari Baghbaderani et al., 2012) . Además, las repercusiones
impredecibles de los contaminantes del petróleo, el impacto de estos desechos
peligrosos en la salud humana es complicado debido a su descomposición
incompleta a productos finales inofensivos, adquiriendo potenciales tóxicos y
carcinógenos (Sathishkumar et al., 2008).

Teniendo en cuenta el impacto perjudicial de los hidrocarburos del petróleo en
los aspectos vivos de los ecosistemas, una preocupación global ha aumentado
no sólo entre las organizaciones de protección ambiental, sino también entre la
población entera (Silva-Castro et al., 2013; Zolfaghari-Baghbaderani et al. ,
2012).

24 g / l). Xu y Obbard. Existe estructuralmente una gran diversidad entre los compuestos orgánicos. KCl (0.. 2007. 2009).01 g / l). La biorremediación se define como el uso de microorganismos para eliminar los contaminantes ambientales del agua y del suelo. Y oligoelementos (Monteiro et al. sólidos. incluyendo Bs1 y Bs2. tales como los alcanos lineales de cadena corta (conocidos como alifáticos) hasta los más complejos y menos degradables con uno o más anillos cíclicos (aromáticos) como cicloalcanos. 2011). desde las formas más fácilmente degradables. se han demostrado las interacciones sinérgicas entre los miembros de las asociaciones de micro-flora y se ha favorecido sobre los cultivos puros en la estrategia de bioaumentación (Alvarez et al. Na _ {2} HPO _ {4} (0.05 g / l). compuesto por diferentes aceites. benceno. 2012).01 g / l).01 g / l). En cuanto a la estructura muy compleja de algunos constituyentes de lodos aceitosos. hidrocarburos aromáticos policíclicos (Bamforth y Singleton. Alemania Fueron explotados para el enriquecimiento bacteriano respectivo y las etapas experimentales. 2011. MgSO _ {4} (0. Domde et al. El presente trabajo tiene como objetivo estudiar la capacidad de degradación de los dos aislamientos más eficientes. grasas. en la parte superior. 2004).95 g / l). El medio mineral constaba de los siguientes constituyentes: NH4Cl (1. Materiales y métodos Medio cultural Agar nutriente (Oxoid) y composiciones de medios minerales de Merck. a través de la degradación completa de diferentes hidrocarburos en dióxido de carbono y agua o la conversión de ellos en subproductos inofensivos.. 2005. . tolueno .. que fueron investigados en inoculación pura y en mezcla con medios minerales suplementados con diferentes hidrocarburos orgánicos. Maqbool Et al. con un efecto de apoyo o de otro modo sobre la microflora local.Este número insta a las empresas industriales asociadas al petróleo a desarrollar tecnologías limpias y estrategias ecológicas que destacan la biorremediación. Sin embargo. se señala que las áreas contaminadas con aceite contienen una amplia variedad de compuestos estructuralmente diferentes. Calcio Cloruro de CaCl _ {2} (0. fenoles y. NaCl (0. Xilenos.85 g / l). FeSO _ {4} (0. compuestos orgánicos y metales.. El lodo aceitoso es un residuo recalcitrante muy complicado. dependiendo de sus concentraciones individuales y naturaleza (Das y Chandran.

Después de la sedimentación de los suelos. Para aislar la comunidad bacteriana.1} a 10 ^ {. Las colonias aparecidas en placas de agar se ensayaron para poseer capacidad de degradación de hidrocarburos mediante cultivo en 100 ml de medio mineral suplementado con 500 mg de alquitrán de crudo o de carbón como único carbono y fuente de energía. se consideran para los experimentos bacterianos. se mezclaron 10 g de muestras de suelo con 100 ml de agua destilada aséptica en matraces de 250 ml y después se agitaron a 100 rpm durante 10 min. se añadieron a los matraces 1 ml de cada aislado. los sobrenadantes se diluyeron en serie de 10 ^ {. Todas las placas. Simultáneamente. se incubaron a 32 ° C durante 72 h. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Y se transfirieron al laboratorio en botellas estériles. al sur de Irán. pH 8 y agitación orbital a 100 rpm durante un período de incubación de dos semanas. Brevemente.3 M) sometiéndose en el baño de agua a aproximadamente 60 ° C durante 90 minutos. separadamente y ambos como co-cultivo con la turbidez de 0. Los sedimentos celulares se volvieron a suspender en 1 ml de agua destilada y se digirieron con NaOH (0. pero sin inóculo inicial. El control preparado con las mismas condiciones. todos los matraces se incubaron a 32 ° C durante dos semanas en un agitador orbital con 100 rpm. Crecimiento de la biomasa y medición de la reducción del sustrato El ensayo de proteína total se empleó como indicador de crecimiento bacteriano a través del método de proteína Bradford cada dos días durante el período de incubación. Posteriormente.Recolección de muestras y aislamiento bacteriano Las muestras de lodo oleoso y de suelo se recolectaron de los sitios de exploración de petróleo en áreas desérticas alrededor de Ahvaz. Finalmente. se centrifugaron 1 ml de las muestras a 10000 rpm durante 10 min. Optimización de la eficiencia de biodegradación Para ensayar la biodegradabilidad de los respectivos hidrocarburos de alquitrán de hulla. la absorbancia espectrofotométrica para cada muestra se registró a 595 NM.10}.5 McFarland (1. De cada dilución en serie. La tasa de consumo de hidrocarburos para cada colonia individual o cultivo mixto se midió usando el ensayo de carbono orgánico total según Walkley y Black (1934) con pequeñas . se colocaron 100 μl en placas de agar nutritivo mediante una varilla de vidrio en forma de L. a continuación. se prepararon 100 ml de medio mineral en matraces de 250 ml que contenían 500 mg de cada hidrocarburo.5 x 108 células / ml) como inóculos iniciales. aceite crudo y aceite de oliva. Las condiciones de cultivo para la primera etapa se ajustaron como temperatura 32ºC. Se determinó el contenido de proteína total a través de la comparación de la curva estándar preparada con albúmina de suero bovino.

KCl 50 mM). su 16S rDNA secuencias de alineaciones con referencia . Alemania).ncbi. 1994). El programa de amplificación se fijó durante 30 ciclos. Los fragmentos de ADN se secuenciaron mediante un secuenciador (SEQLAB. Además.8. Resultados y discusión Identificación bacteriana Entre 6 colonias aisladas como bacterias biodegradables de aceite se seleccionaron dos colonias que tienen una biodegradabilidad de alto potencial para estudios adicionales. se compararon todas las secuencias con secuencias de referencia de las bases de datos NCBI (http://WWW. luego con la adición de solución ferrosa 0. un recocido a 50 oC durante 10 seg y un paso de extensión a 60 oC durante 4 min. 5 μl de tampón Taq (TAPS. En este orden.nih. 5 Μl de mezcla de dNTP 2 mM y 5 μl de cada cebador (10 μM / μl). De hecho. pH 8. que corresponde a las del género Pseudomonas. 1 μl (3 unidades) de ADN polimerasa Taq. Phylogenetic identificación se realizó mediante 16S rDNA análisis. que representa el hidrocarburo restado en los medios líquidos de células libres. el catabolismo de carbono orgánico se evaluó indirectamente monitorizando la reducción del carbono orgánico total en los sobrenadantes simultáneamente con el ensayo de proteína total.nlm. Phylogenetic análisis se realizó utilizando MEGA software de la versión 4 y la relación genética se mostró en base a la 16S rDNA secuencia de genes de vecinos de unión árbol con bootstrap valor de 1000 de replicación. La mezcla de amplificación por PCR de 16 μl contenía el ADN bacteriano (de aproximadamente 200 ng).gov/Genbank) usando el software Blast.AGGAGGTGATCCAGCC-3'). el ADN genómico se extrajo a través del fenol / cloroformo / alcohol isoamílico de acuerdo con Sambrook et al.. MgCl2 3 mM.5 M (como agente de titulación ) Y ferrozina (como indicador) se determinó indirectamente la cantidad de dicromato de potasio sin reaccionar. El ensayo se modificó a medida que el contenido restante de carbono.modificaciones. (2001). seguido de un paso de extensión final a 72 oC durante 5 min. Cada uno consistía en una desnaturalización a 96 oC durante 10 s. los productos de PCR se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se visualizaron usando bromuro de etidio. Identificación de las colonias que degradan el aceite La caracterización morfológica y bioquímica se determinó con referencia al manual de bacteriología determinante de Bergey (Holt et al. Finalmente. Las características morfológicas y bioquímicas de dos aislamientos se resumen en la pestaña 1. se oxidó con una cierta cantidad de dicromato de potasio concomitante de ácido sulfúrico al 98%. El fragmento del gen rDNA 16S se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con un conjunto de cebador universal que incluía Fd1 (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ') y Rd1 (5'. Posteriormente.

bioquímico y fisiológico de bacterias aisladas de áreas contaminadas con aceite . las cepas Bs1 y Bs2 presentaron una similitud del 98% con la cepa CMG581 y BM8 de P. aeruginosa y con nuestras respectivas cepas bacterianas correspondientes (Bs1 y Bs2). Como se muestra en la Figura 1. Tabla 1 Análisis morfológico.secuencias presentes en NCBI indicó su estrecha relación con Pseudomonas aeruginosa.