PACs

Para superar algunos de los problemas asociados con el uso de sistemas cósmidos o
YAC, se ha desarrollado un método para clonar y empaquetar fragmentos de ADN usando
un sistema bacteriófago P1 que ofrece la capacidad de clonar grandes fragmentos de
ADN genómico de entre 70 y 95 kpb de tamaño. El bacteriófago P1 tiene un genoma
mucho mayor que el fago λ (en el intervalo de 110-115 kbp), y se han diseñado vectores
con los componentes de replicación esenciales de P1 incorporados en un plásmido
(Ioannou et al., 1994). Al infectar E. coli, el bacteriófago P1 puede expresar sus funciones
líticas, producir 100-200 nuevas partículas de bacteriófago y lisar la bacteria infectada, o
el bacteriófago infectante puede reprimir sus funciones líticas, y el genoma del
bacteriófago se mantiene como un gran, estable, Plásmido de baja copia. El fago P1 tiene
dos orígenes de replicación: uno para controlar la replicación del ADN lítico y el otro para
mantener el plásmido durante el crecimiento no lítico. Durante el ciclo lítico, se produce
nuevo ADN de fago y se escinde en un sitio pac antes de la inserción en partículas de
fago.
La clonación de fragmentos de ADN extraños en un vector P1, o cromosoma artificial P1
(PAC), se muestra en la figura 3.19. El vector PAC se digiere con las enzimas de
restricción ScaI y BamHI para generar dos brazos vectoriales: un brazo corto y un brazo
largo. El ADN genómico se digiere parcialmente con MboI (secuencia de reconocimiento 5
\ alpha - GTAC - 3 \ alpha, que da lugar a los extremos de la etiqueta compatibles con
BamHI) y se selecciona en un gradiente de sacarosa. Se aislan fragmentos entre 70 y 95
kb de longitud y se ligan entre los brazos vectoriales para generar una serie de moléculas
lineales. Si la ligadura se produce entre dos brazos cortos, la molécula resultante no
contendrá ni los orígenes de replicación P1 ni el gen KANR, y será no viable. Si ambos
brazos son largos no habrá sitio de pac y no habrá empaquetado en los cabezales del
fago. La única combinación que se obtendrá será la de la secuencia de insectos flota- da
tanto por un brazo corto como por un brazo largo.
Phage P1 utiliza una estrategia de empaquetamiento 'full-head' y puede acomodar una
longitud de DNA total de aproximadamente 110-115 kbp. Esto significa que cualquier
inserto de más de 95-100 kpb dará como resultado el truncamiento del ADN envasado
antes de que ambos sitios loxP se inserten en el fago y la molécula no pueda circularizar
tras la transfección en el huésped. Una vez inyectada en la célula huésped cre + E. coli, la
proteína Cre circulariza el ADN en los sitios loxP y el ADN se replica usando el origen de
replicación del plásmido. El sitio de enzima de restricción BamHI del vector original, en el
que se insertó el ADN extraño, se encuentra dentro del gen sacB bacteriano (que codifica
la levansacarasa). La expresión de este gen es tóxica para células de E. coli que crecen
en sacarosa. Por lo tanto, el crecimiento de sacarosa proporciona un mecanismo de
selección positiva para aquellos PAC que contienen insertos. La propagación de las
células de E. coli que albergan las colonias recombinantes de PAAC en la que se obtiene
la glucosa, genera colonias de colonias con insertos de ADN.
Clonación en un vector PAC. El vector PAC contiene el plásmido de bacteriófago P1 y los
replicones líticos, junto con un sitio de escisión de pac para permitir el ensamblaje del
ADN en las partículas de fago. Además, el vector contiene el gen de resistencia a la
replicación (ori) y de ampicilina pUC para la propagación y selección del propio vector.
Estas secuencias se pierden en el PAC recombinante. Los insertos de ADN grandes se
clonan en el gen del saco B (cuya función se puede seleccionar contra) y se envasan in

1992). El número de copias del plásmido puede incrementarse más de 25 veces mediante la inducción de β-D- tiogalactopiranosido de isopropilo (IPTG) de un replicón lítico P1 de alta copia controlado por promotor lac que está presente dentro del PAC recombinante (Pierce et al. coli usando la resistencia a la kanamicina como marcador de selección. Utilizando el sistema de empaquetamiento de ADN P1.. La transfección de las partículas de fago P1 en una célula de E. Los PACs recombinantes se mantienen como plásmidos dentro de E. el ADN genómico de 70 a 95 kb puede ser fácilmente clonado y manipulado. Las moléculas de ADN recombinante se aíslan entonces como plásmidos usando métodos tradicionales.vitro en partículas de fago P1. La forma circular se mantiene entonces a bajo número de copias usando el replicón de plásmido P1. . coli que alberga una copia de la recombinasa Cre resultará en la circularización del PAC recombinante en los sitios lox P. Las mejoras en el diseño de vectores han permitido la producción de PAC que pueden acomodar insertos de 130-150 kbp. • no se produce reordenamiento o deleción de ADN metilado debido al uso de cepas huésped de restricción-menos y • El ADN recombinante se recupera fácilmente como plásmidos para su posterior cribado y manipulación. Las principales ventajas del método de envasado de ADN P1 sobre otros métodos de clonación genómica son • el gran tamaño de los fragmentos de ADN que pueden insertarse en los vectores.