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Journal of Bacteriology, 1969 de septiembre, p. 720-729
Copyright © 1969 Sociedad Americana de Microbiología
Complejo Nitrato Reductasa de Escherichia coli K-12:
Participación de formiato deshidrogenasa específica
y citocromo b, componentes en nitrato reducción.
JOSE RUIZ-HERRERA' AND J. A. DEMOSS Department ofBiology, University of California, San
Diego, La Jolla, California 92037 Received for publication 9 June 1969.

Se estudió la participación de distintas deshidrogenasas de formiato y componentes del citocromo en la
reducción de nitratos por Escherichia coli. La actividad de formiato deshidrogenasa presente en extractos
preparados a partir de células inducidas por nitrato de la cepa HfrH fue activa con varios aceptores de
electrones, incluyendo azul de metileno, metosulfato de fenazina y viroleno de bencilo. Ciertos mutantes que
son incapaces de reducir el nitrato tenían niveles bajos o indetectables de actividad de formiato
deshidrogenasa ensayados con azul de metileno o metosulfato de fenazina como aceptor de electrones. De
nueve de estos mutantes, cinco produjeron gas cuando se crecieron anaerobicamente sin nitrato y poseían una
actividad de formiato deshidrogenasa ligada a vitileno de bencilo, lo que sugiere que distintas
deshidrogenasas de formiato participan en los sistemas de nitrato reductasa y dimérica.
Los otros cuatro mutantes formaron poco gas cuando se crecieron anaerobicamente en ausencia de nitrato y
carecían de la decil-formiato deshidrogenasa ligada a viroleno de bencilo así como la actividad unida al azul
de metileno o al metosulfato de fenazina. El citocromo b1 presentin nitrato inducida por las células se
distingue por sus propiedades espectrales y su control genético de los principales componentes del citocromo
b1 de las células aeróbicas y de las células cultivadas anaerobically en ausencia de nitrato. El citocromo bk
específico de nitrato se redujo completa y rápidamente en 1 mm de formiato pero no se redujo en 1 mm de
nicotinamida adenina dinucleótido reducido; El ascorbato redujo sólo una parte del citocromo b1 que se
redujo por formiato. Cuando se añadió nitrato, el citocromo b1, reducido en formiato, se oxidó con cinética
bifásica, pero el citocromo bk reducido en ascorbato se oxidó con cinética monofásica. Los efectos
inhibitorios del N-óxido de n-heptil hidroxiquinolina sobre la oxidación del citocromo b1 por nitrato
proporcionaron evidencia de que el citocromo específico del nitrato está compuesto de dos componentes que
tienen potenciales redox diferentes pero propiedades espectrales idénticas. Concluimos de estos estudios que
la reducción de nitratos en E. coli está mediada por la operación secuencial de una deshidrogenasa de
formiato específica, dos citocromos específicos b, componentes y nitrato reductasa.

Un número de observaciones indican que la cuestiones importantes sobre la relación de esta vía
reducción de nitrato en Escherichia coli se produce con otras vías de transporte de electrones
principalmente por una vía que implica la En E. coli. La formamida deshidrogenasa debe ser
deshidrogenasa formiato, el citocromo bl y la nitrato también un componente del sistema de
reductasa. Entre los diversos sustratos que son hidrogenidasa (15), así como de la formiato oxidasa.
metabolizados por E. coli, el formiato es el donador Estas funciones múltiples de la deshidrogenasa
de electrones más efectivo para la reducción de formiato han sido previamente reconocidas, y se ha
nitrato en células cultivadas anaerobicamente en sugerido que al menos dos formaciones distintas de
presencia de nitrato (2, 23). deshidrogenasas, en forma de partículas y solubles,
En tales células, se induce la formate están formadas por E. coli (4, 5).
deshidrogenasa, el citocromo b1 y la nitrato La participación del citocromo b en la reducción del
reductasa a niveles relativamente altos en nitrato crea una situación aún más compleja, ya que
comparación con los de las células cultivadas en el citocromo b1 es uno de los principales
ausencia de nitrato (2, 17, 23). Estos tres citocromos presentes en las células aeróbicas y
componentes están presentes en las fracciones de anaerobias de E. coli y por lo tanto debe funcionar
membrana (6) y han sido parcialmente purificados en otros sistemas de transporte de electrones (3, 10,
como una unidad a partir de extractos celulares (8). 18). En la actualidad no se conoce si el citocromo
Finalmente, los mutantes de E. coli que son B1 componentes están involucrados en diferentes
incapaces de producir nitrito a partir de nitrato vías de electrones o en qué grado interactúan tales
(mutantes NR7) carecen de formiato vías.
Deshidrogenasa o nitrato reductasa o combinaciones Para definir los componentes del complejo de
de estas actividades y el citocromo b (1, 16, 17, 22). nitrato reductasa y su relación con otras vías
La propuesta de que formiato deshidrogenasa y metabólicas, se estudiaron los eventos bioquímicos
citocromo bi son componentes específicos del involucrados en la reducción de nitratos en el E. coli
sistema de reducción de nitrato plantea algunas de tipo salvaje y en un número de mutantes NR.

se lavaron dos veces con tampón monocromador de rejilla Bausch & Lomb. o mediante el siguiente A temperatura ambiente. 37ºC en un baño de agua con agitación. 140 umoles proteína. los Las cepas de E. y el otro se redujo con ditionito sódico inclinar el formiato en el compartimiento principal. HfrH resultados se expresaron cualitativamente. Warburg. evolucionado por minuto por miligramo de proteína. La cinética de reducción y oxidación del citocromo b1 se siguió con un espectrofotómetro de .8 ó 7. Los determinaron con un espectrofotómetro de cultivos se inocularon con un 2 a 5% de inóculo de grabación de haz simple construido y amablemente un cultivo durante la noche cultivado en medio disponible por Warren Butler en la Universidad de similar y se dejó crecer hasta el centro de la fase California en San Diego.4% y glucosa al 1% evaluó observando la acumulación de gas en viales (esterilizada por separado). Para la un ensayo espectrofotométrico descrito medición de la reducción absoluta anteriormente (17). específica de deshidrogenasa. se siguió el mismo procedimiento manométrico usando un aparato de procedimiento general. se redujo con ditionito 10 kc.05 M (pH 6. y se electrones añadidos. se midió la formiato línea de base. anaeróbicas. Todas las cepas se manométricamente siguiendo el desprendimiento de cultivaron en un medio completo que contenía una hidrógeno del formiato (15). Esta suspensión tambor de longitud de onda proporcionaron las se usó como tal (células enteras) o se congeló señales de entrada a una grabadora Moseley 7000 durante la noche a -15ºC antes de su uso (células AM X-Y.5%. seguido de centrifugación a 3000 x g durante sódico sólido.7 ml. sustituyendo vigorosamente con aire estéril.8). y la reducción del vitileno de bencilo se siguió por el uso de un MATERIALES Y MÉTODOS colorímetro Klett con un filtro de 660 nm. se colocaron pocillos de formiato en el (vía luminosa de 10 nm).0 ml en una célula de 15 segundos cada uno en un sonificador Branson de absorción de lado metálico. μm de diámetro).0 ml. se células se prepararon mediante tres tratamientos de colocó una muestra de 1. Los extractos libres de absolutos a temperatura de nitrógeno líquido. Y se La forma deshidrogenasa se midió con diferentes coloca en un matraz de Dewar que contiene N2 en aceptores de electrones utilizando un radioensayo o el compartimento celular del instrumento.3). se colocaron 0. coli usadas en estos estudios.8) en un volumen total de idénticas de 3. dos componentes burbujas de viroleno de bencilo. midió la altura del pico de la banda a desde esta En algunos experimentos.0 ml en células de absorción de vidrio 2. como se describió anteriormente (17). coli. reductasa en E. 60 \ mu l de distintos del citocromo b1 y la nitrato reductasa son formiato sódico y células o extracto en un volumen componentes obligatorios de un complejo de nitrato final de 5. En unidades de densidad óptica por miligramo de tubos de Thunberg. El desarrollo del color no fue lineal y. se congeló en N2 líquido. La producción de gas por cultivos en crecimiento se caldo nutriente (Difco) al 0. el medio se burbujeó procedimiento utilizado con formiato.05 μM de tampón de dividido. No se produjo CO2 en ausencia de receptores de Se dibujó una línea basal entre 540 y 570 nm. y el nivel de citocromo se expresa como mediante el siguiente procedimiento cualitativo. los cultivos se cultivaron viologeno de metilo reducido como donadores de en matraces con brazos laterales del tubo de Klett a electrones. nitrato de potasio al 1% y formiato sódico al 0. Para la medición de espectros reducidos congeladas-descongeladas). se burbujeó el medio con una mezcla * Los espectros de absorción de los citocromos se estéril de N2 al 95% más CO _ {2} al 5%. sólido La actividad se expresó como microlitros de CO2 Para obtener el espectro reducido-menos-oxidado. 10 μmol de utilizó un accesorio que proporcionó un haz aceptor de electrones y 0. omitiendo el N2 líquido. clorhidrato de tiamina (5 g / ml).0. se colocaron muestras fosfato de potasio (pH 6. En este caso. y del fotómetro y un potenciómetro orientado al Resuspendido en el mismo tampón. La salida fosfato de potasio 0. Los frascos y los manómetros se cubeta se oxidó enjuagando con aire durante 30 lavaron con N2 y se equilibraron a 37ºC antes de segundos. y los mutantes NR.Se presenta la evidencia de que una forma De tampón de fosfato de potasio (pH 6.derivados de ellos se La hidrogenidasa fórmica se ensayó describieron previamente (17). La luz monocromática de exponencial. 1. Para Con otros donantes de electrones se siguió el condiciones aerobias.nil-benzilo calcularon. y AB2102. por lo tanto. el medio se suplementó con cultivo.0 nm de ancho de banda fue proporcionada por un centrifugación. Los niveles de citocromo se calcularon como sigue. Para condiciones el donante de electrones por formiato. El contenido de una brazo lateral. En el compartimento principal se Para determinar los espectros diferenciales. Los tubos se enjuagaron con N2. base de sal (20). Las unidades de densidad óptica se deshidrogenasa específica de vi. se mezcló con 500 mg de Al203 (1 10 minutos para eliminar células enteras. La nitrato reductasa se ensayó con formiato o Para medir las actividades. invertidos sumergidos en tubos del medio de Cuando se indicó. Las células se recogieron por 1. 30.2 ml de celdas o extracto.

En las células cantidades catalíticas metosulfato de fenazina (17). metileno. con los siguientes niveles de donadores de electrones en un volumen aire). 6 µmoles de formiato. b longitud de onda doble Aminco-Chance a 35ºC oa Expresado como micromoles de nitrato por minuto temperatura ambiente. pero el fenazina en nuestras preparaciones y la formiato formiato fue del 30 al 40% tan activo como el metil deshidrogenasa puede ensayarse mediante este viològeno reducido en las células congeladas. por miligramo de proteína. Este ensayo no implica un flujo indirecto El metil viològeno reducido. mientras que el ferricianuro de potasio.lenzol de bencilo y el RESULTADOS cloruro de trifeniltetrazolio fueron mucho menos Las propiedades generales del sistema de reducción eficaces. Hemos medido rutinariamente la formiato de nitratos presentes en las cepas silvestres deshidrogenasa siguiendo la reducción de utilizadas en estos estudios correspondieron a las diclorofenol indofenol (DCPIP) en presencia de descritas anteriormente (2. ya que el electrones directamente a la nitrato reductasa (21). reducción de nitratos que la glucosa (Tabla 1). el vi. 6. y µmoles de ascorbato. Aunque la o ascorbato reducido como el donador de actividad de formiato deshidrogenasa que utiliza electrones. varios reactivos actúan como donadores corresponde a la velocidad observada con el azul de de electrones para la reducción de nitratos (Tabla 1). el formiato Aunque el DCPIP sólo se reduce lentamente fue un donador de electrones más efectivo para la mediante una mezcla de extracto crudo y formiato. _______________________________________ El azul de metileno y el metosulfato de fenazina fueron los aceptores más eficaces.01 mM.25 µmoles de metil viològeno Las células inducidas por nitrato de HfrH se (reducido). 8). 10 cultivaron y se rompieron en un Branson Sonifier. mientras que un aumento de permitió probar directamente la posibilidad de que 100 veces en la concentración del inhibidor no distintas formaciones deshidrogenasas están afectó a la reducción de nitrato con metil viològeno implicadas en el metabolismo de E. que transfiere de electrones a través del citocromo b1. procedimiento en mutantes que carecen de descongeladas. La disponibilidad de una serie de como donador de electrones fue completamente mutantes que carecen de formiato deshidrogenasa inhibida por n-heptil hidroxiquinolina-N-óxido en las células inducidas por nitrato (17) nos (HOQNO) 0. coli. La formiato deshidrogenasa presente en azul de metileno o metosulfato de fenazina como las células inducidas por nitrato de la cepa HfrH aceptor de electrones no pudo ser detectada o era utilizó varios aceptores de electrones (Tabla 2). el extracto se preparó como se indicó en Materiales . 2. La proteína se determinó mediante el procedimiento de Lowry et al. 48 µmoles de b formiato. (12). 0. final de 2.5 ml: 48 µmoles de glucosa. La reducción de nitrato se ensayó como se ha descrito.8 µmoles de ditionito sódico. citocromo b1 no se oxida por el metosulfato de fue el donador de electrones más eficaz.1 jsmoles / ml (excepto para el trataron como se describe. La reducción de nitrato con formiato citocromo b1. En en presencia de pequeñas cantidades de metosulfato células congeladas-descongeladas o en extractos de fenazina se reduce a una velocidad que celulares. algunos de los mutantes todavía formaban gas cuando se cultivaban en a Las células inducidas por nitrato se cultivaron y se condiciones que conducían a la formación del sistema de hidrogenasa formica en el medio silvestre (Tabla 3) a La concentración de aceptores de electrones utilizada fue de 3. inducidas por nitratos de las cepas HfrH. muy baja en tales mutantes.

por lo específica. coli se desarrolla anaerobiamente.800 cuentas por minuto por mol). mutaciones temperaturas de nitrógeno líquido y 528 y 558 nm a puntuales sobre la base de las tasas de reversión temperatura ambiente. las presencia y ausencia de nitrato son también deshidrogenasas de formiato pueden no ser cualitativamente distintos. Cuando las cepas de tipo silvestre se cultivaron aeróbicamente. 1). la mayores a 528 y 558 nm. un segundo tipo de mutante. 1. Los cultivos se dejaron incubar al menos 5 días observaciones siguientes con mutantes NR. proteína. mutante TW-15).que habían reducido los niveles de citocromo b1. NR- El ensayo de formiato deshidrogenasa con benziol mutantes. Los resultados se expresan como resultados mostrados se expresan como nanomoles micromoles de C02 por minuto por miligramo de de CO2 por minuto por miligramo de proteína. hidrogenasa formica (Tabla 3) como resultado de Éstos eran 526 nm (bandas β) y 555 nm (banda α) a mutaciones que aparecen Para ser único. Sobre la base de las gas. ambos componentes eran evidentes en el espectro reducido (Figura 2. Las células deshidrogenasa específica de nitrato como la cultivadas en presencia de nitrato mostraron formiato deshidrogenasa implicada en el sistema de solamente dos picos mayores entre 500 y 600 nm. pero se congeló antes de su uso. Sin embargo.__________________ picos a 530 y 560 nm a temperatura ambiente. Los resultados para benzyl viologen se expresan cualitativamente. Los colorimétrico). Fig. 23). cultivadas en ausencia de nitrato presentaron picos Cuando E. Los espectros absolutos genéticamente distintas ya que en algunos de los de las células congeladas-descongeladas reducidas mutantes NR-.230 suplementado con nitrato (radioensayo y ensayo cuentas por minuto por mol) utilizado. La realizaron con extractos celulares frescos forma deshidrogenasa se ensayó mediante la preparados a partir de células cultivadas liberación de CO2 radiactivo a partir del formiato anaerobiamente en medio completo (ensayo de 4C. los y se consideraron positivos (+) si formaban más del componentes b555 encontrados en células anaerobias 10% del gas observado en el tipo salvaje. cepa RB-12). inducidas por nitrato parecerían ser distintos del b componente b555 en células aeróbicas. Además. tanto. Cuando tales mutantes se hicieron crecer en condiciones anaerobias en presencia de nitrato. Todos los ensayos se componente cuando se creció anaerobicamente con . y los nanomoles de CO2 se calcularon a partir vitileno de bencilo) o en medio completo de la actividad específica del formiato (8. formó niveles normales de los componentes b558 cuando creció anaeròbicamente en ausencia de nitrato (no mostrado. 22. las bandas de los evaluó la formación de gas en cultivos que crecen principales componentes del citocromo b se anaerobicamente en medio completo sin nitrato en encontraban a 555 y 562 nm (a temperatura de tubos que contienen viales invertidos para atrapar nitrógeno líquido). que no formaba ningún componente citocromo b555 detectable cuando se creció anaeróbicamente con nitrato (Figura 2. se expresó cualitativamente. un hombro a 549 nm adición de nitrato provoca un aumento en el nivel de (citocromo c) a temperatura de nitrógeno líquido y citocromo b1 (17. Estos resultados apoyan la hipótesis de que dos deshidrogenasas de _______________________________________ formiato bioquímicamente distintas están El siguiente análisis espectral demuestra que los implicadas en la reducción de nitratos y la componentes del citocromo b1 formados en formación de hidrógeno en E. Ver espectro no inducido de tipo silvestre. Cuando se usó virògeno de bencilo como aceptor de c electrones. Por otro lado. la evolución del CO2 a partir del La actividad con azul de metileno se calculó como formiato o la reducción del colorante en presencia micromoles de CO2 liberado de formiato (actividad de formiato no fue lineal con el tiempo y. las células (17). se pierden tanto la formiato con ditionito se muestran en la Fig. coli.y Métodos. que han alterado los niveles de la b555 viologeno fue cualitativo. La distinción entre estos componentes b555 y b558 a S (identificados por sus picos de una banda a la e temperatura del nitrógeno líquido) fue evidente en algunos mutantes NR.

reducción de nitrato y proporcionan evidencia de mostrando picos a 555 y 562 nm. formó una distribución normal de los en las células cultivadas anaeròbicamente en componentes del citocromo. el que está compuesto de dos citocromos distintos que principal componente del citocromo b encontrado poseen características espectrales idénticas.nitrato. incluido un presencia de nitrato parece ser fisiológica y componente b555. 2]. Las siguientes observaciones implican idénticos a los encontrados en las células de tipo directamente al componente b555 en el sistema de salvaje aeróbico cultivadas bajo estas condiciones. . cuando se cultivaron en genéticamente distintos de los componentes del condiciones aerobias (Fig. Los espectros citocromo b encontrados en otras condiciones de absolutos mostrados para las células aeróbicas son crecimiento. Por lo tanto.

Esta diferencia en la extensión de la reducción del Al aumentar la concentración de NADH a 100 mM. se encontró que las adiciones adición de nitrato (Figura 4A). el ascorbato . Se usaron suspensiones de células congeladas-descongeladas a una concentración de proteína de 3. se produjo una reducción citocromo. Estos resultados sugieren que dos inmediata del citocromo b. Las células se cultivaron anaerobicamente en medio completo con (células inducidas) y sin (células no inducidas) nitrato de potasio y se trataron como se indica.74 mg / ml para las células inducidas. Las barras en el centro de la figura muestran la escala de unidades de densidad óptica para cada una de las curvas. 1. 3). Sólo una ascorbato. Al parecer. sólo se repetidas de dinucleótido de nicotinamida adenina redujo una parte del citocromo b1. y en este caso la cinética bifásica se reparaciones de células inducidas por nitrato c. 4B. formiato.08 mg / ml para las células no inducidas y de 1. pero uno de ellos sólo resto se oxidó después de un desfase temporal después de un desfase definitivo en el tiempo lag. definido. Cuando se siguió la cinética de reducción y también causó la reducción del citocromo 1. ya que la adición (NADH) reducido de 1 mm no causaron la posterior de formiato causó la reducción de más reducción del componente citocromo b1 presente en citocromo. Se obtuvieron resultados similares formiato inmediatamente después del ascorbato utilizando extractos brutos. componente citocromo causada por formiato y fue posible efectuar una reducción del citocromo b1. en la que la adición de de NADH. Espectro absoluto ditionito-reducido de la cepa HfrH cultivada con y sin nitrato. 3).FIG. La adición posterior de componentes del citocromo b. y que el nitrato oxidado ambos parte del citocromo se oxidó inmediatamente y el componentes del citocromo. observó para la oxidación por nitrato. se redujeron por el nitrato causó la oxidación completa del citocromo. descongelado (Fig. Los espectros se determinaron a temperatura N2 (A) y temperatura ambiente (B). Con algún tiempo de retraso. Sin oxidación del citocromo b1 en un espectrofotómetro embargo. uno de los cuales se reduce por el pero con una cinética peculiar (Fig. Cuando se añadió provocó un incremento adicional de la reducción del formiato de 1 mm. ascorbato se verificó mediante el experimento pero consideramos esto como un nivel no fisiológico mostrado en la Fig. en este caso el citocromo reducido se de registro de longitud de onda doble oxidó completamente en una sola etapa tras la AmincoChance.

HOQNO no impidió que el formiato redujera al menos parte del citocromo. 6.Figura 2.Cuando se añadió HOQNO 0. oxidado por nitrato (Figura 4G). el segundo paso de la cinética bifásica fue resultados obtenidos con ascorbato como donador de completamente inhibido por HOQNO. pero completa del citocromo (Figura 4B). Los efectos de HOQNO sobre la oxidación del La forma reducida citocromo b exhibió una banda citocromo b1 Proporcionó evidencia adicional de alfa. 5B también confirman los decir.32 mg / ml (aeróbico). por lo contrario. dejando un citocromo reducido con un un solo paso. se llevó a cabo una serie similar de experimentos en los que se determinaron los espectros a temperatura ambiente con la fijación por haz dividido para el espectrofotómetro (Figura 5A).25 mg / ml para RB-12 (anaeróbico). en este caso. a 558 nm a temperatura ambiente. Se obtuvieron resultados idénticos máximo de absorción idéntico. Los cambios cinéticos observados.1 nM después de la reducción El nitrato reoxidó completamente al citocromo. Además. Las concentraciones de proteína fueron 6.72 mg / ml para TW-15 (aerobio). Por el ambiente. Los espectros de citocromo de dos mutantes NR crecen bajo diferentes condiciones.82 mg / ml para TW-15 mg / ml (anaeróbico) y 5. Los espectros se determinaron a una temperatura de N2 líquido sobre suspensiones de células heladas-descongeladas y se prepararon como se ha descrito. la porción de citocromo b1 que se redujo tanto. que que dos citocromos distinguibles estaban siendo corresponde al componente b555 (figura 1B). reflejan los cambios que se producen por ascorbato no fue impedida por HOQNO de ser específicamente en el citocromo b555 componentes. reducidos y oxidados en este experimento. 4. el nitrato causó la oxidación de sólo una nitrato y la oxidación se produjo inmediatamente en parte de este. Para demostrar que estos resultados se debieron específicamente al comportamiento del citocromo b555. Los resultados cuando el citocromo se redujo sólo por formiato. La adición de más nitrato no tuvo efecto adicional y. . es presentados en la Fig. otra electrones y demostró que un citocromo con un vez la reducción de del citocromo oxidado por máximo de absorción de 558 nm a temperatura fomato fue evitada por HOQNO (Figura 4B). sólo una parte cuando se añadió HOQNO a la preparación reducida de la reducción del citocromo se reoxidó mediante en formiato.

que carecen de formiato deshidrogenasa pero poseen nitrato reductasa no forman nitrito ni eliminan nitrato del medio durante el crecimiento (datos no publicados). oxidó. La presencia de HOQNO inhibiría el flujo de electrones entre ambos citocromos. 17. El formiato a una concentración de 8. participación en la reducción de nitrato de dos el nitrito comienza a acumularse. 13). HOQNO no inhibió la oxidación del citocromo (curvas d. Cuando se añadió 8. el citocromo b555 y la nitrato reductasa. incluso después de 8 min de burbujas continuas Con aire (curva c). y el resto del citocromo reducido no se en la actualidad. y esta acumulación continúa durante la fase estacionaria. crecimiento en las mismas condiciones. Sin embargo. la reducción de nitratos se produce Principalmente por el funcionamiento secuencial de la deshidrogenasa formiato. e. El hecho de que HOQNO no tuvo ningún efecto sobre la oxidación de citocromos cuando se utilizó un bajo nivel de formiato sugiere que ambos citocromos son autooxidables. 5. presumiblemente porque utilizamos 1% de Después de burbujear aire a través de la suspensión nitrato. ya que el formate continuaría reduciendo el citocromo antes del bloque. Estos resultados pueden explicarse asumiendo la cuando tales mutantes llegan a la fase estacionaria. permitiendo que sólo un citocromo se oxidase rápidamente en presencia de exceso de formiato. coli (2. El papel completamente (curva b). citocromo. burbujear con aire durante 1 NADH y su relación con la actividad nitrato minuto causó oxidación rápida de sólo la mitad del reductasa asociada con formiato deshidrogenasa es. Sin embargo. coli ha sido propuesta por varios investigadores (6. una condición que suprime la formación del de células durante 1 minuto. Los investigadores de Severla han demostrado que el NADH puede servir como donante de electrones para la reducción de nitratos en extractos libres de células de E. Los resultados presentados aquí. DISCUSIÓN La participación de la formiato deshidrogenasa. junto con los resultados de los estudios sobre NR-mutantes (17). nitrito. En contraste. es decir. 7).3 X 103 M En ninguno de estos casos se reduce aún más el redujo rápidamente el citocromo bi (curva a). lo que sugiere que citocromos con espectros idénticos que difieren sólo el NADH puede servir como donante de electrones en sus potenciales redox (ver Fig. 23). desconocida. el padre de tipo salvaje la autooxidación del citocromo b1 en las células acumula grandes cantidades de nitrito durante el inducidas por nitrato (Figura 6). f). estos resultados pueden interpretarse asumiendo la existencia de dos citocromos en las . 6. para la reducción de nitratos sólo en células de fase Otra evidencia de tal hipótesis se obtuvo al analizar estacionaria. células inducidas por nitrato que pueden ser reducidas por el formiato y oxidadas por el oxígeno (Figura 7). coli (2). los mutantes NR. 8. Nuevamente. el citocromo se oxidó sistema de nitritos reductasa en E.3 X específico de la actividad nitrato reductasa ligada al 10 M de HOQNO. indican que diferentes formas de estos componentes están involucrados en el sistema de reducción de nitratos y que hay poca interacción con otras cadenas de transporte de electrones. citocromo b1 y nitrato reductasa en la reducción de nitratos por E. Cuando la concentración de formiato era menor (5 X 10-4 M).

Las células se prepararon como en la Fig.5 µmoles de formiato sódico por ml. se añadieron 10 g de desoxirribonucleasa por ml de suspensión para reducir la viscosidad. En este caso.8 mg / ml). 4 y se usó a una concentración de proteína de 2. desoxirribonucleasa (2.06 M FIG. 4. A la cubeta de referencia. burbujeó con aire durante 8 min. (c) suspensión (a) más 8.0 mg de proteína por ml) a cada cubeta. En las cubetas reducidas. Los espectros diferenciales se obtuvieron con el espectrofotómetro de haz dividido a temperatura ambiente.3 mg de soluciones 1.0 M a 4.3 µmoles de formato de sodio por ml. 5. Se añadieron formiato sódico y ascorbato sódico (ácido ascórbico ajustado a pH 7.3 X 10-5 M HOQNO. se añadieron 0. (a) Suspensión celular más 8. Las células de HfrH se cultivaron anaeròbicamente en medio completo suplementado con nitrato de potasio al 1% y se usaron como una suspensión congelada- descongelada. La suspensión de células de referencia se oxidó burbujeando con aire a través de una pipeta pasteur. nitrato en presencia de HOQNO. Espectro diferencial del citocromo b 1 reducido por formiato y ascorbato y oxidado por . excepto que la suspensión celular frozenthawed se trató con o ácido ascórbico sólido.0 FIG. Reducción y oxidación del citocromo b1 y efecto de HOQNO.05 ml de formiato 0. 3. (e) la suspensión (d) burbujeó con aire durante 1 minuto: (f) suspensión Fig. temperatura ambiente con el espectrofotómetro de haz dividido. 6. (d) suspensión de células más 0. (b) la suspensión (a) burbujeó con aire por 1 min.0 ml que contenía 2.5 µg / ml) para reducir la viscosidad. Se prepararon las células y las condiciones fueron como en la Fig. Auto-oxidación del citocromo b1 y efecto de con hidróxido sódico) como 0. se añadieron 0. Los espectros de diferencia se determinaron a suspensión celular (4.0 ml de / ml.05 ml de nitrato de potasio 1M para oxidar el citocromo b1. Se añadió una muestra de suspensión celular (3.01 ml HOQNO.

redujo sólo una parte catalítica. formación de componentes del citocromo debe ser Varios de los hechos presentados aquí sugieren que regulada específicamente por los otros componentes dos componentes distintos del citocromo b555 son catalíticos con los que están normalmente asociados. 7 se propone explicar la que E. 7 que dos durante 1 min. Además. como se muestra aquí y por otros (14. yo. la efectos del inhibidor HOQNO sobre estos procesos. un donador de electrones de potencial puede establecerse por el aislamiento de la unidad redox moderadamente alto. Este modelo podría explicar por qué muchos NR- que carecen La formiato deshidrogenasa específica mutantes que carecen de nitrato reductasa o formiato de metosulfato de fenazina asociada con la deshidrogenasa también presentan niveles reducción de nitrato. una mutantes NR-que carecen del citocromo b 555 comprensión clara de las variaciones genéticas inducido por nitrato todavía forman componentes observadas para las deshidrogenasas de formiato normales del citocromo b1 en condiciones aerobias. La cinética bifásica de parte en la especificidad de aceptor de electrones de la oxidación por nitrato se debe a la capacidad del la formiato deshidrogenasa asociada con estos dos formiato. requerirá un análisis genético y bioquímico detallado Estas observaciones no establecen si es el mismo de esta enzima y su participación en distintas vías. (III) HOQNO inhibe la oxidación de nitro aparente falta de interacción de este sistema con de la parte del citocromo b555 formada por formiato otras cadenas de transporte de electrones argumentan (aproximadamente 50%). pero se demuestra más claramente por citocromo I reducido incluso en presencia de la existencia de un sistema formiato de hidrogenasa citocromo II oxidado. disminuidos pero intermedios del citocromo b 555 mutantes carezcan de estas dos deshidrogenasas (17). la existencia de mutaciones específico del nitrato que reducen el ditionito o el pleiotrópicas que afectan las actividades y la formiato. coli especifica una serie de componentes interacción del citocromo b. 11) y con nitrato para la deshidrogenasa formiato. tal vez el gen estructural con formiato deshidrogenasa (7. las variaciones sido resueltas unas de otras puede explicarse genéticas y fisiológicas observadas para las dos asumiendo que un componente citocromo deshidrogenasas de formiato deben resultar de una b1permanece asociado con formiato deshidrogenasa interacción y asociación del producto génico con y el otro con nitrato reductasa durante los distintos componentes de transporte de electrones. Esta distinción se basa en componentes del citocromo. el ascorbato reduciría solamente el La formiato deshidrogenasa implicada en la segundo componente del citocromo. 22). 7. la asociación de membranas (aproximadamente el 50%) del citocromo b555 de los componentes. Sin embargo. Esquema sugerido para el secuencialmente en la transferencia de electrones de complejo de nitrato reductasa de formiato a nitrato. de mantener el sistemas (5). oxidados por el nitrato. se explican más . Si ambos son reductasa (9) después de que estas enzimas habían especificados por el mismo gen. componentes del citocromo b555 con diferentes potenciales de oxidación-reducción funcionan FIG. Estas observaciones. (I) El nitrato provoca una Esa reducción de nitratos es catalizada por un oxidación bifásica del citocromo b555. su oxidación por nitrato y los transporte de electrones.. mientras esté presente. burbujeó con aire fácilmente por la propuesta de la Fig. El hecho de que algunos NR. junto con el hecho de que HOQNO inhibe completamente la reducción de nitrato por formiato. del citocromo puede no ser formado. (vía formiato deshidrogenasa) reducirían ambos componentes.(d) más 8. Está claro que los Una interpretación alternativa es que ambas componentes del citocromo b555 específicos del actividades se pierden como resultado de una nitrato son distintos del componente citocromo b555 alteración pleiotrópica que afecta a los componentes formado en condiciones aerobias. con los diferentes distintos de citocromo b1 para diversos sistemas de donantes de electrones. (II) El complejo de enzimas asociado físicamente que sólo ascorbato. oxidación del citocromo b555 reducido por ascorbato por nitrato. los sugiere que ambas actividades dependen de un informes de que el citocromo bi está asociado tanto elemento genético común. pero no inhibe la la existencia de tal complejo. Los efectos reducción de nitratos parece ser distinta de la selectivos de HOQNO resultarían de su inhibición formiato deshidrogenasa implicada en el sistema de la transferencia de electrones entre los dos formiato de hidrogenidasa. E. citocromo b1 asociado con diferentes componentes o El esquema de la Fig.3 X 10-3 M HOQNO. ya que los de membrana de la célula (1). Mientras que ditionito y formiato Escherichia coli. En cualquier caso. Uno o el otro de los dos componentes formadas. procedimientos de purificación. En cualquier caso. formiato y una deshidrogenasa de formiato específica de benzilo viologeno en mutantes NR.