You are on page 1of 7

Metodele PCR utilizate pentru determinarile de biologie

moleculara
Pentru probarea diagnosticului, se recomanda urmatoarele analize si investigatii:
Reactia de polimerizare in lant PCR (polimerase chain reaction) are la baza o tehnologie in
vitro care imita capacitatea naturala de replicare a ADN si care consta in generarea rapida a
unor copii multiple a unei secvente nucleotidice tinta (ADN sau ARN) dintr-o gena de interes
sau un patogen specific; produsul amplificat PCR este apoi detectat prin diverse metode.
Numarul de copii ale secventei tinta creste exponential cu fiecare ciclu de amplificare,
deoarece fiecare secventa nucleotidica nou sintetizata constituie o matrita pentru o noua
copie. Produsul PCR care reprezinta o copie a ADN/ARN tinta original este
denumit amplicon. Aceasta metoda permite detectarea cu specificitate foarte mare a unor
concentratii foarte scazute ale secventei tinta.
Amplificarea se realizeaza intr-un analizor special (thermal cycler), iar amestecul de
reactie trebuie sa contina urmatoarele elemente:
- ADN sau ARN tinta: extras din proba in cursul etapei de prelucrare;
- enzima care faciliteaza sinteza lantului complementar de acid nucleic: ADN polimeraza Taq
(izolata din Thermophilus aquaticus) pentru o tinta ADN sau RTth ADN polimeraza – pentru o
tinta ARN - care are activitate atat de revers-transcriptaza, cat si de ADN polimeraza (permite
realizarea in acelasi amestec de reactie, atat a transcrierii inverse a ARN tinta in ADN
complementar - ADNc- cat si amplificarea ADNc);
- cofactori enzimatici: Mg2+ si/sau Mn2+;
- primeri (P1 si P2): secvente scurte, monocatenare, cu lungimea maxima 20-30 nucleotide,
care se leaga de o matrita monocatenara prin imperecherea complementara a bazelor;
servesc ca punct de plecare pentru sinteza lantului complementar cu ajutorul ADN
polimerazei, marcand inceputul si sfarsitul regiunii care trebuie sa fie amplificata;
- deoxinucleotidele (dATP, dGTP, dCTP si dUTP): folosite pentru sinteza noii catene ADN
prin atasarea lor la capatul primerilor, complementar cu matrita (observatie: ampliconul va
contine deoxiuridina in loc de o deoxitimidina, deosebindu-l de ADN nativ);
- amperaza: enzima care promoveaza amplificarea selectiva a tintei si distrugerea produsilor
de contaminare din cursul reactiilor de amplificare anterioare; catalizeaza clivarea ADN-ului
care contine deoxiuridina la inceputul primului ciclu de amplificare si nu degradeaza ADN-ul
sau ARN-ul tinta.

Reactia PCR se desfasoara in 3 etape:

1. Denaturarea: in urma incalzirii amestecului de reactie la 94ºC, ADN-ul tinta este separat
(denaturat) in 2 catene;

2. Hibridizarea primerilor: ca urmare a scaderii temperaturii la 55-70ºC, primerii se vor
atasa complementar la capetele 3’ ale celor 2 catene;

3. Elongatia: la temperatura de 72ºC, ADN polimeraza termostabila in prezenta Mn2+ si a
excesului de deoxinucleotid-trifosfati (deoxiadenozina, deoxiguanozina, deoxicitidina si
deoxiuridina) va extinde primerii atasati in lungul matritei tinta si va produce un amplicon
ADN. Analizorul va repeta automat acest proces pentru un numar stabilit de cicluri (de obicei
30-35), la fiecare ciclu dublandu-se cantitatea de amplicon ADN.

La randul sau. se produce o incetinire a reactiei iar produsii PCR incep sa se degradeze. unde detectia are loc in faza de platou.domeniu de linearitate mult extins (sunt necesare mai putine dilutii ale probelor). detectia in acest moment este optima in sensul ca rezultatele se coreleaza mai bine cu nivelul initial al tintei. spre exemplu. in evaluarea raspunsului virusologic sustinut la pacientii cu hepatita cronica cu virus C. In ultimii ani. dupa ce reactia a fost stopata iar produsii au inceput sa se degradeze. . .Exponentiala: la fiecare ciclu se dubleaza cantitatea de amplicon ADN (se admite o eficienta de 100% a reactiei). Tehnologia real-time PCR prezinta numeroase avantaje fata de cea conventionala: - acuratete mai mare a rezultatelor obtinute (efectuarea detectiei se realizeaza in faza precoce a reactiei. iar daca faza se prelungeste mult produsii PCR vor suferi o degradare importanta. comparativ cu tehnica PCR conventional. tehnologia PCR a fost revolutionata prin dezvoltarea metodelor de detectie in faza exponentiala (detectie in timp real: real-time PCR). nu se mai formeaza alti produsi de amplificare. procesul global de amplificare desfasurat de-a lungul unui numar definit de cicluri poate fi divizat in 3 faze: .Platou (end-point): reactia este stopata. respectiv in faza de crestere exponentiala a amplificarii.limita inferioara de detectie mult imbunatatita (se pot detecta cantitati mai mici ale ADN-ului tinta. . . cand se produce o dublare exacta a cantitatii de amplicon la fiecare ciclu. Metodele PCR traditionale (conventionale) au la baza o detectie a produsilor PCR in faza de platou a procesului (detectie end-point). avantaj esential.Lineara: pe masura ce componentele reactiei sunt consumate. .

Determinarea cantitativa a viremiei .PCR conventional: detectia calitativa a tipurilor oncogene ale virusului papilomatozei umane (HPV). Analizorul calculeaza concentratia ADN-VHB prin comparararea semnalului tintei cu semnalul QS din fiecare proba si controale.Real-time PCR: determinarea cantitativa a viremiei la pacientii infectati cu virusurile hepatice B sau C. Cuantificarea viremiei se realizeaza cu ajutorul unei secvente ADN neinfectioase denumita Quantitation Standard (QS). . Extractia acizilor nucleici se face automat printr-o tehnica de captura la suprafata unor bilute magnetice de sticla. agentul lizant si bilutele de sticla. ca si secventa tinta. In fiecare proba este introdus ADN QS intr-o concentratie cunoscuta. .pregatirea probei pentru a izola ADN-VHB. amplificare PCR si detectie. impreuna cu proteaza. Proba procesata. in timp ce substantele nelegate vor fi indepartate printr-un proces de spalare. analiza mutatiei factorului V Leiden si a mutatei protrombinei. cu mentiunea ca recent in laboratorul nostru s-a trecut de la tehnologia conventionala PCR la tehnologia real-time PCR Taqman cu prelucrarea automata a probelor. in tehnologia conventionala.vom descrie in acest document etapa de determinare a incarcaturii virale B. ADN QS cu un numar cunoscut de copii este adaugat in fiecare proba si parcurge aceleasi etape de preparare a probei. ce include bilutele de sticla impreuna cu ADN VHB si ADN VHB QS. QS contine secvente VHB cu zone identice de legare a primerilor ca si ADN- ul tinta. Particulele virale sunt lizate prin incubarea la temperatura ridicata cu o proteaza si un tampon care elibereaza acizii nucleici si ii protejeaza de actiunea DNA-zelor din plasma. ADN VHB si ADN VHB QS vor fi captati la suprafata bilutelor de sticla. Dupa ce are loc incubarea amestecului. Testele de determinare a viremiei VHB se bazeaza pe 2 procese majore: . care este cuantificat in cursul desfasurarii reactiei (‘in timp real”) prin monitorizarea fluorescentei emise la fiecare ciclu de amplificare. spre deosebire de detectia colorimetrica care avea loc la sfarsitul reactiei.amplificarea PCR a ADN-ului tinta cu detectia simultana a sondei oligonucleotidice dublu marcate clivate specifice tintei. dar cu o zona unica de legare a sondei de detectie care permite diferentierea ampliconului QS de ampliconul tintei. va fi adaugata amestecului de amplificare si transferata in analizorul in care vor avea loc .In laboratorul Synevo cele 2 tipuri de metode PCR se aplica la efectuarea urmatoarelor teste: . Dupa incheierea etapei de spalare. acizii nucleici adsorbiti vor fi eluati cu o solutie apoasa la temperatura inalta. Particularitatea o constituie metoda de detectie a produsului PCR.

In cazul in care amplificarea este eficienta. Detectia se realizeaza cu ajutorul sondelor de tip 5’ nucleaza-sonde TaqMan. amplificarea se face in prezenta unui sistem raportor care emite fluorescenta. dublu marcate: la un capat cu o substanta fluorofora (“reporter dye” R) si la celalat capat cu o molecula blocanta (“quencher dye” Q).amplificarea si detectia. Energia emisa de fluorofor in urma excitarii in UV va fi inregistrata la sfarsitul fiecarui ciclu de amplificare. fluorescenta sistemului R va fi inhibata de molecula Q. Cat timp sonda este intacta. permitand inregistrarea independenta a emisiilor lor. ADN polimeraza Taq va degrada sonda prin activitatea sa enzimatica de 5’ endonucleaza si va elibera astfel fluoroforul. Sondele HBV si HBV QS sunt marcate cu fluorofori R diferiti. moleculele de ADN nou formate vor fixa prin hibridizare sonda TaqMan. Inregistrarile sunt folosite pentru generarea unei . fiind proportionala cu cantitatea de ADN tinta prezenta in tub pana in momentul respectiv. In cazul tehnologiei real-time PCR. in cursul etapei de elongatie.

izolat printr-o tehnica automata dintr-o proba de sange integral. Deoarece cantitatea de ADN VHB QS este constanta in toate probele. Aceasta etapa este realizata tot de ADN polimeraza. traversarea acestei valori marcheaza declansarea amplificarii. Cu cat este mai mare titrul de ADN VHB din proba. Pentru efectuarea testului se utilizeaza sistemul PCR LightCycler care foloseste o detectie in . procesul se desfasoara intr-un mod similar. o regiune de amplificare exponentiala si o regiune de platou. in care amplificarea secventei tinta inceteaza in special datorita epuizarii enzimei si inhibitiei prin cantitatea mare de ADN. cu atat titrul ADN VHB este mai mic. Cu cat valoarea Ct este mai mare. fluorescenta emisa de sonda de detectie ar trebui sa fie detectata in cursul aceluiasi ciclu. cu atat mai devreme fluorescenta emisa se va ridica deasupra nivelului bazal de fluorescenta. In cazul determinarii ARN viral hepatita C. Pentru fiecare proba se poate determina cu exactitate ciclul de amplificare in care se inregistreaza depasirea valorii prag (Ct= critical threshold value).curbe de amplificare cu 3 regiuni: o regiune de latenta in care acumularea de ADN nu atinge inca punctul limita de detectie a semnalului. ceea ce permite ca atat transcrierea inversa cat si amplificarea PCR sa se produca impreuna cu detectia in timp real a ampliconului. Analiza mutatiei factorului V Leiden Metoda permite detectarea si genotiparea unei mutatii punctiforme a genei umane care codifica factorul V. Prin intermediul unor primeri specifici se asigura amplificarea unui fragment ADN tinta din gena factorului V. Constantele de calibrare specifice lotului de reactivi vor fi folosite impreuna cu Ct corespunzatoare ADN VHB si ADN VHB QS pentru calcularea titrului ADN VHB din probe si controale. In treimea inferioara a regiunii de amplificare exponentiala se stabileste o valoare prag (“assigned fluorescence level”). in cazul tuturor probelor. dar se adauga si etapa de transcriere inversa a ARN-ului tinta pentru a genera ADN-ul complementar (ADNc).

pentru detectia ampliconului se folosesc 2 sonde care hibridizeaza la o secventa interna a fragmentului amplificat. Daca nu se produce acest lucru.sonda 2. Ca urmare a apropierii celor 2 fluorofori in cursul fazei de hibridizare. testul va fi considerat invalid si vor trebui repetate toate etapele. sonda marcata cu fluoresceina hibridizeaza la o secventa care include situsul respectiv (sonda a mutatiei). pentru validarea rezultatelor se folosesc 2 controale. Sonda marcata cu Red 640 hibridizeaza la o secventa a tintei care nu contine situsul mutatiei (sonda ancora). deoarece sonda cu o secventa mai scurta (sonda mutatiei) este prima care disociaza si cei 2 fluorofori nu mai sunt in apropiere. Genotipul heterozigot prezinta o combinatie distincta de proprietati. acesta va emite o lumina fluorescenta rosie. cand ampliconul este prezent in concentratii crescute. astfel ca scaderea fluorescentei se va inregistra la temperaturi mai joase. prin analiza curbei de topire efectuata dupa incheierea ciclurilor de amplificare. mutant homozigot sau genotip heterozigot. facilitand apropierea celor 2 fluorofori. marcate cu fluorofori diferiti: . heteroduplexul ADN este stabil si va avea o temperatura de topire mai mare. Fluoresceina este excitata de lumina albastra emisa de o sursa a LightCycler-ului si emite o lumina fluorescenta verde. Daca este prezenta mutatia factorului V. Sondele sunt reprezentate de 2 secvente oligonucleotidice specifice. a carei intensitate va fi masurata in unitatea optica a LightCycler- ului. printr-un transfer de energie a rezonantei fluorescente (FRET: fluorescence resonance energy transfer). pentru acesta din urma trebuie sa se obtina obligatoriu un profil de genotip heterozigot. In plus. . Sondele de hibridizare sunt de asemenea folosite pentru stabilirea genotipului mutatiei. negativ si pozitiv. marcata la capatul 3’ cu fluoresceina (fluoroforul donator D). cu mentiunea ca. marcata la capatul 5’ cu substanta LightCycler Red 640 (fluoroforul acceptor A). In prezenta genotipului salbatic (fara mutatie). Secventele celor 2 sonde sunt astfel selectate incat sa hibridizeze la secventele tintei intr-un aranjament de tip cap-coada.sonda 1. energia emisa excita la randul sau fluoroforul Red 640.timp real prin fluorescenta a produsului amplificat diferita de cea obtinuta cu ajutorul sondei TaqMan. Cantitatea de fluorescenta emisa va fi proportionala cu nivelul tintei. Pentru analiza mutatiei protrombinei se foloseste o metoda similara. In cursul analizei curbei de topire. Rezultatul pentru ADN-ul unei probe trebuie sa prezinte intotdeauna un profil al curbei de topire pentru unul din cele 3 genotipuri: tipul homozigot salbatic (mutatie absenta). Astfel. . in cursul fazei de hibridizare a primerilor. nepotrivirea sondei mutatiei cu tinta va destabiliza hibridul. cresterea semnificativa a temperaturii induce scaderea fluorescentei emise.

se foloseste un control celular reprezentat de ADN-ul β-globinei umane care se va amplifica simultan cu ADN-ul tinta. Specificitatea sistemului de tipizare este parte a procesului de amplificare. Detectia ampliconului este efectuata cu ajutorul unor sonde oligonucleotidice specifice care permit identificarea separata a ampliconului HPV si a celui corespunzator β-globinei. Etapa de pregatire a probei consta in extractia ADN HPV din celule cervicale recoltate in mediu lichid. Produsul Dynal SSP consta in amestecuri de primeri. precum si o pereche de primeri de control (specifici pentru o secventa nonalelica din proba. Pentru monitorizarea acuratetii acestor 4 procese. . Un rezultat negativ pentru o proba este validat numai daca se obtine un rezultat pozitiv pentru ADN-ul β-globinei.Dynal SSP Tool. Amestecul de reactie contine perechi de primeri specifici atat pentru ADN-ul provenit de la 13 tipuri HPV cu risc inalt. cat si pentru ADN-ul β-globinei. . Amplificarea se realizeaza intr-un termocycler. Genotiparea HPV In cazul acestui test amestecul de reactie contine primeri pentru amplificarea ADN a 37 genotipuri HPV precum si a genei β-globinei. . care furnizeaza o a doua opinie dupa interpretarea manuala. printr-o tehnica manuala. care functioneaza ca un control intern al PCR. iar procesarea post-amplificare este redusa la maximum. Tehnica Dynal SSP pentru tipizarea HLA Este aplicata in laboratorul Synevo pentru determinarea HLA-B27. In cazul in care are loc amplificarea.hibridizarea produsilor de amplificare la sonde oligonucleotidice specifice tintei. Dynal SSP este bazat pe principiul ca un set de primeri cu o complementaritate perfecta cu proba poate fi utilizat mult mai frecvent si mai eficient decat seturile de primeri cu una sau mai multe nucleotide necomplementare la capatul 3’.Detectia tipurilor oncogene HPV Testul include 4 procese majore: . marker pentru spondilita ankilopoietica. verificand eficienta procesului). fiecare continand una sau mai multe perechi de primeri specifici. reducand astfel riscul unor erori umane. Dynal SSP este o tehnica PCR ce utilizeaza primeri cu secventa specifica pentru tipizarea HLA. Interpretarea rezultatelor obtinute poate fi facuta rapid cu ajutorul unui program de interpretare . . identificarea alelelor tinta se face prin electroforeza in gel de agaroza. Pentru detectie si genotipare se utilizeaza un ADN amplificat denaturat si stripuri care includ sonde oligonucleotidice dispuse liniar (sub forma de benzi) care permit identificarea independenta a genotipurilor HPV individuale. iar detectia pe un analizor ELISA automat.pregatirea probei.detectia acestora printr-o metoda colorimetrica.amplificarea ADN-ului tinta cu ajutorul unor primeri complementari specifici HPV.