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Universidad Autónoma del Estado de Morelos

Facultad de Medicina
Laboratorio de Microbiología

CONTENIDO

I PARTE
Pág.
NORMA OFICIAL MEXICANA
(RESIDUOS BIOLOGICOS INFECCIOSOS)
INTRODUCCION A LA BACTERIOLOGIA GENERALIDADES
MANEJO DEL MICROSCOPIO OPTICO
TIPOS DE PREPARACION PARA MICROSCOPIA DE BACTERIAS
DIAGNOSTICO DE LA TUBERCULOSIS POR MICROSCOPIA Y CULTIVO
MORFOLOGIA Y TIPOS DE AGRUPACIONES DE LAS BACTERIAS
MANEJO DEL AUTOCLAVE
DIVERSOS METODOS DE ESTERILIZACION PARA MATERIAL
BACTERIOLOGICO
PREPARACIONES DE MEDIOS DE CULTIVO SINTETICOS
METODOS DE INOCULACION BACTERIANA EN TUBO
METODOS DE INOCULACION BACTERIANA EN PLACA
IDENTICACION BACTERIANA GRAMPOSITIVOS Y GRAMNEGATIVOS
(PRUEBAS DE IDENTICACION :BIOQUIMICAS, CAMP, CATALASA, OXIDASA
ETC.
ACCION DE ANTISEPTICOS Y DESINFECTANTES IN VITRO
PRUEBA DE SENSIBILIDAD BACTERIANA IN VITRO : ANTIBIOGRAMA
EXUDADO FARINGEO
AISLAMIENTO DE ENTEROBACTERIAS : COPROCULTIVO
ANÁLISIS BACTERIOLOGICA DE LA ORINA
EXUDADO NASAL
EXUDADO OPTICO
EXUDADO OCULAR
EXUDADO VARIOS

II PARTE
EXTRACCION Y MANEJO DE SANGRE PARA ANÁLISIS
PRUEBAS DE PRECIPITINAS (FLOCULACION)
REACCIONES DE AGLITINACION PARA EL DX. REACCIONES FEBRILES
REACCIONES DE PRECIPITACION PARA DETERMINACION DE PCR
TITULO DE ANTIESTREPTOLISINAS O

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MEDIDAS DE SEGURIDAD

En todo laboratorio debe existir un manual de seguridad cuyos principios deben aplicarse en todo
momento. A continuación se mencionarán las normas básicas que el alumno debe conocer con el fin
de poner en situación de riegos la seguridad personal o del grupo.

1. Usar bata blanca de laboratorio con las siguientes características: bata larga (no filipina), con
manga larga preferentemente sin botones en los puños; con botones al frente y siempre
debidamente abotonada.

2. Para el manejo de material infeccioso usar siempre guantes de látex o plásticos, gogles, cubre
boca y gorra (cuando no lleve el pelo recogido)

3. Para el manejo de material cáustico, volátil o inflamable protegerse con los gogles y guantes de
ácidos.

4. A partir del momento en que el alumno cruza la puerta del laboratorio deberá respetar las cinco
normas de “NO”.

* NO FUMAR, NO CONSUMIR ALIMENTOS NI BEBIDAS, NO RECIBIR AMIGOS, NO JUGAR CON
APARTOS E INTRUMENTAL DE LABORATORIO, NO ORGANIZAR EVENTOS NI BROMAS SUS
COMPAÑEROS.*

5. El uso del mechero debe ser razonable, debe encenderse solo en el momento de ejecutar la
maniobra que lo requiere. Mantenerlo apagado cuando no se necesario.

6. Las sustancias que se utilizan y las operaciones que se realizan son potencionalmente tóxicas y
peligrosas; se debe evitar la inhalación de vapores y el contacto con cualquier parte del cuerpo. Si
se tiene accidentalmente, lavarse de inmediato con abundante agua de la llave y AVISAR AL
PROFESOR O AL TECNICO ACADEMICO

7. Loa alumnos que tengan el cabello largo deberán llevarlo recogido o usar gorra.

8. Para el uso del microscopio, se recomienda evitar el uso de cosméticos en los ojos (rímel).

9. Por ningún motivó arrojar materiales sólidos al desagüe del lavabo o del escurridero de las mesas
de trabajo.

10. Usar bolsas de polietileno para la recolección de material sólidos de desechos como: torundas,
jeringas, palillos, gasas, que contengan sangre en bolsa roja, en el depósito de punzo cortantes
las agujas, lancetas, vidrios de los tubos y laminillas en depósito de basura municipal se desecha
las bolas de los guantes, de las cajas Petri y papel.

11. Si accidentalmente se derrama material infeccioso sobre la mesa, se deberá absorber con un
paño impregnado de solución de hipoclorito al 1 % o fenol al 5% (solución cáusticas).

12. No cambiar de lugar los reactivos para usos del grupo. Deben estar disponibles para todos.

13. No confundir los tapones de los frascos reactivos, ni introducir una misma pipeta a diferentes
reactivos.

14. Conservar limpia el área de trabajo.

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15. Utilizar las gavetas inferiores de las mesas de trabajo para guardar útiles escolares u objetos que
no tengan relación con el experimento en curso.

16. Maniobrar y trasladar cuidadosamente el material de vidrio, éste deberá enjuagarse con agua
corriente, lavarse con jabón líquido, enjuagarse con agua destilada y con alcohol etílico al 70% y
secarse a temperatura ambiente en la estufa de calor seco para mayor rapidez.

17. Los materiales calientes deberán manipularse con pinzas adecuadas o bien usar guantes de
material a prueba de calor.

18. Prevenir la deglución de reactivos cáusticos, tóxicos o infectantes evitando al máximo los pipeteo
orales directos. Usar perillas apropiadas o bulbos goteros.

19. Lavarse las manos con jabón antes de abandonar el laboratorio.

20. La entrada al laboratorio debe de ser puntual. No hay tolerancia después de la hora asignada.

21. El alumno no puede abandonar el laboratorio a su libre criterio. Deberá solicitar autorización al
profesor o al técnico académico.

22. Todos los accidentes que en su persona o en el experimento que se realiza ocurran, por triviales
que éstos parezcan deben comunicarse al profesor o al técnico académico.

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recolección. Uno de los campos de mayor evolución en la sociedad moderna ha sido el dedicado el cuidado a la salud. además de realizar lo mejor posible los distintos análisis de laboratorio. venenosas y biológico-infecciosos representan un peligro para la salud humana y el ambiente. han llevado a niveles antes inimaginables la generación de residuos incrementando los riesgos para la salud y la amenaza de contaminación del ambiente. algunos de ellos deben considerarse como potencialmente peligrosos. Los residuos peligrosos en cualquier estado físico por sus características corrosivas. incluyendo las técnicas de derrame por accidentes así como las relativas a la inspección y vigilancia en la aplicación. almacenamiento. inflamables. MARCO JURÍDICO Los procedimientos a realizar derivan y se encuentran fundamentados en las siguientes disposiciones jurídicas aplicables en materia de residuos peligrosos y municipales. envasado. separación. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología INTRODUCCIÓN La tecnología del laboratorio es una profesión práctica. La Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-1995. transporte. Recursos Naturales y Pesca para llevar a cabo acciones y tareas a ejecutar en cada una de distintas etapas por personal asignado a las diferentes áreas que conforman las unidades institucionales: Identificación. contrarrestan la eficacia de las medidas y el equipo utilizado para la protección al personal. envasado. Leticia García Gómez Pág. explosivas. En el momento presente se hace necesario establecer un sistema dinámico que incorpore los avances tecnológicos que garanticen mejores resultados acordes a las necesidades actuales apegado a la legislación vigente en la materia expedida por las Secretaria de Salud y la del Medio Ambiente. La producción de bienes y servicios. Profra. reactivas. Los errores humanos y las prácticas incorrectas realizadas en las unidades de atención médica y Laboratorios Clínicos. almacenamiento. 4/113 . LEY GENERAL DE SALUD: Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA2-1993 para la disposición de Sangre Humana y sus componentes con fines terapéuticos. tratamiento y disposición final. tóxicas. establece los requisitos para la separación. tratamiento y disposición final de los residuos peligrosos biológico-infecciosos que se generan en establecimientos que prestan atención médica. recolección. el técnico debe recordar constantemente las posibles causas de accidentes. los eventuales peligros y las medidas más eficaces para disminuir las probabilidades de daños materiales y contaminación infecto contagiosa. actividad que si bien no genera una importante cantidad de residuos. los hábitos de consumo y la explosión demográfica. Ma. reincorporado el proceso productivo aquellos desechos susceptibles de reciclamiento y sometiendo tratamientos a los residuos biológico-infecciosos y toxico- peligrosos. OBJETIVO Establecer un sistema confiable y seguro para el manejo y control de los residuos que se generan en la operación cotidiana en el laboratorio de análisis clínicos a fin de evitar la existencia de riesgos de orden sanitario y el deterioro ambiental.

almacenamiento. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología LEY GENERAL DEL EQUILIBRIO ECOLÓGICO Y LA PROTECCIÓN AL AMBIENTE: Reglamento de La Ley General de Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente Materia de Residuos Peligrosos. que Establece las Características de los Residuos Peligrosos. Leticia García Gómez Pág. -Envases -y . NORMA NOM-003-SCT2. NORMA NOM-CRP-001-ECOL. PROYECTO DE LA NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-087-7101-T994. laboratorios de producción de biológicos. recolección. tratamiento y disposición final de los residuos peligrosos biológico-infecciosos que se generen en establecimientos que presten atención médica. envasado. NORMA NOM-005-SCT2. Profra./93. que establece los requisitos para la clasificación. Ma.Embalajes destinado al Transporte de Sustancias. 5/113 . el Listado de los mismos y los Limites que hacen a un Residuo Peligroso por su Toxicidad al Ambiente. separación. tanto humanos como veterinarios. Características de las Etiquetas de Envases y Embalajes destinados al Transporte de sustancias y Residuos Peligrosos. así como laboratorios clínicos. NORMA NOM-007-SCT2. transporte. tales como hospitales y consultorios médicos. de enseñanza y de investigación. Información de Emergencia de Transportación para el Transporte Terrestre de Materiales y Residuos Peligrosos. LEY GENERAL DE LAS VÍAS DE COMUNICACIÓN: Reglamento para el Transporte Terrestre de Materiales y Residuos Peligrosos. y Residuos Peligrosos.

Punzo-cortantes Toxico – Peligroso .Caducos o dañados . Leticia García Gómez Pág. Fuentes de Generación. en algunos casos de tipo biológico-infecciosos y tóxico-peligrosos.Medicamento Caduco . Objetos punzo-cortantes: Aquellos que han estado en contacto con pacientes o con sus muestras clínicas durante el diagnóstico y tratamiento.Papel .Cultivo y Cepas .Sangre . A continuación se identifican los residuos y fuentes de generación.Reciclables . 6/113 . los residuos peligrosos biológicos . virus u otros microorganismos con capacidad de causar infección ó que contiene o puede contener toxinas producidas por microorganismos que canses efecto nocivo a seres vivos y al ambiente que se generan en establecimientos de atención médica.Metal Con fundamento en la NOM-O52-ECOL-1993 y la NOM-087-ECOL-1995.Peligroso Basura común Reciclables medica Infeccioso Banco de sangre X X X Laboratorio X X X X Profra.Mercurio Común basura municipal .Cartón .infecciosos que se generan en diversas áreas de atención médica son las siguientes: Residuos peligrosos biológicos . Ma.infeccioso: Es el que contiene bacterias. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología ASPECTOS GENERALES El laboratorio de Análisis Clínicos desarrolla diferentes actividades por las cuales se generan diversos tipos de residuos.Plástico . Identificación de residuos Grupo Tipo de Residuo Biológico – Infeccioso .Reactivos de Laboratorio .Vidrio . Fuentes de generación Clasificación de residuos Asistencia Biológico – Toxico .

Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología GENERALIDADES DE LAS BACTERIAS Las bacterias son células unicelulares y procariotas. Ya que pueden medir de 0. Lo cual le proporciona a la bacteria rigidez a la bacteria. 7/113 . A excepción de la Archaeobacteriasque no poseen. Leticia García Gómez Pág. los dos tipos de paredes. no se podía analizar la estructura subcelular ni siquiera de las mayores células animales y vegetales. Se puede clasificar a las bacterias en dos familias: GRAMPOSITIVAS FORMA CELULAR FAMILIA GÉNERO Cocos Micrococcaceae Staphylococcus Streptococcaceae Streptococcus Bacilos Esporulados Bacillus Clostidium Mycobacteruaceae Mycobacterium GRAMNEGATIVOS FORMA CELULAR FAMILIA GÉNERO Cocos Neisseriaceae Neisseria Moraxellaceae Moraxella Brahamella Veillonella Bacilos Enterobacteriaceae Escherichia Salmonella Shigella Klebsiella Proteus Yersinia Enterobacter Vibrionaceae Vibrio Spirillaceae Campylobacter Helicobacter Miscelánea Bordetella Brucilla Legionellaceae Legionella Una estructura exclusiva de las bacterias y en la que se basa su clasificación es el péptido glicano. es mitogeno porque estimula la mitosis de los linfocitos y tiene una actividad pirógena ya que induce la fiebre. son pequeñas que solo se pueden observar con la ayuda del microscopio. Ma. Este péptido glicano es un heteropolimero regular de molécula de N-acetilglicano y ácido N- acetilmuramico. El peptidoglucano interfiere con la fagocitosis. Los antibióticos β-lactamicos inhiben la síntesis de peptidoglucano lo cual suele conducir a la muerte celular.2 µm hasta 35 µm. Profra. Aunque tanto las bacterias grampositivas como las gramnegativas contienen peptidoglucano en sus paredes. Incluso al mejorar la óptica. La estructura celular no se pudo analizar con más detalle hasta la introducción del microscopio electrónico en el siglo XX este instrumento junto con la tinción de Gram. los dos tipos de paredes celulares son muy distintos. y los Micoplasmas ya que carecen de pared celular.

su función primaria consiste en medir la adherencia de la célula a otras bacterias para transmisión de plasmados (material extragenetico que sirve para transferir información de bacterias para hacerse resistente a los medicamentos. Profra. ya que contiene dos capas por fuera de la membrana citoplasmática. 8/113 . y tienden a carecer de lípidos y proteicas. la cual es una hoja externa contiene el polisacárido el cual es una molécula anfipatica que se comprende de tres regiones lípido A . También sirve para la adherencia a células epiteliales. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología Las grampositivas suelen tener de 30 a 200 moléculas de grosor. Las paredes contienen también polímeros hidrosolubles de fosfatos de poliol llamados ácido teicoicos. ATRICO Sin flagelos MONOTRICO Un flagelo externo ANFITRICO Uno o más flagelos en cada externo LOFOTRICO Dos o más flagelos en ambos externos PERITRICO Flagelos alrededor de la célula Pilis o fimbras son proyecciones de las células. la molécula fue llamada originalmente endotoxina. Ma. El movimiento de las bacterias se mueve que se extiende desde la superficie celular hacia fuera. que son antígenos de superficie y funcionan como estructuras de unión a otras bacterias así como receptores específicos en la superficie de las células. Membrana externa esta membrana es una bicapa lipidica. Puesto que la disposición y numero de flagelos son característicos de cada especie. Las gramnegativas son mucho más complejas. polisacárido central y antigeno O. Leticia García Gómez Pág. Contienen de dos a tres moléculas de peptidoglucano y por fuera de esta capa se encuentra la membrana externa exclusiva de las Gramnegativo el área entre la superficie externa de la membrana citoplasmica y la cara interna de la membrana externa se conoce como espacio periplasmico el cual contiene enzimas hidroliticas para el metabolismo de la célula.

se dice que el análisis es por microscopia. Estos nombres científicos provienen del griego o del latín y sus raíces algunas veces intentan ser descriptivas de sus características fundamentales o bien provienen de lugares o personas relacionadas con el descubrimiento del organismo. Leticia García Gómez Pág. Considerando como especie a un grupo en el que todos los individuos son esencialmente iguales. ya que sus dimensiones promedio son de 1 a 6 micras. identificables como pertenecientes al grupo y no a ningún otro. 9/113 . se refiere este análisis como cultivo. En cuanto a la nomenclatura de las bacterias. Zhiel-Neelsen). el cual es descriptivo para la morfología. tipo de agrupamiento celular y reacciones de coloración especiales (Gram.Morfologías micro y macroscópica: Refiriéndose el primer término al estudio microscópico (microscopia) descriptivo de la morfología. se escribe solo con la primera letra mayúscula y el segundo nombre. (ejemplo: Neisseria gonorrea). los cuales se consideran en cuatro categorías. El análisis microscópico considera las características del desarrollo de las bacterias sobre medios de cultivo sólidos..). es conveniente estudiar de manera sistemática sus características descriptivas (caracteres taxonómicos) mediante estudios de laboratorio. Cuando estos nombres se imprimen deberán ir con letras cursivas o negritas y cuando son manuscritos deberán ir subrayados tanto el nombre genérico como el nombre especifico. siendo el primer nombre el género y el segundo la especie. un género es un grupo de especies similares. Ma. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología INTRODUCCIÓN A LA BACTERIOLOGÍA INDICACIONES GENERALES PARA EL TRABAJO BACTERIOLÓGICO INTRODUCCIÓN. etc.Reacciones bioquímicas: Evalúan los cambios que se producirán sobre medios de cultivo diferenciales enriquecidos con azucares. el genérico. deberá escribirse con todas las letras minúsculas. Como un gran número de técnicas de laboratorio y otros procedimientos relacionados con la salud se centran en bacterias.Inoculación en animales de experimentación: Profra. El estudio de las bacterias y de su estructura es particularmente difícil debido al tamaño pequeñísimo de las mismas. los largos y complicados nombres que estas llevan se basan en un sistema binominal (dos nombres) científico. 3). 2). Para poder clasificar un microorganismo hasta su especie. una visión general de estos microorganismos enseñará al estudiante de Medicina los fenómenos básicos de la Bacteriología. El primer nombre. Cuando se estudia a las bacterias bajo el microscopio ya sea óptico o electrónico. Cuando el estudio es bacteriano requiere del uso d medios de cultivo vivos o sintéticos. que en orden de importancia son: 1). agrupamiento y reacciones de tinción. el de la especie. por tanto. no pueden ser observadas a simple vista para su estudio. para lo cual es necesario el empleo del microscopio óptico compuesto y en ocasiones se requiere del microscopio electrónico... enzimas y otras sustancias al ser inoculados con bacterias.

cobayos (cuyos). Los animales generalmente utilizados para estos fines son: conejos. Profra. Ma. ratones y ratas blancas.Reacciones inmunológicas: Las cuales sirven para identificar bacterias según sus anfígenos constituyentes. 4).. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología Para estudiar la patología de las enfermedades infecciosas. 10/113 . Tales caracteres inmunológicos están subordinados a la diferenciación bioquímica de las especies en tipos inmunológicos. Leticia García Gómez Pág.

Nunca habrán de destaparse completamente.  Evitar corrientes de aire con objeto de que la flama no se propague a otros lugares u objetos o se diseminen los microorganismos motivos de estudio. mínimas que se deben cumplir para realizar todo tipo de trabajo bacteriológico. Profra. Solicitar al profesor o al técnico académico. Ma. deberán traerlo recogido todo el tiempo que permanezcan en el laboratorio. ya que se considera que el investigador o el estudiante de Microbiología los ha estudiado ampliamente en forma teórica y habrá de ponerlos en práctica en el momento oportuno. Dichos conceptos o recomendaciones rara vez se mencionan en los métodos bacteriológicos.  Manipular adecuadamente las cajas de Petri estériles o con materiales bacteriológicos. si no en forme de ostra. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL TRABAJO BACTERIOLÓGICO.  No se debe estar hablando cuando se estén manipulando materiales estériles o con cultivo  Flamear hasta el rojo el asa bacteriológica. sin perder de vista que en algunos procedimientos pueden exigirse condiciones especiales aparte de las que a continuación se mencionan:  Siempre que se trabaje con agentes biológicos o sus productos es necesario el uso de cubre bocas y gorro de tipo quirúrgico. es conveniente enlistar a continuación aquellas recomendaciones básicas. pipetas con muestra liquida.  Los estudiantes que tengan el cabello largo. lo mismo que los tubos de ensaye conteniendo medios de cultivo. Teniendo en cuenta las recomendaciones anteriores y/o las adicionales que se requieren es posible asegurar el éxito y la veracidad en los experimentos o investigaciones que se emprendan.  Trabajar siempre con la flama del mechero cercana al área de inoculaciones o muestreos con agentes biológicos. 11/113 . Leticia García Gómez Pág. Con respecto al trabajo que habrá de realizarse en el laboratorio relacionado con análisis bacteriológicos. si lo considera necesario una demostración objetiva de esta técnica.  Por ningún motivo dejar sobre la mesa asas sin flamear. es conveniente que desde que se inicia un experimento se tengan en cuenta las condiciones que se requieren tanto de esterilidad de productos como prevención de contaminación del personal y del medio ambiente. tubos de cultivo destapados o cualquier material contaminado. sin embargo.

.. quien fue uno de los primeros en dejar constancia de sus observaciones. Sin embargo en la historia del microscopio óptico compuesto se atribuye mención oficial al Holandés Anthony Van Leeuwenhoek (1632-1723).... Este hecho se atribuye indistintamente al fabricante de gafas danés Zacarías Jensen (1590)..MARCO TEORICO: 1. Leticia García Gómez Pág.Para su almacenaje 4..Reseña histórico del microscopio óptico 2..Citado al final de la práctica I.... de igual manera se enseñará a cuidarlo y a tratarlo como un importante aparato de laboratorio.Reseña histórica del microscopio óptico El microscopio compuesto.Conocimiento de sus partes fundamentales 3..Observaciones con seco fuerte 4.MEDIDAS DE SEGURIDAD: 1.MARCO TEORICO: 1. a diferencia del microscopio simple.Para su manejo 3. 12/113 .OBSERVACIÓN DE PREPARACIONES MICROSCÓPICAS: 1. La invención de este aparato o herramienta de laboratorio fue indispensable para que el hombre pudiera observar los microorganismos y determinar su morfología como la conocemos hoy en día. para lo cual deberá desarrollar la siguiente metodología: I. 2. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología PRACTICA 1 MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO OBJETIVO: El alumno aprenderá a manejar el microscopio compuesto y conocer las partes de que consta. IV..Iluminación del campo microscópico 2.. Profra. de las heces de un diarreico y del sarro dental..Factores que lo dañan III.Para el transporte del microscopio. está provisto de dos sistemas de lentes: uno son los objetivos y el otro son los oculares.Observaciones con objetivo seco débil 3.Observaciones en placa de Mazzinni.. y a Galileo (1609) aunque la capacidad de aumento de los lentes convexos era ya conocida tiempo atrás..Tipos de microscopios II.. elaborando notas detalladas y bosquejos de los diminutos pobladores de las aguas estancadas.Observaciones con objetivo de inmersión 5. usualmente montados en un tubo o cuerpo del microscopio.REPORTE 1. Ma..

el brazo. además pueden ser un solo tipo de aumento o juegos de oculares de diferentes aumentos. tornillo macrométrico y micrométrico. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología Leeuwenhoek diseño diferentes tipos de microscopios. ajena a la estructura del instrumento. los cuales están montados por medio de engranes a un soporte y este es accionado por dos tornillos: el primero es el macrométrico. En la subsiguiente evolución del microscopio óptico han participado eminentes científicos y técnicos desde si invención hasta nuestros días.  Sistema de iluminación: (I): Formado por una fuente luminosa generalmente integrada a la base del microscopio. 2. Hacia la mitad inferior del tubo se encuentra el dispositivo para sostener las preparaciones en la posición correcta: la platina.  Sistema mecánico (M): Está formado por soporte. la segunda es Profra. mismas que podemos observar en la figura 1.Conocimiento de sus partes fundamentales: Se considera que la física del microscopio óptico (que en lo sucesivo llamaremos simplemente “microscopio”) consta de tres sistemas: sistema óptico. Estos objetivos son:  Objetivo 10 X o seco débil  Objetivo 40 X o seco fuerte  Objetivo 100 X o de inmersión Por último. El tornillo del condensador se encuentra en la parte inferior de la platina Para el sistema de iluminación. dos tipos de fuentes luminosas se pueden encontrar: una puede ser una lámpara periférica que proyecta la luz que choca contra un espejo cóncavo o plano. por lo regular tres montados en el revolver. para lo cual estará provista de dos tornillos que constituyen el carro y que permiten desplazar con seguridad la preparación hacia atrás y hacia delante o a la izquierda y a la derecha. Los objetivos generalmente son varios. Ma. Durante su vida envió a las sociedades científicas más de 350 cartas con observaciones microscópicas. Aunque la estructura era rudimentaria. la mitad de las cuales eran de plata. para darnos el modelo de instrumento de laboratorio que podemos emplear exitosamente en nuestras experimentaciones día con día. son las siguientes:  Sistema óptico (O): Está formado por oculares. objetivos y condensador. el condensador de la luz tiene también una lente o juego de lentes que sirven para concentrar y orientar los rayos luminosos hacia la preparación El sistema mecánico consta del tubo del microscopio. cada uno de los cuales posee las siguientes partes. Todos ellos poseían una gran capacidad óptica. Se estima que monto alrededor de 247 lentes. de movimientos lentos o finos. aunque puede darse el caso de que esta sea una lámpara periférica. así puede tener un solo ocular (monocular) o dos oculares (binocular). tres de oro y el resto de bronce. Leticia García Gómez Pág.. en cuya parte superior están colocados los oculares y en la inferior sobre el revólver están los objetivos. el revólver. tornillo del condensador y otros. que puede ser fija o móvil. El sistema óptico puede ser muy variado según el modelo del instrumento de que se trate. la calidad de las lentes utilizadas y su capacidad como observador dieron como resultado una serie de observaciones que causaron sensación entre los naturistas de su época. de movimientos rápidos y el segundo es el micrométrico. 13/113 . la platina. sistema mecánico y sistema de iluminación.

centrífugas.MEDIDAS DE SEGURIDAD: 1. 2. Entre estos microscopios destaca el microscopio electrónico con el cual es posible observar estructuras como los virus. deslizarse hasta la orilla de la mesa y apoyar la base sobre la palma de la mano izquierda. de rayos X.. fenómeno que ocurre cuando esta pasa de un medio transparente a otro o de idéntica característica pero óptimamente más densa que el primero. Mantenerlo siempre en posición vertical. el de polarización. mayor aumento... Ma.  Nunca deberá colocarse cerca de mecheros encendidos ni sobre mesas en donde halla equipos que al estar en funcionamiento estén vibrando. por ningún motivo inclinarlo puesto que se le pueden caer las piezas que no son fijas. De tal modo que los microscopios se clasifican por el tipo de fuente luminosa empleada y por el medio de refracción y resolución en: a). Dentro de estos se encuentra el microscopio simple o lupa. el de fase. El aumento depende de la emisión de onda. el de campo oscuro. Se basan parcial o totalmente en la refracción o desviación de la luz visible. de iones o de electrones. que no pueden ser vistos con el microscopio de luz ordinaria.000 o mas que el de los ópticos (tomando como referencia el aumento 200 X). etc. agitadores. ya que el uso de este y los diferentes tipos que existen le dan la capacidad de ser multifacético y su uso se ha extendido a todas las ramas del área biomédica. como el filtro azul. el estereoscopio.  Para colocarse sobre la mesa de trabajo debe depositarse suavemente sobre ella y deslizarlo son cuidado hacia el lugar donde se encuentran las conexiones de corriente eléctrica. de rayos X.Tipos de microscopios Siendo la microscopia el examen de preparaciones a través del microscopio... Estos instrumentos aumentan el tamaño de los objetos por medio de radiaciones d onda corta. b).Microscopios ópticos: Usan la luz blanca visible (con sus diferentes modificaciones). II. el de proyección y otros. En estos. el microscopio compuesto. la obtención de la imagen se logra de varias maneras: por medio de una pantalla fluorescente. 14/113 . Leticia García Gómez Pág. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología una lámpara ínter construida en el microscopio que proyecta los rayos luminosos directamente al condensador sin el uso del espejo 3.Para el transporte del microscopio:  Al trasladarlo del área de despacho del material a la mesa de trabajo debe tomarse con la mano derecha el brazo del microscopio. el de interferencia.Microscopios no ópticos: Los que utilizan radiaciones tales como: de onda corta. los oculares u otras. el de fluorescencia. Su aumento puede ser de 100. de iones o de electrones. mientras más corta.. es sin lugar a dudas más que este simple concepto. por medio de una película fotográfica o por medio de tubos de televisión y de rayos catódicos especiales. como rotadores.Para su manejo Profra.

Factores que lo dañan: Todos los mencionados en cada maniobra que se ejecute para su manejo.Para su almacenaje: Mientras el microscopio no se está usando debe de mantenerse protegido del polvo. b) Efectuar las maniobras de limpieza en oculares. Si esta tiene galvanómetro para ajuste de la intensidad. deberá proceder a limpiarlas con un trozo de papel seda (papel especial para instrumentos ópticos). Profra. además de la técnica de iluminación del campo microscópico. jabones.  Los objetivos.. A continuación se dan las metodologías y técnicas que el alumno tendrá que desarrollar para cada una de las secciones antes mencionadas. 40X. objetivos y condensador. solventes orgánicos como el xilol.OBSERVACIÓN DE PREPARACIONES MICROSCÓPICAS: Tomando en consideración el contenido temático de la materia de Microbiología y la naturaleza del trabajo del laboratorio que el alumno desempeñara.  No deben quitarse ni desarmarse las lentes de su lugar. es indispensable que su entrenamiento en el manejo adecuado del microscopio óptico compuesto los inicia con los diferentes tipos de preparaciones que tendrá necesidad de efectuar en la mayoría de sus prácticas. III. el condensador y los oculares en los que la limpieza con papel seda no sea suficiente para remover los residuos deberán reportarse al técnico auxiliar del laboratorio. tener cuidado de que no quede al máximo. e) Encender la fuente luminosa. cerciorándose de que no halla falsos contactos ni alambres que puedan ocasionar un corto circuito. las cuales son: Preparaciones en portaobjetos para objetivos 10X. a) Conectar el cable del microscopio a la corriente eléctrica. f) Observar a través de los oculares. 100X. Nunca usar papeles ni telas que desprendan pelusas. porque al hacerlo permite el paso del polvo al interior del microscopio que no podría ser quitado con una limpieza simple. El campo microscopio estará oscuro. por lo que debe mantenerse en lugares secos y guardados en su estuche o cubierto con una funda de material plástico de tamaño adecuado.. 4. objetivos y condensador estén limpias. un ajuste entre 2 y 3 graduaciones puede ser bueno. Leticia García Gómez Pág. detergentes. 1. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología  Antes de hacer uso de el debe cerciorarse de que los oculares. por ningún motivo el alumno podrá usar agua. la humedad y los vapores corrosivos.. de no ser así. Ma. etc. c) Colocar el objetivo 10X (seco débil) sobre la apertura de l platina teniendo cuidado de que este no quede de lado (inclinado) si no exactamente vertical a la platina y al condensador. si no mediante el desensamble de las lentes y esto solo puede hacerlo un técnico especializado. d) Cerrar el diafragma para evitar una cantidad de luz excesiva que pueda dañar la vista. se deberá quitar primero el exceso de aceite con un paño o trozo de papel suave y posteriormente con papel seda.Iluminación del campo microscopio. transporte y almacenaje. 3. Nunca se usará xilol..  Cuando se ha usado el objetivo de inmersión. 15/113 .

25 0.8 a 2. (ƒ) 40 mm 16 mm 4 mm 1.1 mm Poder de resolución aprox. El campo microscópico se encuentra ahora listo para que sea posible colocar sobre la platina la preparación que se desee observar. sin destellos policromáticos ni sombras.100x Apertura numérica 0-10 0. De lo contrario vuelva a repetir el procedimiento.4 Distancia focal aprox..18 µm con luz de 450 nm (azul) 2. 16/113 . Ma. MATERIAL. uniforme.9 µm 0. de tal manera que no hiera la vista.OBSERVACIÓN CON OBJETIVO 10x (Seco Débil) Para llevar a cabo este método o técnica. REACTIVOS Y EQUIPO:  Portaobjetos (4)  Cubreobjetos (2)  Muestra bacteriológica en tubo de 16 x 150 con 10 ml de caldo nutritivo  Pipetas Pasteur con gotero (1)  Mechero Bunsen  Tina de Tinción con puente de vidrio  Preparación bacteriológica teñida.35 µm 0.20 mm 4 – 8 nm 0. el alumno requiere haber realizado la revisión ocular de los puntos de seguridad para el manejo del microscopio y la técnica de iluminación del campo microscópico Profra. fija en portaobjetos. 2.25 – 1.7 mm 0.5 – 0.3 µm 0.55 a 0. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología g) Abrir lenta y cuidadosamente el diafragma hasta obtener un campo microscopio nítido. si el instrumento tuviese algún desperfecto comunicarlo al profesor o al auxiliar académico. siguiendo la técnica de enfoque adecuada.65 1. el campo microscópico deberá ser semejante a la imagen que nos proporciona una luna llena.0 mm Distancia de trabajo 17. SIN CUBREOBJETOS  Microscopio óptico compuesto  Papel seda  Aceite de inmersión PROPIEDADES DE LOS OBJETIVOS DE UN MICROSCOPIO Propiedad Objetivo De rastreo o lupa Bajo aumento Gran aumento Gran aumento Inmersión aceite Aumento 4x 10x 40x – 45x 90x . h) Si estos pasos se han realizado adecuadamente. Leticia García Gómez Pág.

. o sea una imagen mas o menos definida del objetivo microscópico.Analizar la preparación recorriéndola con el objetivo 10X mediante el dispositivo del carro de la platina.Para el caso de las preparaciones en fresco. Fijar en este punto el tornillo tope móvil e INTERCAMBIAR inmediatamente al objetivo 10X 2.. Ajustarlo a posterior. Ma. teniendo cuidado de que el traslado de la preparación sea siempre con movimientos finos o suaves de derecha a izquierda y a la inversa... 6. 7. afinar la imagen microscópica.Sin dejar de observar el campo microscópico.. suele ser útil cerrar parcialmente el diafragma antes de intentar el enfoque de la preparación.. 5.Observar a través de los oculares. Verificar que la iluminación del campo sea correcta.* * Si el microscopio esta provisto de tope móvil por medio de un tornillo situado entre la platina y el brazo.Cerciorarse de que el objetivo 10X este colocado correctamente sobre la apertura de la platina y de que se encuentre a la altura tope. 4. Leticia García Gómez Pág. una preparación fresca de muestra microbiana montada entre porta y cubreobjetos 3. accionar mediante movimientos suaves el tornillo macrometrico en sentido contrario al movimiento realizado para localizar el punto tope (haciendo que la distancia entre la preparación y el objetivo 10X sea mayor) hasta encontrar el punto de enfoque. aproximadamente). Profra.Mediante movimientos finos con el tornillo micrométrico.Solicitar al profesor o al auxiliar del laboratorio. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología METODO: 1..Colocar la preparación sobre la platina del microscopio. se deberá buscar la altura tope idónea mediante la ubicación primero del objetivo de mayor tamaño (el de 100X). empezando en el ángulo superior derecho del área del cubreobjetos y terminando en el ángulo inferior correspondiente.. el cual deberá quedar a una altura aproximada al espesor del portaobjetos (2 a 3 mm. 17/113 . 8. teniendo cuidado de accionar la pinza para sujetar en firme el portaobjetos.

METODO: Profra. 2. representar gráficamente los campos microscópicos importantes.. (INMERSIÓN): Para este tipo de observaciones se requiere que el alumno halla realizado la técnica de iluminación del campo microscópico.. SIN MOVER EL ENFOQUE LOGRADO CON EL OBJETIVO 10X. Como el enfoque ya esta dado por el objetivo 10X. la imagen del objeto se observará ahora (con el objetivo 40X) inmediatamente. etc. teniendo cuidado de que quede ajustado en posición exactamente vertical.Anotar las técnicas y procedimientos manuales.Observar a través de los oculares. Leticia García Gómez Pág.SIN RETIRAR DE LA PLATINA LA PREPARACIÓN DEL PROCEDIMIENTO ANTERIOR.. METODO: 1. girar el revolver hacia el objetivo 40X. Ma. la revisión ocular de los puntos de seguridad del microscopio. 18/113 .Anotar las técnicas y procedimientos manuales.OBSERVACIONES CON OBJETIVO 40 x (Seco fuerte) Para este método se continúa trabajando con la preparación anterior.Analizar la preparación recorriéndola de la misma manera que para el objetivo seco débil.. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología 9. pero ahora con mayor aumento (poder de resolución). Punto 8 del método anterior.. 3. etc..Si la imagen no este bien definido.. ajustar el enfoque accionando el tornillo micrométrico suavemente en el sentido que sea necesario (hacia el frente o hacia atrás) 4. 4. 3. 5. representar gráficamente los campos microscópicos importantes..OBSERVACIONES CON OBJETIVO 100x.

En este caso. Tener a la mano un recipiente gotero con aceite de inmersión.Colocar la preparación sobre la platina.Para Realizar la observación de este tipo de preparaciones se debe empezar SIEMPRE con el enfoque del objetivo 10X. 4.. no totalmente definida.. en virtud de que algunos experimentos de la sección de Inmunóloga requieren que el examen microscópico se realice en este tipo de instrumentos.Sin mover ningún dispositivo del microscopio.Observar a través de los oculares. La imagen microscópica aparece instantáneamente.. 2. 8.SIN MOVER LOS TORNILLO MACRO Y MICROMETRICO.Observar a través de los oculares. Afinar dicha imagen accionando mediante movimientos finos el tornillo micrométrico. depositar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación.. teniendo cuidado de: accionar la pinza para sujetar en firme el portaobjetos y de que este quede colocado con la superficie que contiene la muestra bacteriológica hacia arriba. puesto que es el objetivo de inmersión. 6.Girar el revolver para retirar el objetivo 40X en el sentido de localización del objetivo de 100X. o sea una imagen mas o menos definida del objeto microscópico. Afinar la imagen del objeto accionando mediante movimientos finos a discreción el tornillo micrométrico.. 3. hasta encontrara el punto de enfoque.Anotar los procedimientos manuales..OBSERVACIONES EN PLACA DE MAZZINNI: También Es conveniente llevar a cabo el entrenamiento previo necesario para la observación de preparaciones que deban valorarse en placa de aglutinación o placa de Mazzinni (también llamada placa excavada).. Ma. sin cubreobjetos. 7. por lo que.. 19/113 .Afinar la imagen microscópica mediante movimientos finos accionado el tornillo micrométrico en el sentido necesario...solicitara al profesor o al auxiliar de laboratorio una preparación bacteriana teñida y fija sobre portaobjetos. 9. SIN COLOCAR TODAVÍA ESTE ULTIMO... pasar al objetivo de 40X girando el revolver el sentido de localización de dicha lente. teniendo cuidado de no usar este en exceso.Analizar la preparación recorriéndola a discreción según sea necesario 14. 10. aunque tal vez no totalmente definida. 11. el alumno deberá de ejecutar primeramente la técnica de definición del tope de los objetivos de manera idénticos a la señalada por los métodos 2 y 3.Sin dejar de observar el campo microscópico.. METODO: Profra. representando gráficamente los campos importantes. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología 1.. 13.Observara a través de los oculares. La imagen microscópica se encuentra enfocada. 5.Girar suavemente el revolver para colocar el objetivo 100X sobre la preparación observando macroscopicamente (a simple vista) que este haga contacto con el aceite. etc. Verificar que la iluminación del campo sea correcta. 5. accionar mediante movimientos suaves el tornillo macrometrico en sentido contrario al movimiento realizado para definir el tope (haciendo que la distancia entre la preparación y el objetivo 10X sea mayor). aunque tal vez. las observaciones se llevan a cabo en el OBJETIVO 10x (Seco débil) EXCLUSIVAMENTE.. 12. Leticia García Gómez Pág.

. pues es material biológico activo..Trasladar la pieza hasta la placa de Mazzinni accionando suavemente el gotero depositar dos o tres gotas de la muestra bacteriológica en una de las excavaciones de la placa. son más grandes que la amplitud que proporciona la pinza de fijación. REPORTE: BUSCAR UN MICROSCOPIO 1) Señalar en el esquema del microscopio a que sistema (óptico.. 8.Observar a través de los oculares. Usar la técnica de los colores distintos. No debe excederse la cantidad de muestra para evitar que se derrame fuera de la placa. NO COLOCAR CUBREOBJETOS. 2) Señalar en el mismo esquema el tornillo para la definición de tope de objetivos.Girar lentamente el tornillo macrometrico en sentido contrario hasta lograr observar la imagen del objeto más o menos definida. 4) Recurrir a las fuentes bibliografías referentes a los antecedentes históricos de la invención del microscopio y de la Microbiología general.Colocar la preparación que contiene la muestra en la posición del campo microscópico. Se recomienda hacer esto en un tiempo razonable. IV. ya que como no lleva cubreobjetos. o de iluminación) pertenecen las partes ahí señaladas.Empleando el objetivo 10X (seco débil). evitando siempre el contacto manual con el liquido.Afinar la imagen mediante movimientos finos discreción del tornillo micrométrico según sea necesario. 5) Representar con dibujos o esquemas los procedimientos manuales realizados para cada paso. 4. Profra. 3. 3) Señalar mediante técnicas de colores los distintos objetivos básicos del microscopio óptico compuesto. anotando siempre las leyendas de los materiales y reactivos empleado. lo que representa cierta dificultad para su manipulación por medio del carro de la platina. 2. mecánico. bajarlo mediante movimientos suaves del tornillo macrometrico hasta la altura de la superficie plana de la placa. Leticia García Gómez Pág. Accionar la pinza de fijación y colocarla sobre la platina.Analizar la muestra recorriéndola en todos sus campos. Evitar todo contacto con la muestra.. trasladar la placa al microscopio. 9. 6. No inclinar la pipeta con el contenido. es decir. su poder de aumento y su nombre común. no más de cinco minutos. Es conveniente mencionar que algunas placas de Mazzinni. Verificar que la iluminación del campo microscópico sea correcta. sin hacer contacto EVITAR ABSOLUTAMENTE EL CONTACTO DEL OBJETIVO CON EL LIQUIDO DE LA EXCAVACIÓN. Ma. 20/113 . 5... Cerrará parcialmente el diafragma 7. el líquido se seca rápidamente. en cuyo caso la placa se colocará sobre la platina y sobre la pinza. 1..Tomando la placa por la orillas. no quedarse fija. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología Para llevar a cabo este método. el alumno requiere haber realizado la revisión ocular de los puntos de seguridad para el manejo del microscopio y la técnica de iluminación del campo macroscópico.. Incluir el reporte sólo aquéllos datos que sean novedosos o diferentes a los que en esta práctica se han encontrado.Empleando una pipeta Pasteur provista de gotero disponer de la muestra bacteriológica fresca contenida en el tubo de ensaye una muestra pequeña y homogénea..

color etc. 4. Señale las ventajas e inconvenientes del examen en fresco 2. De diámetro y dibujar dentro de él los objetos microscópicos observados con su forma. 7) Anotar conclusiones. que sean originales SIEMPRE anotar en la parte inferior el poder de aumento del objetivo empleado. tamaño. también una descripción de su observación. Si ha podido observar microorganismos móviles. Cuestionario 1 1. Enumere las diferencias de tamaño y de otros tipos (morfológicos. Enumere las partes del microscopio. Define como funcionan: -Microscopio de campo oscuro -Microscopio de contraste de fases -Microscopio de fluorescencia Profra. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología 6) Los campos microscópicos se deben de representar siempre con un círculo de 8 cm. Leticia García Gómez Pág. 6. ¿Por qué se coloca un cubreobjetos sobre la muestra? 3. Ma. sugerencias y bibliografías. 5. estructurales) que haya observado en los microorganismos procariotas y eucariotas. explique qué tipo de estructuras cree que generan este movimiento. Define: -Resolución -Apertura numérica -Distancia de trabajo -Flurocromo 7. comentarios. 21/113 .

1. Preparación de laminillas (frotis). I. 22/113 . es importante tener la idea de la forma y tamaño de los microorganismos para lo cual se observarán al microscopio óptico compuesto tal y como se encuentran en los tejidos y en la naturaleza (frotis en fresco) y con técnicas de coloración especiales (como la Gram. METODOS. todas las cuales requieren una clara visión de las células bacterianas aisladas. Leticia García Gómez Pág. y otras) para el análisis de estructuras celulares y de sus características taxonómicos. REPORTE. de caldo nutritivo inoculado con pajas y materia orgánica hidrolizada y fermentada. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología PRACTICA 2 TIPOS DE PREPARACIONES PARA MICROSCOPIA DE BACTERIAS. METODOS: MATERIAL. OBJETIVOS: Elaborar diferentes tipos de preparaciones para la observación microscópica de las bacterias y conocer la morfología elemental de los representantes de los principales grupos (géneros) bacterianos. Frotis en fresco 3. INTRODUCCION: Para la mejor compresión de la bacteriología. Para identificar un microorganismo desconocido. 2. por lo que es de suma importancia saber realizar los tipos de preparaciones o frotis necesarios para tales fines. II. por lo que a continuación se dan a conocer y el alumno deberá llevar a la práctica los métodos más usuales.  Asa bacteriológica. MARCO TEORICO. Introducción. III.  Cultivos sp. En agar nutritivo en placa o en tubo. Coloración ( o tinción) simple 4. Ma. movimiento. Coloración (o tinción) de Gram. tipo de agrupación celular si es que la hay. Profra.  Tina y puente de tinción. II. reacciones de tinción y otras características morfológicas visibles por microscopía. las primeras etapas importantes estriban en determinar su forma.  Cubreobjetos (4)  Pipetas Pasteur con bulbo gotero. desarrollando la siguiente metodología: 5.  Portaobjetos (4). REACTIVOS Y EQUIPOS:  Tubo de ensaye de 16 x 150 con 10 ml.

ya que se pueden volver a engrasar y quedar con las huellas digitales gravadas. papel seda. Manipularlos por las orillas. Si no se tiene cuidado de los puntos anteriores. Por lo general la microscopía bacteriana se realiza en unas laminillas de vidrio de 22 x 22 mm. absorbiendo con pequeños rollitos de papel suave absorbente.  Piseta para agua corriente. 3.  Mechero bunsen. 4.:  Cristal violeta.  Lámpara de alcohol. Llamadas portaobjetos en los que se realizan los frotis. durante dos o tres veces.  Aceite de inmersión. los cuales deben estar perfectamente limpios y desengrasados. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología  Equipo de colorantes de Gram. 23/113 . 5. FROTIS PARA INMERSION: Profra. Se debe evitar tocar las superficies con los dedos. 4. Depositar una gota de esta muestra en el centro de un portaobjetos previamente limpio. FROTIS EN FRESCO. 1. es posible que las dificultades que se presenten al observar al microscopio las bacterias se deben a descuidos desde esta parte. Tomar con una pipeta Pasteur manipulada con un gotero una muestra del tubo que contiene la materia orgánica hidrolizada. 1. safranina. Eliminar si es necesario el líquido que se salga de la superficie del cubreobjetos. lugol. 2. alcohol-cetona. Frotarlos con una torunda con alcohol etílico clínico. Lavar con esponja impregnada de solución jabonosa cada uno de los portaobjetos.  Microscopio óptico compuesto. 3. 2. Cubrir la preparación con un cubreobjetos. Dejarlos secar al aire libre o de otra manera con un paño de algodón sin pelusas. PREPARACIONES DE LOS FROTIS. Son preparaciones entre lámina y laminilla. Este tipo de preparación se efectúa colocando una muestra bacteriana en medio líquido sobre un portaobjetos y siempre debe ir protegida con un cubreobjetos. Enjuagarlos con abundante agua de la llave. 2. 3. Ma. Inmediatamente observarlos al microscopio primero bajo objetivo seco débil (10X) y después con seco fuerte (40X) siguiendo las técnicas de iluminación y enfoque previstas. Pasar cada uno de los portaobjetos por la flama del mechero. así que para asegurar lo anterior es necesario: 1. evitando que se forme burbujas de aire. 5. Leticia García Gómez Pág. 6. Es conveniente mencionar que este tipo de frotis NO DEBE OBSERVARSE EN Objetivo 100 X ni por supuesto emplear aceite de inmersión.

9. La operación de cualquiera de los puntos anteriores requiere de habilidad y adiestramiento. es recomendable solicitar al auxiliar o profesor la demostración objetiva de los mismos. Introducirla al líquido y emulsionar mediante agitación suave el contenido bacteriano de la misma (inoculó). 7. Retirar el asa. Ma. flamearla al rojo. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología Este tipo de frotis se utiliza para la observar preparaciones de microorganismos que se habrán de fijar mediante calor al portaobjetos con la finalidad de teñirlos por la técnica más conveniente. 8. procurando que la muestra quede del tamaño y forma de una monedita de baja denominación. Este tipo de frotis no UTILIZAN CUBREOBJETOS 1. Con la mano izquierda tomar la placa o el tubo con el cultivo y con la derecha manipular el as bacteriológico “calibrada”. Enfriarla al contacto con una parte de la superficie del medio (agar) que No presente desarrollo bacteriano (colonias). Evitar introducir el asa a la parte sólida (o sea del agar). puede hacerse pasar rápidamente el portaobjetos por la flama de una lámpara de alcohol a intervalos de Profra. Disponer de un cultivo bacteriano en placa (medio sólido) o en tubo Inclinado. Depositarla en la charola de materiales. Depositar una gota de suero fisiológico en el centro del portaobjetos. teniendo siempre la flama del mechero cerca. 15. 4. por lo que si se tienen dudas. previamente flamear por algunos segundos sin soltar en ningún momento el asa que contiene el inoculó. blanda o cremosa. Disponer de la charola de tinción provista de un puente de varilla de vidrio (puente de tinción). sino del material biológico. Leticia García Gómez Pág. el cual es de consistencia suave. Tener cuidado de que sobre la mesa de trabajo no halla solventes u otros materiales inflamables ni corrientes de aire. 13. 7. 2. 14. Para abreviar tiempo. destaparlo retirando el tapón con el dedo meñique de la mano derecha sin soltarlo. No tratar de extraer trozos de materia sólida. Dejar secar a temperatura ambiente el líquido del portaobjetos.b) Si el cultivo proviene de tubo inclinado. 3. abrir parcialmente la caja petri (en modo de “ostra”). Cerrar la caja Petri o colocar el tapón al tubo de cultivo. Flamear por algunos segundos la abertura de la caja Petri o de la boca del tubo de cultivo. 5. Retirar el asa. Colocar sobre el puente un portaobjetos previamente lavado y completamente seco. Sostener al mismo tiempo el asa. 12. 6. Encender la flama del mechero de alcohol y colocar éste cerca del área de trabajo. Flamear el asa al rojo. 24/113 . 10. Inmediatamente después de tomar un inoculó del materia bacteriológico mediante contacto suave del asa con alguna de las colonias seleccionadas. Mantener siempre la flama del mechero cerca. Dirigir el asa al portaobjetos con la gota de suero fisiológico. 11.a) Si el cultivo proviene de placa. Introducir el asa.

16. previamente preparado para tinción y fijado a la flama. 25/113 . las Grampositivas y las Gramnegativas. por ejemplo. 3. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología unos 30 segundos hasta que seque. Dejar secar el portaobjetos al aire libre. No olvidar usar aceite de inmersión . Dejar actuar el colorante sobre la muestra por un tiempo de treinta segundos a un minuto. pero existen otros métodos que dan más información. 5. Se debe tocar el frotis con el dorso de la mano y no debe dar la sensación de quemadura. Se califica de tinción diferencial porque divide a las bacterias en dos grupos. Dejarlo actuar durante un minuto. TINCION SIMPLE: Se da este nombre aquéllos técnicas en que solo se emplea un colorante para teñir a las células bacterianas. 1. 4. de verde de malaquita. 2. Inclinar el portaobjetos y lavar con agua de la piseta. de este modo ha quedado fijado por calor al portaobjetos. 2. 4. Estas tinciones no tienen carácter taxonómico. de quien lleva su nombre: tinción de Gram. por ejemplo azul de metileno. soluciones de azul de metileno. METODO: 1. Una coloración simple como azul de metileno muestra muy bien la forma y dimensión de los microorganismos. Cubrir ahora la muestra con unas gotas de lugol. TINCION DE GRAM. de eosina. rojo de safranina y la piseta con agua de la llave en una piseta. lugol. mediante el uso de un colorante básico. Gram. Leticia García Gómez Pág. el cristal violeta y de un colorante de contraste. 5. el cual a continuación se describe. 6. Disponer a la mano los frascos reactivos del equipo de coloración de Gram: Cristal violeta. El frotis está listo para teñirse por la técnica más conveniente. 6. No calentar demasiado la muestra. Inclinar el portaobjetos y lavar con agua de la piseta. Disponer sobre el puente y la charola de tinción un frotis de muestra bacteriana en portaobjetos. el rojo de safranina. Ma. Cubrir la muestra con algunas gotas de la solución de los colorantes antes mencionados. No usar papel o tela absorbente para eliminar las gotas de agua. alcohol-cetona. Profra. el cristal violeta. 3. A continuación se mencionarán dos métodos de uso frecuente en Bacteriología. Observar al microscopio bajo objetivo 100X. 4. 5. Inclinar el portaobjetos y lavarlo con agua de la llave potable proveniente de una piseta. Colocar sobre el puente y la charola de tinción el frotis con el inoculó ya fijado a la flama. Cubrir la preparación con unas gotas de colorante básico.etc.Emplear la técnica de enfoque practicada al inicio de esta práctica. El método más generalmente usado para identificar bacterias fue creado por el científico danés Hans Christian J. Dejarlo actuar durante un minuto.

Profra. En la misma posición inclinada del porta. No aplicar calor directo ni papel absorbente. 2. Observar al microscopio con el objetivo de 100X empleando la técnica de enfoque ensayada en la práctica primera. el rojo de safranina. Las paredes celulares de las bacterias grampositivas retienen el complejo cristal violeta – yodo. lavar con unas gotas de alcohol-cetona durante un tiempo de 10 a 30 segundos o hasta que los residuos del lavado sean incoloros. no así las Gram positivas que permanecen de color morado. Lavar con agua corriente. Describir al pie de los campos sus caracteres taxonómicos elementales: morfología a. 11. y las tinciones diferenciales como es tinción de Wright. Investigar la pared celular de las bacterias Grampositivas y Gramnegativas El uso de colores en los métodos de tinción es importante. en este momento todas las bacterias se tiñen de morado. No olvidar aplicar aceite de inmersión. la tinción de Gram y tinción de Zhiel Neelssen. las bacterias gramnegativas previamente decoloradas absorben este colorante quedando teñidas de rojo pálido o rosa intenso. Dejar secar el frotis al aire libre. la tinción simple. REPORTE: 1. 12. 3. INTERPRETACION DE LA REACCION DE GRAM. 26/113 . III. el rojo de safranina. 8. Representar los campos microscópicos del frotis en fresco. Leticia García Gómez Pág. Representar con esquemas las operaciones llevadas a cabo para los métodos del 1 al 5. Con la aplicación del colorante de contraste. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología 7. Inclinar el portaobjetos y lavar con agua corriente hasta que los residuos del lavado sean incoloros. Cubrir la muestra con el colorante de contraste. Dejarlo actuar durante un minuto. Con el lavado de alcohol – cetona las bacterias gramnegativas se decoloran. Ma. 9. 10. agrupación. reacción de Gram.

R.C. debido a que es un bacilo acido – alcohol resistente (BAAR) que posee una capsula cerosa que impide la permeabilidad de los colorantes de Gram. y normalmente para muestras como el L. con mesas. Se utilizan métodos de concentración para aquéllas muestras que contengan microorganismos distintos de Mycobacterium para destruir las bacterias contaminantes dejando vivo el bacilo tuberculoso. Además de destruir los microorganismos contaminantes. Ma. lavado gástrico). Sin embargo los métodos de concentración pueden matar parte de los bacilos de Koch. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología PRACTICA 2 – 1 TIPOS DE PREPARACIONES PARA MICROSCOPIA DIAGNOSTICO DE LA TUBERCULOSIS POR BACILOSCOPIA Y CULTIVO. Las sustancias desechables se deben desinfectar inicialmente con solución de hipoclorito y luego ponerse al autoclave. Tendrá piso artificial. REPORTE. Introducción. METODOS. Muchos de estos materiales contiene normalmente un gran número de bacterias (heces. tuberculosis (bacilo de Koch). y no se debe emplear para otros fines. los métodos de concentración reducen el volumen de la muestra. la orina. otros se contaminan con facilidad (orina) y lo habitual es que el pus tuberculoso presente infección secundarias. Leticia García Gómez Pág. el pus y los tejidos. Profra. el mayor peligro corresponde a las partículas suspendidas en el aire. el liquido de lavado gástrico los líquidos cefalorraquídeo y pleural. Se deberán tomar toda clase de precauciones contra la producción y diseminación de esta clase de partículas. sino que requiere de una tinción especial llamada Zhiel – Neelsen. De se posible.. y permiten manejarla con más facilidad. paredes y piso fáciles de lavar. Con la siguiente metodología: MARCO TEORICO. INTRODUCCION: La tuberculosis es una enfermedad infecta contagiosa causada por M. aunque sí centrifugación. las heces. Pueden encontrase bacilos tuberculosos en el esputo. El cual es un bacilo que no se tiñe por el método de Gram. esputo. Cuando se trabaja con bacilo tuberculoso. OBJETIVOS: Efectuar los métodos de laboratorio para la identificación de Mycobacterium tuberculosis mediante la tinción especial de Zhiel – Neelsen y cultivo de Lowenstein – Jensen. 27/113 . y el Líquido pleural no se utilizan concentración. la zona del laboratorio donde se realice el trabajo con material tuberculoso debe apartarse.

Lavar la preparación en posición inclinada con acido sulfúrico al 20 %. INTERPRETACION: Profra. Muestra bacteriológica sospechosa de BAAR. tiras de papel filtro. Volver a colocar el porta en el puente de tinción y cubrirlo con suficiente alcohol etílico al 95 % dejándolo actuar sobre la preparación por 2 minutos 14. 1. Colocar el portaobjetos sobre el puente de vidrio o un triple. Cubrir la muestra con azul de metileno Loeffler o verde de malaquita y dejarlo actuar 30 segundos. A. Al término de este tiempo. Se cubre la preparación con la solución de Carbolfuccina básica hasta que el papel filtro quede bien humedecido. No se debe dejar secar el colorante. REACTIVOS Y EQUIPO: Equipo de tinción de Zhiel −Neelsen Carbolfuccina básica (frasco gotero) Acido sulfúrico (H2SO4) al 20 % Alcohol etílico al 95 % Azul de metileno de Loeffer (frasco gotero) Pinzas de disección. 12. Volver a cubrir la muestra con la Carbolfuccina conforme esta se vaya evaporando. porque la muestra puede quemarse. lámpara de alcohol Torunda con alcohol. R. 15. Leticia García Gómez Pág. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología METODO: I. 17. aceite de inmersión. Solicitar al profesor o al auxiliar académico un frotis para baciloscopia y fijarlo a la flama. 16. 10. prenderle fuego. 5. Lavar con agua. Colocar sobre el portaobjetos una tira de papel filtro que cubra la superficie de la muestra. Comenzar a calentar lentamente por debajo el portaobjetos hasta la emisión de vapores. 3. no continuo. 13. Lavar la muestra con agua y si esta vuelve rosada. ES INDISPENSABLE TRABAJAR CON CUBREBOCAS Y EVITAR EL CONTACTO MANUAL DE LAS MUESTRAS SOSPECHOSAS DE BAAR. Lavar con agua destilada. 2. Ma. puente de vidrio Portaobjetos. El calentamiento debe ser intermitente. Continuar calentando en forma intermitente y adicionando colorante a discreción durante 20 minutos. dejar secar a temperatura ambiente. 28/113 . hasta que el liquido que escurra sea amarillo o cristalino (no rojizo). 11. para la tinción de contraste. Microscopio óptico. 6. repetir el lavado con acido sulfúrico hasta que el agua de lavado sea amarillo o cristalino. 7. A. tuberculosis POR MICROSCOPIA: BACILOSCOPIA O B. MATERIAL. piseta. Tomar con una pinza de disección una torunda impregnada de alcohol. IDENTIFICACION DE M. retirar el papel filtro y lavar la preparación con agua destilada. 9. papel seda. 8. Observar al microscopio con objetivos de 100 X. 4.

Profra. en superficie inclinada. tuberculosis. 2. Leticia García Gómez Pág. 8. según el colorante de contraste empleado. Centrifugarla mezcla a 3. 5. 3. Al término del estudio. deberá de efectuarse la tinción de Zhiel – Neelsen de la misma manera que para la baciloscopia. En caso de no haber desarrollo de colonias en este lapso. las células epiteliales. Equipo de tinción de Zhiel – Neelsen. Se incuban los tubos en posición horizontal a 37 ⁰C. 6. El sedimento de la muestra concentrada se siembra por estrías en cuatro tubos por lo menos en el medio de Lowestein – Jensen. revisándose cada semana. 7. REACTIVOS Y EQUIPO: Tubos con medio inclinado de Lowestein – Jensen. Representar los pasos efectuados para la tinción de Zhiel − Neelsen. esterilizar los tubos con el medio de cultivo. que son las únicas alcohol –acido resistente. el estudio se reportara negativo. los filamentos mucosos y otros artefactos se observaran teñidos de azul o verde. En caso de ser negativo el primer análisis se deberá dejar en incubación hasta 6 o 8 semanas. Muestra bacteriológica sospechosa a BAAR. aparecerán con barritas tipo cigarrillo o como bastoncillos rojos ligeramente curvos. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología Los bacilos de Koch o Mycobacterias. lavar y secar. REPORTE: 1. Ma. 3. Se examinan con lupa al cumplirse los 15 primeros días buscando colonias de Mycobacterias. La mezcla se lleva a la incubadora a 37 ⁰C durante 30 min. Representar el campo microscópico de un análisis positivo de Mycobacterium tuberculosis. tuberculosis POR CULTIVO: MATERIAL. mientras que los microorganismos que no son acido− alcohol resiste. DIAGNOSTICO DE M. METODO: II. bien sea centrifugándola en caso de que esta sea liquida o mezclándola a partes iguales con NAOH al 4 % para homogeneizarla. Si los medios de cultivo presentan algunas colonias típicas. Investigar bibliográfica sobre el bacilo de Koch o M. 4. los leucocitos. 29/113 . 2. Equipo de cultivos. 1. 9. 000 rpm durante 5 min para concentrar los bacilos. Agitándola ocasionalmente. Hacer una concentración aséptica de la muestra sospechosa de BAAR.

3. para determinar este se acude al recurso de la microscopia mediante el cual son dos los criterios que determinaran la morfología bacteriana: la forma elemental unicelular y la disposición o tipo de agrupamiento permanente de mas de dos células. La forma de las bacterias es un carácter taxonómico importantísimo tanto para su clasificación como para su identificación. constituye esta el principal carácter taxonómico para la clasificarlas en tres grupos básicos netamente distintos: 1. Bacilos y cocobacilos. su tipo de agrupamiento y su reacción a Gram: MARCO TEORICO. Profra. Introducción. Aunado a la descripción morfología esta el anales del tamaño o dimensiones de cada célula bacteriana. ambos grupos netamente distintos en virtud de que el primero es Gramnegativo y el segundo Grampositivo entre otras diferenciales taxonómicas. Cocos. I. OBJETIVOS: Estudiar la morfología al microscopio de géneros bacterianos representativos. del prefijo diplo que significa dos o un par. Tienen gran valor diferencial características taxonómicas tales como la forma y agrupamiento de las células. Leticia García Gómez Pág. Ma. reacción a colorantes diferenciales como el de Gram. REPORTE. A este grupo pertenecen el género Neisseria (al que pertenecen los meningococos y gonococos) y la especie Diplococos pneumoniae. 2. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología PRACTICA 3 MORFOLOGIA Y TIPO DE AGRUPAMIENTOS DE LAS BACTERIAS. distinción de estructura celulares especiales tales como: capsula. INTRODUCCION: La observación directa de todos los microorganismos es esencial para su estudio. etc. 30/113 . Así las bacterias de diversas especies que se reúnen apareadas (disposición de par) después de la fisión se denominan diplococos. COCOS: La clasificación de las células esféricas y esferoidales en géneros se basa fundamentalmente en tipos distintos de agrupamiento de células después de su fisión. flagelos y endosporas. Espirilos o helicoidales. Como la morfología celular es la diferencia más manifiesta entre las bacterias.

sino grupos irregulares y masa como acumulo de frutas de uvas a los que se le llama estafilococos. Profra. alcohol-cetona. Piseta para agua corriente. disposición a la que se le denomina sarcina. safranina. Otras bacterias cocoides no forman pares regulares ni cadenas. otras tienen simplemente forma de “coma”. A este grupo corresponden una gran diversidad de géneros bacterianos de dimensiones y otros características taxonómicos muy diversos. otros forman acúmulos cúbicos de ocho células. provoca un tipo de conjuntivitis en el hombre. S. lugol. constituyen también un grupo muy amplio y diverso en el que se encuentran los bacilos esféricos o entero bacilos y los bacilos Grannegativos pequeños. algunos de estos son Bordetella pertussis y especies de Brucella. epidermidis. Encontrándose como ejemplo típico la especie Moraxella lacunata. de las primeras tenemos Spirillum minor y de las segundas encontramos Vibrio cholerae o Vibrio comma. Asa bacteriológica. que un bacilo rechoncho muy corto de forma casi de coco. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología Los cocos que se reúnen en disposición de collar de cuentas o perlas o diese también en cadenas de más de cuatro células en disposición lineal se denominan estreptococos. los cuales constituyen el géneros Staphylococcus. Las especies rígidas se enrollan en varias vueltas. El grupo representativo es el género Streptococcus. no esporulados. Portaobjetos (4) Cubreobjetos (4) Pipetas Pasteur con bulbo gotero. los cuales requieren la reacción bioquímica de sus cultivos para clasificarlos taxonómicamente. Se clasifican por su afinidad a colorantes diferenciales en Grampositivos. BACILOS: Son bacterias de forma alargada o de barra que cuando se observan in vivo efectúan un movimiento curvo en uno de sus extremos y dan la apariencia de bastoncillos. Las bacterias helicoidales flexibles constituyen la familia Spirochaetaceae del orden Spirochaetales y comprenden a tres géneros de vida libre: Treponema. Tina y puente de tinción. REACTIVOS Y EQUIPOS: Equipo de colorantes de Gram: Cristal violeta. ESPIRILOS O BACTERIAS HELICOIDALES: Se encuentran dos tipos de bacterias esta forma. Los cocobacilos son bacterias de forma esferoidal (esférico-alargado). Grannegativos y bacilos acido alcohol resistente (BAAR). Los bacilos Grampositivos pueden ser esporulados. Borrelia y Leptospira. Ma. Cultivos sólido de 24 horas de: Staphylococcus aureus. Existen otras especies de forma similar que en ocasiones se llegan a encontrar como bacilos pequeños. METODOS: MATERIAL. S. las rígidas y las flexibles. Los bacilos Grannegativos por su parte. aerobios o anaerobios. Streptococcus sp. 31/113 . Algunos cocos de poder patológico incierto forman grupos de cuatro células como la especie Gaffkya tetragena. Leticia García Gómez Pág. albus.

Observar al microcopia bajo objetivo 100X. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología Microscopio óptico compuesto. Teñirlos por la técnica de Gram. El uso de colores es indispensable. Mechero bunsen. 32/113 . Representar el campo microscópico de cada género bacteriano. tipo de agrupamiento y reacción a Gram. III. papel seda. a. Preparar un frotis para inmersión de cada cultivo. Profra. c. Describir morfología. Leticia García Gómez Pág. METODO: Se proporcionaran cultivos puros de diferentes géneros bacterianos con la finalidad de que el alumno prepare frotis para teñir por Gram y observe por microcopia la morfología exacta de cada unos de ellos. REPORTE: 1. El uso de colores en los métodos de tinción es importante. b. Lámpara de alcohol. Ma. Realizar investigación bibliografía de cada género. Aceite de inmersión. 2.

.Diferentes aparatos... Leticia García Gómez Pág.Germicidas químicos.. Según las condiciones.Factores que lo dañan III.uso y manejo del autoclave 2. II. Ma. como utensilios de alimentación o instrumentos quirúrgicos. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología PRACTICA 4 ESTERILIZACIÓN MANEJO DEL AUTOCLAVE OBJETIVO: El alumno aprenderá a manejar el autoclave y conocer las partes de que consta.Calor seco 3.. La capacidad de controlar las poblaciones microbianas sobre el objeto inanimado.MARCO TEORICO: 1. IV.....Citado al final de la práctica I.Para su almacenaje 3. de igual manera se enseñará a cuidarlo y a tratarlo como un importante aparato de laboratorio. tiene una importancia práctica considerada... es Profra..MEDIDAS DE SEGURIDAD: 1..MARCO TEORICO: INTRODUCCIÓN. porque hay términos como desinfectantes y antisépticos que se emplean a menudo libremente.Luz ultravioleta 4. 33/113 .. Esta situación es incluso más confusa porque un tratamiento particular puede inhibir el crecimiento o destruir los microorganismos.. para lo cual deberá desarrollar la siguiente metodología: I. A veces. La terminología tiene una especial importante cuando se aborda el control microbiano.Conocimiento de diversos métodos de esterilización: 1.REPORTE 1..Introducción 2.Conocimiento de sus partes fundamentales 3.Calor húmedo (vapor de presión) 2.

normalmente químicos. CINÉTICA DE MUERTE MICROBIANA. Profra. es una tarea no tan fácil como en el caso de organismos de mayor tamaño. Un objeto esterilizado está totalmente libre de microorganismos viables. Una población microbiana no se destruye instantáneamente cuando se expone aun agente letal. éste se denomina esterilizante. Es el proceso por el que todas las células vivas. son destruidos o eliminados de unos objetos o hábitat. esporas y otros agentes infecciosos. Por el contrario. empleados para desinfectar y se utiliza normalmente con objetos inaminados. inhibición o eliminación de microorganismos que pueden causar enfermedad. 34/113 . Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología necesario eliminar todos los microorganismos de unos objetos. METODOS DE ESTRILIZACION O DESINFECCIÓN: Nivel de actividad de germicidas líquidos seleccionados. Un desinfectante no esteriliza necesariamente un objeto. Cuando la población se ha reducido. es generalmente exponencial logarítmica. Leticia García Gómez Pág. El saneamiento tiene una estrecha relación con la desinfección. mientras que otras situaciones puede ser necesario solo destruir parcialmente la población microbiana. Con este sistema la población microbiana se reduce a niveles que se consideran seguros según la norma de salud publica. al igual que su crecimiento. Los desinfectantes son agentes. al final de 1min supervivencia 1 106 9 x105 105 5 2 105 9 x104 104 4 3 104 9 x103 103 3 4 103 9 x102 102 2 5 102 9 x101 101 1 6 101 9 1 0 7 1 0. frente a tiempo de exposición a un agente determinado. incapaz de reproducirse. La muerte de una población.9 0. la desinfección consiste en la destrucción. La esterilización  del latín sterilis. y que el 90 % de los microorganismos se destruyen durante cada minuto de exposición. Cuando se esterilización con un agente químico. la velocidad de destrucción puede disminuir debido a la supervivencia de la cepa microbiana más resistente. porque pueden permanecer esporas y algunos microorganismos viables. Si se representa el logaritmo del numero de microorganismos de la población de la sobrevive. Experimento teórico de destrucción microbiana Minutos Numero de microorganismos Microorganismos Microorganismos Log. Ma. La temperatura es de 121 ª C. Por ejemplo. ¡Es imposible tomar el pulso a una bacteria Una bacteria se considera muerta si no hay crecimiento cuando se inocula en un medio de cultivo que normalmente facilitaría su crecimiento. Para estudiar la eficacia de un agente letal hay que saber cuando los microorganismos están muertos. los productos de saneamiento se emplean en restaurantes para limpiar utensilios de alimentación. es decir la población se reduce en niveles iguales o intervalos constantes. Los objetos inaminados suele limpiar y desinfectar parcialmente.1 -1 6 Se supone que la muestra inicial contiene 10 microorganismos vegetativos por mL.10 de al comienzo de ensayo destruidos en 1min.

Ma.2 % Baja Antisepsia: Alcoholes (etílico. Gas Oxido de etileno 450 a 500 mg/litro a 55. Leticia García Gómez Pág. 121 ° C Durante 16 horas. o 160 ° c Durante 2 horas. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología METODO CONCENTRACIÓN NIVEL ACTIVDAD DESINFECTANTE Esterilización: Calor 250 ° F (121°C) o 271°F (132°C) Calor húmedo (vapor o presión) Durante diversos intervalos de tiempo.60 °C Liquido Glutaraldehido Variable Peróxido de hidrogeno 6 a 30 % Dióxido cloro 6a8% Ácido paracetico Variable Desinfección: Calor: ALTO Calor Húmedo 75 a 100 °C Pasteurización con agua caliente Liquido Glutaraldehido Variable Alta a intermedia Peroxido de hidrogeno 3a6% Alta a intermedia Formaldehído 1a8% Alta a baja Dióxido de cloro Variable Alta Ácido paracetico Variable Alta Productos clorados 500 a 5.1 a 0. isopropilico) 70 % Intermedia Productos fenoliticos 0.000 mg de yodo disponible / litro. 1 a 2 % de yodo disponible Clorhexidina 0. 35/113 . 75 a 4 % Hexaclorofeno 1a3% Paraclorometaxileno 0. Productos de amonio cuaternario 0.5 a 4 % AUTOCLAVE: Profra. isopropilico) 70 % Yodoforos 1 a 2 mg de yodo libre /litro.000 mg de cloro libro o disponible a litro Intermedia Alcoholes (etílico. Calor seco 171 ° C Durante 1 hora.5 a 3 % Intermedia o baja Productos yodoforos 30 a 50 mg de yodo libre /litro Intermedia o baja hasta 10.

estimuló enormemente el progreso de la microbiología. en 1884. pero si son desechos de medios de cultivo con bacterias el tiempo será de 20 a 30 minutos. La esterilización con valor en autoclave. PROCEDIMIENTO (METODO) El uso adecuado de la autoclave se realiza: Profra. esto requiere la utilización de vapor saturado a presión. Se expulsa el aire que inicialmente se encuentra en la cámara hasta que este quede llena de vapor saturado y se cierran las salidas. El desarrollo del autoclave que fue creado por Chamberland.8 Kg ( 15 Libras) de presión. 121°C y 6. 36/113 . Leticia García Gómez Pág. Ma. El procedimiento se continúa durante 15 minutos para permitir un margen de seguridad siempre y cuando sea esterilización de medios de cultivo. entre 10 y 12 minutos. que pasa a través de una <<camisa>>al interior de la cámara del autoclave. El vapor saturado y caliente continua entrando en la cámara hasta que se alcanza la temperatura y presión deseada. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología La esterilización con calor húmedo debe realizarse a temperaturas superiores a 100 % para destruir las endoesporas bacterianas. aparato similar a una olla de presión especial. A esta temperatura. normalmente. Se hierve agua para producir vapor. el vapor saturado destruye todas las células vegetativas y endosporas en volúmenes pequeño de liquido.

Checa que el manómetro nos indique cero y que la válvula de escape de aire se encuentre abierta. 6. 37/113 . Concluido este tiempo se apaga el autoclave y se deja enfriar hasta que el manómetro llegue a cero. este punto si es esterilización de medios de cultivo será lo adecuado a 121° C. (Nunca colocar lienzos con agua. REPORTE: Definir los siguientes términos y citar ejemplos de cada uno de ellos. 3. 9. Dejar que tome la autoclave a temperatura ambiente. Encienda. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología 1. 2. Ma. esto ocasionara que la esterilización no sea confiable) Abrir las llaves o las mariposas de cierre hermético en la misma forma de cerrarla (en forma de cruz). 5. 8. 3. Quitar el recipiente de esterilización. 2. o agregar agua al aparato.  Esterilización Profra. se cierra (para aplicar el vapor saturado). CUIDADOS DEL AUTOCLAVE 1. Evitando que el autoclave se oxide. Se cierra la autoclave en forma de cruz con las llaves de mariposa (sin aplicar ninguna fuerza). Se introduce el material a esterilizar (en recipiente). 7. Leticia García Gómez Pág. Cuando el aire sea constante en la válvula de aire. 15 libras de presión durante 15 minutos. Limpiar y secar la autoclave con un paño (jerga) seco. 5. Abrir la llave que se encuentra en la parte inferior del aparato es la válvula de drenaje de esta manera no tendera agua. Al marcar el manómetro 15 libras de presión se controla con el termostato durante 15 minutos (temperatura de 121° C). Se conecta la autoclave. pero o si es para desinactivacion de microorganismos será:121°C. mediante el termostato colocado en el nivel máximo. Se saca el material ya esterilizado y se drena el agua. 4. Se agrega agua dentro del cilindro hasta la marca que indica la columna del nivel del agua. 4. 15 libras de presión durante de 20 a 30 minutos. Dejar abierto la autoclave por lo menos 8 horas.

Leticia García Gómez Pág.) se basa en que la mayoría de los microorganismos que provocan epidemias y que contaminan la leche. algunos gérmenes patógenos que no forman esporas. hay que utilizar una temperatura mucho más elevado por más tiempo (165 °C durante 2 horas). Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología  Desinfección  Antisepsia  Germicida  Esporicida PRACTICA No. La técnica de pasteurización (63 °C durante 30 min. durante 15 a 20 min. Para este fin suelen utilizarse diversos métodos a base de calor. Si se utiliza calor para esterilización. puede ser calor seco como se aplica en un horno. como los bacilos diftéricos. II. I MARCO TEORICO: La esterilización se logra por un proceso que suprime completamente o destruye todos los organismos vivos encima o dentro de un objeto. es necesario debidamente esterilizadas. Profra. Los virus de la hepatitis pueden sobrevivir a la ebullición. gases o vapores germicidas capaces de destruir las esporas bacterianas. pero a una temperatura similar a la lograda con vapor saturado a 15 libras de presión (en autoclave: 121 °C. La susceptibilidad de los microorganismos al calor húmedo es variable. pero no al autoclave o al calentamiento en horno. 1. no forman esporas y que son destruidos con dicha exposición. son sensibles a temperaturas tan bajas como de 55 °C durante 10 min. Las cajas de Petri son instrumentos de vidrio en que se preparan los medios de cultivo sólidos para el aislamiento la reproducción de un agente etiológico en particular. METODOS. o calor húmedo mediante vapor de agua. 38/113 .. aunque en la actualidad es posible disponer de ciertos agentes químicos como el oxido de etileno y la beta propiolactona.ESTERILIZACIÓN DE CAJAS PETRI PARA CULTIVO.) es eficaz contra gérmenes formadores de esporas. Ma. Es conveniente mencionar que actualmente se dispone en el comercio de cajas de plástico estéril. Si en lugar de vapor se emplea el horno (calor seco). Cualquier proceso destinado a esterilizar ha de ser adecuado también para destruir todo tipo de esporas. tanto para el uso en la experimentación como para el material de desecho. que están sustituyendo el calor en algunas aplicaciones selectivas.4 DIVERSOS METODOS DE ESTERILIZACION PARA MATERIALES BACTERIOLOGICOS OBJETIVO: Conocer y aplicar los métodos de esterilización adecuados para cada tipo de material bacteriológico. Inversamente. lo que representa cierta comodidad para el analista aunque a un costo más elevado.

Doblarlos hacia abajo. 3. 6. Para el segundo caso. 8.  Cinta testigo. Dejar enfriarlas completamente. ESTERILIZACION DE CAJAS DE PETRI CON CULTIVO. Profra. 5.  Cinta testigo. Cortar hojas de papel para envoltura (estraza. hacer dos dobleces de un centímetro aproximadamente. 39/113 . Envolver cada caja en una hoja para envoltura. Preparar el autoclave. Rotular la envoltura con el número de equipo. 3. Ma. para que el medio de cultivo no se derrame al calentarse. nunca por calor seco. Retirar cualquier tipo de etiquetas adhesivas que se encuentran pegadas a la caja de Petri.  Horno o autoclave. Llevarlas a esterilizar al autoclave o al horno. 4. Retirar las cajas. 7. 4. dejar enfriar el horno o la autoclave. No colocar cinta o etiquetas adhesivas directamente sobre el vidrio. 2. equipo y escuela. Siempre que una caja o placa contiene medio de cultivo inoculado que ya se terminó de analizar deberá estrelizarse antes de proceder a lavarla. El método más indicado para ello es el de la autoclave. manila o aluminio) en proporción de tres veces el diámetro de la caja para lo largo y dos veces para el ancho. Rotular sobre la envoltura con: fecha.  Papel grueso para envoltura. Se puede disponer de ellas de inmediato o bien se pueden almacenar en refrigeración o a temperatura ambiente en un lugar seco y donde no exista riesgo de romperse la envoltura. Después doblar los extremos hacia adentro para formar puntas en ambos lados. MATERIAL Y EQUIPO:  Cajas de Petri inoculada con bacterias. para lo cual. levantar primero los extremos laterales largas de la hoja. Lavar y secar perfectamente las cajas de Petri. no invertida.Para el primer caso. someterlas a 15 libras de presión durante 20 min. Leticia García Gómez Pág. Al término de este tiempo. a 160 °C durante 90 min. METODO: 1. Ensamblar cada caja y colocarla sobre una hoja de papel para envoltura. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología MATERIAL Y EQUIPO:  Cajas de Petri de vidrio. Envolver la caja. Sujetarlos con un trozo de cinta testigo. teniendo cuidado de que ésta quede en posición derecha. 2. unirlos. METODO: 1.  Horno o autoclave.  Papel grueso para envoltura. 2.

METODO: 1. con las indicaciones del envase en que vienen contenidos. 9. de tal manera que se podrá verter directamente del matraz a cajas de Petri estériles o a algún otro recipiente con facilidad. 40/113 . Este método es recomendable para cuando el volumen de medio de cultivo a preparar no es muy grande (alrededor de 50 mL). 2. se debe consultar siempre que se vaya a hidratar un medio. Ensamblar cada caja teniendo cuidado de que correspondan exactamente la base y la tapa. Nunca se derramará al drenaje. REACTIVOS Y EQUIPO: Frasco de medio de cultivo. Secar con un lienzo de algodón o en la estufa. Esterilizar a 15 Libras de presión durante 30 min. recordar que. por tanto. 8. Tener cuidado de no colocarlas en posición invertida ni de lado. Llevarlas al autoclave. Autoclave. según la dosificación indicada en el frasco. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología 5. 11. ESTERILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO. Leticia García Gómez Pág. MATERIAL. En caso de que las especificaciones del medio de cultivo indiquen la aplicación de un proceso distinto del autoclave (por ejemplo filtración. Esperar a que se enfríen. Pinzas de tenaza. ultra centrifugación. Medir en una probeta el volumen de agua destilada necesaria para la cantidad del medio que se ha pesado. por ejemplo el calor no es recomendable para los casos en que se trabaja con sustancias termolábiles. Lavar con detergentes. 13. Finalizado este tiempo. Ma. Desechar en la bolsa roja RPI el medio de cultivo. etc. ESTERILIZACION DE MEDIOS EN MATRAZ. Probeta de 100 mL. Incubadora a 37 °C. 12. 3. Vaciar el agua destilada a un matraz erlenmeyer de capacidad adecuada. Balanza granataria. Matraz Erlenmeyer. En estas condiciones. A continuación se mencionaran los métodos generales para la preparación de medios de cultivo que requieren esterilizarse al autoclave. 3. no todos los medios de cultivo se esterilizan por el mismo método. A). Profra. Pesar la cantidad necesaria del medio de cultivo en polvo. Mechero. dejar que se enfríe gradualmente el autoclave.) se recomienda consultar las técnicas apropiadas para dicho fin. Quitar la envoltura. 6. Agitador de vidrio de 25 cm. Como ya se ha mencionado. 7. sin tener que efectuar maniobras riesgosas. 10. las cajas están listas para esterilizarse nuevamente y usarse con nuevos medios de cultivo o bien para devolverlas al almacén. Retirar las cajas.

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4. Rotular la envoltura con el número de equipo.

5. Agitar con un agitador de vidrio hasta obtener una suspensión homogénea.

6. Calentar lentamente hasta que el medio se disuelva por completo. Una disolución
completa es cuando el medio en vez de verse opaco se ve cristalino a contra luz.

7. Tapar la boca del matraz con un tapón del algodón compacto con una gasa y cubrirlo con
un capuchón de papel aluminio que llegue hasta cuello del matraz.

8. Llevar a la autoclave que ya estará dispuesta para usarse como se ha indicado.

9. Esterilizar bajo las condiciones de presión y temperatura indicadas para cada medio.

10. Dejar enfriar el autoclave y retirar el o los matraces que contienen el medio de cultivo.

11. a) El medio de cultivo puede almacenarse en el matraz en que se preparó. Dejar enfriar
hasta la solidificación a temperatura ambiente. b) El medio de cultivo puede distribuirse
por tanteo a cajas Petri o a tubos previamente esterilizados; en cuyo caso debe de
hacerse en caliente lo más rápido posible a fin de evitar la formación de grumos o la
solidificación total antes de destruirse adecuadamente. Tómense rodas las medidas
pertinentes de esterilización en cualquier maniobra con material de cultivo.

12. En ambos casos, someter los materiales a la prueba de la esterilización o (control de
calidad), que consiste en llevar a la incubadora a 37°C durante 24 horas. Rotular con
etiquetas adhesivas con nombre del medio de cultivo, número de equipo, escuela y fecha.

Al día siguiente:

13. Revisar el material de la incubadora. Desechar el material que se muestre signos de
contaminación. Conservar el material que sí se mantiene estéril.

14. Disponer de los medio de cultivo en el experimento requerido o bien almacenarlos en el
refrigerador debidamente etiquetados y sellados hasta el momento de uso y anotar la
fecha de caducidad.

ESTERILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO EN TUBOS.

Este método se habrá de utilizar cuando:

a).- No sea estudio de la morfología de las colonias un carácter determinante, sino que sea de
más importancia estudiar sus reacciones metabólicas, como es el caso de las reacciones
bioquímicas para Enterobacterias.
b).- También para conservar microorganismos en medios líquidos o sólidos inclinados por tiempos
relativamente grandes, ya que en estas condiciones la deshidración es más lenta.
c).- Asimismo, este método ofrece una buena alternativa para cuando se habrán de preparar
grandes volúmenes de agares que se tendrán que vaciar a placas y cuya manipulación sea difícil.
d).-Se preparan medios líquidos o caldos.
De lo anterior se derivan dos variantes de este método: Preparación de medios líquidos (caldos) y
preparación de agares; que a continuación se describen.

PREPARACION DE CALDOS.

Profra. Ma. Leticia García Gómez
Pág. 41/113

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1. Disponer el material necesario, cuidando que los tubos, matraces y pipetas estén
perfectamente limpios y secos.

2. Pesar la cantidad necesaria del medio de cultivo para el volumen que se requiera,
siguiendo las indicaciones de la etiqueta del envase.

3. Medir en la probeta el volumen requerido de agua destilada y pasarlo a un matraz
erlenmeyer.

4. Vaciar el medio de cultivo en polvo al agua contenido en el matraz.

5. Mezclar, agitar, calentar, hasta obtener una disolución completa del medio, siguiendo
las indicaciones de la etiqueta del frasco reactivo. Una disolución correcta es cuando
el medio vuelve cristalino.

6. En caliente, pasar el volumen requerido para cada tubo, midiendo el medio por
comparación con un blanco de agua. No se recomienda medir los medios con pipetas.

7. Tapar cada uno de los tubos con tapones compactos de algodón o con tapones
especiales (de acero inoxidable o de PVC) para tubos de cultivos, en cuyo caso no es
necesario el tapón de algodón.

8. Roturar en los capuchones con: nombre del medio, numero de equipo, fecha, escuela.

9. Colocar los tubos en canastillas de mallas de alambre propias para autoclave, en
posición vertical.

10. Llevar el autoclave.

11. Esterilizar según las especificaciones del medio de cultivo.

12. Al término de la esterilización, dejar que los tubos se enfríen un poco. Retirar de la
autoclave.

13. Dejar enfriar a temperatura ambiente y llevarlos a la incubadora a 37°C durante 24
horas, para someterlos a la prueba de la esterilidad. Mantenerlos siempre en posición
vertical.

Al día siguiente:

14. Revisar cada uno de los tubos. Descartar los que presenten desarrollo bacteriano.

15. Conservar los medios estériles. Si no se usarán de inmediato, almacenarlos en
refrigeración hasta el momento de su uso. Mantenerlos en gradilla siempre en
posición vertical.

PREPARACION DE MEDIOS DE AGAR EN TUBO.
1. Disponer el material necesario, cuidando que los tubos, matraces y pipetas estén
perfectamente limpios y secos.

2. Pesar la cantidad necesaria del medio de cultivo en polvo para el volumen que se
requiera, siguiendo las indicaciones de la etiqueta del envase.

Profra. Ma. Leticia García Gómez
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Facultad de Medicina
Laboratorio de Microbiología

3. Medir con la pipeta el volumen requerido de agua destilada y pasarlo a un matraz
erlenmeyer.

4. Vaciar el medio de cultivo en polvo al agua contenida en el matraz.
5. Mezclar, agitar, calentar, hasta obtener una disolución completa del medio, siguiendo
las indicaciones de la etiqueta del frasco reactivo. Una disolución correcta es cuando
el medio se vuelve cristalino.

Es importante que el medio esté bien disuelto, de lo contrario la concentración de agar
podría ser diferente en cada tubo y por lo tanto no tendrán la misma consistencia.

6. En caliente, pasar el volumen requerido para cada tubo, midiendo el medio por
comparación con un blanco de agua. No se deben usar pipetas para medir los medios
de agar.

7. Tapar cada uno de los tubos con tapones compactos de algodón o con tapones
especiales (de acero inoxidable o de PVC) para tubos de cultivo, en cuyo caso no es
necesario le tapón de algodón.

8. Si se tapan con algodón, se deberán cubrir éstos con capuchones de papel grueso o
aluminio uno por uno. Preguntar por la técnica de doblado para los capuchones.

9. Rotular en los capuchones con: nombre del medio, número de equipo, fecha, escuela.

10. Colocar los tubos en la canastilla de malla de alambre propio para el autoclave, en
posición vertical.

11. Llevar al autoclave, esterilizar según las especificaciones del medio de cultivo.

12. Al término de la esterilización, dejar que los tubos se enfríen un poco. Retirar del
autoclave.

13. Si es necesario que el agar proporcione una superficie inclinada, en caliente se
colocan los tubos sobre la mesa de trabajo ligeramente inclinado, cuidando que el
medio no toque el tapón de algodón. No mover. Dejar enfriar a temperatura ambiente
hasta que solidifiquen. El medio se volverá opaco.

14. Llevarlos a la incubadora a 37 ° C durante 24 horas para someterlos a prueba de
esterilidad. Mantenerlos en posición vertical.

Al día siguiente:

15. Revisar cada uno de los tubos, descartar los que presenten desarrollo bacteriano.

16. Conservar los medios estériles. Si no se van a usar de inmediato mantenerlos en
refrigeración hasta el momento de su uso.

III METODOS DE ESTERILIZACION DE DIVERSOS MATERIALES BIOLOGICOS.

En virtud de que cada tipo de material biológico requiere de métodos de esterilización especiales,
diferentes autoclaves, algunos de estos materiales y las condiciones especiales de esterilización.

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vasos de Castillos de alambre Estufa precipitados y recipientes cerrados con tapones metálicos o laminas metálicas Jeringuillas de vidrio (3) Tubos de vidrio con tapones Estufa de algodón. algodón. limpios y otros plásticos que no -------------------------------. Las soldaduras de metal y vidrio pueden fundirse incluso a 115 °C en el autoclave. nitratos de células (11. Calor . Las cajas para la esterilización de las pipetas deben tener algodón en el fondo. vidrio(9) lisol. Radiación ultravioleta (12) resisten el calentamiento.filtración. Lisol (10) etc. Frascos a vacíos con tapones Cestillos de alambres Autoclave de rosca y junto de goma (4) 1. algodón. de vidrio con tapones de metal. 44/113 . fragmentos de vidrio. HCl resisten el calentamiento. SISTEMA DE ESTERILIZACION DEL MATERIAL DE LABORATORIO RECIPIENTE MATERIAL METODO Pipetas contaminadas Recipiente cilíndrico de Hipoclorito(10). autoclave Porta-objetos contaminados. 4. tubos de aluminio. nitratos de células (11. limpios y otros plásticos que no -------------------------------. 2. Propileno y otros plásticos que resistente el calentamiento -------------------------------. individual: envoltura de papel kraf Tubos de ensaye o de Gradilla de aluminio Estufa centrifuga. irradiación Profra. Para evitar la contaminación por la entrada de aire. o laminas metálicas Matraces de vidrio. Lisol. Leticia García Gómez Pág. Autoclave Aire -------------------------------. para evitar la rotura de los picos. Tubos de centrifuga de nylon. O por esterilización por separado de frasco y tapones la goma de silicón soporta el calor seco. Ma. Recipiente cilíndrico de vidrio. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología SISTEMA DE ESTERILIZACION DEL MATERIAL DE LABORATORIO RECIPIENTE MATERIAL METODO Pipetas o placas Petri limpias Para esterilización conjunta: Estufa cajas (1) de cobre o aluminio con tapas imbricadas (2). Tubos de centrifuga de nylon. 3.

45/113 .Los objetos a esterilizar tiene que sumergirse por completo en hipoclorito. cultivo sólido y líquidos. tubos cerrados. 1963) 12. Algunos recipientes de goma soportan muchas esterilizaciones. ampolletas soluciones salinas.. el plástico.. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología 9.. Filtración. o las soluciones de proteína o de base de los ácidos nucleicos. los objetos tienen que se expuestos a la luz directa de la lámpara y almacenados después en recipientes estériles. frascos. tubos cerrados. filtración. El algodón no deben emplearse. Los recipientes de vidrio para las pipetas deben en el fondo fibra de vidrio para evitar que se rompan los picos..La luz ultravioleta no atraviesa el vidrio. o papel de estraza Los corrientes medios de Frascos con tapón de rosca (5) Autoclave. Frascos con tapón. ampolletas. Profra. azucares etc. Ma. Medios de cultivo con suero. durante 12 horas.De propileno goma de vidrio.Los tubos de nitratos de celulosa pueden explotar si se esterilizan al autoclave (Silver. por lo menos. Por tanto. tubos cerrados. pues reduce el Hipoclorito. 10. Soluciones termolabiles Frascos con tapón de rosca (5) Tindalización. ampolletas Desinfectante volátil Suero Frasco de tapón de rosca (5) Desinfectante volátil. SISTEMA DE ESTERILIZACION DEL MATERIAL DE LABORATORIO RECIPIENTE MATERIAL METODO Soportes para los filtros en los Envoltura de papel kraf Autoclave. 11. Leticia García Gómez Pág.

el cual es introducido a las moléculas orgánicas mediante una reacción catalizada por la deshidroginasa glutamica. Nicotínico.COMPUESTOS NECESARIOS PARA LA FORMACIÓN DE CELULAS.Fuentes de Carbono: Necesario para la síntesis de numerosos compuestos orgánicos que constituyen el protoplasma. 3.COMPUESTOS NECESARIOS COMO FUENTE DE ENERGIA En las bacterias no foto sintetizadora. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología PRACTICA 5 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO SINTÉTICOS: NUTRICIÓN DE LAS BACTERIAS OBJETIVO: Conocer tanto los factores de crecimiento como los factores ambientales de crecimiento que requieren las bacterias para su cultivo in Vitro mediante la preparación d medios de cultivo sintéticos. b). 2.COMPUESTOS INORGÁNICOS. Ejemplos de estos son: Cloruro de Sodio. Estos elementos son asimilados por los microorganismos en forma iónica. Calcio y Cobalto. Cada uno de estos elementos es sintetizado por una sucesión discreta de reacciones enzimáticas y cada enzima se produce bajo el control de un gen específico. Hidrógeno. Leticia García Gómez Pág.. el fumarato.. Estos suministran enzimas necesarias que las bacterias son incapaces de suministrar. el oxigeno y el azufre. Siendo el CO2 la principal fuente de carbono. Azufre. a).MARCO TEORICO. Necesarios Para el metabolismo. 46/113 . tiamina. Manganeso.. Cuando el microorganismo experimenta una mutación genética. pirodixina. Ac.. biotina. Entre ellos están las vitaminas del complejo B. las bacterias han de disponer de un medio que contenga los compuestos químicos adecuados para sostener las reacciones biosinteticas necesarias. el ATP se genera por medio de reacciones de oxidorreducción.. como por ejemplo el NH3. I. Para sintetizar los diversos compuestos de su protoplasma y por lo tanto crecer y multiplicarse. Las sustancias que desempeñan estas funciones son de naturaleza diferente.. Siendo la principal fuente de este elemento en la mayoría de las bacterias el NH3. Hierro. el ácido láctico. Así. las cuales pueden considerarse como reacciones medias de donadores y receptores de hidrógeno. Ma. Bióxido de Carbono. las cuales se clasifican en: 1. siendo algunos de ellos el Cinc.Fuentes de Nitrógeno: Indispensable para la formación exclusiva de nuevas células. dependiendo del tipo de respiración: aeróbica. anaeróbica o fermentación. la cadena se rompe y el producto final no se Profra. Necesarios en su forma intacta como factores de crecimiento.COMPUESTOS ORGANICOS.. estas sustancias químicas se consideran como necesidades nutritivas. Algunos de estos nutrientes son necesarios en cantidades tan pequeñas que se denominan oligoelementos. Agua. Estos deben ser de dos tipos: fuentes de carbono y fuentes de nitrógeno. 4.

los cuales se consideran como factores ambientales que afectan el crecimiento celular bacteriano in Vitro. ATMÓSFERA. in Vitro generalmente es necesario preparar medios de cultivo sintéticos en los cuales las características y la concentración de cada uno de los ingredientes son exactamente conocidas y se han calculado considerando las necesidades nutricionales y ambientales de los microorganismos que se desea cultivar. Ma. Considerando el estado físico de un medio de cultivo cuando esta listo para ser inoculado.5 aunque existen algunas como Thiobacillus thioxidans que necesitan un pH de 2 y otras que requieren un rango de 8. En el laboratorio de Microbiología se emplean diferentes tipos de medios. los cuales son: CONCENTRACION DE IONES HIDRÓGENO O pH. Las especies bacterianas varían ampliamente en cuanto a sus condiciones térmicas optimas para su desarrollo. Leticia García Gómez Pág. ya que es lógico penar que los medios naturales son los tejidos infectados del huésped y que los microorganismos causales de la enfermedad crecerán mejor en los medios de cultivo sintéticos que se asemejan mas al medio ambiente proporcionado por los tejidos del huésped. las cuales pueden agruparse en tres categorías: Psicrofilas. independientemente de estos factores nutricionales que la célula elaborará o recibirá. Los microorganismos tienen un rango de pH bastante limitado y debe determinarse empíricamente el pH óptimo para cada especie. debe tenerse cuidado de emplear el medio mas adecuado para el asilamiento e identificación del microorganismo que sea el objeto de estudio. las que se desarrollan mejor a temperaturas de 30 a 37º C y termofilas. LUZ. La mayoría de las bacterias se desarrollan mejor en ausencia de esta. 47/113 . La humedad abundante es esencial para la multiplicación de las células vivas pero no para esporas. esto es por que viven pero no se reproducen. HUMEDAD.5 a 7. El organismo debe entonces obtener ese compuesto del medio y entonces se considerará como un factor de crecimiento para el organismo afectado. existen también factores físicos y químicos que se le deberán proporcionar a fin de que pueda multiplicarse.5 como Alcaligenes faecalis. los medios de cultivo sintéticos se agrupan en dos categorías. facultativos y anaerobios estrictos. Las bacterias en su mayoría crecen entre rangos de 6. La luz solar con su componente ultravioleta puede incluso ser letal para los microorganismos Para realizar estudios sobre el metabolismo microbiano. cuya temperatura optima para su desarrollo es de 50 a 60º C. por lo que pueden ser aerobios estrictos. Además. quistes y células durmientes. mesofilas. CLASIFICACION Y SELECCIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO. que son las que crecen mejor a temperaturas bajas (15 a 20º C). TEMPERATURA. Los microorganismos de acuerdo al tipo de respiración que realizan pueden requerir o no del oxigeno del aire. estos se clasifican en: Profra. ya que este rango comprende la temperatura óptima para los organismos de vida libre (huéspedes) y para las formas parásitas. la primera considera es estado físico en que se somete al inoculo microbiano y la segunda considera su contenido de nutrientes y factores de crecimiento en las dosis o formulación final. La mayoría de las especies son mesofilas. En general. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología forma más.

como se obtiene una superficie de contacto relativamente amplia y compacta como para que los microorganismos no se difundan ni se mezclen. de los cuales se puede disponer si se conocen los requerimientos nutricionales y el tipo de material que se desea cultivar. la desecación es lenta. existe en el comercio una amplia gama de medios de cultivo deshidratados. etc. Estos medios vienen referidos con el termino “médium” seguido a antecedido por un nombre especifico. También son útiles para estudiar características metabólicas de ciertos grupos bacterianos. como por ejemplo. es posible detectar algunas características metabólicas taxonómicas tales como las hemólisis en sus diversos grados y reacciones bioquímicas. Debe tenerse cuidado de emplear el medio mas adecuado para el aislamiento o identificación de las bacterias motivo de estudio. en este tipo de medios. Las ventajas de estos medios son muy diversas. 48/113 .  Medios selectivos o especiales. Agar SS. pruebas de fermentación en Entero bacterias c). por ejemplo.. Asimismo. por ejemplo SIM médium. si no también el recuento de colonias o recuento de gérmenes. ya que como estos medios siempre están contenidos en tubos de ensaye y tapados herméticamente. Ma. Otra ventaja muy importante es que en este tipo de medios es posible determinar no solo la morfología microbiana. un medio que contiene agar es sólido desde los 4º C y funde a 98º C. Leticia García Gómez Pág. razón por la que no solidifican completamente ni proporcionan una superficie sólida compacta. Las ventajas de utilizar medios sólidos estriban en que.. por lo que las bacterias crecen sin formar colonias. De este modo. Profra. caldo destrozado. que son:  Medios simples o básales. Caldo de Stuart.  Medios para pruebas bioquímicas. Son referidos comúnmente con el término de “caldos” seguido de un nombre específico. agar manitol.Medios de cultivo semisólidos: Son medios de cultivo que están adicionados con agar o gelosa en una concentración menor que la de los medios sólidos o agares. en una concentración que varia según la dosificación de nutrientes. por ejemplo: Agar nutritivo. estos se identifican mediante el termino “agar” seguido de un nombre especifico. a). así. por ejemplo: caldo nutritivo. También el utilizar un medio sólido permite al investigador aplicar técnicas específicas de inoculación y darse cuenta a simple vista si el cultivo ha sido o no contaminado con gérmenes extraños a la muestra que es objeto de estudio.Medios de cultivo líquidos: En estos medios solamente se encuentran los factores de crecimiento en solución acuosa.Medios de cultivo sólidos: Estos medios contienen aparte de los nutrientes una sustancia que se extrae de una especie de alga marina llamada agar. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología  Medios de cultivos sólidos o medios de agar. no contienen agar. b). etc. ya que al irse multiplicando van quedando suspendidas en el seno del liquido. Así. los medios se clasifican en cuatro grupos principales.  Medios de cultivos líquidos o caldos de cultivo. aproximadamente 6 g/lt. esto permite que cada germen que ha sido inoculado se nutra y se multiplique para formar conglomerados de bacterias que pueden verse a simple vista y que son llamados “colonias”.  Medios de cultivo semisólidos. son útiles como medio de transporte o de conservación de muestras por periodos de tiempo largos. Por lo que respecta a la clasificación de medios de acuerdo a su contenido de nutrientes o de factores de crecimiento.  Medios enriquecidos..

peptona y cloruro de sodio.. Este medio se recomienda para identificar bacterias hemolíticas como el genero Streptococcus. permitiendo el crecimiento solo de los gérmenes patógenos para los que este formulado. Ma. Algunos de estos complementos pueden ser: sangre fresca desfibrinada. reactivos que proporcionan un pH ácido. durante un minuto en baño Maria hirviendo. b). 49/113 . etc.  Medio Lôeffler: Es un medio sumamente enriquecido con suero.  Medio de Robertson: Este medio contienen además de la sustancia basal.Medios de cultivo selectivos: Son medios que deben su importancia al hecho de que contienen sustancias que impiden el desarrollo de la flora bacteriana no patógena. que impide el crecimiento de bacterias que no pertenecen a las Mico bacterias. además de los nutrientes básicos contienen lactosa y rojo neutro como indicador de fermentación.  Medio de Bordet-Gengou: Es un medio complejo que contiene patata. Algunos de estos medios son:  Agar McConckey: A este medio se le han incorporado sales biliares. huevo y glicerol.  Agar nutritivo: Consiste en extractos de carne.  Agar chocolate: Es el medio base para agar sangre..Medios enriquecidos: Estos medios están adicionados con complementos para crecer. También en algunos de estos medios se incorporan sustancias que estimulan el desarrollo de bacterias específicas. Su uso principal en el laboratorio es de almacenaje de especimenes. para gérmenes no exigentes. sales biliares que impiden el desarrollo de microorganismos no entéricos. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología a). ya que es selectivo para bacilos entéricos. solo que es llevado a 100º C antes de vaciarse a cajas de Petri. peptona. con lo que se permite el desarrollo de los hongos pero se inhibe el de las bacterias.  Caldo nutritivo: Es un extracto acuoso de carne con peptona al 1% adicionado con Cloruro de Sodio. suero. de utilidad para el cultivo de bacterias del genero Corynebacterium. Profra.Medios simples o básales: Estos medios son de uso general en el laboratorio. necesarios para microorganismos patógenos importantes.5 con lo que se favorece el desarrollo de los hongos e inhibe las bacterias.  Agar SS: El cual aparte de las sales biliares contienen verde brillante que inhibe a bacterias coliformes y permite el crecimiento de Salmonella y Shigella  Agar Sabouroud: Es un medio de dextrosa y peptona con un pH ajustado a 5 o 5.. Es útil para el cultivo de anaerobios y para mantener algunos cultivos patrón. el verde malaquita. glicerol y sangre. entre los cuales están los siguientes:  Agua peptonada: Se emplea como solución de peptona al 1 0 2 % y suministra metabolitos nitrogenados. Es de uso general y se emplea a menudo como base en la elaboración de medios más complejos. con lo que ocurre la hemólisis y se vuelve un mejor sustrato para Haemophilus sp. Para tal objetivo se emplean diferentes sustancias como por ejemplo. Leticia García Gómez Pág. agar y agua. el cual debe tenerse a 45º C aproximadamente y vaciarse directamente a cajas de Petri. c). Entre los medios enriquecidos mas usados se encuentran los siguientes:  Agar sangre (o gelosa sangre): Es un medio base al que se le adiciona un 10 % de sangre desfibrinada estéril. carne cocida. se emplea en el aislamiento y cultivo de Bordetella pertusis.

solo que se le ha adicionado un tercer carbohidrato. Los demás microorganismos no crecen y el medio conserva su color verde. El medio contiene además hierro ferroso que toma un color negro cuando se produce el H2S. 50/113 .  Infusión de cerebro y corazón o BHI: Este es un medio líquido muy útil. pues permite el desarrollo de microorganismos delicados. almidón y huevo. También con estos medios puede observarse la formación de gases en los medios líquidos si se emplean tubos de Durham invertidos. Biggy agar. Además se ha adicionado con verde de malaquita como inhibidor de otros microorganismos. Para observar la producción de indol a partir de triptofano o de un aminoácido semejante. Se agrega un indicador. Además de muchos otros medios de este tipo como el caldo de tetrationato. sulfatos y citratos así como glicerol. Esta prueba debe hacerse después de valorar la movilidad y la producción da H2S. Profra. agar endo.  SIM médium o medio SIM: Este medio se utiliza para la valoración de tres reacciones bioquímicas: o S: sulfuro de hidrógeno o 1 Para observar la producción de este gas a partir de tiosulfato. Los medios más usados para las pruebas bioquímicas son los siguientes:  Agar citrato de Simmons: Contiene citrato de sodio como única fuente de carbono y azul de timol con indicador. agar END. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología  Medio de Lowenstein Jensen: Es u medio completo que Contiene varios fosfatos minerales. dextrosa. por lo general rojo de fenol. d). tiosulfato de sodio y rojo de fenol como indicador. Sirve para valorar la fermentación de estos dos azúcares y también para la producción de sulfuro de hidrógeno.  Medio de Thayer-Martin: En este medio se han incorporado dos antibióticos. agar verde brillante.  Agar soya tripticasa: En este medio la triptona y la peptona de soya permiten el desarrollo de microorganismos delicados que requieren de suero. para señalar la acidez producida por la fermentación del azúcar. que inhiben el desarrollo de la mayoría de los microorganismos. la polimixina y la ristocetina. la sacarosa. o M: motilidad. La movilidad a través del medio semisólido se traduce por diseminación de la opacidad bacteriana a partir del trayecto de la picadura de inoculación.Medios para reacciones bioquímicas: Su composición generalmente consta de peptona enriquecida con un azúcar al 1%. para lo cual es necesario agregar unas gotas de reactivo de Erlich o de Kovac’s a la superficie del medio entubado. gonococos y meningococos. o I: indol. Leticia García Gómez Pág. Ma. Los microorganismos que pueden utilizar el citrato como fuente de carbono se desarrollan bien y el indicador se vuelve azul. etc. con excepción de las especies patógenas de Neisseria.. sustratos necesarios para el desarrollo de la familia de las Micobacterias. En presencia de indol se produce un anillo rojizo entre el medio y el reactivo.  Agar Kligler: Se le ha incorporado a la sustancia nutritiva: lactosa.  Agar triple azúcar: Semejante al agar Kligler. Puede adicionarse con agar.

fosfatos y rojo de fenol. Es un caldo idéntico al anterior solo que varía en la reacción final.  Medios con descarboxilasa: Se logra una mejor diferenciación de las enterobacterias estudiando la actividad específica de la descarboxilasa sobre una serie de ácidos aminados. pues los productos de la descarboxilación son siempre alcalinos. urea como sustrato. EQUIPO Y REACTIVOS. Frasco reactivo de agar nutritivo Balanza granataria Frasco reactivo de caldo nutritivo Autoclave Agua destilada: 200 ml aprox. si esto no ocurre el medio permanece ácido y conserva su color amarillo. el ácido aminado del caso y azul de bromotimol como indicador. Es útil para la observación de la producción de ureasa por bacterias del género Proteus.CH3) a partir de glucosa. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología  Caldo dextrosado PM: Es un medio compuesto por peptona— fosfato de glucosa. Los medios contienen una base nutritiva. Sirve para observar la licuación de la gelatina por acción de las gelatinasas bacterianas producidas por algunas enterobacterias. de largo Gradilla para 12 tubos Pinzas para tubo de ensaye Espátulas o cucharas METODO. En este caso el color rosa aparece en pocos minutos. el modo de preparación hasta el momento de su uso. Un color rojo indica una reacción positiva (ácida).  Caldo dextrosado VP: Se utiliza para valorar la reacción de Voges – Proskauer (de las pruebas IMVIC). arginina y ornitina.CHOH. de tal manera que solidifique a temperatura de incubación (37°C). Si el ácido aminado es descarboxilado. la naturaleza o el tipo de microorganismos para el que se ha sintetizado. Profra. Se añade un mililitro de KOH al 10% al caldo inoculado e incubado. además de glucosa. Se observa de cuando en cuando las 24 horas siguientes. el pH del medio se vuelve alcalino. Ma. 51/113 . Sirve para efectuar la prueba del rojo de metilo. Se obtiene una reacción más rápida añadiendo huellas de creatinina al medio incubado más 2. Al medio inoculado e incubado de 24 a 48 horas se le agregan cuatro gotas de indicador rojo de metilo. Leticia García Gómez Pág. como lisina. Incubadora a 37º C Matraz Erlenmeyer 100 ml (1) Mechero Bunsen Matraz Erlenmeyer 200 ml (i) Probeta de 100 ml (1) Pinzas de tenaza para matraz Tubos de 16 x 150 (12) Agitador de vidrio de 25 cm. Un color rosa de eosina indica una reacción positiva debida a la producción de acetilmetilcarbinol (CH3CO. Sin embargo. Se proporcionan envasados en forma deshidratada (en polvo) en frascos los cuales traen impreso en una etiqueta la composición aproximada en g/l de los nutrientes.  Gelatina: Se emplea este sustrato puro hidratado a una sola dosis apropiada.  Caldo urea: Contiene extractos de levadura.5 ml de NaOH al 40%. a pesar de la fermentación de la glucosa. las condiciones de envase y almacenaje y la dosificación peso/volumen a la que deberá de hidratarse para obtener un medio adecuado MATERIAL. PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO SINTETICOS Todos los medios de cultivo que se mencionan en los párrafos anteriores son algunos de los que se encuentran disponibles en el comercio de la industria química.

12. Disponer una serie de 8 tubos de l6x150 para contener cada uno 10 ml de agar nutritivo. 10. El manejo de ambos tipos de balanzas es sencillo pero diferente. Leer las indicaciones impresas en la etiqueta de cada frasco reactivo o el instructivo anexo de cada medio de cultivo. el otro mantenerlo en posición vertical en una gradilla y dejarlos a temperatura ambiente hasta que solidifiquen. la cual puede ser de tipo convencional (de platillos) o eléctrica (de tipo digital). Calentar directamente a la flama con ayuda de una pinza de tenaza o sobre una parilla eléctrica. Medir por tanteo el volumen requerido para cada tubo. la cantidad y el volumen. Esterilizar por el método que se indique. no con el matraz) de agua destilada requerida para el total de tubos de ensaye de cada medio. 3. Generalmente consisten en: vaciar el polvo a un matraz erlenmeyer que contenga ya el volumen exacto (se mide siempre con probeta. 7. fecha. equipo. Por lo general. Disponer una serie de 4 tubos de 16x150 para contener cada uno 10 ml de caldo nutritivo. Calcular por regla de tres la cantidad de cada medio de cultivo en polvo deshidratado que se requiere pesar para el volumen total requerido. 11. Construir una cajita de papel doblado para cada medio y proceder a pesar la cantidad requerida de cada medio de cultivo en polvo. 6. /pulg. la relación peso/volumen está dada en g/l o sea g/l000 ml. según el volumen requerido para cada tubo y el número de tubos. No usar pipeta. 9. Tapar cada uno de los tubos con algodón compacto y cubrirlos con un capuchón de papel estraza. Disolver por agitación el polvo en el agua. 13. en base a la dosificación señalada en el instructivo del frasco reactivo. 5. Por lo general. Anotar en cada cajita el nombre del medio de cultivo. Apartar de la serie de tubos de agar nutritivo dos tubos con medio de cultivo. Determinar el volumen total que se requiere de cada medio de cultivo. Ma. Colocar sobre el platillo de la balanza la cajita de papel doblado y pesarlo (esta técnica se refiere como “tarar”). Distribuir el medio de cultivo ya hidratado a los tubos de ensaye. Profra. Agregar con cuidado por medio de una espátula o cucharilla la cantidad en gramos requerida del medio de cultivo en polvo. 8. Etiquetar. 2. Disponer de una balanza granataria. si no se saben emplear es conveniente recurrir al auxiliar del laboratorio o al profesor para solicitar entrenamiento o instrucciones para el manejo de las mismas. se procede con la autoclave a 15 lb. Continuar la preparación de cada medio de acuerdo a las instrucciones del frasco reactivo. Leticia García Gómez Pág. durante 15 a 20 minutos según el tipo de medio del cultivo. Apartar de la serie de tubos con caldo nutritivo un tubo con medio de cultivo y dejarlo a temperatura ambiente Etiquetar con nombre del medio de cultivo. teniendo cuidado de que no se queme ni derrame al empezar la ebullición. 4. 52/113 . 14. En caliente colocar uno de ellos en posición inclinada sobre la mesa de trabajo. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología 1. escuela.

tanto los que se esterilizaron como los que no se sometieron a este proceso.  Representar con dibujos los procedimientos de preparación de medios de cultivo. continuar con el medio de cultivo en los tubos.  Investigación bibliográfica sobre nutrición bacteriana y curva de crecimiento bacteriano. después lavar y secar.  Anotar los resultados obtenidos después de la prueba de esterilidad con los tubos sometidos a esterilización y con los que no se sometieron a este proceso. fecha.  Anotar los cálculos necesarios para pesar la cantidad necesaria de cada medio de cultivo para el volumen requerido. la cual consiste en llevarlos a la incubadora 37° C durante 24 horas. 53/113 . Comparar ambos resultados. 20. Efectuar análisis macroscópico de la serie de tubos con esterilización. 19. Someter a la prueba de esterilidad TODOS los tubos. 16. Leticia García Gómez Pág. Efectuar análisis macro y microscópico de la serie de tubos sin esterilizar. Etiquetar con nombre del medio de cultivo. equipo. escuela. así como el método de preparación. Profra. 18. Retirar de la autoclave. esterilización y prueba de esterilidad. Se utilizarán en la siguiente práctica.  Anotar la composición de cada uno de los medios de cultivo preparados. Ver anexo de esterilización por autoclave REPORTE. Conservar los tubos que no manifiesten ningún tipo de contaminación microbiana. se deberán esterilizar primero. Marcarlos con la leyenda “estéril”. Dejar enfriar a temperatura ambiente. 21. distribución en los tubos. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología 15. Ma. Los tubos que si presenten contaminación microbiana. Al día siguiente: 17.

. METODO: Profra. REACTIVOS Y EQUIPO. a fin de saber llevarlas a la práctica en los experimentos que lo ameriten. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología PRACTICA 6 METODOS DE INOCULACIÓN BACTERIANA EN TUBOS. asa. MATERIAL. 1. el aislamiento o la resiembre de un microorganismo requieren de técnicas adecuadas tanto para el propósito del cultivo como para la naturaleza y requerimientos del germen.INOCULACIÓN EN MEDIOS INCLINADOS. lámpara. OBJETIVO: Conocer los métodos de aislamiento de las bacterias provenientes de diversas fuentes y ensayar las técnicas de inoculación en tubo. INTRODUCCIÓN.Inoculación por picadura 3. 2. ya sea para su identificación posterior o para base de cultivo. 1 Agar nutritivo inclinado en tubo de 16 x 150 inoculado con cultivo puro.) Colorantes para Tinción de Gram. Papel seda. 2 Mechero Bunsen AL DIA SIGUIENTE: 4 Portaobjetos 4 Cubreobjetos Equipo de Tinción (Tina. 1.Inoculación en medios inclinados. de un medio en placa o de medios líquidos en tubo.Inoculación por agitación. piseta.. una calibrada y una recta. alcohol- cetona 70-30. suero fisiológico. 1 Placa de cualquier medio con cultivo puro. 2 Agar nutritivo inclinado en tubo de 16 x 50 estériles. 54/113 . mechero. 1 Gradilla para tubos de 16 x 150. Microscopio.. (Cristal Violeta. 4 Agar nutritivo vertical en tubo de 16 x 50 estériles. puente. La siembra. Este tipo de cultivo es empleado principalmente para el aislamiento o la resiembra de cepas que pueden provenir de otro medio inclinado. Aceite de inmersión.Inoculación por emulsión 4. Leticia García Gómez Pág. NOTA: Por cada tipo de inoculación se deberá incubar un tubo testigo negativo.. Por lo que es de gran importancia conocer las diversas al respecto y su aplicación. 2 Caldo nutritivo vertical en tubo de 16 x 150 estériles. Ma.. lugol. safranina. 2 asas.

No se trata de extraer trozos del medio. suave o cremosa. Flamear durante algunos segundos la boca del tubo y al mismo tiempo el asa hasta el rojo vivo. Colocar al tubo recién sembrado un capuchón o gorrito de papel. usando el dedo meñique de la mano derecha. enfriarla por contacto con un punto del agar que no presente desarrollo de colonias. 4. no depositar los tapones en ningún lado. disponer la flama del mechero cercana al área de siembre. Depositarla sobre la mesa. Esterilizar al rojo vivo el asa puesto que contiene residuos de material bacteriológico. 10. fecha. evitar el contacto de la mano con la boca de los tubos después de flamearlos. Introducir el asa al agar. 12. 2. Profra. Manipular ahora el tubo estéril para inocular. Flamear la boca del tubo. 55/113 . 8. Colocarle un tapón. ¡PRECAUCIÓN!. tomar con la mano izquierda el tubo con cultivo y el tubo con medio estéril. Sin soltar el asa. 5. escuela y con el numero uno. Tomar con el asa calibrada un inoculo. Si la muestra bacteriológica (inóculo) proviene de un tubo de cultivo. quitar el tapón del tubo que contiene el cultivo bacteriano. Flamear la boca del tubo durante algunos segundos. colocar el tubo con cultivo en la gradilla. ¡PRECAUCIÓN! 14. Tomar con la mano derecha el asa calibrada de la misma manera que se sostiene un lápiz. NOTA: Un inoculo suficiente es tan solo la pequeña porción de colonias que se adhieren al asa al primer contacto. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología 1. trazar una estría (zig-zag) abierta a lo largo de la superficie. Así se sostiene el tapón hasta el término de la manipulación de este tubo. ¡PRECAUCIÓN!. quitar el tapón del tubo con agar nutritivo estéril usando el dedo meñique de la mano derecha. La manipulación de los tubos debe hacerse frente a la flama del mechero. Sin soltar ni el asa ni los tubos. 11. 15. Colocar el tapón. 3. numero de equipo. si no del material bacteriológico que ha crecido en la superficie. eliminar las corrientes de aire. Sin soltar el asa con el inoculo. 7. 9. Retirar el asa sin soltarla. ¡PRECAUCIÓN!. Leticia García Gómez Pág. recogerse el cabello (mujeres). 6. Retirar el asa. disponer sobre la mesa de trabajo exclusivamente el material de cultivo. Tómese las medidas de seguridad básicas: uso de cubre bocas. Introducir el asa con el inoculo hasta el fondo de la superficie inclinada y tocando suavemente la superficie del medio. etc. el cual es de consistencia blanda. flamear la boca del tubo recién inoculado. 13. Rotular con: nombre del medio de cultivo. Se continúa sosteniendo con la mano derecha. no introducir el asa a la profundidad del agar. Ma.

56/113 . Leticia García Gómez Pág. Para este método se utilizan medios sólidos contenidos en tubo de cultivo endurecido en posición vertical. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología 16. 12. Proceder repitiendo exactamente los puntos del 1 al 11 del caso anterior. Flamear la boca del tubo recién inoculado. Este método es adecuado para la inoculación de medios de cultivo líquidos. Repetir exactamente los puntos del 13 al 16 de los métodos anteriores. Retirar el asa teniendo cuidado de que el trayecto de salida se el mismo que el de entrada. Se deben mantener en posición vertical sobre todo cuando ocurre la solidificación del medio ya inoculado. Profra. emulsionándolo con la misma asa en el seno del liquido 13. Ma. Al inocular un medio liquido. METODO: 1.. ¡PRECAUCIÓN! 15. El método es empleado para conocer la motilidad de las bacterias. estos tubos de cultivo no deben ir acostados nunca en las rejillas contenedoras ni en la incubadora. que quede una sola picadura. 13.. 15 y 16. Para inocular se utiliza asa calibrada. Para ello se utilizan medios sólidos previamente calentados hasta una temperatura de 50º C al momento de inocular. usándose asa recta para inocular. 12. Colocarle el tapón. se introduce el asa al tubo ligeramente inclinado y el inoculo que lleva se vierte por frotamiento contra la pared del tubo. Se usa para efectuar pruebas bioquímicas de Enterobacterias y en algunas ocasiones para conservar muestras bacteriológicas por periodos de tiempo grandes. con la única diferencia de que el asa para inocular no es calibrada si no recta. 2. para conservar cultivos patrón y para algunas otras pruebas bioquímicas de Enterobacterias. Colocar este tubo en una gradilla y llevarlo a la incubadora a 37º C junto con los otros tres tubos de los procedimientos siguientes recién inoculados.INOCULACIÓN POR AGITACIÓN. Introducir el asa con el inóculo al centro del agar hasta la profundidad que permita el largo del asa. 4. Proceder de la misma manera que para el método del tubo inclinado repitiendo exactamente los puntos 14.. Incubarlos durante 24 horas.INOCULACIÓN POR PICADURA. ¡PRECAUCIÓN!. METODO: 1. Tener cuidado de que la trayectoria de la inoculación de efectué en línea recta. 14. Este tipo de inoculación es de empleo particular en el aislamiento de microorganismos anaerobios esporulados.INOCULACIÓN POR EMULSIÓN. el cual siempre estará contenido en un tubo de ensaye. Proceder repitiendo exactamente los puntos del 1 al 11 de los métodos anteriores. 3. es decir.

durante 10 minutos. fecha. 2. Sin soltar el asa. Ma. Incubar a 37º C durante 24 horas. Depositarla sobre la mesa. 17. Efectuar el análisis microscópico de cada tipo de siembre. 21. 16. Llevar a baño María de 50º C un tubo de agar nutritivo estéril. Dibujar los resultados del análisis macroscópico de cada uno de los cultivos. Describir cada uno. Rotular con: nombre del medio de cultivo. 15. 13. de equipo. Efectuar frotis en fresco para los cultivos líquidos que presentes desarrollo bacteriano. 4. escuela y el numero 4. 20. 57/113 . Efectuar investigación bibliografía de los géneros o especies bacterianas que se aíslen Profra. Llevarlo a la incubadora junto con los otros tres tubos inoculados. Colocar el tubo en una gradilla en posición vertical hasta que solidifique a temperatura ambiente. Rotar entre las manos el tubo para homogenizar el inóculo en el fondo del medio de cultivo. colocarle el tapón. ¡PRECAUCIÓN! 14. 18. Efectuar frotis de Gram para los cultivos sólidos que presentes desarrollo bacteriano. Retirar el asa procurando siempre que la muestra quede en el fondo del tubo. REPORTE: 1. Colocar al tubo un capuchón o gorrito de papel. Representar los campos microscópicos de cada uno de los cultivos. Comparar con el medio testigo negativo. 3. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología METODO: 1. Repetir exactamente los pasos del 1 al 11 de los métodos anteriores. Leticia García Gómez Pág. No es suficiente el esquema. Inocular introduciendo el asa calibrada con el material bacteriológico en el seno del medio de cultivo que se encuentra semisólido. Al día siguiente: 19. 12. Representar con esquemas los procedimientos de inoculación para cada tubo de los tipos de siembra. 2. num. Esterilizar al rojo el asa con los residuos del inóculo. Flamear la boca del tubo inoculado.

Koch enfrentó esta limitante agregando gelatina al caldo de cultivo. Los medios de cultivo sólidos se hacen adicionando una sustancia solidificante al caldo de cultivo. Las colonias así formadas tienen dimensiones desde mínimas. Equipo de Gram. Debemos a las investigaciones de Robert Koch el descubrimiento en 1881 del primer agente solidificante adecuado para el desarrollo bacteriano: la gelatina. Aunque en poco tiempo descubrió que esta no era la solución adecuada a su búsqueda. Leticia García Gómez Pág. ya que. hasta masas de varios milímetros de diámetro. algunas bacterias digieren la gelatina y a la temperatura optima para el desarrollo bacteriano (37º C) ésta ya no era sólida. Placas con base de agar sangre o agar soya tripticasa. textura y color. OBJETIVO: Efectuar el método de asilamiento de bacterias en placa de agar a partir de muestras bacteriológicas puras o mixtas y observar las características morfológicas macroscópicas del crecimiento bacteriano. hasta cierto punto depende de la naturaleza del medio. Una solución al problema provino algunos años mas tarde gracias a la observación hecha por Hesse. en un gran número de casos es constante y de gran valor diferencial. Koch enfrentó el problema de que dichas superficies carecían de los nutrientes necesarios para que se desarrollaran las bacterias productoras de enfermedad. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología PRACTICA No. esta se divide rápidamente y su progenie se agrupa en una masa de células idénticas que quedan prácticamente en posición fija. MARCO TEORICO. Cultivo puro sp en placa o en tubo inclinado Asa calibrada Mechero Incubadora AL DIA SIGUIENTE: Microscopio óptico. por lo que los medios de cultivo con ese sistema equivalían a caldo de cultivo. Los estudios iniciales demostraron que cuando se colocan las bacterias en un medio sólido como pan. presentan características no solo de volumen si no también de forma. Sin embargo. un solidificante vegetal extraído de algas marinas. huevo duro. REACTIVOS Y EQUIPO. 7 OBSERVACIÓN Y ANALISIS DE LAS COLONIAS METODO DE INOCULACIÓN EN PLACA. Cuando Se deposita una bacteria en la superficie de un medio sólido. ayudante de Koch. 58/113 . albúmina o la superficie fresca de papas cortadas. puede desarrollarse una colonia formada por una sola especie bacteriana. Esta masa se llama colonia y por lo general es visible a simple vista en 24 hrs. Si bien es cierto. MATERIAL. METODO: INOCULACIÓN EN PLACA CON ASA BACTERIOLÓGICA. Profra. apenas visibles. quien empleo el agar. Ma. (ESTRIAS SECTORIALES O ESTRIAS CRUZADAS).

8. Tomar un inóculo (una asada es suficiente) de la misma manera como se explica en la practica anterior. siendo el sector I el mas pequeño y el que debe quedar hacia el lado izquierdo del analista al momento de manipular en posición derecha (no invertida) la caja para su inoculación. (como se indica en la siguiente figura). Sin soltar el asa con el inoculo. Esterilizar el asa al rojo vivo. Esto nos da tres sectores. 3. Con la mano derecha manipular el asa. 5. Con la mano izquierda manipular la caja de Petri en posición derecha o el tubo inclinado con cultivos puros. Disponer la flama del mechero en el área de inoculación. 59/113 . I III X II 2. Tomar la caja de Petri en posición derecha y previamente marcada con tres sectores. 4. colocar sobre la mesa el tubo o caja con cultivo puro. 7. Manipularla de tal manera que el sector uno quede hacia el lado izquierdo del analista. NO SE DEBE HABLAR. 1. Profra. marcar la base de una caja con base de agar sangre o agar soya tripticasa estéril. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología Equipo de tinción. Leticia García Gómez Pág. teniendo cuidado de no levantar de ninguna manera la tapa de la caja pues el medio de cultivo podría contaminarse. Con un plumón o lápiz de cera. METODO SE RECOMIENDA USAR CUBREBOCAS SIEMPRE QUE SE TRATE DE INOCULAR O AISLAR MICROORGNISMOS. Papel seda. Aceite de inmersión. Ma. 6.

Cerrar la caja. Incubar a 37º C durante 24 Hrs. 12. sellar la caja con cinta adhesiva. 17. Si se considera necesario. 60/113 . Levantar la caja a la altura de la flama a una distancia de separación de no mas de 20 cm. 13. Tener cuidado de no introducir el asa en la profundidad del agar de siembra. Girar nuevamente la caja. No apilar mas de dos cajas. 14. Cerrar la caja previamente. Sin volver a tomar inóculo. Esterilizar el asa. Leticia García Gómez Pág. Al día siguiente: Profra. Trazar suavemente una serie de zig-zag o estrías muy cerradas a todo lo largo de esta superficie. Sin retirar la caja de la flama del mechero. Llevar las placas a la incubadora. hasta que el sector III quede a la izquierda. empezando este en el área de cruce de los dos sectores anteriores. 15. Por ningún motivo de deberá abrir la caja. Girar la caja hasta que el sector II quede ahora hacia la izquierda. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología 9. Cerrar la caja. retirar el asa y esterilizarla al rojo vivo. Ma. Levantar parcialmente la tapa (modo de ostra) 10. ya que la superficie de cultivo debe mantenerse totalmente plana 11. Mantenerla sobre la mesa en posición invertida. Etiquetar con los datos de rutina. empezando en el área de cruce de estos dos sectores. Sin volver a tomar inóculo. colocarlas en posición invertida. Introducir hasta el fondo del sector I el asa con el inoculo. trazar un zig-zag mas abierto que el del sector I. X I II III I III X II 16. trazar un solo zig-zag mas abierto que el del sector II. Esterilizar el asa.

 CONSISTENCIA: Dura.  TAMAÑO: Consiste en estimar la superficie que ocupa cada colonia en mm. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología 18. Investigar otras técnicas de aislamiento de colonias. dorado. convexa. 61/113 . rizoide. 1. 19. saliente. abultada. etc. Investigar las características de cultivo de los microorganismos identificados. Representar con esquemas los resultados de los puntos 1 y 2 posteriores a la incubación. REPORTE. ondulada. 2. cremosa. tales como inoculación por cuadros.  SUPERFICIE: Plana. Nota: Se deberá efectuar una descripción de la morfología colonial por cada tipo de colonia que haya desarrollado. mucosa. por cada variedad de colonia. Investigar acerca de los parámetros básicos para la descripción de la morfología colonia. por surcos. Tómese como guía los siguientes parámetros mínimos:  FORMA: Puntiforme. Ma. Efectuar el análisis macroscópico de las placas dirigido hacia la descripción de la morfología colonial. 3. Profra. mieloide. filamentosa. circular. etc. anillada concéntrica etc. 4. Efectuar el análisis microscópico con el método de Gram. etc. Leticia García Gómez Pág. amarillo.  COLOR: Blanco.

La identificación de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de características y diferentes criterios en la evaluación de similitudes. grupo de enzimas o determinada vía metabólica. Los sistemas comerciales mas comúnmente utilizados son:  BBL. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentación de distintos azucares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente. Identificar bacterias por medio de las pruebas bioquímicas apropiadas para cada una de las bacterias en estudio. revelador. tiras de papel filtro impregnadas en reactivos o pequeños compartimentos con medios prontos para sembrar. etc. OXIDASA Y CATALASA.). definida como bastones Gram. ENTEROTUBE II (Becton Dickinson).. generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. crecimiento a una determinada temperatura. por que proveen los reactivos prontos para su uso o porque son totalmente automatizables. ya sea sustratos deshidratados. llamadas pruebas bioquímicas convencionales. aerobios o anaerobios Profra. IDENTICACION DE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS OBJETIVOS. Para llevarlas a cabo. Es un sistema pronto para usar para la identificación de Enterobacterias. Leticia García Gómez Pág. se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo. Conocerá las características de las pruebas bioquímicas y la forma en que se realizan cada una de ellas. No significa de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. INTRODUCCIÒN. Existen diferentes sistemas que facilitan la realización de tales ensayos. comerciales. son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimático. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología PRACTICA 8 PRUEBAS BIOQUIMICAS. etc. El alumno al término de esta práctica aprenderá: Técnica de inoculación en las pruebas bioquímicas. En todos los casos se emplean códigos numéricos para la interpretación de resultados. Ma. 62/113 .Los comerciales utilizan modificaciones de las pruebas bioquímicas convencionales. a). crecimiento en presencia de inhibidores. indicador. ENSAYOS BIOQUIMICOS. Los ensayos bioquímicas tradicionalmente utilizados. Las pruebas o ensayos bioquímicas. etc. A la determinación de la especie se puede llegar según diversos sistemas (manuales de identificación. (-).) que puede ser diferente aún para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos. porque simplifican la interpretación de un resultado utilizando un valor numérico. porque proponen el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la identificación de un grupo bacteriano.

Es un sistema estandarizado para la identificación de bacterias Gram. 63/113 . agrupadas según el tipo de ensayo y se denominan según su nombre corriente: Profra. 2). (-). descarboxilaciòn de ornitina. se enumerarán a continuación solo las que se utilizan mas frecuentemente. fermentación de arabinosa. Leticia García Gómez Pág. Esta integrado por las siguientes pruebas: Producción de H2S en agar triple azúcar hierro (TSI).  OXI/FFERM TUBE II (Becton Dickinson). Consiste en un tubo de plástico con 12 medios de cultivo contenidos en compartimentos individuales que se inoculan simultáneamente en una etapa y permiten la detección de 15 características bioquímicas.  API 20 E. Si bien existen una gran variedad de pruebas bioquímicas empleadas con fines de identificación.Cultivar el microorganismo de un medio de propagación que contenga el sustrato de una enzima inducible y luego de la incubación demostrar la actividad enzimático. Otros sistemas: Quintet 3H de diagnostics Pasteur para Enterobacterias. atmósfera y temperatura adecuados. En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 hrs. producción de indol. ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador de la presencia del sustrato. oxidasa (-). Consiste en una plantilla de micro tubos conteniendo medios de cultivo deshidratados que se reconstituyen al agregar una suspensión bacteriana. Consiste en un tubo de plástico de 12 medios de cultivo que permite la realización simultánea de 14 pruebas bioquímicas.. versión miniaturizada del API 20 E API Listeria API NH (Neisseria-Haemophilus) Existen también sistemas de identificación comerciales para levaduras: API 20 C (Para levaduras del genero Candida) Auxacolor de Diagnostics Pasteur Fongiscreen 4H de Diagnostics pasteur (para identificación de lavaduras de interés médico) b). deben llevarse a cabo los correspondientes controles de calidad. Permite la realización de 20 pruebas bioquímicas a partir de una única colonia bacteriana. (-). fuerza iónica. Este sistema identifica las 23 especies mas frecuentemente aisladas de muestras clínicas. de incubación) en un medio en el que el microorganismo se desarrolla en forma optima. o de algún producto de su degradación. Es un sistema listo para usar para la identificación de bastones Gram. API10S. a pH... descarboxilaciòn de lisina. fermentación de sorbitos y producción de acetoìna (VP) En esquema la realización de una prueba bioquímica implica: 1). Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología facultativos. crecimiento en citrato. Ma. Siempre que se prepare un nuevo lote de medio de cultivo para una prueba. sembrando en dicho medio una cepa positiva y otra negativa para este test.En la cátedra se desarrollo un sistema para la identificación de Enterobacterias que consta de nueve pruebas bioquímicas convencionales (SYS 9E). aerobios o anaerobios facultativos. oxidasa (+). fenilialanina deaminasa.Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado sustrato o inhibidor y luego de la incubación visualizar el crecimiento y la degradación de un sustrato.

. Ornitina e) Urea 5..Producción de ácido..Descomposición de azucares simples.Detección de exoenzimas a) Lecitinasa b) Proteasas.. a) Indol b) H2S c) Fenilalanina d) Lisina.1. Ma.Fuente única de carbono a) Citrato b) Malonato c) Hipurato para coniformes 4.Requerimientos de oxigeno OF (Oxido-fermentación) Crecimiento en caldo tioglicolato 2. a) asimilación b) dentrificaciòn 4. a) Oxidasa b) Catalasa 2...2..Misceláneos Profra.N...Ensayos combinados a) TSI (Triple azúcar Hierro) b) LIA (Agar Hierro Lisina) c) Bilis esculina 6. arginina.Enzimas vinculadas con la respiración. (Orto nitro B-D-galactopiranosico) d) Esculina e) Hipurato 3.P. 64/113 .Detección de enzimas y vías metabólicas a) RM-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer) b) Gluconato c) O.2. Leticia García Gómez Pág. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología 1.Utilización de compuestos nitrogenados 4.. coagulasa c) Amilasas d) Celulasas e) Desoxirribonucleasas f) Acción de microorganismos sobre la sangre (Hemolisinas) 7..Descomposición de carbohidratos aminoácidos y otros.3.G. 2.. ácidos orgánicos y otros. o ácido y gas Fermentación de carbohidratos 2.1.Reducción de nitrato.

. MATERIAL  Portaobjetos  Tubos de ensaye 13 x 100  Aplicadores de madera  Mecheros de Bunsen (2)  Asa calibrada  Asa recta (sin calibrar)  Puente y charola para tinción  Cajas petri  Microscopio REACTIVOS  Colorantes para tinción de Gram  Aceite de inmersión  Agar nutritivo  Agar base sangre  Peróxido de Hidrogeno  Sensidiscos para oxidasa  Reactivo de Kovacs  Pruebas bioquímicas o Citrato de Simmons o Kligler o TSI Profra. (Solo para bacterias Gram negativas)  Inocular con la técnica de picadura y estría en citrato de Simmons.  Observar morfología colonial. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología a) KCN b) Bilis c) Producción de pigmentos 8. Kligler y TSI. 65/113 . Ma. PRUEBAS BIOQUÍMICAS. Leticia García Gómez Pág.  Inocular con la técnica de picadura en LIA y SIM  Inocular por agitación en UREA.  Observar y registrar resultados.Test de crecimiento o inhibición A) Temperatura B) NaC.  Realizar tinción de gram.  Incubar a 37º C durante 24 Hrs. C) Antibióticos 3º Realizar el examen macroscópico y microscópico de las bacterias en estudio. MATERIALES Y REACTIVOS.

Sirve para valorar la fermentación de estos dos azúcares y también para la producción de sulfuro de hidrógeno. dextrosa.  Gelatina: Se emplea este sustrato puro hidratado a una sola dosis apropiada. Es un caldo idéntico al anterior solo que varía en la reacción final. urea como sustrato. Se observa de cuando en cuando las 24 horas siguientes.  Caldo dextrosado VP: Se utiliza para valorar la reacción de Voges–Proskauer (de las pruebas IMVIC).  Agar triple azúcar: Semejante al agar Kligler. Al medio inoculado e incubado de 24 a 48 horas se le agregan cuatro gotas de indicador rojo de metilo. fosfatos y rojo de fenol. Leticia García Gómez Pág. para lo cual es necesario agregar unas gotas de reactivo de Erlich o de Kovac’s a la superficie del medio entubado. Los demás microorganismos no crecen y el medio conserva su color verde.  Agar Kligler: Se le ha incorporado a la sustancia nutritiva: lactosa. La movilidad a través del medio semisólido se traduce por diseminación de la opacidad bacteriana a partir del trayecto de la picadura de inoculación. Sirve para observar la licuación de la gelatina por acción de las gelatinasas bacterianas producidas por algunas enterobacterias. tiosulfato de sodio y rojo de fenol como indicador. Esta prueba debe hacerse después de valorar la movilidad y la producción da H2S.CH3) a partir de glucosa. Se obtiene una reacción más rápida añadiendo huellas de creatinina al medio incubado más 2.  Caldo dextrosado PM: Es un medio compuesto por peptona—fosfato de glucosa. Profra. Se añade un mililitro de KOH al 10% al caldo inoculado e incubado. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología o LIA o SIM o UREA INTERPRETACION: Medios para reacciones bioquímicas: Su composición generalmente consta de peptona enriquecida con un azúcar al 1%. Para observar la producción de indol a partir de triptofano o de un aminoácido semejante. En presencia de indol se produce un anillo rojizo entre el medio y el reactivo. En este caso el color rosa aparece en pocos minutos.  SIM médium o medio SIM: Este medio se utiliza para la valoración de tres reacciones bioquímicas: o S: Sulfuro de hidrógeno o 1 Para observar la producción de este gas a partir de tiosulfato. 66/113 . Es útil para la observación de la producción de ureasa por bacterias del género Proteus. Ma. o I: indol. Un color rosa de eosina indica una reacción positiva debida a la producción de acetilmetilcarbinol (CH3CO. Los medios más usados para las pruebas bioquímicas son los siguientes:  Agar citrato de Simmons: Contiene citrato de sodio como única fuente de carbono y azul de timol con indicador. o M: Motilidad.5 ml de NaOH al 40%. Un color rojo indica una reacción positiva (ácida). Los microorganismos que pueden utilizar el citrato como fuente de carbono se desarrollan bien y el indicador se vuelve azul. por lo general rojo de fenol. para señalar la acidez producida por la fermentación del azúcar. solo que se le ha adicionado unos terceros carbohidratos. Se agrega un indicador. Sirve para efectuar la prueba del rojo de metilo.  Caldo urea: Contiene extractos de levadura.CHOH. El medio contiene además hierro ferroso que toma un color negro cuando se produce el H2S. También con estos medios puede observarse la formación de gases en los medios líquidos si se emplean tubos de Durham invertidos. de tal manera que solidifique a temperatura de incubación (37° C). la sacarosa.  Medios con descarboxilasa: Se logra una mejor diferenciación de las enterobacterias estudiando la actividad específica de la descarboxilasa sobre una serie de ácidos aminados.

Si se deja acumular. Anotar la morfología macroscopica y microscópica de cada bacteria. arginina y ornitina. Conclusiones de los resultados obtenidos. si esto no ocurre en el medio permanece ácido y conserva su color amarillo. el pH del medio se vuelve alcalino. Dibujar los campos microscópicos de cada placa e indicar la valoración del grado de desarrollo bacteriano. células del centro de una colonia bien aislada. Si el ácido aminado es descarboxilado. 67/113 . Peróxido de hidrógeno al 3% (diluir la solución de 30% con agua destilada). Transferir. 4. a pesar de la fermentación de la glucosa. REPORTE: 1. Principio El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aeróbico de los hidratos de carbono. la catalasa es una hemoproteína de estructura similar a la de la hemoglobina. 2. Medios y reactivos 1. a la superficie de un portaobjetos en el que se coloco una pequeña gota de agua. 2. 3. Excluyendo los estreptococos. 2. además de glucosa. Representar los campos microscópicos que se hubieran observado. Añadir 1 o 2 gotas de peróxido de hidrógeno al 3%. Cultivo de 24 horas del microorganismo en un medio no selectivo y que no contenga sangre. Los medios contienen una base nutritiva. Químicamente. pues los productos de la descarboxilación son siempre alcalinos. es comúnmente utilizada para diferenciar estreptococos (negativos) de estafilococos (positivos). Procedimiento Prueba en portaobjetos 1. Se recomienda no añadir el organismo al Profra. Emulsionar bien. con asa. el ácido aminado del caso y azul de bromotimol como indicador. Prueba de Catalasa Introducción La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua. el peróxido de hidrógeno es letal para las células bacterianas. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología como lisina. Ma. Leticia García Gómez Pág. La catalasa transforma el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo a la siguiente reacción: H2O2 H2O + O2 (burbujas de gas) La prueba de catalasa. Sin embargo. excepto que los 4 átomos de hierro de la molécula están en estado oxidado (Fe+++) en lugar de reducido (Fe+ +). la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad catalasa. Identificar la especie o el género bacteriano. llevada a cabo en portaobjetos o en tubos.

haemolyticum. ambos -) de Erysipelothrix (-) Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos técnicas: 1. Dado que algunas bacterias pueden poseer enzimas distintas de la catalasa. Originariamente.  Bacillus (+) de Clostridium (-). indica una prueba positiva.pyogenes y C. Profra. Ma. Controles Staplylococcus aureus: positivo Streptococcus spp. formadas a los 20 a 30 segundos no se consideran una prueba positiva. 2. La principal excepción es Streptococcus. luego de añadir el peróxido de hidrógeno.  Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+. Leticia García Gómez Pág. especialmente si se utilizan ansas que contengan hierro. 68/113 . capaces de descomponer el peróxido de hidrógeno. se considera una reacción fuertemente positiva. Método del portaobjetos (recomendado):  Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Se mide la altura que alcanza la formación de burbujas de gas en el tubo.  Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H 2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. Prueba semicuantitativa: las determinaciones cuantitativas de catalasa se llevan a cabo más comúnmente en la identificación de micobacterias. ya que se pueden producir falsos positivos.: negativo Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. Prueba en tubos o placas de agar Añadir unas gotas de peróxido de hidrógeno al 3% directamente sobre la superficie de una placa o tubo de agar donde se ha desarrollado un cultivo puro del organismo en estudio Interpretación 1. esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:  Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). unas pocas burbujas diminutas. Una columna de burbujas de 50 mm o más. con las excepciones de C. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología reactivo. Prueba cualitativa: la rápida aparición y producción sostenida de burbujas de gas o efervescencia.

 Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo). 2. colocar un sensidisco de oxidasa. en forma perpendicular a la estría de los estreptococos B por investigar. 69/113 . Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología  Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo). Profra. detectada por la presencia de una zona de aclaración en forma de punta de flecha en la intersección de ambas estrías indica una identificación positiva de estreptocos del grupo B. Un área de hemólisis mas intensa. Es importante que las placas no sean incubadas anaerobicamente pues algunas cepas de estreptococos B del grupo A producen una CAMP positiva en ausencia de oxigeno. Atkins y Munich-Peterson (“CAMP”). Desechar el portaobje PROCEDIMIENTO.  tos en un recipiente con desinfectante.  Dejar reaccionar un minuto y hacer las observaciones. El factor CAMP es una sustancia extracelular producida por estreptococos del grupo B que intensifica la lisis de los glóbulos rojos producida por la B-lisina estafilococica. es catalasa negativo PRUEBA DE OXIDASA 2º Realizar la prueba de oxidasa a la bacteria en estudio. La prueba se realiza estriando una placa de agar sangre con una cepa de estafilococos productora de B-lisina. PRUEBA DE CATALASA 1º Realizar la prueba de catalasa a la bacteria a estudiar. de la siguiente manera:  Colocar una gota de peroxido de Hidrógeno (agua oxigenada) en el portaobjetos  Con un aplicador de madera tomar una colonia de la caja con bacterias a identificar y depositarla sobre la gota de agua oxigenada  Homogenizar y observar a los 30 seg. de la siguiente manera:  En medio de agar nutritivo con bacterias en estudio. Resultados: Presencia de burbujas. Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre. es catalasa positivo Ausencia de burbujas. la prueba ha sido solo recientemente utilizada para la identificación de estreptococos del grupo B. Leticia García Gómez Pág. se debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dará un falso resultado positivo. PYOGENES Si bien el fenómeno CAMP fue descrito en 1994 por Christie. Método del tubo de ensayo:  Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en slant densamente inoculado. Ma. PRUEBA DE CAMP PARA LA IDENTIFICACION DE S.  Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

que tienen como finalidad matar o destruir las bacterias patógenas provenientes de los enfermos. inocular S. Leticia García Gómez Pág. glutaraldehido acuoso 2 %. 70/113 . formaldehído 1-10 %. Los desinfectantes son sustancias químicas de acción fuerte y que pueden ser irritantes para la piel y mucosas de los enfermos ya que poseen poca toxicidad selectiva: no solo son tóxicos para los parásitos microbianos. Profra. En la profesión de la Medicina hay que tener presente que los microorganismos existen constantemente a menos que se hayan tomado precauciones especiales para matarlos. Hasta que se supo que los microorganismos provocan enfermedades. desinfección. Algunos desinfectantes de uso común son: óxido de etileno (gas).  En un medio de cultivo agar sangre. sobre especímenes infectantes y saber diferenciar un antiséptico de un desinfectante. compuestos fenolicos 1-3 %. PRACTICA 9 ACCION DE LOS ANTISEPTICOS Y DESINFECTANTES In Vitro. En la actualidad se procura enseñarle al estudiante de Medicina a manejar los llamados agentes desinfectantes y las sustancias antisépticas. no se confiaba en la necesidad de esterilización. Realizar conclusión. barrer la descarga lateralmente. aereus). mesas. hipoclorito de sodio 1 %. MARCO TEORICO. OBJETIVO. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología PRUEBA DE CAMP. pyogenes a 3 mm de distancia de la línea media (donde se ha inoculado S. inodoros. cómodos. REPORTE Anotar los resultados obtenidos de cada bacteria y reportar.  Incubar 24 Hrs a 37º C  Observara y registrar resultados. antisepsia y medidas sanitarias. estos tuvieron que desarrollarse y estudiarse en cultivos puros de laboratorio. inhibirlos o suprimirlos. y hubo que investigar el efecto de diversas sustancias y condiciones sobre ellos. Ma. sino también para las células huéspedes. etc. Resultó necesario crear instrumentos para observar los microorganismos. por lo tanto pueden ser usados solamente para los enfermos.  Inocular S. pero no pueden administrarse por vía general y no son activos en los tejidos. Observar la acción de los agentes químicos desinfectantes y antisépticos a diferentes concentraciones. lisol 5 %. auereus en la línea media. termómetros.

compuestos de amonio cuaternario como los jabones. disponer las placas de agar nutritivo estéril. Algunos ejemplos de antisépticos son : agua oxigenada. 4.1% Pipeta pasteur c/ gotero Benzal 1:1000 y 1:10 000 Pipetas de 5 ml. Aproximadamente de la suspensión de bacterias vías que se le ha proporcionado. etc. detergente y el benzal o cloruro de benzalconio. (10) Sol. rotularlas con los nombres de los agentes químicos que se están empleando. 7. Asa calibrada Tintura de yodo 2% Mechero (2) Nitrato de plata 1% Suspensión bacteriana Suero fisiológico Placas con agar nutritivo (10) AL DIA SIGUIENTE (opcional): Equipo de gram. tintura de yodo 2%. ¡USAR UNA PIPETA PASTEUR CON BULBO! ¡NO ASPIRAR CON LA BOCA! 5. 8. METODO: 1. Flama. agentes oxidantes como el permanganato de potasio. Leticia García Gómez Pág. Incubar durante 24 Hrs. llevarlas a la incubadora a 37º C. Usar cubrebocas. 6. conc. Fenol 5% Tubos 13X100 (10) Clorox MR Gradilla Bicloruro de mercurio 0. colocarlas en posición invertida. Rotular los tubos de 13X100 con los nombre de los agentes desinfectantes y de los antisépticos que se proporcionen. METODO: DILUCION BACTERIANA EN AGENTES QUIMICOS. MATERIAL. Al día siguiente: Profra. Agregar a cada uno de los tubos 1 ml.1% y los compuestos orgánicos de mercurio. 71/113 . Marcar cada placa con los datos escolares. Tapar con parafilm cada uno de los tubos y dejarlos en reposo por 15 min. De cada tubo de dilución. Colocar en cada uno de ellos 1ml. bicloruro de mercurio 0. Del reactivo con el que se han rotulado. REACTIVOS Y EQUIPO. Ma. compuestos yodados. 3. Mientras tanto. de jabón. cabello recogido. tomar un inoculo con el asa y sembrarlo con la técnica de estrías sectoriales en la placa de agar correspondiente. 2. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología Los antisépticos son sustancias que matan o inhiben las bacterias al igual que los desinfectantes pero que pueden aplicarse sobre la piel y mucosas sin producir irritación u otros efectos sobre los tejidos del huésped. hexaclorofeno 2%. compuestos de metales pesados como el nitrato de plata 1%.

3. Ma. Identificar la especie o el género bacteriano. Dibujar los campos microscópicos de cada placa e indicar la valoración del grado de desarrollo bacteriano. Investigación bibliográfica de los mecanismos de acción de los antisépticos y de los desinfectantes. 72/113 . (+++). Leticia García Gómez Pág. Esterilizar las cajas el autoclave. (+) o (-). Lavar. Representar los campos microscópicos que se hubieran observado. Conclusiones de los resultados obtenidos. Valorar el grado de desarrollo bacteriano contra la eficacia del agente químico. Efectuar análisis microscópico de cada una. 4. Profra. 2. REPORTE: 1. Retirar las placas de la incubadora. 10. Secar. 11. Efectuar análisis microscópicos a criterio. (++). Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología 9. tomando como base el criterio de cruces: (++++).

. MÉTODO DE DILUCIÓN EN TUBO: En este método. Es posible que los resultados de estos análisis hagan necesaria la elección de un medicamento diferente. Después cada tubo se inocula con el microorganismo cuya existencia se está estudiando. pueden ser útiles las pruebas de sensibilidad a medicamentos de los microorganismos aislados. bacterias entéricas gramnegativas). MARCO TEÓRICO En el tratamiento de una infección.Cuando el microorganismo aislado es frecuentemente resistente a los medicamentos antimicrobianos (por ejemplo. 73/113 .. 1:10. este tipo de pruebas eran fastidiosas y se emplean poco. etc. el tratamiento antimicrobiano inicial se escoge en base a la impresión clínica. septicemia). 1:20. 3. La determinación de estas cantidades puede realizarse por uno de los siguientes dos métodos principales: dilución ó difusión. después de que el médico se convence de que existe una infección y ha hecho un diagnóstico etiológico tentativo en base a la clínica. 2. Su concentración en los líquidos del cuerpo o en los tejidos. Leticia García Gómez Pág. Ma. La identificación de ciertos microorganismos que son uniformemente sensibles a los medicamentos elimina la necesidad de nuevas pruebas y permite la elección de los medicamentos óptimos únicamente en base a la experiencia.. 2. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO La actividad antimicrobiana se mide in Vitro para determinar: 1. Sin embargo. por lo que el advenimiento de series Profra.Cuando un proceso infeccioso es grave y parece ser mortal menos que sea tratado específicamente (por ejemplo. La potencia de un agente antimicrobiano en solución. La sensibilidad de un microorganismo dado a concentraciones conocidas de medicamento. Las pruebas de laboratorio para determinar la s sensibilidad a los antibióticos se encuentran indicadas en las siguientes circunstancias: 1. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología PRACTICA 10 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD BACTERIANA in vitro A LOS ANTIBIOTICOS OBJETIVO Conocer la acción in vitro de los antibióticos y analizar las aplicaciones y limitaciones del antibiograma. la droga probable contra un germen infeccioso se añade en una serie de diluciones: 1:5. En otras circunstancias. 3. Después de incubar todos los tubos se establece comparación de los crecimientos y se valora la resistencia del microorganismo investigado para cada droga. A tubos que contienen un medio de cultivo adecuado para la bacteria estudiada.En ciertas infecciones en las que la erradicación de los organismos infecciosos requiere del uso de medicamentos que sean rápidamente bacteriostáticos. meningitis. 1. Bajo esta consideración puede elegirse un posible medicamento de elección: un antibiótico. Es preferible que antes de administrarlo se tomen muestras de laboratorio para el aislamiento del agente causal.

MÉTODO: Se recomienda como medida de seguridad usar cubrebocas y gorra. A partir del disco se produce por difusión un gradiente de concentración del antibiótico en el medio. Después de la incubación se toma el diámetro de la zona clara de inhibición que rodea al depósito del medicamento. aceite de inmersión. además de la simple interacción del medicamento y los microorganismos (por ejemplo la naturaleza del medio. los cuales se colocan en un medio sólido en placa que ha sido sembrado en forma abundante con el germen de prueba. Como la difusión es un proceso continuo. difusibilidad.  Unidiscos de distintos antibióticos. La dificultad principal estriba en las diferentes velocidades del crecimiento para los diversos microorganismos y deben corregirse variando la densidad del inóculo. permite el informe de susceptible o resistente para un microorganismo al mismo medicamento (método de Kirby Bauer). Mantener la flama cercana a área de inoculaciones. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología preparadas con diluciones de caldo para numerosos medicamentos diferentes. como medida del poder inhibidor del antibiótico contra el microorganismo de prueba.  Asa calibrada.  Placas con agar para antibiograma o base de agar sangre o agar soya. MÉTODO: DIFUSIÓN EN PLACA. 74/113 . REACTIVOS Y EQUIPO. Profra. sin embargo puede lograrse una estabilización permitiendo que la difusión se inicie antes de que comience el crecimiento bacteriano. Sin embargo. 2. la estandarización de estas condiciones permite un ensayo cuantitativo de la potencia del antibiótico o de la sensibilidad del microorganismo. Leticia García Gómez Pág.  Cultivo puro en placa. en placas para microtitulación.T.  Tubo de 13X100 con 2 ml. MATERIAL.  Estrella con distintos antibióticos. Es obvio que este método está sujeto a muchos factores físicos y químicos. papel seda. ha incrementado y simplificado mucho este método. Evitar corrientes de aire. De caldo nutritivo o BHI con hisopo estéril. tamaño molecular y estabilidad del medicamento). Ma. El uso de un disco sencillo para cada antibiótico con estandarización cuidadosa en las condiciones de la prueba. el gradiente de concentración nunca es estable en largo tiempo. MÉTODO DE DIFUSIÓN EN PLACA: cuando se determina la sensibilidad bacteriana por este método. la mayor parte de los laboratorios emplean discos de papel filtro impregnados con antibióticos: unidiscos o multidiscos.

De halo de inhibición problema. Ma. Profra. inocular por emulsión con asa calibrada el medio de cultivo líquido contenido en tubo de 13X100. 75/113 . 5. Llevarlas a la incubadora. 3. Medir con una regla graduada en milímetros el halo de inhibición que halla producido cada antibiótico: zona circundante al sensidisco con ausencia de desarrolló bacteriano. 4. Si se dispone de unidiscos individuales (sensidiscos). asegurándose de que los inóculos se realicen en toda la superficie de la placa. a partir de una relación simple de los mm. disponer de otra placa de agar para antibiograma. Aquéllos sensidiscos cuyo halos es igual o mayor que el estándar. 12. Introducirlo al caldo que contiene la emulsión bacteriana motivo del estudio de sensibilidad antibiótica. A 37°C. en contraste con la superficie de método de cultivo que no es afectada por el medicamento. 9. sembrar la placa de agar antibiograma de modo de estrías cerradas o expansión total. Disponer de una placa con medio de cultivo estéril para antibiograma a temperatura ambiente. Anotar los radios de los halos de inhibición estándar para cada antibiótico. Incubar durante 24 hrs. No colocar más de cinco o seis unidiscos. Posteriormente lavarlas y secarlas. inocularla de la manera antes descrita y colocar con una pinza de disección esterilizada a la flama los unidiscos uno a uno. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología 1. Disponer de un hisopo estéril. Presionar ligeramente cada sensidisco para asegurar el contacto con la población bacteriana. De un cultivo puro en placa. se les asigna el valor de 0% resistente y 100% susceptible. Considerando que aquéllos sensidiscos que no presenten halo reinhibición se les asigne el valor de 0% de susceptibilidad y 100% resistente. 11. Disponer de una pinza de disección esterilizada a la flama. 7. Calcular el % de susceptibilidad para cada antibiótico utilizado para el antibiograma. proceder a disponer las cajas de Petri para la esterilización a la autoclave. Mantenerlo a temperatura ambiente o en incubadora si el procedimiento no se va a efectuar de inmediato. colocarlas invertidas. Efectuar análisis macroscópico para evaluar la acción antimicrobiana de cada antibiótico. 10. Tomar una estrella de antibióticos y colocarla bien cerrada sobre la placa recién sembrada. procurando que estos queden separados entre sí y de los bordes de la placa unos dos centímetros. Leticia García Gómez Pág. 2. Al término de la interpretación del antibiograma. Sellar las placas. Mantenerla tapada perfectamente con el tapón de algodón. 6. Retirar las placas de la incubadora. tapar inmediatamente para evitar contaminación. Etiquetar con los datos escolares y de cultivo. AL DÍA SIGUIENTE: 8. Evitar que con el hisopo se derramen gotas de caldo emulsionado sobre la placa para el antibiograma. Usando el hisopo como instrumento de siembra o inoculación. que representan el 100% de susceptibilidad o sensibilidad.

Con los valores estándar y los resultados prácticos. % de susceptibilidad y % de resistencia. 2. 3. Ma. Investigación bibliográfica sobre los factores que pueden afectar la actividad antimicrobiana in vitro. Leticia García Gómez Pág. Profra. puede efectuar frotis para microscopía por Gram. Representar los resultados de cada antibiograma. 76/113 . señalando el nombra del agente etiológico motivo de estudio. halo de inhibición práctico. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología REPORTE: 1. diseñar una tabla con columnas que contenga: antibiótico.

pero también Streptococcus del grupo C y Arcanobacterium (Corynebacterium) haemolyticum. 4. Bordetella pertusis y Corynebacterium diphteriae. La causa mas frecuente de faringitis bacteriana es Streptococcus beta hemolítico del grupo A. Branhamella catarrhalis. Un escaso número de Streptococos beta hemolítico del grupo A en una muestra no necesariamente indica colonización y puede representar infección. Staphylococcus aureus y a nivel de género a Neisseria sp. II. entre los cuales podemos mencionar Streptococcus alfa hemolítico. Leticia García Gómez Pág. La detección de estreptococos beta hemolítico del grupo A en muestras faríngeas es importante debido al resurgimiento de la fiebre reumática aguda y la presentación de un padecimiento parecido al síndrome de choque tóxico.Enumerar los microorganismos que forman parte de la flora normal de vías respiratorias superiores. Estas muestras también son útiles para detectar los agentes etiológicos de laringitis.Obtener en forma adecuada la muestra de un exudado faríngeo. aspirado sinusal.. exudado nasal. Ma.. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología PRACTICA 11 EXUDADO FARINGEO PROCESAMIENTO E INTERPRETACIÓN DE MUESTRAS DE VÍAS RESPIRATORIAS SUPERIORES I. Klebsiella pneumoniae. 77/113 . 2. INTRODUCCIÓN La obtención y manejo adecuado de las muestras de vías respiratorias superiores tienen un lugar importante dentro de los procedimientos para la detección e identificación de Streptococcus pyogenes beta hemolítico. se asocia con este cuadro. exudado nasofaríngeo. Profra. entre otros. OBJETIVOS 1.Realizar la identificación de Streptococcus pyogenes beta hemolítico. Las muestras de vías respiratorias superiores incluyen: exudado faríngeo.. 3. Haemophylus influenzae del grupo B. lavado nasal. Existen en vías respiratorias superiores una variedad de microorganismos que forman parte de la flora normal transitoria o permanente. succión nasofaríngea. Staphylococcus coagulasa negativos.. epiglotitis. otitis externa y angina de Vincent y para detección de portadores faríngeos de Staphylococcus aureus y Neisseria meningitidis.Expresar diferentes tipos de muestras que se pueden obtener en vías respiratorias. Neisseria meningitidis que pueden encontrarse transitoria o permanentemente ocasionando o no cuadro clínico. Neisseria meningitidis. Micoplasma pneumoniae. otitis media.

.. (epiglotitis) y Arcanobacterium haemolyticum (muy rara). evitando tocar lengua. úvula. paredes de la boca. III. Las muestras deben ser colectadas en ayunas y sin previo aseo bucal y debe ser remitido principalmente para la detección de Streptococcus del grupo A. 78/113 . Ma. aunque también puede ser útil para detectar Neisseria meningitidis. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología EXUDADO FARÍNGEO Un exudado faríngeo se debe obtener de la región de las amígdalas o de la porción posterior de la faringe en zonas de abscesos.manitol  Tubo con medio de Biggy  Hisopos estériles  Abatelenguas estériles  Asas bacteriológicas  Colorantes para la tinción de Gram  Aceite para inmersión  Papel limpia lentes  Microscopio  Diapositivas Segunda sesión:  Cultivos de la práctica anterior  Cultivos demostrativos  Preparaciones permanentes IV. Leticia García Gómez Pág.MATERIAL PARA OBTENER UN EXUDADO FARÍNGEO Primera sesión:  Placa de gelosa sangre  Placa de gelosa chocolate  Placa de gelosa sal.MÉTODO Profra. Haemophylus influenzae. exudados o inflamación.

Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología 1. Fijar el frote y teñirlo con el método de gram. La coaglutinación es un método simple y rápido que consiste en aglutinar a estreptococos del grupo A con anticuerpos específicos unidos a estafilococos. Se le pide al paciente que abra bien la boca. Identificar Streptococcus por morfología colonial y celular. Gelosa sal-manitol. Ma. en caso negativo no hay cambio de color. Medio selectivo para Staphylococcus. La sensibilidad a la bacitracina para la identificación del grupo A es una prueba presuntiva. Continuar con la distribución del inóculo por estriado en placa con el asa bacteriológica. gelosa sangre y sal-manitol. precipitación. Se hace descender suavemente la lengua con un abatelenguas y se introduce un hisopo estéril hacia la faringe posterior. tornándose en color amarillo. 5. D. Gelosa chocolate. por morfología colonial. El hisopo se pasa suavemente y rápido con movimientos hacia arriba y abajo por detrás de la úvula y entre los pilares tonsilares. Además frotarlo en la superficie del medio de Biggy y por último hacer un frote en portaobjeto. si hay crecimiento de Staphylococcus aureus. Toma de la muestra. INTERPRETACIÓN (IDENTIFICACIÓN PRELIMINAR) Gelosa sangre. Las colonias que se observan de color café oscuro a negro corresponden a candida. . Incubar los cultivos a 37 grados centígrados durante 24 hrs. La diferenciación de los grupos de Lancefield de estreptococos beta hemoliticos es importante para orientar el tratamiento y pronóstico de estas infecciones. Leticia García Gómez Pág. Identificar Neisseria. 6. F Y G son los mas frecuentes y de ellos el que causa patologías mas graves es el A. Rotar el hisopo en cada una de las zonas marcadas de las placas de gelosa chocolate. Para realizar el aislamiento de bacterias del exudado faríngeo. Determinar el tipo de hemólisis (alfa o beta).B. Los grupos A. Además podemos realizar: Prueba de conglutinación para identificación de Streptococcus pyogenes beta hemolítico grupo A. marcar las zonas de inoculación en cada placa de medio de cultivo. C. Profra. y prueba de las oxidasas. celular. Medio de Biggy. Hacer la observación microscópica con el objetivo de 100X. habrá fermentación del manitol y habrá viraje del indicador en el medio de cultivo. 3. aglutinación en látex y coaglutinación. 2. 4. 79/113 . Existen métodos para su identificación definitiva como son: inmuelectroforesis.

En otro pozo del portaobjetos llevar a cabo la prueba de control negativo. . Comparar. Colocar una gota de una suspensión de las colonias aisladas en un pozo de un portaobjetos para aglutinación 2. 5. FLUJOGRAMA OBTENCION DE LA MUESTRA Con el hisopo estéril frotar la parte posterior de la faringe. estriar el asa. tinción de Gram. El acoplamiento se lleva a cabo entre la proteína A del estafilococo y la fracción Fc del anticuerpo. sin embargo los resultados negativos deberán ser confirmados por cultivo. García Gómez Morfología colonial picadura Pág. y Colonias café fermentación de manitol. Identificación de Staphylococcus Medio de transporte Biggy Observación Candida de la sp. en el80/113 medio con Manitol + manitol – Gram. . lo que permite el diagnóstico rápido. 4. Reactivo Strip A: anticuerpos específicos de conejo acoplados a Estafilococos no viables. Colonias aisladas de estreptococo beta hemolítico proveniente del paciente son el antígeno. Realizar oscuro o negras prueba de coagulasa. las amígdalas particularmente. Esta prueba puede hacerse directamente a partir de exudado faringeo. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología MATERIAL: . prueba de oxidasas Inocular con el hisopo. Gelosa sangre sembrar por estría para Gelosa chocolate Identificación de Neisseria (enriquecido) Gelosa +manitol Coagulasa coagulasa – aislamiento y Ma. epidermidis para aislamiento. Control negativo: gammaglobulina de conejo no inmunizado acoplada a estafilococos no viables. INTERPRETACIÓN: La formación de grumos indica presencia de estreptococos beta hemolítico del grupo A. incubar a hrs 37º C 24 hrs . Mezclar bien y leer a los 2 min contra fondo oscuro.hacer Profra. aureus S. lengua y saliva. Leticia sp. Incubar a 37º C 24 S. 3. los puntos blanquecinos así como cualquier área que presente signos de inflamación o exudación. morfología colonial. Añadir igual cantidad del reactivo Strip A. Inocular con el hisopo. MÉTODO: 1. evitando el contacto con la úvula.

Señale el fundamento de la prueba de coaglutinación. Mencione que microorganismos aislaría con los diferentes medios de cultivo utilizados en la práctica 4. 81/113 . Ma. Describa la obtención de una muestra de exudado faríngeo 2. Mencione los tipos de muestras que puede obtener de vías respiratorias superiores 3. Streptococcus beta hemolítico Prueba bacitracina COAGLUTINACIÓN Halo de inhibición. bacitracina Sin halo de inhibición. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología Identificación de Streptococcus por su morfología colonial. sensible Streptococcus grupo A bacitracina resistente Streptococcus grupo no A AUTOEVALUACIÓN 1. forma y agrupamiento. sus ventajas y limitaciones. Leticia García Gómez Pág. Profra. Gram y tipo de hemólisis.

Profra.Sólo es necesaria una pequeña cantidad de excremento. 82/113 .. Yersinia. 7... De todas las muestras recolectadas. Ma. En un cultivo sistemàtico de heces.. PROCEDIMIENTO PARA LA RECOLECCION: 1.. 5. el exàmen se hace para encontrar Salmonella. Leticia García Gómez Pág. 6. E. prolongada en pacientes inmunosuprimidos. 4. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología PRACTICA No..No debe usarse para el cultivo el excremento depositado en la tasa del sanitario.Debe recogerse las heces en un recipiente seco. Campylobacter. Un solo cultivo de heces negativo no se debe considerar como confirmaciòn de que no hay bacterias infecciosas. las heces son las que contienen el mayor nùmero y la màs amplia variedad de microorganismos.. OBSERVACIONES: 1.Cryptosporidiosis es causa de diarrea intensa. 2.Rotular el frasco con todos los datos del paciente. Al menos se hacen generalmente tres cultivos si el cuadro del paciente sugiere alguna bacteria y si los dos primeros cultivos han resultado negativos.Un excremento diarreico suele dar buenos resultados.Se prefiere un excremento recientemente eliminado como muestra..Candida albìcans en gran nùmero en las heces se considera patògeno en presencia de un tratamiento anterior con antibiòticos. Un trozo del tamaño de una nuez aproximadamente. 3. coli enteropatògena(en el recièn nacido) y cultivos puros de estafilococos. Las alteraciones de la flora normal por los antibiòticos con frecuencia cambian los microorganismos normalmente inocuos en patògenos. 12 COPROCULTIVO INTRODUCCION: Los cultivos de heces se hacen comúnmente para identificar microorganismos paràsitos de enfermedades entèricas y virus del tracto intestinal. Shigella..Enviar al laboratorio para su proceso. 2.

. la vulva ola ropa. 13 UROCULTIVO 1.. Profra. b) Se retira la tapa de un recipiente estèril y se coloca con su superficie exterior hacia abajo sobre un àrea limpia. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología PRACTICA No. Una vez que han pasado los primeros 25 ml en el sanitario. la paciente orina. b) Se retrae completamente el prepucio para dejar expuestos los extremos del pene.HOMBRES: a) El paciente debe lavarse cuidadosamente las manos con jabòn y agua y después secarla con una toalla limpia. Ma. d) El paciente desecha la primera porciòn de orina directamente al sanitario y después recolecta directamente dentro del recipiente estèril. Con un aseo previo. No deben recolectarse las ùltimas gotas de orina. Leticia García Gómez Pág. 2.. Como la bolsa toca la superficie de la piel y por consiguiente recoge gèrmenes comensales.LACTANTES Y NIÑOS: En lactantes y niños pequeños. debe analizarse la muestra tan pronto sea posible. 3. la paciente debe abrirse los labios. c) Se limpia la zona alrededor del meato urinario con gasas antisèpticas. e) Después de limpiarse. 83/113 . c) La regiòn alrededor del meato urinario debe asearse de adelante hacia atràs con una gasa antisèptica. El vaso con que se recoge debe sostenerse de tal manera que se evite el contacto con las piernas. la orina debe recogerse en bolsas de plàstico estèriles especiales. d) Con una mano.. Los dedos deben conservarse apartados del borde y de la superficie interna del recipiente. la orina se recoge directamente en el recipiente estèril.MUJERES: a) La paciente debe lavarse cuidadosamente las manos con jabòn y agua y después secarlas con una toalla limpia. dejàndolos apartados hasta haber recolectado la muestra.

se desecha la aguja de la jeringa y se sustituye por otra estèril antes de que se inyecte la muestra al frasco de cultivo.Rotular las muestras con los datos del paciente y la fecha y hora de la toma de muestras.... el tipo persistente continuo o recurrente de bacteriemia es indicativo de una situación màs seria. PROCEDIMIENTO: 1. 4.Debe frotarse el sitio propuesto para la punciòn con un antisèptico o alcohol a 70 %. Profra. 2.Se recomienda realizar por duplicado el cultivo. Aunque una bacteriemia ligera transitoria es un dato frecuente en muchas enfermedades infecciosas. OBSERVACIONES: 1.. 6.. a los 7 y 14 dìas de incubaciòn.Se realiza la extracción de sangre.. Se recolecta siempre que se sospeche bacteriemia o septicemia. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología CULTIVOS DE SANGRE O HEMOCULTIVOS INTRODUCCION: La sangre para cultivo es posiblemente la muestra sencilla màs importante sometida al laboratorio microbiològico para su exàmen. Ma.Se deben realizar reportes parciales de los cultivos negativos a las 24 y 48 hrs... 3. 84/113 .La venipunciòn debe hacerse con una jeringa y aguja estèriles.. evitando cualquier contaminación en el sitio que se ha limpiado. para que se inicie el tratamiento adecuado de inmediato.Se debe informar al mèdico inmediatamente de los resultados positivos. Leticia García Gómez Pág. 5.Deben limpiarse los tapones de los frascos de cultivo con yodo y secar al aire y después con alcohol al 70 %. 2.

El paciente debe estar en completo ayuno antes de la recolecciòn. Leticia García Gómez Pág.. Una muestra de esputo puede ser expectorado desde el interior profundo de los bronquios.Tuberculosis pulmonar.Hay que examinar la muestra antes de enviarla al laboratorio.. 2..No debe refrigerarse la muestra..Deben enviarse las muestras al laboratorio ràpidamente... Profra.. 2. 3. 3. una sustancia de los pulmones.El esputo debe ser expectorado de los bronquios 4. para saber si es verdaderamente esputo o sólo saliva.Sospecha de infecciones pulmonares micòticas.Sospecha de neumonía viral. 2. 4..Bronquiectasia.La muestra debe recolectarse en un frasco estèril. 7. obtenida mediante expectoración profunda...Bronquitis crònica. PROCEDIMIENTO: Debe instruirse al paciente de que esta prueba requiere esputo traqueobronquial.. (Por lo general es material purulento o mucopurulento). ni es baba ni saliva. Los cultivos de esputo son importantes en el diagnòstico de: 1. 6. 3. 85/113 . 5. Ma.Deben etiquetarse las muestras con todos los datos del paciente..Infecciòn neumònica por micoplasma.Neumonía bacteriana.. CONSERVACIÒN Y ENVÌO DE LA MUESTRA: 1. de modo que los microorganismos aùn sean viables. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología CULTIVO DE ESPUTO O EXPECTORACIÒN INTRODUCCIÒN: El esputo no es material de la regiòn posnasal.. 1.

2. de preferencia.. Procedimiento para la recolecciòn usando equipos con hisopos estèriles... Leticia García Gómez Pág.. incluya el sitio y las caracterìsticas macroscòpicas de la herida... 3..Envìe al laboratorio para su proceso. 2. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología CULTIVOS DE HERIDAS INTRODUCCION El material procedente de heridas infectadas puede revelar una variedad de microorganismos aerobios y anaerobios.Abra el recipiente para la recolecciòn. 6. 7.Inserte el hisopo dentro del medio de transporte o soluciòn salina estèril..Envìe al laboratorio para su proceso. el aparato gastrointestinal y el genitourinario tambièn pueden invadir con facilidad otras partes del cuerpo ocasionando infecciones graves y a menudo mortales.Si se sospecha infecciòn por micobacterias u hongos. Ma. 4.Rotule la jeringa con todos los datos del paciente.En caso de cultivo de heridas secas.Rotule la muestra con todos los datos del paciente.Aspire el material de 1 a 3 ml. 5. 2. 1. Puesto que los anaerobios son la microflora predominante en seres humanos y permanentemente se encuentran en vìas respiratorias superiores.Debe tener cuidado de no tocar el extremo del hisopo.. PROCEDIMIENTO: De preferencia se debe recolectar con ayuda de una jeringa estèril. saque el hisopo y tome una muestra aplicando el hisopo estèril directamente sobre la fuente del cultivo. debe recogerse el exudado o el tejido en lugar de usar hisopo.. 86/113 . Profra. incluya el sitio y las caracterìsticas macroscòpicas de la muestra. los hisopos se deben humedecer con soluciòn salina estèril antes de usarlos. 1.

4.El pus de infecciones estafilocòcicas es gelatinosa.El pus de Pseudomona aeruginosa es azul verdoso. Profra. LAS MUESTRAS MÀS ÙTILES PARA EL ANÀLISIS SON EL PUS O LOS TROZOS DE TEJIDO...Las infecciones por actinomicosis muestran grànulos de “azufre”. Leticia García Gómez Pág. 3. 87/113 . Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología SI ES POSIBLE TOMAR UN FROTIS DIRECTO DE LA MUESTRA SERIA DE GRAN UTILIDAD EL EXÀMEN MICROSCÒPICO PARA COMPLEMENTAR EL ESTUDIO... 2. Ma. OBSERVACIONES: 1.El pus de lesiones estrèptocòcicas es delgado y seroso. TAMBIEN SON ACEPTABLES LAS CUBIERTAS DE HERIDAS QUE SUPURAN.

Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología Profra. Ma. 88/113 . Leticia García Gómez Pág.

Las estructuras dela muestra atraen los colores y así como el microorganismo se puede ver con el microscopio de luz. inoculación de animales. que son sales formadas por un Ion positivo y otro negativo. Existe una técnica de tinciòn. y generalmente se fija a la laminilla pasándola rápidamente a través de la flama de un mechero de Bunsen. cajas de Petri. Para preparar un cultivo es necesario estimular la multiplicación de los microorganismos o celulas vivas en un medio especial que promueva el crecimiento del material en cuestión. etc. agar chocolate. Ma. 14 EXUDADO NASAL. evitando que sea muy superficial. Inmediatamente se siembra en medios de cultivo adecuados (agar sangre. El cultivo se prepara de acuerdo a las propias necesidades alimenticias y se refrigera o incuba. Los frotis se observan después de la tinción con colorantes. PAI. Envío: Las muestras se protegen del calor excesivo con un refrigerante. pruebas serologicas y pruebas cutáneas.) o se inocula en el medio de transporte de Stuart. Cada microorganismo tiene sus propios requerimientos para crecer (que consisten en la combinación adecuada de ingredientes nutritivos. ÒTICO Y ÓPTICO. TOMA DE MUESTRAS EXUDADO CUTANEO Toma: Con un hisopo de algodón se toma una porción del exudado. OBJETIVOS: o El alumno conocerá los principales cultivos a realizar para la identificación de microorganismos patógenos. El frotis se prepara distribuyendo una pequeña cantidad de la muestra en una laminilla. Los frotis también se pueden fijar con una solución de metanol y posteriormente se observan con el microscopio. en la que se colorea la base pero los microorganismos quedan incoloros y ello permite el estudio de su estructura Cultivos. Para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas se utilizan seis categorías distintas de pruebas de laboratorio. La tinción. Los cultivos se guardan en tubos de ensayo. dependiendo de la temperatura que precisa cada microorganismo. Leticia García Gómez Pág. Estas incluyen frotis y tinciones. MARCO TEÓRICO TÉCNICAS DE DIAGNOSTICO. botellas de dilución u otros recipientes. EXUDADO FARINGEO Profra. semisólido o liquido. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología PRACTICA No. uno de los cuales tiene color. A continuación se describirá brevemente algunas de ellas: El frotis. cultivos. o Utilizará las tinciones adecuadas para la identificación de microorganismos. biopsias. El recipiente contiene un alimento (llamado medio de cultivo) que puede ser solido. llamada tinciòn negativa. 89/113 . temperatura y presencia o ausencia de oxígeno). Este material también se puede teñir. o Desarrollará las técnicas para cultivo y el procedimiento para la realización del mismo.

se puede transportar en medio de Stuart. el hisopo se mantiene en un medio de transporte y se envía de inmediato con refrigerante: Agentes virales: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapón de rosca con 0. Con esta muestra se deben hacer de inmediato frotes en portaobjetos limpios que se fijan de inmediato con acetona. se presiona ligeramente la uretra con el fin de que lo expulse y éste se recoge con un hisopo de alginato estéril el cual se deposita en el medio de transporte de Stuart. En casos de gonorrea. Agentes bacterianos: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapón de rosca con medio de Amies o de Stuart. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapón y se tapa herméticamente. HEMOCULTIVO Toma: Se limpia el sitio de la punción con una torunda de algodón impregnada con etanol al 70% o Profra. se emplea un hisopo de alginato de calcio adecuado para toma de muestras en varones. cuando se produce un exudado abundante. Con un hisopo de algodón se hace un raspado de las áreas hiperémicas. EXUDADO VAGINAL Y ENDOCERVICAL Toma: Se utiliza un espejo vaginal para revisar el cérvix. Envío: El tubo con el medio de transporte se envía lo antes posible de modo que no llegue al laboratorio después de 24 horas. No es necesario refrigerar la muestra. 90/113 . El hisopo se mantiene in situ de 10-15 segundos durante el acceso de tos. Cuando se sospecha de infección por clamidias. dacrón o nylon (nunca de algodón en caso de sospechar Bordetella) por las fosas nasales hasta la nasofaringe. Ma. EXUDADO NASOFARINGEO Toma: Se pide al paciente que se siente y coloque su cabeza hacia atrás. la muestra se debe sembrar de inmediato en la placa de agar de Thayer Martin y sólo que ésto no sea posible. el cual se introduce unos 2 a 4 cm en la uretra y se frotan las paredes haciendo girar el hisopo durante 5 a 10 segundos. Las preparaciones se envuelven individualmente y se envían protegidas de la luz y el calor excesivo. Leticia García Gómez Pág. se introduce el hisopo (de alginato de calcio o de dacrón. En caso de gonorrea no se hace ningún tipo de limpieza y se recoge una muestra de exudado con ayuda de un hisopo. con esta muestra se deben hacer de inmediato frotes en portaobjetos limpios que se fijan con acetona. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapón y se tapa herméticamente. Envío: Si la muestra no se va a procesar de inmediato. Se ilumina bien la cavidad orofaríngea y con un abatelenguas se empuja la lengua hacia abajo para facilitar el acceso a la parte posterior de la faringe. Envío: El tubo y las preparaciones se envía lo antes posible de modo que no lleguen al laboratorio después de 24 horas. así como de las membranas o manchas de Koplic. sin tocar los cornetes y tratando de producir un acceso de tos. Envío: Agentes virales: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapón de rosca con 1 a 2 mL de solución salina isotónica estéril. Cuando se sospecha de una infección por clamidia. EXUDADO URETRAL Toma: Se recomienda al paciente que no orine por lo menos una hora antes de tomar la muestra. nunca de algodón) o el cepillo unos 2 a 4 cm dentro del canal endocervical y se rota cuidadosamente presionando contra la pared. si es que las presenta. evitando el contacto con las superficies vaginales. purulentas o necróticas. Se introduce un hisopo de alginato de calcio. Agentes bacterianos: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapón de rosca con medio de Amies o de Stuart. después de lo cual se retira rápidamente. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapón y se tapa herméticamente.5 mL de solución salina isotónica estéril. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología Toma: Se pide al paciente que se siente y coloque su cabeza hacia atrás. se limpia el exocérvix con un hisopo de algodón para eliminar el moco y el exudado. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapón y se tapa herméticamente.

Las heces obtenidas del suelo. con la cantidad de 10 gramos. 1. Sólo en caso de sospechar parásitos. MATERIA FECAL Toma: Las muestras fecales pueden ser obtenidas en recipientes limpios de boca ancha y con tapa hermética que permitan su fácil transporte. ORINA Toma: Se usa un recipiente estéril. Envío: Cuando se trate de estudios virológicos. la muestra no debe refrigerarse. Si se trata de hisopo rectal en solución salina. Estudios virales: el tiempo de envío debe ser menor a los tres días y en condiciones de refrigeración. De inmediato la sangre se inyecta a través del tapón (previamente desinfectado con alcohol) de un frasco con medio bifásico para hemocultivo. la muestra debe enviarse inoculada en medios específicos. 91/113 . Leticia García Gómez Pág. Envío: La muestra se debe enviar de inmediato al laboratorio con refrigerante... Aunque el sondeo vesical es la forma ideal para evitar la contaminación. siguiendo las indicaciones que se describen en el inciso M20. Estudios virales: el envío debe tardar menos de un día. Cuando el envío tarda más de 24 horas.Los cultivos faringeos son importantes para diagnosticar las siguientes enfermedades: a). No hay que refrigerarlo. Si se sospecha de una infección bacteriana. debido a la posibilidad de extender la infección en el paciente. se utiliza en casos muy excepcionales en el hospital. El envío se hace a temperatura ambiente. excusado así como del pañal no son satisfactorias. el envío se hace a temperatura ambiente. sueros y L. en envases apropiados correctamente sellados.R. Si se trata de un adulto. sin anticoagulante. Envío: La muestra se debe enviar de inmediato al laboratorio. la micción espontánea es la técnica más aconsejable: después de una cuidadosa limpieza de la región urogenital con agua y jabón y después con benzal al 1%. Estudios para determinación de coproantígenos por ELISA: el tamaño que se envía será similar al tamaño de una nuez independientemente de la consistencia. Cuando la muestra presente sangre y/o moco de preferencia mandar de esa parte. Estudios bacteriológicos: se inocula en un medio de transporte (Cary Blair o Amies) y se envía a temperatura ambiente Estudios parasitológicos: se adiciona formol al 10% v/v neutralizado y se homogeniza bien. la muestra se envía refrigerada. Explicación de la prueba. Por esto. debido a que pueden contaminarse con material extraño. (CON HISOPO O LAVADO) Valores normales Negativo: No hay crecimiento. de boca ancha con tapa de rosca. se toman de 5 a 8 mL de sangre total. Se deben recuperar unos 5 mL los cuales se conservan en tubos de vidrio estériles con tapón de rosca. ni acompañarse de hielo.C. se instruye al paciente para que deseche la primera parte de la micción y se colecta el chorro medio. Ma. CULTIVOS FARINGEOS. Estudios parasitoscópicos: tres muestras consecutivas (de diferente día). de preferencia que no sean de vidrio. Envío: El frasco del hemocultivo se empaqueta bien en un recipiente con doble cubierta para evitar su ruptura. o de 2 a 3 mL si se trata de un niño. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO (LCR): Toma: La obtención de la muestra es responsabilidad exclusiva del médico quien la tomará bajo rigurosas condiciones de asepsia. se usa la primera parte de la micción.faringitis estreptocócica Profra. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología solución de yodo al 2%.

Moniliasis d). 6. 5.Bordetella pertussis y obtención de virus.Estreptococo hemolítico  b)...... secreción de una herida quirúrgica) 4.Infección viral e)..El cultivo faringeo se puede utilizar para detectar portadores de microorganismos como: a)...Tipo de muestra (tejido de granulación.Difteria: se debe tomar un cultivo faringeo y uno nasofaringeo c).Sitio donde se tomo la muestra 3. MATERIAL Y REACTIVOS Medios De cultivo Hisopos estériles Solución fisiológica Medio de transporte Estufa de incubación Portaobjetos Microscopio Reactivos para tinción de Gram Equipo para tinción Mecheros de Bunsen Asa calibrada Profra.Infección amigdalina f). Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología b).Neisseria meningitidis c). Incluya lo siguiente: 1....Estudio que se pide.Fiebre reumática c).Staaphylococcus aereus INFORMACION PARA EL LABORATORIO MICROBIOLOGICO. Leticia García Gómez Pág..... 2..Fecha y hora de la recolección 2.El cultivo faringeo puede ayudar a establecer el foco infeccioso en casos de: a). 92/113 .Glomérulo nefritis hemorrágica aguda 3.Escarlatina b). La muestra se debe rotular con los datos personales del paciente y el nombre del médico.Corynebacterium diphtheriae d).Tratamiento actual con antibióticos... Ma.. liquido de un absceso..Diagnostico del paciente.-Faringitis gonocòcica g).

Haemophylus Incubar durante 24 Hrs a 37º C y observar los resultados Profra. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología METODO Toma de muestra Stuart P. Leticia García Gómez Pág. 93/113 . fresco Incubar 30 min. Conckey Enterobacterias Staphylococo Agar Sangre SM Streptococo Gram (+) Sabouroud Hongos Agar Chte. Ma. A 37 37 37º C Tinción de Gram Mc.

comúnmente ésta se maneja para obtener. transmisión. MARCO TEORICO. se debe evitar la coagulación de la misma. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología PRACTICA 2-15 UNIDAD DOS DE MICROBIOLOGIA EXTRACCION Y MANEJO DE LA SANGRE PARA ANALISIS. prevención y curación de enfermedades causadas por microorganismos o sus productos. leucocitos y plaquetas. MARCO TEORICO: La sangre es de importancia fundamental en la producción. Sangre completa o total: Se conoce como sangre completa o total al tejido sanguíneo líquido constituido por la fracción liquida que es el plasma y los elementos figurados tales como: eritrocitos. Esta preparación se conoce como sangre total o sangre anticoagulada. para lo cual basta añadir un anticoagulante al tubo de Los anticoagulantes generalmente son soluciones de oxalatos de potasio. heparina o sales del EDTA (ácido etilen diamino tetra acético). diagnóstico. Para lo cual deberá desarrollar la siguiente metodología. La coagulación de la sangre es un fenómeno muy complejo en el cual intervienen por lo menos 15 factores (factores de coagulación). B) Suero sanguíneo. El plasma deberá ser un líquido transparente amarillento claro. Leticia García Gómez Pág. 1. Con el fin de estudiar adecuadamente dichos procesos es necesario conocer además la técnica correcta de la extracción. OBJETIVO Que el alumno aprenda a obtener muestras de sangre con objeto de analizarla y conozca la manera de tratarla según el estudio para el que esté destinada. El procedimiento más sencillo consiste en añadir una gota de la solución acuosa anticoagulante por cada 5 mLde sangre. Si se desea que la sangre extraída se conserve como tal. es señal de que hubo hemólisis. II. Después de recibir la sangre en el tubo. Si se desea plasma habrá que centrifugar para acelerar la sedimentación de los elementos figurados. 3) Obtención de suero sanguíneo. I. de citrato de sodio. Suero sanguíneo: Se denomina suero sanguíneo o simplemente suero al líquido transparente de color pajizo que es el plasma menos los componentes de la coagulación. METODOS: 1) Extracción de sangre. lo que significa que esta muestra sanguínea no es idónea para análisis y deberá desecharse y obtenerse una nueva muestra. III. A) Sangre completa o total. 2) Obtención de sangre completa o total. INDICACIONES GENERALES. Ma. 94/113 . se tapa éste y se mezcla suavemente por inversión para que el anticoagulante se distribuya homogéneamente. Este proceso guarda estrecha relación con la fibrinólisis (un Profra. observa este de un color rojizo o francamente rojo. las técnicas para el manejo de sangre completa o de sus componentes dependiendo del tipo de análisis al que se le vaya a destinar.

En condiciones anormales. se inicia el mecanismo de coagulación y tiene lugar la coagulación de la misma en un tiempo de dos a seis minutos. EXTRACCION DE SANGRE VENOSA. Centrífuga clínica. oxalatos u otro) Torundas con alcohol. Limpiar la zona de punción con una torunda con alcohol de uso clínico. 2) Tanto el material para extracción como material de vidrio deberán estar perfectamente limpios (sin residuos de sustancias químicas o detergentes) y secos. un suero lechoso o quiloso indica una comida reciente mientras que un color rojizo o rojo es señal de hemólisis. unos 7 cm. La extracción de la sangre se efectuará a un alumno voluntario de cada equipo. Pero cuando se escapa la sangre. Tubos de ensaye 13Xl00 (4) Gradilla p/tubos 13xl00 (1) Solución anticoagulante (EDTA. REACTIVOS y EQUIPO: Jeringa estéril desechable. Ma. Cuando el coagulo se retrae espontáneamente o por centrifugación. Tratar de localizar y palpar profundidad. MATERIAL. empujar el émbolo rápidamente. Retira el protector de la aguja. Tomar la jeringa ya provista con la aguja. Hacer un torniquete con la ligadura en un brazo. de preferencia que sea desechable. Esperar unos segundos para que se evapore el exceso de alcohol. alcohol. al que se le indicó con 24 horas de anticipación que debe de permanecer en ayunas hasta el momento de la extracción. material de vidrio húmedo o caliente o con residuos de substancias como detergentes. Dentro del cuerpo algunas sustancias normalmente existen en el plasma conservan la sangre en estado fluido. una vena fija y de buen calibre. 4. etc. arriba del pliegue del codo. 2. de 10 mI (1) Aguja hipodérmico # 21 Tubo de goma látex para ligadura. INDICACIONES GENERALES: 1) Usar solo material estéril para la extracción de sangre. 1. 1. como fibrinógeno (factor I) y otras proteínas de la sangre. por cuanto el factor contacto o factor XII de coagulación interviene en iniciación de ambos procesos. 95/113 . El plasma sanguíneo contiene varias sustancias. 5. 11. METODOS. Leticia García Gómez Pág. Las causas más frecuentes de hemólisis son: vaciar la sangre de la jeringa con la aguja puesta. 3) Asegurarse de que todo el material necesario se encuentre disponible ANTES de iniciar la técnica de extracción sanguínea. se lleva consigo los glóbulos rojos y blancos quedando como sobrenadante el suero. que son factores intrínsecos formados principalmente en el hígado. Profra. 111. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología sistema que impide la coagulación dentro de los vasos sanguíneos y desintegra los coágulos). 3. éstos hacen que la sangre se coagule cuando abandona el cuerpo. No es conveniente utilizar muestras en estas condiciones para ningún tipo de análisis.

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6. Introducir la aguja firmemente en la piel, siempre con la parte bicelada hacia arriba.

7. Si se introdujo correctamente la aguja en la vena, comenzará a fluir la sangre en la
jeringa, en cuyo caso se jalará lentamente el émbolo hasta que se obtenga el volumen de
sangre necesario.

8. Una vez obtenida la sangre, se suelta el torniquete y se retira con cuidado la aguja. Sobre
el punto de entrada de la aguja se coloca una torunda con alcohol y se mantiene el brazo
del donador en posición estirada por unos cinco minutos.

9. Distribuir la sangre en los recipientes adecuados dependiendo de si se usará para suero o
como sangre completa.

2. OBTENCION DE SANGRE COMPLETA O TOTAL.

Una vez obtenida la sangre, su manejo deberá de hacerse con rapidez, para evitar su coagulación
dentro de la jeringa.

1. Separar la aguja de la jeringa.

2. Disponer de un tubo de 13x100 conteniendo una gota de anticoagulante. Vaciar en
este 5 mL de sangre, presionando suavemente del émbolo de la jeringa.

3. Tapar el tubo y mezclar suavemente por inversión su contenido durante 10 veces.

4. Rotular la muestra con una etiqueta adhesiva que mencione: nombre del donador,
número de equipo, facultad y fecha.

Esta muestra de sangre anticoagulada está disponible para ser sometida a análisis clínica por
ejemplo: Biometría hematica, velocidad de eritrosedimentación o tipo sanguíneo entre otros.

3. OBTENCION DE SUERO SANGUÍNEO.

1. Separar la aguja de la jeringa.

2. Disponer de un tubo 13x100 (SIN ANTICOAGULANTES). Vaciar en éste 5 mI de la sangre
extraída.

3. Rotular el tubo con una etiqueta adhesiva mencionado: nombre del donador,
4. número de equipo, escuela y fecha.

5. Dejarlo en reposo a temperatura ambiente durante algunos minutos (5 a 10 min.) para que
se coagule la sangre.

6. Trascurrido este tiempo, despegar con un aplicador de madera el coagulo, teniendo
cuidado de no retirar fuera del tubo ninguna porción del coagulo formado.

7. Llevar la muestra a centrifugar a 3,000 rpm durante 10 min.(calibrándolo con otro tubo con
agua).

8. Retirar el tubo de a centrifuga.

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9. Disponer de una pipeta pasteur provista de gotero. Eliminar el aire del bulbo gotero
presionándolo y sin volverlo a soltar introducirlo al tubo sumergiéndolo solamente en el
seno del suero, sin tocar el paquete globular sedimentado.
10. Quitar la presión manual que se está aplicando al gotero y dejar que se aspire el suero
sanguíneo. Pasarlo a un tubo de ensaye 13x100 limpio y seco. Repetir esta operación
cuantas veces sea necesario para extraer todo el suero.

El suero sanguíneo así obtenido puede emplearse de inmediato para su análisis o bien puede
almacenarse en condiciones asépticas o de ser posible de esterilidad en refrigeraci6n o en
congelaci6n. Los análisis en los que se utiliza suero son por lo regular: reacciones inmuno16gicas
(reacciones antígeno-Anticuerpo Ag – Ab), química sanguínea, etc.

IV. REPORTE.

1. Representar esquemáticamente la secuencia del método para la obtención de sangre
completa.

2. Representar esquemáticamente la secuencia del método para la obtención de suero
sanguíneo.

3. Investigar el manejo de la centrifuga clínica. Representación esquemas la colocación
de los tubos etc.

4. Investigar fisiología del mecanismo de la coagulación sanguínea.

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PRACTICA 2-16
PRUEBA DE PRECIPITINAS (FLOCULACION) I PARA EL DIAGNOSTICO DE LA SÍFILIS.

OBJETIVO

Conocer la técnica de la prueba de precipitinas (o floculación) más frecuentemente empleada en el
diagnóstico serologico (inmunológico) de la enfermedad llamada sífilis, mediante la siguiente
metodología:

I. MARCO TEORICO
II. METODOS.
V.D.R.L. Prueba cualitativa
V.D.R.L. Prueba cuantitativa

III. REPORTE.

MARCO TEORICO.

La sífilis es una enfermedad venérea transmisible, causada por una bacteria de la familia de las
espiroquetas:
Treponema pallidum. Se transmite pon contacto sexual directo o por vía intrauterina. La bacteria fue
descubierta en 1905 por el científico alemán Fritz Richard Schaudinn, analizando las ulceras
primarias (chancros) de personas infectadas con sífilis. Este microorganismo nunca se ha podido
cultivar en medios artificiales

(No vivos) conservando su virulencia, aunque se logran cultivos de espiroquetas no virulentas muy
similares a T. pallidum. Una espiroqueta usualmente muy empleada como fuente de antígeno para
pruebas diagnósticas serológicas de sífilis es el Treponema de Reiter, otra es el Treponema de
Nichols. El T. pallidum de conservarse vivo y móvil durante cierto tiempo en medios artificiales y en
cultivos de tejidos similares (2 a 2.5 días) pero se multiplica muy poco o nada.

Se espera que la inmunización contra la sífilis resulte posible. Sin embargo, la preparación de la
vacuna depende del cultivo del microorganismo con métodos todavía no conocidos.

Los métodos de laboratorio para el diagnóstico de la sífilis se pueden agrupar en tres categorías:

1. Demostración de los Treponemas mediante microscopio a través de frotis de material de lesiones
en: a) tinción negativa, b) impregnación argéntica, c) campo oscuro, d) contraste de fases, e)
microscopia de florescencia.

2. Reacciones inmunológicas inespecíficas, tales como: Pruebas de fijación del complemento y la
prueba de precipitina o floculación. Estas últimas son así llamadas porque en condiciones adecuadas
originan agregados o acumulos visibles en las reacciones positivas. Diversas formas de reacciones
de precipitina llevan los nombres de las personas o los equipos técnicos que los crearon, Kahn,
Kline, Mazzinni, V.D.R.L. (Venereal Research Laboratory), R.P.R. (Rapid plasma Reagin). Estas
pruebas no son específicas porque ninguno de los antígenos empleados son de origen treponémico.
En el caso de la prueba V.D.R.L., el antígeno es la cardiolipina lecitina purificada, una sustancia de
naturaleza
Química compleja pero que fundamentalmente contiene lípidos que no tienen relación con T.
pallidum pero que por causas desconocidas reaccionan especialmente con sueros de pacientes
sifilíticos. En este método no son raras las reacciones positivas falsas en personas normales o en

Profra. Ma. Leticia García Gómez
Pág. 98/113

b) Pipetear 0. Estas pruebas suelen aplicarse cuando existe duda acerca del resultado de las pruebas inespecíficas. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología pacientes con enfermedad no sifilítica.0 mL) 2).  Sol. MATERIAL. REACTIVOS y EQUIPO:  Equipo para VDRL que contiene:  Antígeno concentrado: cardiolipina lecitina purificada.l mL) 2). debidamente agitada antes de usarse. Se ha comprobado que-en el 70 a 80% de los casos de sífilis confirmada dan reacción positiva.0 mI  Suero sanguíneo no bemolizado. Pruebas diagnósticas específicas.1 mL de sol. de control negativa.0 mI de sol. depositar una gota del suero inactivado en una excavación de la placa de aglutinación. TPCF. Este es el ensayo que llamaremos "Problema". (pipeta de 0. Ma.  Solución control negativo. Profra.a) Pipetear 0.5 a 1. 2) Preparar el antígeno de cardiolipina lecitina purificada en un tubo de 13x100 de la siguiente manera: 2).  Pipetas de 0.  Rotator de Kahn. TPI). 4) En la excavación siguiente depositar una gota de sol. c) Prueba de fijación del complemento de Reiter. b) prueba específica de fijación del complemento. llevar a baño mar1a a 60°C el suero en un tubo de 13xl00 durante 3 minutos. Buffer (pipeta de 0. Las más usuales son: a) Prueba de inmovilización del Treponema pallidum.e) Agitar por golpeteo durante 1 minuto. añadir a cada una de las excavaciones una gota de la emulsión antigénica preparada en el paso 2).85%). 3. 3) Con una pipeta Pasteur con gotero. 1. 99/113 . 2).d) Pipetear 1. Leticia García Gómez Pág. d) técnica de anticuerpos fluorescentes. Buffer diluyente para el antígeno.0 mL de suero sanguíneo.1 mL) 2). (por ejemplo: NaCI O.1 mI (2)  Pipeta de 1. PRUEBA CUALITATIVA: VDRL 1) Inactivar de 0.  Placa de aglutinación. 5) Con una pipeta Pasteur con gotero.c) Agitar por golpeteo durante 1 minuto.1 mL de ant1geno concentrado: CLP.  Aplicadores de madera  Pipetas Pasteur con gotero (2)  Baño maría a 60 ºC. buffer (pipeta de 1.  Microscopio compuesto.

. 7) Reportar los resultados en términos de la mayor dilución serológica que produce una reacción positiva franca (no positiva débil). 2) Pipetear 0. 100/113 . 1:8. Leticia García Gómez Pág. dado por las partículas de antígeno. etc. primero el control negativo y después el problema.POSITIVO DEBIL: si se observan grumos pequeños. . 2. Mezclar bien por golpeteo. Las reacciones cuantitativas se efectúan usando una serie de sueros diluidos en solución salina y cada dilución se trata como suero individual y se ensaya de la misma manera que se describe para la reacción cualitativa. Representar con esquemas el proceso de inactivación del suero sanguíneo. 7) Trasladar la placa a un agitador de Kahn.NEGATIVO: si es idéntico al control negativo. 1) Disponer una serie de seis tubos de 13x100 o más si resulta necesario. de la siguiente manera: a) Control negativo: Se deberá observar sin grumos o con leve grado de aspereza. 1:4. Profra. 1:32! 1:64. 2. PRUEBA CUANTITATIVA.0 mI de dilución. REPORTE: 1. 6) Ensayar cada reacción serológica de la misma manera que si fuera el suero sangu1neo para la reacción cualitativa. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología 6) Mezclar cada ensayo con un aplicador de madera para homogeneizar la reacción.5 mI del suero inactivado al tubo 1. 1:16. Ma. Observar. Agitar por rotación a 180 rpm durante 3 minutos. b) Suero problema: Se valora a criterio de la siguiente . 3) Agregar 0. 4) Pasar 0. Representar con esquemas el proceso de presentación del antígeno CLP o emulsión antigénica. De esta manera se preparan diluciones al 1:2.5 mI de solución salina (NaCl 0.9 %) en cada uno de los tubos.5 mI de la dilución anterior al tubo Mezclar bien por golpeteo 5) Se repite esta operación (paso 4) hasta que el sexto o último tubo contenga 1. 9) Interpretar el ensayo problema por comparación con el control negativo.POSITIVO FUERTE: si se observan grumos grandes sin partículas. 8) Observar al microscopio con objetivo 10X.

4. Dar el título o valor de la cuantificación de los anticuerpos analizadas. Representar con esquema el proceso de diluciones para la reacción cuantitativa. 9. 7. Investigar por lo menos dos de los métodos de demostración de treponema pallidum por microscópica. 101/113 . Leticia García Gómez Pág. 6. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología 3. Investigar por lo menos dos de las pruebas diagnósticas cuantitativa. Ma. Profra. Representar con esquemas las reacciones antígeno anticuerpo. Interpretar concretamente (dar resultado) el suero problema analizado. 5. Representar los campos microsc6picos correspondientes a cada ensayo. Interpretar concretamente los resultados de las diluciones. 8.

1. 1. Las reacciones de aglutinación son ampliamente usadas como ayuda del diagnostico de enfermedades como la fiebre tifoidea.  Aplicadores de madera  Pipetas de 0. fiebre de malta.  Rotator de Kahn. La excepción es el antígeno de Proteus OX19. brucelosis. MARCO TEORICO. REPORTE. METODOS. II. 102/113 . Ma. REACTIVOS y EQUIPO: Equipo de antígenos para reacciones febriles:  Antígeno Proteus OX-19. OBJETIVO: Que el alumno realice e interprete las reacciones antígeno-anticuerpo de aglutinación para el diagnostico de las enfermedades infecciosas fébriles. PRUEBA CUALITATIVA EN PLACA. para lo cual deberá desarrollar la siguiente metodología. Reacción cuantitativa en placa. llamándosele a esta reacción de Well felix. Profra. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología PRACTICA 217 REACCIONES DE AGLUTINACIÓN PARA EL DIAGNOSTICO DE REACCIONES FEBRILES. y tifo. I. A la reacción con el antígeno de Brucella abortus sele conoce como Reacción Huddleson. 2. en cinco de ellos se utilizan las propias bacterias como antígenos para demostrar la presencia anticuerpos específicos.1 mL (2).  Placa de aglutinación (mazzinni)  Pipeta pasteur con gotero.  Antígeno Salmonella typhi O  Antígeno Salmonella typhi H  Antígeno Salmonella paratyphi A  Antígeno Salmonella paratyphi  Suero control negativo (suero fisiológico)  Suero control positivo. III. METODOS MATERIAL.De los seis antígenos que básicamente se emplean. que se emplea para detectar mediante aglutinación a los antígenos de Rickettsia prowasekii.ç  Microscopio compuesto. Reacción cualitativa en placa. II. mientras que la reacción efectuada con los antígenos de Salmonella se les domina como Reacción de Widal. I. con lo cual se deduce el antigeno etiológico de la enfermedad.  Antígeno Brucella abortus. MARCO TEORICO. Leticia García Gómez Pág.  Suero sanguineo.

7. a fin de llevar un registro exacto de los resultados de cada uno. 11. 14. de acuerdo a la siguiente escala: Interpretación macroscopica:  Aglutinación total o de 100 % (++++)  Aglutinación parcial de 75% (+++)  Aglutinación parcial 50% (++)  Aglutinación negativa 0% (+) 12. 9. 4. 1. 10. 8. 3. Interpretar el suero problema comparándolo con los controles. Ma. a temperatura ambiente. En la siguiente excavación colocar una gota de suero sanguíneo. 103/113 . Mezclar cada uno de los ensayos con un aplicador de madera diferente para cada caso. En la primera excavación colocar una gota de solución control positivo debidamente agitado por inversión y a temperatura ambiente. 5. se lleva el riesgo de que estas se sequen y su valoración puede resultar dudosa o falsa. Seleccionar uno de los seis antígenos del equipo de reacciones febriles. 13. a fin de evaluar si este es positivo. En la tercera excavación colocar una gota de solución control negativo. Observar los ensayos al microscopio con objetivo 10X. PRUEBA CUANTITATIVA. en cuyo caso se deberá indicar el grado de aglutinación. Adicionar a cada uno de los ensayos una gota del antígeno seleccionado. Trasladar la placa a la maquina rotatora para agitar por rotación las reacciones a 180 rpm durante un minuto. Anotar en una hoja de reporte el nombre del antígeno con que se esta trabajando. debidamente agitar por inversión y a temperatura ambiente. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología Para este método se realizan reacciones individuales con cada uno de los seis antígenos. Disponer de una placa de aglutinación perfectamente limpia y seca. a temperatura ambiente. Leticia García Gómez Pág. después el control negativo y finalmente el suero problema. Anotar los resultados. Luego para realizar las reacciones con los seis antígenos se proceden a efectuar el método cuantitativo con aquellos antígenos que hallan dado reacción positiva con (++) o más. Repetir el mismo procedimiento para los cinco restantes. Profra. Seleccionar una hilera de tres excavaciones. 2. Este es el ensayo problema. 6. 2. debiendo hacerse la interpretación microscópico de cada una en forma individual en virtud de que si se analiza el conjunto de reacciones hasta el final. comenzando por el control positivo.

le corresponde a un titulo de 320. 0. depositar respectivamente 0. Anotar las diluciones en las que dio reacción positiva (++) o más. la reciproca de la última dilución que nos dá reacción positiva verdadera o sea de (++) o más. se describe a continuación: 1.04. 10. 104/113 .04 1 / 40 40 0. Observar los ensayos al microscopio con objetivo 10X e interpretar cada uno de ellos comparándolo con las experiencias anteriores de los controles positivo y negativo. Mezclar cada una de las reacciones con un aplicador de madera. 0. así se tiene las siguientes equivalencias: mL de suero Dilución Título 0. 2. siendo éste. 0. debidamente agitado por inversión y temperatura ambiente. En cinco excavaciones consecutivas. 7. Disponer una placa de aglutinación. una gota de antígeno seleccionado. Se considera que las cantidades de suero empleadas en cada ensayo o reacción son equivalentes a cierta dilución del suero.08.005 mL de suero problema. Ma. a fin de llevar un registro exacto de los resultados. 9. Usar una pipeta de 0. usando uno diferente para cada caso. 5. Seleccionar uno de los antígenos que hallan dado la reacción cualitativa positiva.1 mL.01. con (+ +) o más. empleando la misma escala de valoración de aglutinación que para la reacción cualitativa.01 1 / 160 160 0. Trasladar la placa a la maquina rotatora de kahn y agitar a 180 rpm durante un minuto.02 1 / 80 80 0. Reportar el valor o titulo de la reacción. 4. 0. 8. En caso de tener positividad cualitativa con otros antígenos hacer la titulación o reacción cuantitativa con cada uno de ellos repitiendo exactamente el método anterior. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología Las reacciones cuantitativas se efectúan usando suero individual y en las pruebas que resultaron positiva.005 1 / 320 320 De manera que sí un suero diera con cierto antígeno todas sus diluciones positivas verdaderas.02. Profra. Anotar en una hoja de reporte el nombre del antígeno seleccionado. ya que el diluyente del antígeno actúa también como diluyente del suero.08 1 / 20 20 0. Adicionar a cada una de las excavaciones. 3. Leticia García Gómez Pág. 6.

Profra. 105/113 . Ma. 7. Mencionar en que formas se puede diagnosticar la bacteria analizada. NOTA: SIEMPRE que se utilice el mismo método. Interpretar concretamente (dar resultado) el suero problema analizado. paratiphy A Fiebre paratifoidea 3 a 5 semanas 1: 80 III. sino hay modificaciones. Anotar el resultado obtenido para cada reacción: Positivo o Negativo y el grado de aglutinación con signos de (+) si es que la hubo. SIGNIFICATIVO Salmonella tiphy O Fiebre tifoidea 3 a 5 semanas 1: 80 Salmonella tiphy H Fiebre tifoidea 4 a 5 semanas 1: 80 S. 5. Representar con esquemas las pruebas realizadas en forma cuantitativa o “titulación” de las reacciones preliminares que hallan resultado positivas con más de (++) 4. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología ANTIGENO PATOLOGIA TIEMPO DE TITULO TITULO MAX. Representar los diagramas de las técnicas realizadas para cada una de las reacciones Ag. 3. Investigar las características generales de las bacterias observadas en esta prueba. 6. Leticia García Gómez Pág. REPORTE 1. Representar los campos microsc6picos correspondientes a cada ensayo. 2.Ab del equipo de reacciones febriles en la prueba cuantitativa.

Ma. 106/113 . Leticia García Gómez Pág. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología Profra.

PRUEBA CUALITATIVA: La prueba de PCR látex se basa en una técnica desarrollada por Senger. de la misma manera que para la prueba cualitativa. su nombre proviene de qué puede formar un precipitado con el polisacárido somático C de los neumococos.  Pipeta Pasteur con gotero. Cuando la prueba resulta positiva es necesario efectuar una cuantificación. METODO: 1) Prueba cualitativa 2) Prueba cuantitativa. en determinación cualitativa y cuantitativa. REACTIVOS y EQUIPO:  Equipo de diagnóstico para PCR en placa. IV. MARCO TEORICO. desarrollando la siguiente metodología. III. La PCR no se encuentra en sujetos normales y desaparece cuando cura el enfermo. Leticia García Gómez Pág. REPORTE.  Suero sanguíneo no hemolizado. 3. 107/113 . Ma. para lo cual se preparan diluciones progresivas de suero problema y se tratan una a una.  Tubos de ensaye 13x 100 (6)  Gradilla. Depositar en la sección. izquierda de la placa de fondo oscuro una gota de la solución control negativa.  Maquina rotadora de kahn. l. Las moléculas inertes biológicamente de poliestireno látex no sensibilizadas con anti-PCR (suero obtenido de animales inmunizados). II. 1. MARCO TEORICO: La prote1na C reactiva es una globulina alfa anormal. 1. Esta prote1na se encuentra en personas que sufren de infecciones agudas bacterianas y en trastornos inflamatorios no infecciosos y ha dado origen a una prueba capilar y a una prueba rápida de precipitación en placa. El método original de Anderson y McCarthy utiliza un tubo capilar que contiene partes iguales de anti-suero de PCR y de suero del paciente. 2. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología PRACTICA 2-18 REACCION DE PRECIPITACION PARA LA DETERMINACION DE LA PROTEINA C REACTIVA OBJETIVO: El alumno realizará el método para la analizar la pruebas de Proteínas C Reactiva con fines de diagnóstico clínico. Otro método que se utiliza con frecuencia es la prueba de precipitación en placa de fondo oscuro. Disponer los reactivos del equipo para PCR y el suero sanguíneo a temperatura ambiente. Profra. MATERIAL. La PCR presente en el suero del paciente sirve como antígeno que cuando se mezcla con el látex sensibilizado produce una precipitación detectable microscópicamente. No se deben de usar a temperatura de refrigeración.

7. etc. Depositar en la siguiente sección de la placa una gota del suero del paciente. Trasladar la placa con los ensayos a la maquina de kahn a 180 rpm durante un min. Los controles positivo y negativo se incluirán a criterio. Preparar diluciones del suero sanguíneo detectado como positivo. recordando que TITULO es la reciproca de la dilución más alta que exhibe reacción positiva. Observar resultados microscópicamente. 8. Interpretar cada uno por comparación con los controles positivo y negativo de la misma manera que la prueba cualitativa. Mezclar cada reacción con un aplicador de madera. Representar cada uno de los pasos de la prueba cualitativa. Adicionar una cuidadosamente una gota del reactivo de látex de anti-PCR a cada gota de las diluciones problema. No son necesarios puesto que ya se interpretaron en la prueba cualitativa. Depositar en la sección derecha de la placa una gota de la solución control positivo. 6. 8. 108/113 . de la última dilución que exhibe reacción positiva. Trasladar la placa a la máquina rotador a 180 rpm durante un minuto. 6. Mezclar con un aplicador cada uno de los ensayos por separado. 7. 1:16. PRUEBA NEGATIVA: Se observa una suave y ligera suspensión granular sin precipitación macroscópica.. Ma. 5. III. Observar los ensayos macroscópicamente. 2. en la proporción 1:4. Leticia García Gómez Pág. Depositar una gota de cada dilución en secciones sucesivas de la placa de fondo oscuro. no hemolizado y sin turbidez. En ocasiones se separan los gránulos precipitados de la solución diluyente. 1:8. Profra. Interpretar el suero problema por comparación con los controles de la siguiente manera: 9. REPORTE: 1. 3. 2. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología 4. PRUEBA CUANTITATIVA: 1. Debe de ser fresco. empleando como diluyente el buffer contenido en el equipo. Reportar el titulo de la reacción. evitando siempre el contacto entre ambos reactivos. 5. PRUEBA POSITIVA: Deberá mostrar una suspensión granular más fuerte que la prueba negativa. (o de igual manera. 4. 1:32. proceder a efectuar la prueba cualitativa. En caso de que el suero problema resulte positivo. evitando que se mezclen entre sí.

para lo cual deberá desarrollar la siguiente metodología: I. Buffer para AEO. Esta prueba es útil para el diagnósticode la fiebre reumática.  Suero sanguíneo fresco y sin hemólisis. Sangre anticoagulada (2 mL)  Sol. (50 mL)  Reactivo de estreptolisina O. Representar cada uno del suero problema cuantitativo. sin hemólisis. METODO: l. Esta prueba mide la cantidad de antitóxina (la antiestreptolisina O) producida por el sistema inmunológico del huésped como respuesta a la tóxina (la hemolisina del tipo estreptolisina O) del Streptococcus beta hemolyticcus. (3)  Pipetas de 10 mL.0 mL(4)  Pipetas de 5 mL. (2)  Pipetas de 1.  Tubos cónicos de plástico. Se preparan originalmente tres diluciones a partir del suero sanguíneo problema. (50 mL)  Suero fisiológico. MARCO TEORICO: La presente práctica describe la neutralización in vitro de una hemolisina bacteriana. PRACTICA 2-19 TITULO DE ANTIESTREPTOLlSINAS O Demostrar la. PREPARACION DE LAS DILUCIONES PRIMARIAS DE SUERO. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología 2. (2)  Baño María 37 C. Anotar el titulo del suero problema cuantificado. 109/113 . REPORTE. (12)  Gradilla para 12 tubos. I. 4. glomérulo nefritis aguada y otras infecciones por Streptococcus beta hemoliticcus. II. 3. REACTIVOS y EQUIPO.  Agua destilada. la estreptolisina O. METODOS. MATERIAL. En estos casos es frecuente que el titulo de antiestreptolisinas O se encuentre por arriba de los valores normales. II. Anotar el resultado del suero problema. reacción inmunológica de neutralización tóxina-antitóxina y el método de cuantificación o titulación de antiestreptolisinas O. METODOS. Leticia García Gómez Pág. que se maneja en el método como reactivo con función de tóxina o antígeno será neutralizado por la concentración existente de antiestreptolisinas O en el suero sanguíneo del paciente. MARCO TEORICO. Ma. II. sin turbidez y sin Inactivar de la siguiente manera: DILUCION A: 1:10 Profra.  Tubos de 13x100.

Rotular el tubo con el número de equipo y llevar a la centrifuga clínica. DILUCION B: 1:100 En tubo de ensaye de 13x100 rotular como “B” depositar con pipeta de 1. PREPARACION DEL REACTIVO ANTIESTREPTOLISINA O. b) Tomar los dos tubos capilares que contienen el hidrosulfito de sodio. d) Conservar sobre la mesa las pipetas que han sido utilizadas. b) Tapar los tubos con papel “parafilm” o tapón de hule y mezclar la dilución por inversión por tres veces. 4.85%) hasta la marca de 10 mI del tubo de centrifuga. rompiendo un extremo de cada uno de los tubos y vaciar su contenido íntegro al interior del frasco ámpula de estreptolisina o liofilizada. 4. III. c) Adicionar al compuesto anterior 10 mL de agua destilada con una pipeta rotulada como tal. 1. III. de 15 mI. Este reactivo se proporciona en la charola de reactivos. 0.500 rpm Profra. en un frascoámpula sellado.0 mL rotulada como “B”. centrifugar a 2. c) Tapar el tubo con tapón de hule con papel “parafilm” y mezclar la dilución por inversión por tres veces. no importa que no provengan del paciente al que se le hará el estudio. 4. depositar con una pipeta o por tanteo. de la siguiente manera. e) Rotular una pipeta de 1. En un tubo de centrifuga de plástico.0 mL rotulada como “A”.5 mL de la solución de Buffer que se ha proporcionado en la charola de reactivos. Ma.5 mL de dilución “A” a) Adicionar con la pipeta de “buffer”. d) Tapar el frasco ámpula y agitar vigorosamente por inversión hasta que el reactivo se halla disuelto completamente. Adicionar suero fisiológico (NaCl 0. con una pipeta de 10 ml rotulada como “suero fisiológico” 3. en forma deshidratada e inactivo. Tapar el tubo con un tapón de hule o con papel "parafilm" y mezclar suavemente (para evitar hemólisis) por inversión por tres veces . ya que se seguirán usando.5 mL del suero sanguíneo. abrirlo. PREPARACION DE LA SUSPENSION DE GLOBULOS ROJOS 5% Para este reactivo se pueden emplear glóbulos rojos de conejo o humanos de cualquier tipo. para finalmente suspender las al 5% en solución buffer.0 mI de sangre fresca anticoagulada.0 mL de la solución buffer que se esta utilizando. a) Retirar el sello del frasco ámpula de Estreptolisina.0 mL rotulada como Buffer. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología a) En un tubo de 13x100 rotulado como "A" depositar con pipeta de 1. Las células se deberán de lavar tres veces con suero fisiológico.Retirar el tapón. 0. c) Conservar sobre la mesa las pipetas que han sido utilizadas. 110/113 . b) Adicionar con la pipeta de 5. que una vez que estén debidamente colocados los tubos de todos los equipos. Para activarlo se deberá agregar hidrosulfito de sodio y agua destilada. 1. ya que se usarán posteriormente.0 mL como “Estreptolisina O”. Leticia García Gómez Pág. 2.

. para efectuar el tercer lavado de las células. 6. así. sin residuos desobrenadarte. Retirar el tubo de la centrifuga y por decantaci6n o con ayuda de una pipeta de 10 provista de perilla o de succionador eliminar el liquido sobrenadarte de las células rojas. CONTROL NEGATIVO: Deberá presentar hemólisis total. 7. e. l)"Tapar el tubo y mezclar suavemente por inversión hasta homogenizar la suspensión de glóbulos rojos al 5 %. IV. el tubo que presenta hemólisis es negativo. Disponer una gradilla con 12 tubos de ensaye de 13 x 100.d. Rotular una pipeta de l. 1.5 mL de solución buffer con la pipeta “buffer”. 8. Este es el primer lavado de los glóbulos. INTERPRETACION CONTROL POSITIVO: Deberá presentar ausencia total de hemólisis. mientras el tubo que no presente hemólisis es positivo. 12. Adicionar nuevamente suero fisio16gico hasta la marca de 10 del tubo. Ma. eliminando por succión con pipeta pasteur si es que el volumen de glóbulos es mayor. Conservar el paquete globular integro. los restantes uno como “control positivo “ otro como “control negativo”. Como el tubo de centrifuga está graduado. DILUCIONES PROBLEMA: Son los tubos del 1 al 10. conservar solamente 0. Efectuar con cada uno de ellos las diluciones y las reacciones de neutralización tóxina-antitóxina de acuerdo a la tabla de titulación por diluciones impresa en la página siguiente. No deberá presentar glóbulos rojos sedimentados. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología durante 3 minutos. l. Repetir los pasos c. 111/113 . para efectuar el segundo lavado de los glóbulos rojos.e. Se comparan contra los controles. lo cual se manifiesta por la sedimentación de los glóbulos rojos en el fondo del tubo y el l1quido sobrenadarte totalmente cristalino e incoloro. Adicionar nuevamente suero fisiológico hasta la marca de 10 del tubo. O mI como "GR 5%" Y mantenerla dispuesta hasta el momento de su uso. d. Adicionar 9. El valor de la prueba se expresa en UNIDADES TODD y representa el titulo de la cuantificación de Antiestreptolisinas O y estará determinado por el inverso (o la recíproca del valor de la última dilución Profra. 5. lo cual se manifiesta por la destrucción de los glóbulos rojos que al liberar la hemoglobina pigmentan la solución de color rojo. 2. Rotulados del 1 a 10.5 mI de paquete globular. empleando para ello los reactivos que previamente sean preparado. Repetir los pasos c. 13. Leticia García Gómez Pág. Preparar con ello la suspensi6n al 5% 10. METODO: DILUCIONES PARA LA PRUEBA "ASTO". 11. 9.

* ** CIFRAS NORMALES: ADULTOS: 0 a 250 Unidades Todd.4 0 0 DILUCION EN mL UOLUMEN DE SOLUCION 0. Establecer pronóstico en base a la relación del valor de la prueba contra los valores normales.0 0.0 0.2 0. Representar gráficamente la serie de diluciones con sus correspondientes reacciones.7 0.5 0.4 0.5 0. * 0. 112/113 .3 1.5 0. Profra.5 0. NIÑOS: 0 a 166 Unidades Todd.0 0. * * *AGITAR CADA UNO DE LOS TUBOS POR GOLPETEO* ** LLEVAR TODOS LOS TUBOS A BAÑO MARIA DE 37 ºC DURANTE 45 MIN.5 0.0 Buffer mL *AGITAR CAD UNO DE LOS TUBOSPOR GOLPETEO* VOLUMEN DE 0. Anotar el título de la prueba. 3.5 0.5 0. REPORTE: 1. Leticia García Gómez Pág.5 0.4 0.6 1. DILUCION A A B B B B C C e C + - REQUERIDA TUBOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 + - UOLUMEN DE CADA 0.2 1.500 rpm DURANTE 1 MIN.2 08 0. 4.5 0.5 0.5 0.6 0.5 0.5 0. NOTA: SIEMPRE QUE SE USE ESTE METODO.5 0.0 0.8 0.5 0. Investigar bibliográfica del agente etiológico y de su patogenia. * * TITULO DE LA REACCION 12 50 100 166 250 333 500 625 833 1250 + - UNIDADES TODD ***CENTRIFUGAR CADA UNO DE LOS TUBOS A 1.R.5 0.0 0.0 1.5 0.5 ESTREPTOLISINAS *AGITAR CADA UNO DE LOS TUBOS POR GOLPETEO* * VOLUMEN DE G.5 0.5 AL 5 % EN mL LLEVAR TODOS LOS TUBOS A BAÑO MARIA DE 37 ºC DURANTE 15 MIN. Ma. Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología CIFRAS NORMALES: que presente reacción positiva.6 0.5 0.5 0.5 0. SINO ANOTAR EL METODO USADO.8 0.6 0. 2.4 0.

Leticia García Gómez Pág. 113/113 . Universidad Autónoma del Estado de Morelos Facultad de Medicina Laboratorio de Microbiología Profra. Ma.