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ENSV dAlger

Post-graduation
en
Immunologie Animale
2016

Les mthodes immunologiques de diagnostic

Dr Bernard China
TABLE DES MATIERES
Les mthodes immunologiques de diagnostic ......................................................................................................... 3
Introduction ......................................................................................................................................................... 3
La rponse Immunitaire ...................................................................................................................................... 4
2. La srologie ......................................................................................................................................................... 7
2.1. Dfinitions ........................................................................................................................................................ 7
Caractristiques structurales des immunoglobulines............................................................................................. 10
Les anticorps monoclonaux et les anticorps polyclonaux ................................................................................. 11
Principe ................................................................................................................................................................. 12
Production............................................................................................................................................................. 12
Immunisation ........................................................................................................................................................ 13
Fusion .................................................................................................................................................................... 14
Propagation, slection et clonage ......................................................................................................................... 14
Production............................................................................................................................................................. 16
Utilisation .............................................................................................................................................................. 18
Rponse primaire et rponse secondaire ........................................................................................................... 19
Avidit et affinit. ............................................................................................................................................. 20
Ractions croises ............................................................................................................................................. 21
Les tests srologiques ....................................................................................................................................... 22
Mesure de la qualit dun test diagnostic ............................................................................................................. 22
Validation dun test. .............................................................................................................................................. 24
Les chantillons................................................................................................................................................. 26
Les tests dagglutination. .................................................................................................................................. 28
1. Dfinitions et caractrisation des ractions dagglutination ............................................................................ 28
2. Les diffrents types dagglutination .................................................................................................................. 30
Immunoprcipitation ......................................................................................................................................... 35
Les conjugs ...................................................................................................................................................... 49
Indirect Fluorescence Antibody Test: IFAT ........................................................................................................ 52
Principe de l'pifluorescence ................................................................................................................................ 53
LELISA. ENZYME LINKED SORBENT ASSAY ........................................................................................................ 57
2 Historique ........................................................................................................................................................... 57
3. Principes de base............................................................................................................................................... 58
4 Classifications et formats ................................................................................................................................... 61
5. Lecteur de plaques ............................................................................................................................................ 62
Western Blot ou Immunoblot ........................................................................................................................... 63
Technique.............................................................................................................................................................. 63
Diffrentes tapes du transfert de western.......................................................................................................... 63
Prparation des chantillons ............................................................................................................................ 63
lectrophorse sur gel ....................................................................................................................................... 64
Transfert sur membrane .................................................................................................................................... 70
Blocage ................................................................................................................................................................ 71
Dtection .............................................................................................................................................................. 71
Analyse ................................................................................................................................................................ 73
Sondage secondaire .......................................................................................................................................... 76

1
Cytomtrie de flux............................................................................................................................................. 77
INTRODUCTION ..................................................................................................................................................... 77
HISTORIQUE .......................................................................................................................................................... 77
DEFINITIONS .......................................................................................................................................................... 78
PRINCIPES TECHNIQUES DE LA CMF ..................................................................................................................... 79
LES ECHANTILLONS CELLULAIRES .......................................................................................................................... 79
LE CENTRAGE HYDRODYNAMIQUE ....................................................................................................................... 80
CIRCUITS OPTIQUES .............................................................................................................................................. 80
COLLECTE DE LA LUMIERE EMISE .......................................................................................................................... 81
LES SIGNAUX RECUEILLIS ............................................................................................................................. 83
La lumire absorbe.............................................................................................................................................. 84
La fluorescence mise ........................................................................................................................................... 84
CONVERSION DES SIGNAUX .................................................................................................................................. 86
PRESENTATION DES RESULTATS ........................................................................................................................... 86
LE TRI CELLULAIRE ................................................................................................................................................. 87
AVANTAGE ET LIMITES DE LA CMF........................................................................................................................ 88
ANALYSE QUANTITATIVE ....................................................................................................................................... 88
SENSIBILITE DE DETECTION ................................................................................................................................... 88
VITESSE DE TRAVAIL .............................................................................................................................................. 88
LANALYSE SIMULTANEE DE PLUSIEURS PARAMETRES ......................................................................................... 88
LE TRI ..................................................................................................................................................................... 89
PRINCIPALES APPLICATIONS ................................................................................................................................. 89
IMMUNOFLUORESCENCE POUR LA CARACTERISATION DES SOUS-POPULATIONS CELLULAIRES ........................ 89
Principes de limmunofluorescence ...................................................................................................................... 90
Principes de la compensation de fluorescence ..................................................................................................... 93
Autres ractions cellulaires ............................................................................................................................... 95
Le chimiotactisme ................................................................................................................................................. 95
LA chambre de Boyden ..................................................................................................................................... 97
LES techniques Capillaires ............................................................................................................................... 97
1.3. Les substances chimiotactiques ..................................................................................................................... 98
Le burst oxydatif.............................................................................................................................................. 100
Le test de prolifration lymphocytaire ............................................................................................................ 102
LELISPOT ou ENZYME LINKED IMMUNOSPOT ................................................................................................ 104
Procedure ........................................................................................................................................................ 105
FluoroSpot assay ............................................................................................................................................. 106
APPLICATIONS ................................................................................................................................................. 106
Bibliographie ....................................................................................................................................................... 107

2
LES MTHODES IMMUNOLOGIQUES DE DIAGNOSTIC

INTRODUCTION

La rponse immunitaire correspond lensemble des mcanismes mis en uvre par un hte
pour se prmunir de situations potentiellement agressives et dangereuses pour lui. Parmi ces
agressions, on pense demble aux pathognes. Ceux-ci sont constitus des bactries, des
virus ou des parasites qui peuvent interagir avec lhte soit par contact direct soit par la
production de toxines.

Mais la rponse immunitaire peut aussi tre dirige contre les cellules cancreuses qui sont
des cellules qui se comportent de manire anormale et qui doivent tre limines par lhte
sous peine de causer des dommages irrversibles.

Le systme immunitaire peut aussi ragir toute molcule considre comme trangre cest
notamment ce que lon note lors dune raction allergique o certaines molcules entranent
une rponse importante du systme immunitaire.

Enfin, les cellules qui ne font pas partie du soi sont aussi reconnues comme trangre
notamment car elles nexpriment pas les mmes molcules du complexe dhistocompatiblit
que les cellules de lhte. Ce sont les mcanismes qui sont la base su rejet des greffes

Si on veut raliser un diagnostic de la rponse immunitaire, on peut analyser diffrents


paramtres. En effet, la rponse immunitaire implique des protines scrtes comme les
Immunoglobulines, les protines du complment ou les cytokines et des cellules comme les
cellules prsentatrices dantignes, les lymphocytes B, les lymphocytes T etc

On peut donc raliser de nombreux dosages diffrents pour valuer diffrents aspects la
rponse immunitaire de lhte.

Les disciplines les plus connues sont la srologie qui consiste dtecter la prsence
danticorps spcifiques dun antigne dans le srum dun patient ou dun animal et
lhmatologie qui consiste notamment raliser un comptage des diffrentes populations
cellulaires prsentes dans le sang.

3
Il existe cependant beaucoup de variantes techniques pour tudier la rponse immunitaire et
ce cours ce propose de faire un inventaire non exhaustif de diffrentes mthodes existantes et
qui sont utilises soit en recherche soit en diagnostic soit pour les deux.

Bienvenus donc dans le monde merveilleux des tests immunologiques.

A certaines reprises, un rappel thorique sera ncessaire pour bien comprendre ce qui est
analys et quels renseignements on peut en tirer.

LA RPONSE IMMUNITAIRE

Classiquement, la rponse immunitaire est divise en une rponse non spcifique ou inne et
une rponse immunitaire spcifique ou adaptative.

La rponse immunitaire inne est rapidement mise en action lors du contact avec le signal
dclencheur constitu principalement par les pathognes. Les mcanismes mis en place sont
non spcifiques dans la mesure o quel que soit le type de bactries ou de virus impliqu, les
mmes dfenses sont mises en jeu. La rponse immunitaire inne fait la plupart du temps
partie de la rponse inflammatoire.

Les principaux lments de cette rponse outre les effets systmiques (fivre, douleur,) sont
le systme du complment, les leucocytes polymorphonuclaires neutrophiles (PMN), les
lymphcoytes natural killer (NK), les interfrons de classe I (alpha et bta)

La rponse immunitaire spcifique met plusieurs jours se dvelopper partir du contact


avec le signal dclencheur mais produit une rponse qui est adapte celui-ci. Ainsi, par
exemple deux souches diffrentes de la mme bactrie vont entraner une rponse
immunitaire diffrente.

4
Figure 1. La prsentation des antignes au systme immunitaire.

La rponse immunitaire spcifique peut tre rsume de la manire suivante (figure 1) : le


pathogne est phagocyt par une cellule prsentatrice dantigne (macrophage, cellule
dendritique), il est digr par le protasome de cette cellule en petits peptides (4 10 acides
amins) qui sont associs aux molcules de classe II du complexe majeur dhistocompatibit.
Ce complexe est prsent la surface de la cellule. Cest cette association CMHII et peptide
qui est reconnu par le rcepteur des lypmphocytes T auxiliaires ou T helper. En fonction du
type dassociation entre le complexe peptide-CMHII et le TCR, la cellule T auxiliaire va se
diffrencier en cellule TH1 ou en cellule TH2. La diffrence principale tient aux cytokines
produites par ces cellules. Les cellules TH1 produisent principalement de linterfron gamma
qui va stimuler les macrophages qui sont infects afin daugmenter leur potentiel microbicide
et donc favoriser la destruction du microbe. Les cellules TH2 vont quant elle produire
notamment de linterleukine 4 (IL-4) qui va stimuler la production danticorps spcifiques par
les lymphocytes B. Les TH2 produisent aussi de lIL-5, de lIL-10 ou de lIL-13. On a
lhabitude de dire que la rponse TH1 oriente le systme immunitaire vers une rponse de
type cellulaire alors que les cellules TH2 vont orienter la rponse immunitaire vers une
rponse de type humorale avec production danticorps spcifiques. Dautre part, ces deux

5
types de rponse sexcluent mutuellement puisque linterfron gamma va inhiber la rponse
TH2 et lIL-10 va inhiber la rponse TH1 (figure 2).

Figure 2. Les rponses TH1 et TH2.

Bien sr la rponse immunitaire est plus complexe que cela et ce nest pas lobjet de ce cours
que dentrer dans trop de dtails. Il est bon de rappeler que la rponse immunitaire met en jeu
des cellules particulires que lon peut identifier et quantifier et des produits solubles que lon
peut galement identifier et quantifier. Parmi ceux-ci citons les anticorps, les cytokines, les
molcules du complment On peut aussi sintresser certaines proprits particulires de
certaines cellules comme le chimiotactisme des PMN, la phagocytose par les macrophages ou
le pouvoir microbicide des PMN.

Nous allons essayer de passer en revue les diffrents tests permettant de mettre en vidence au
laboratoire ces diffrentes composantes de la rponse immunitaire.

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2. LA SROLOGIE

Les techniques srologiques visent mettre en vidence les anticorps spcifiques de certains
antignes dans le srum de lhte. Cependant, les mmes techniques peuvent aussi tre
utilises pour dtecter la prsence danticorps spcifiques dans dautres fluides corporels que
le srum comme le lait ou le contenu intestinal.

2.1. DFINITIONS

Antigne : molcule qui entrane une rponse immunitaire humorale spcifique.

Un antigne est en gnral constitu de plusieurs pitopes.

Epitope : motif molculaire reconnu par la partie variable de lanticorps ou du rcepteur de la


cellule T (TCR). Ce motif a une taille denviron 10 acides amins pour un pitope venant
dune protine. On distingue principalement deux types dpitopes, les pitopes squentiels o
cest la squence des acides amins qui est reconnue et les pitopes conformationnels o cest
la structure tridimensionnelle qui est reconnue.

Un haptne est une molcule de faible poids molculaire antignique, c'est--dire capable
d'tre reconnue par le systme immunitaire (notamment travers les anticorps (Ac)), mais
non immunogne; incapable de l'induire, sauf s'il est coupl une molcule porteuse
("carrier"), ce qui confre l'immunognicit de l'haptne. L'immunochimie des haptnes est
due Karl Landsteiner, dans les annes 1910.

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Figure 3. Les diffrents types dpitope

Anticorps : Immunoglobuline qui a une spcificit pour un antigne donn. Il existe 5 classes
danticorps : IgM, IgG, IgD, IgA et et IgE. Toutes les immunoglobulines sont constitues
dun motif de base commun fait de deux lourdes et de deux chanes lgres (HL)2. Chaque
chane tant constitue dune partie constante et dune partie variable. La runion des parties
variables des 2 chanes lourdes et de 2 chanes lgres constitue le paratope qui est le motif
molculaire qui reconnait lpitope sur lantigne. Chez les IgD, les IgG et les IgE, le motif 2
Chanes lourdes, 2 chanes lgres est unique. Ces anticorps sont bivalents (ils peuvent
reconnatre 2 pitopes identiques). Les IgM sont constitues de 5 rptitions du motif de base,
elles sont donc decavalentes. Les IgA sont soit monomriques (sang), dimriques ou
scrtoires. Ces dernires sont constitus de 2 rptions du motif de base runis par pice
scrtoire. Les IgA scrtoires sont ttravalentes. La partie constante de chacune des classes
dImmunoglobulines sont diffrentes et sont dailleurs cods par des gnes diffrents.

8
.

Figure 4. La structure dune immunoglobuline

Figure 5. Les diffrentes classes dimmunoglobulines

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Les immunoglobulines sont des protines prsentent sous forme membranaire (BCR) et sous
forme soluble (anticorps).

CARACTRISTIQUES STRUCTURALES DES IMMUNOGLOBULINES

Les BCR et les anticorps sont des htro-ttramres extrmement polymorphique au sein de
lindividu, qui sont constitus de deux chanes lourdes H (pour HEAVY) et deux chanes
lgres L (pour LIGHT) lies entre elles de manire covalente par des ponts disulfures. Les
deux chanes H et les deux chanes L sont respectivement identiques entre elles. Chacune de
ces quatre chanes sera caractrise par une rgion variable V (extrmit N-terminale) qui est
le site de liaison lantigne, et par une rgion constante C (extrmit C-terminale).

Figure 6. Les domaines des Immunoglobulines

CONSTITUTION DES CHANES LOURDES ET DES CHANES LGRES

Les chanes lgres sont constitues de deux rgions :

Une rgion variable VL (pour VARIABLE DOMAIN FROM LIGHT CHAIN ),


elle-mme constitue par 3 rgions hypervariables HV1, HV2, HV3.
Une rgion constante CL (pour CONSTANT DOMAIN FROM LIGHT CHAIN )
dun domaine immunoglobuline.

Il existe 2 types de chanes L : et qui diffrent par leur rgion constante.

Les chanes lourdes sont constitues de deux rgions :

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Une rgion variable VH (pour VARIABLE DOMAIN FROM HEAVY CHAIN ),
elle-mme constitue par 3 rgions hypervariables HV1, HV2, HV3.
Une rgion constante CH (pour CONSTANT DOMAIN FROM HEAVY CHAIN )
dun certain nombre de domaines immunoglobulines suivant lisotype considr : 3 pour
les immunoglobulines IgG, IgA et IgD et 4 pour les immunoglobulines IgM et IgE.

LES ANTICORPS MONOCLONAUX ET LES ANTICORPS POLYCLONAUX

Lorsquun animal est immunis avec un antigne, il va entraner la stimulation de tous les
lymphocytes B qui produisent des anticorps spcifiques de chacun des pitopes de cet
antigne. Cette stimulation va entraner la multiplication clonale de ces lymphocytes B qui
vont se transformer en plasmocytes secrtant les immunoglobulines spcifiques. Un clone
produit les mmes immunoglobulines qui ont la mme spcificit pour un pitope donn.
Lanticorps drivant dun clone de plasmocytes est dit monoclonal (venant dun seul clone).
La combinaison des immunoglobulines drives de clones diffrents mais reconnaissant
toutes des pitopes diffrents du mme antigne forme un srum polyclonal spficique de
lantigne donn. Dans la situation naturelle, un antigne produit toujours un srum
polyclonal. Pour obtenir des anticorps monoclonaux cest--dire drivant dun seul clone de
plasmocyte et donc spcifiques dun seul pitope donn, une manipulation doit tre ralise
au laboratoire.

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Figure 7. Les antiorps monclonaux et polyclonaux

PRINCIPE

Afin de produire des lignes stables de cellules produisant l'anticorps dsir, Kohler et
Milstein (1975) ont labor l'ide et la mthode de fusion de deux types de cellules. Ainsi, des
cellules B (produisant les anticorps), dont l'incapacit de se reproduire est pallie par des
mylomes (des cellules cancreuses immortelles) rsulte en un hybridome secrtant des
anticorps et ayant la fois la proprit de se reproduire indfiniment.

PRODUCTION

Plusieurs tapes sont ncessaires pour l'obtention d'anticorps monoclonaux.

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Figure 8. Reprsentation schmatique du processus d'obtention d'anticorps monoclonaux

(http://monde.ccdmd.qc.ca/ressource/?id=55907&demande=desc)

IMMUNISATION

La premire est une inoculation, gnralement par voie pritonale d'un antigne ou
d'un haptne un animal de laboratoire, (les plus courants tant la souris, le rat ou le lapin), ce
qui a pour effet de produire des plasmocytes librant des anticorps contre cet antigne. Des

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anticorps diffrents (polyclonaux) sont produits pour combattre l'antigne. Il est possible
d'obtenir des anticorps reconnaissant des substances qui ne sont pas immunogniques, en
les conjuguant des protines immunogniques, comme lalbumine srique bovine (BSA) ou
lovalbumine (OVA). Plusieurs protocoles d'immunisation sont possibles en variant les doses,
les intervalles des injections, l'adjuvant utilis et la dure du traitement. L'adjuvant utilis est
principalement l'adjudant de Freund soit incomplet (mulsion dhuiles, deau et dmulsifiants
(savons) qui pige lAg) soit complet (complexe deau, dhuiles, dmulsifiants et de
morceaux de bactries tues). Cette injection a pour effet de produire des plasmocytes librant
des anticorps polyclonaux contre cet antigne. Les adjuvants agissent selon 2 types dactions
dans les prparations vaccinales. Le premier favorise et prolonge la dure de linteraction
entre lantigne et le systme immunitaire, par exemple lhydroxyde dalumine. Le second
recrute et active les cellules de limmunit naturelle pour quelles induisent la rponse
adaptative.

FUSION

Ensuite, l'animal est sacrifi et les cellules B sont isoles partir de la rate. Celles-ci, ne
pouvant se multiplier mais produisant les anticorps dsirs, sont fusionnes avec
des mylomes (cellules cancreuses, donc aptes une division cellulaire rapide et
immortelles). Cette tape de fusion peut tre effectue en utilisant par exemple le
polythylne glycol (PEG). Ces cellules sont ensuite mises en culture, ces hybridomes ayant
la proprit des cellules cancreuses, elles se multiplient rapidement et indfiniment.

PROPAGATION, SLECTION ET CLONAGE

Les cellules mylomateuses utilises pour la fusion ne produisent pas d'anticorps ou une des
chanes d'anticorps. De plus, ces cellules ont perdu (par slection gntique) la facult de
produire une enzyme appele hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT).
Cette enzyme est implique dans la synthse des nuclotides, plus particulirement dans la
voie de sauvetage (par opposition la voie de novo).

La synthse de lADN dans les cellules des mammifres utilise un voie principale (de novo)
qui require de la glutamine et de laspartate comme substrats initiaux ainsi quune source de
phosphate afin de conduire la synthse des dsoxynucltotides puriques (dATP et dGTP) et
pyrimidiques (dCTP, dTTP). Sur cette voie principale, plusieurs tapes peuvent tere
bloques par laminoptrine qui est un analogue du dihydrofolate qui se lie la dihydrofolate

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rductase. Il en rsulte que la voie de novo est bloque et que les nuclotides ne sont pas
forms.

Heureusement, les cellules des mammifres peuvent survivre en prsence


daminoptrine en utilisant la voie de secours. La premire tape en est la transformation de
lhypocxanthine en IMP et cette raction est catalyse par lhypoxantine-guanine
phosphorybosol transfrase (HGPRT). The first converts hypoxanthine in IMP, a reaction
catalysed by the enzyme hypoxanthine-guanine phosporybosyl transferase (HGPRT). La
seconde convertit la thymidine end TMP et cette reaction est catalyse par la thymidine kinase
(TK). Donc une mutation soit dans le gne HGPRT ou dans le gne TK permet la cellule de
crotre normalement dans un milieu de culture standard mais elle meurt sur un milieu
contenant de laminoptrine. Lhybridome lui peut survivre sur un milieu HAT (hypoanthine,
aminoptrine, thymidine) car il utilise les gnes HGPRT et/ou TK non muts du splnocyte.

Figure 9. Voies de biosynthse des doxynuclotides triphopshates.

La slection des cellules fusionnes se fait avec les composs


chimiques hypoxanthine, aminoptrine et thymidine (milieu HAT) L'aminoptrine, en
bloquant la synthse de novo des nuclotides, oblige les cellules utiliser la voie de
sauvetage. Les mylomes parents n'ayant pas l'enzyme essentielle, seules les cellules
fusionnes avec les splnocytes et l'ayant ainsi acquis pourront survivre. L'hypoxanthine et la
thymidine sont les substrats de cette voie de sauvetage. Par ailleurs, les cellules B non-
fusionnes s'limineront d'elles-mmes, tant incapable de se reproduire. Suite une priode

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de slection dans le milieu HAT, les hybridomes se dveloppent en colonies. Le taux de
succs d'une fusion est plutt faible et varie selon le protocole utilis (de 5 % 50 %). Afin de
favoriser la croissance de ces hybridomes, plusieurs additifs peuvent tre ajouts dans le
milieu de culture (Fetal Bovine Serum, facteur de croissance, couche de cellules nourricires).
Ces lignes d'hybridomes secrtent des anticorps tous diffrents. Afin de slectionner notre
anticorps d'intrt, il faut d'abord isoler chacun des clones. Classiquement, cette slection se
fait par dilution limite pour permettre l'isolation de clones uniques. Plus rcemment,
l'utilisation du cytomtre en flux permet aussi la sparation de cellules. Aprs une seconde
ronde de culture, chaque clone est ensuite test, la plupart du temps en Western Blot,
par ELISA, afin de vrifier sa capacit lier l'antigne ou l'haptne utilis pour
l'immunisation. Les anticorps scrts sont ensuite tests pour liminer ceux qui induisent des
ractions croises avec d'autres antignes.

PRODUCTION

Aprs la slection, la production de lots d'anticorps se fait par purification d'un milieu
biologique contenant l'anticorps en solution, celui-ci tant soit une ascite produite chez
l'animal (cest--dire une injection intrapritonale de l'hybridome dans un animal prpar
l'avance) mais cette approche est interdite depuis 2004 en Belgique, soit
un surnageant de culture cellulaire ayant servi cultiver l'hybridome in vitro. Selon l'chelle
de grandeur dsire, la production en suspension cellulaire peut se faire dans des bioracteurs.
La purification proprement dite peut se faire de diffrentes manires, comme par exemple
la chromatographie liquide haute performance, par affinit avec la protine G ou
par prcipitation l'ammonium.

Une fois obtenu un clone d'hybridome scrtant un anticorps de spcificit voulue, il sera
caractris afin de connatre la classe des chanes d'immunoglobine, son affinit, ou
l'pitope reconnu (epitope mapping).

Il y a plusieurs mthodes disponibles pour cartographier lpitope reconnu par un anticorps


sur un antigne donn dont certaines sont donnes ci-aprs.

La mthode de rfrence (Gold Standard) est la co-cristallographie rayons-X qui permet


une visualisation directe de linteraction entre lantigne et lanticorps. Cependant, cette

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est approche est techniquement complique, elle ncessite une grande quantit de protine
purifie ainsi que beaucoup de temps et de surcroit elle est coteuse.

Le criblage dune libraire de peptides (overlapping peptide scan ou analyse pepscan)


utilise une librairie doligopeptides de fragments se chevauchant ou non dune protine
cible et teste leur capacit se lier lanticorps dintrt. Cette mthode est rapide et peu
coteuse et convient bien la recherche dun anticorps spcifique dun pitope donn
partir dun grand nombre danticorps dirig contre lantigne cible. Au dpart on pourrait
penser que cette technique est surtout dvolue aux pitopes squentiels, mais la
combinaison de diffrents peptides issus de diffrentes parties de la protine et leur
maintien dans une conformation donne (CLIPS scaffolds) permet aussi dtudier les
pitopes conformationnels.

Figure 10. Schematic representation of a 1-CLIPS reaction (left panel), and different
CLIPS-based topologies (2-CLIPS & 3-CLIPS loops) for mimicry of discontinuous
epitope (right panel)

La mutagense dirige. En utilisant cette technique, on peut muter spcifiquement chaque


acide amin dune protine ensuite on regarde si lanticorps se lie toujours la protine
mute. Cette technique permet aussi dtudier les pitopes aussi bien squentiels que
conformationnels. Cette approche demande beaucoup de manipulations, elle est lente et
est typiquement rserve de petites squences peptidiques.

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http://www.edu.upmc.fr/sdv/masselot_05001/mutagenese/mutation.html

Figure 11. Le principe de la mutagense dirige

UTILISATION

Les applications varient de l'usage en laboratoire l'application clinique. Les anticorps


monoclonaux ont de multiples applications en recherche et en diagnostic, clinique humaine et
animale, exploitant la reconnaissance de protines en biologie, ou encore peuvent tre utiliss
comme mdicaments (herceptine dans le traitement du cancer du sein chez la femme).

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RPONSE PRIMAIRE ET RPONSE SECONDAIRE

Figure 12. Rponse primaire et rponse secondaire

Lors dun premier contact avec lantigne, la rponse humorale est lente se mettre en place
et de faible intensit. Les Immunoglobulines produites sont surtout de type IgM et lavidit
des anticorps est faible. Lors dun deuxime contact, la rponse est plus rapide, plus intense et
de type IgG. Lavidit des anticorps est plus leve (voir plus loin).
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La deuxime fois : il y a beaucoup plus de cellules rpondeuses (y compris in situ) donc une
probabilit de rencontre entre les diffrents partenaires plus grande, donc production plus
rapide. Lors du premier contact des cellules mmoires ont t constitues qui ont gardes le
souvenir de ce premier contact.

AVIDIT ET AFFINIT.

Affinit

L'affinit des anticorps est l'intensit de la raction entre un dterminant antignique unique et
un seul site de liaison de l'anticorps. Il est la somme des forces d'attraction et de rpulsion
agissant entre le dterminant antignique et le site de liaison de l'anticorps tel que reprsent
sur la Figure 2.

Figure 13. Illustration de la notion daffinit

Laffinit est la constante d'quilibre qui dcrit la raction antigne-anticorps, comme illustr
dans la Figure 14. La plupart des anticorps ont une forte affinit pour les antignes.

20
Figure 14. Le calcul de laffinit

Avidit

L'avidit est une mesure de la force globale de la liaison d'un antigne possdant des
dterminants antigniques multiples avec des anticorps polyvalents. Lavidit est influence
la fois par la valence de l'anticorps et la valence de l'antigne. Lavidit est suprieure la
somme des affinits diffrentes. Ceci est illustr dans la Figure 4.

Figure 15. Diffrence entre affinit et avidit

Laffinit fait donc rfrence la force de liaison entre un dterminant antignique unique et
un site anticorps individuel alors que l'avidit fait rfrence la force globale de la liaison
entre les antignes et les anticorps multivalents.

RACTIONS CROISES

La cross-ractivit (encore appele raction croise) fait rfrence la capacit dun site
anticorps donn ragir avec plus dun dterminant antignique ou encore la capacit dune

21
population polyclonale danticorps ragir avec plus dun antigne. La Figure 5 illustre
comment des ractions croises peuvent se produire. Elles peuvent rsulter de lexistence dun
pitope en commun entre lantigne donnant lieu la raction croise et celui ayant servi
limmunisation ou encore de la reconnaissance dun pitope possdant une structure similaire
dans lantigne cross-ractif et lantigne immunisant (multispcificit).

Figure 16. La notion de raction croise

LES TESTS SROLOGIQUES

La dtection des anticorps spcifiques dans le srum peut se faire de diffrentes manires. On
distingue principalement les techniques dagglutination, les techniques
dimmunoprcipitation, les techniques dimmunolectrophorse, les techniques
immunoenzymatiques, les immunoblots etc

MESURE DE LA QUALIT DUN TEST DIAGNOSTIC

Quelle que soit la mthode utilise, il est important de pouvoir estimer la qualit dun test de
diagnostic. Les paramtres utiliss sont la sensibilit, la spcificit, lexactitude, la valeur
prdictive positive et la valeur prdictive ngative.

TABLEAU 1. LES CARACTRISTIQUES DUN TEST DIAGNOSTIC

Patient
Positif Ngatif
Positif A=VP B= FP A+B
Test
Ngatif C=FN D=VN C+D
A+C B+D N=A+B+C+D

La sensibilit : capacit pour un test de dtecter comme positif un chantillon positif

22
Se =A/A+C comprise entre 0 et 1 et souvent exprim en %

Elle est influence par les rsultats faux ngatifs cest--dire les chantillons positifs dtects
comme ngatifs par le test.

La spcificit : capacit dun test de dtecter comme ngatif un chantillon ngatif.

Sp=D/B+D comprise en 0 et 1 et souvent exprime en %.


Elle est influence par les rsultats faux positifs cest--dire les chantillons ngatifs dtects
comme positifs par le test.

Lexactitude : La proportion de de rsultats corrects

E=A+D/N compris entre 0 et 1 et souvent exprim en %.

Ce quon gagne en sensibilit on le perd en spcificit et vice versa. Si vous avez un test trs
sensible vous augmenter la probabilit davoir de faux positifs et donc de diminuer la
spcificit. Dautre part, si vous avez un test trs spcifique vous risquez davoir des faux
ngatifs et donc de diminuer la sensibilit. Ainsi, pour un test de screening on va privilgier
un test trs sensible quitte avoir des faux positifs. Ensuite, tous les positifs sont retests avec
un test trs spcifique qui permet dliminer les faux positifs.

La valeur prdictive positive est la proportion de vrais positifs parmi les positifs dun test ou
encore cest la probabilit quune rponse positive du test corresponde un chantillon positif
(organisme infect).

VPP=A/A+B ou VP/VP+FP compris entre 0 et 1 et souvent exprim en %.

VPP= valeur prdictive positive, VP=vrais positifs, FP=faux positifs.

Inversement, la valeur prdictive ngative est la proportion de vrais ngatifs parmi les ngatifs
dun test ou encore la probabilit quune rponse ngative du test corresponde un
chantillon ngatif (organisme sain).

VPN=D/D+B ou VN/VN+FN compris entre 0 et 1 et souvent exprim en %.

VPN=valeur prdictive ngative, VN : vrai ngatif, FN : faux ngatif.

23
VALIDATION DUN TEST.

Vous avez dvelopp un nouveau test diagnostic et vous voulez tester sa qualit. Plusieurs cas
de figure peuvent se prsenter. Soit vous disposer dune mthode de rfrence et la validation
consistera comparer votre nouveau test par rapport la mthode de rfrence sur les mmes
chantillons. Il est important de disposer dchantillons positifs et dchantillons ngatifs.

La validation consistera a calcul la spcificit relative et la spcificit relative ou encore


lexactitude relative par rapport la mthode de rfrence.

TABLEAU 2. VALIDATION DUN TEST PAR RAPPORT A UNE MTHODE DE RFRENCE

Mthode de rfrence
Positif Ngatif
Positif A=80 B=10 A+B=90
Test
Ngatif C=20 D=90 C+D=110
A+C=100 B+D=100 N=A+B+C+D=200

Sensibilit relative (%)= (A/A+C) x100

Dans lexemple ci-dessus, la sensibilit relative vaut 80%.

Si la sensibilit relative est de 80% cela veut dire que 8 chantillons sur 10 sont positifs avec
les deux tests et 2 chantillons sont positifs pour la mthode de rfrence et ngatifs pour le
nouveau test.

Spcificit relative (%)= (D/D+B) x100

Dans lexemple ci-dessus, la spcificit relative vaut 90%

Si la spcificit relative est de 90% cela veut dire que 9 chantillons sur 10 sont ngatifs avec
les 2 tests et quun chantillon est ngatif avec la mthode de rfrence et positif pour le
nouveau test.

Dans le cas expos ci-dessus, lexactitude relative vaut 85%.

En gnral en considre quun nouveau test est valable si les valeurs de spcificit relative et
de sensibilit relative et lexactitude relative sont suprieures 90%.

24
On peut aussi calculer lindex de Youden (%) : (Spcificit + Sensiblit)-100

Ici dindex vaut : 170-100 soit 70%.

On peut galement calculer lagrment entre les deux tests de diffrentes manires. En
gnral on utilise le test Kappa de Cohen et le test de McNemar.

Le test de McNemar est un calcul de Chi carr qui calcule la valeur suivante= Chi2=(B-
C)2/(B+C) avec 1 degr de libert. Si la valeur est suprieure 3,84 les deux tests sont
considrs comme significativement diffrents et inversement avec un risque derreur de 5%.

Dans notre exemple, la valeur de chi carr vaut : 100/30 soit 3,3 ce qui est infrieur 3,84
donc les deux tests ne donnent pas significativement des rsultats diffrents (p>0,05).

LE COEFFICIENT KAPPA DE COHEN

Figure 17. Le calcul du coefficient Kappa de Cohen

Po= proportion daccord observ

Pe =proportion daccord alatoire

TABLEAU 3. EXEMPLE DE CALCUL DAGRMENT ENTRE 2 MTHODES

Test de rfrence

Positif Ngatif

Test Positif 80 10 90
valider Ngatif 20 90 110

100 100 200

25
Dans notre exemple Po= (80+90/200)=0,85

Pe= 1/2002 (100x90+100x110)=9000+11000/40000=0,5

K=0,85-0,5/0,5=0,35/0,5=0,7

TABLEAU 4. VALEURS DE LAGRMENT SELON LA VALEUR DE KAPPA


Accord Kappa
Excellent 0,81
Bon 0,80 - 0,61
Modr 0,60 - 0,41
Mdiocre 0,40 - 0,21
Mauvais 0,20 - 0,0
Trs mauvais < 0,0

Lagrment entre les deux mthodes est donc considr comme bon.

Si on veut valider une toute nouvelle mthode sans disposer de mthode de rfrence, il faut
disposer dchantillons connus comme positifs ou comme ngatifs. Pour cela, on peut si cest
un test srologique utilis du srum danimaux immuniss ou non ou bien on peut utiliser les
donnes cliniques. Pour dautres tests, on peut utiliser des chantillons artificiellement
contamins. Mais de toute la faon la situation est moins confortable que la situation o un
test de rfrence existe.

LES CHANTILLONS

En srologie on travaille essentiellement avec du srum. Celui ci est obtenu par ponction de
sang veineux dans un tube sec. Aprs coagulation et centrifugation, on rcupre le surnageant
qui est constitu de srum alors que les cellules sont emprisonnes dans le caillot.

Le srum est le liquide sanguin dbarrass de ses cellules et des protines de la coagulation.
C'est le liquide surnageant obtenu aprs coagulation et centrifugation du sang dans un tube
sec , c'est--dire sans inhibiteur de la coagulation. A l'inverse du plasma, obtenu par simple
centrifugation sans coagulation pralable, le srum est dbarrass des facteurs
de coagulation et du fibrinogne, consomms par la coagulation. Ce liquide principalement
constitu d'eau, contient des substances dissoutes, qui sont essentiellement :

26
des protines (anticorps, albumine, etc.) ;
divers ions (sodium, chlorure, etc.).

. Une protine srique est une protine contenue dans le srum. Ces protines peuvent tre
spares lors d'examens biologiques par lectrophorse (sur actate de cellulose ou agarose).
On obtient la sparation de deux types de protines en 5 fractions protiques :

les albumines (les plus abondantes)


les globulines :
Alpha 1-globulines.
Alpha 2-globulines.
Btaglobulines.
Gammaglobulines (aussi appeles immunoglobulines).

Figure 18. Gel dlectrophorse des protines sriques.


http://fr.wikipedia.org/wiki/%C3%89lectrophor%C3%A8se_des_prot%C3%A9ines

27
LES TESTS DAGGLUTINATION.

L'agglutination immunologique a t dcouverte par Gruber et Durham la fin du xixe sicle,


avec des suspensions bactriennes incubes avec les immunosrums homologues. Ce
phnomne est gnral et s'applique tout systme o les antignes sont associs une
particule biologique (cellule) ou inerte (latex, bentonite) ayant t pralablement
sensibilise par adsorption ou fixation chimique de molcules antigniques leur surface,
dans la raction d'agglutination on observe la clarification de la suspension antignique
particulaire par suite de la formation d'agrgats qui se dposent au fond du tube.
L'agglutination s'observe galement sur des surfaces (lames de verre ou de plastique) sur
lesquelles sont dposs la suspension antignique et l'immunsrum ou une solution
d'anticorps.

Figure 19. La raction dagglutination

1. DFINITIONS ET CARACTRISATION DES RACTIONS DAGGLUTINATION

1.1. Principe des ractions dagglutination

Lagglutination correspond la formation dun complexe immun entre des antignes


particulaires (bactries, virus, hmaties,) ou rendus particulaires (par fixation des
hmaties, des particules de latex,) et des anticorps spcifiques.

28
Le rseau tridimensionnel obtenu est visible loeil nu sous forme dagglutinats.

1.2. Facteurs influenant les ractions dagglutination

Lagglutination dpend :

de lantigne (accessibilit la surface de la particule, nombre de sites antigniques)

du milieu dans lequel la raction a lieu. En effet, la liaison Ag-Ac et la formation du rseau

tridimensionnel sont influences par :

- la temprature (en gnral, lagglutination apparat plus rapidement 37C qu 4C)

- le pH (pH optimum entre 6 et 8)

- la force ionique (modification des interactions Ag-Ac)

de la structure molculaire de lAc :

- Ac agglutinants si agglutination dantignes dont ils sont spcifiques une

concentration en NaCl de 0,15 mol/L (= 0,9 % ou 9 g/L = solution isotonique).

Les anticorps agglutinants utiliss sont, le plus souvent, des IgM.

- Ac non agglutinants si absence dagglutination dantignes dont ils sont spcifiques

une concentration en NaCl de 0,15 mol/L (= 0,9 % ou 9 g/L = solution isotonique).

Les anticorps non agglutinants utiliss sont, le plus souvent, des IgG.

1.3. Caractristiques des ractions dagglutination

Avantages Inconvnients

Trs sensibles Peu prcises

Faciles mettre en oeuvre Effet de zone

29
Figure 20. Le phnomne de zone. Complexes antigne-Anticorps forms (y) en fonction
de la quantit dantigne (x). Zone 1 : excs danticorps, peu de complexes forms, Zone
2 : beaucoup de complexes car bon rapport Ab-Ac, Zone 3 : excs dantignes, peu de
complexes forms

2. LES DIFFRENTS TYPES DAGGLUTINATION

2.1. Agglutination active

Si lantigne est particulaire ou cellulaire, on qualifie lagglutination d active .

2.1.1. Agglutination active directe

Lagglutination active directe rsulte de la formation dun complexe immun entre un antigne
particulaire (ou cellulaire) et un anticorps agglutinant.

Ces ractions peuvent tre ralises :

en tubes,

en microplaques,

sur lames.

Ces ractions peuvent tre :

30
qualitatives,

ou quantitatives : la dernire dilution du srum donnant encore une agglutination nette

permet de dterminer le titre du srum.

Exemple : srogroupage des salmonelles, groupage ABO,

2.1.2. Agglutination active indirecte ou artificielle

Lagglutination active indirecte ou artificielle rsulte de la formation dun complexe immun


entre un antigne particulaire (ou cellulaire) et un anticorps non agglutinant. Il faut donc avoir
recours des artifices pour obtenir une agglutination :

a. Grce des pontages entre les anticorps (macromolcules ou anticorps antianticorps)

Cet artifice consiste ajouter dans le milieu ractionnel des macromolcules (BSA =

Albumine srique bovine, Dextran, Ficoll,) ou des anticorps anti-anticorps qui crent
desponts entre les molcules danticorps fixs sur des particules voisines.

b. Grce un traitement enzymatique

Cet artifice consiste hydrolyser les glycoprotines prsentes la surface des cellules par un
traitement enzymatique (exemples denzymes : papane, enzyme dextraction dans le cas du
srogroupage des streptocoques) rendant plus accessible les sites antigniques.

2.2. Agglutination passive

Lagglutination passive rsulte de la formation dun complexe immun entre un antigne

normalement soluble mais rendu particulaire par fixation sur un support figur et un anticorps
agglutinant.

2.2.1. Particules de latex

Ce sont des particules de forme sphrique le plus souvent de 0,81 !m de diamtre.

LAg est fix par simple contact.

Pour viter toute agglutination spontane, on travaille pH fixe et gal 8,2.

Avantages des particules de latex : elles sont antigniquement neutres et peu fragiles.

Exemple : diagnostic de la syphilis (VDRL latex),

31
2.2.2. Hmaties

Les hmaties sont des cellules fragiles qui shmolysent en 3 semaines environ. Toutefois, un
traitement au formol diminue cette fragilit.

Elles portent leur surface de nombreux Ag risquant dagglutiner avec des anticorps
diffrents de ceux recherchs.

Pour pallier ces problmes, on travaille avec :

des hmaties humaines du groupe O Rh-

des hmaties dune autre espce animale (mouton, dinde, poulet)

Toutefois, il est souvent ncessaire dliminer les Ac htrologues des srums en les
adsorbant avec des rythrocytes de la mme espce. On ralise toujours un tmoin srum pour
limiter les fausses agglutinations.

La fixation des Ag la surface des hmaties peut tre ralise de plusieurs faons :

par simple contact (ex : antigne Vi de Salmonella)

par fixation chimique (ex : glutaraldhyde)

par fixation immunologique (ex : IgG anti-hmatie de mouton)

Avantages des hmaties : lecture facile, grande sensibilit

Exemples : srologie de la syphilis par recherche des anticorps anti-polyosides denveloppe

de Treponema pallidum (raction du TPHA)

32
Figure 21. Lagglutination directe (en haut) et lagglutination indirecte (en bas).

33
LAGGLUTINATION EN PHASE LIQUIDE

Lagglutination peut aussi se faire en phase liquide, dans ce cas, les particules antigniques
sont mlanges avec le srum immun. Si aucune raction antigne, anticorps ne se droule,
alors les particules antigniques insolubles prcipitent au fond du puit et on peut le visualiser
lil nu (figure). Si une raction antigne-anticorps a lieu, il y a formation du rseau
tridimentionnel qui retarde la prcipitation des particules insoluble.

Figure 22a. Rsultat dune agglutination en phase liquide

Figure 22 b: interprtation des rsultats dune agglutination en phase liquide. De


gauche droite, du plus ngatif au plus positif.

34
Un fois encore le rapport entre la quantit dantigne et danticorps est important. En excs
dantigne, la prcipitation aura lieu mme en prsence danticorps spcifiques car ceux-ci
sont prsents en trop faible quantit. En excs danticorps, le rseau tridimentionnel ne se
formera pas non plus et la prcipitation ne sera pas retarde.

IMMUNOPRCIPITATION

Contrairement lagglutination, ici il sagit dantignes solubles que lon veut faire prcipiter
grce la raction antigne-anticorps alors que dans la raction dagglutination en phase
liquide on veut retarder la prcipitation dun antigne particulaire qui est insoluble et donc
tendance naturellement prcipiter.

Vritable modle du genre par sa simplicit et son immense champ d'application, la


prcipitation spcifique entre un antigne et les anticorps homologues est indiscutablement la
plus importante raction Ag-Ac in vitro. Cette raction, dans ses deux aspects qualitatif et
quantitatif, aussi bien en milieu liquide qu'en milieu glifi, a eu une importance historique
considrable par les progrs thoriques et pratiques qu'elle a permis de raliser en
immunologie, non seulement sur le plan analytique, mais aussi pour le dveloppement de
nombreux concepts fondamentaux de cette discipline.

Dcouverte en 1897 par Kraus, cette raction se traduit par la formation plus ou moins rapide
(quelques minutes plusieurs heures) d'un agrgat (appel parfois floculat) visible l'il nu
lorsqu'on mlange, dans des proportions appropries et des concentrations suffisantes, un
immunsrum ou une solution d'anticorps avec une solution de l'antigne homologue.
L'agrgat, d'abord dispers dans l'ensemble de la phase liquide, se dpose progressivement
sous la forme d'un prcipit dans le mlange ractionnel dont il peut tre spar par
centrifugation.

Si, au lieu de mlanger la solution d'antigne et l'immunsrum, on les superpose (sans


mlange) dans un tube fin, l'immunsrum plus dense tant au fond, le prcipit form se
prsente sous la forme d'un disque fin visible qui apparat en quelques minutes (pour un
srum de bonne affinit) l'interface des deux liquides. Cette preuve qualitative de
prcipitation interfaciale, ou ring-test , est couramment utilise comme mthode
exploratoire rapide et fiable pour la dtection des anticorps prcipitants dans un immunsrum.

35
Mais c'est surtout aprs l'tablissement des mthodes quantitatives d'tude de la raction de
prcipitation Ag-Ac par M. Heidelberger et son cole (Wu, Randall), partir de 1928, puis
par E. Kabat, que cette raction connut son vritable essor comme fondement de
l'immunochimie quantitative.

L'importance de cette mthodologie a t capitale plusieurs gards :

elle a permis de dmontrer de manire dfinitive que les anticorps taient des protines ;

elle a introduit une dimension quantitative en immunologie (dosage des antignes et des
anticorps) qui, jusqu'alors, tait reste essentiellement descriptive ;

elle a conduit proposer puis dmontrer la multivalence des antignes, la divalence ou la


multivalence des anticorps et de ce fait, permis Marrack ds 1933 de proposer la thorie
du rseau dcrit plus loin ;

elle a permis de dmontrer l'immunognicit de macromolcules autres que les protines,


notamment les polyosides dont la structure rptitive a permis d'en utiliser des fragments
comme haptnes pour dterminer la taille des pitopes et du site anticorps.

En 1946, l'Institut Pasteur de Paris, Jacques Oudin eut l'ide de remplacer le milieu liquide,
dans lequel la raction de prcipitation tait jusque-l effectue, par un milieu glifi qui
freinerait la sdimentation.

Prcipitation quantitative en milieu liquide

La raction de prcipitation Ag-Ac est un processus complexe qui peut se dcomposer en


deux stades : d'abord combinaison des divers pitopes et des sites anticorps homologues
(interaction primaire) de cintique rapide de l'ordre de la fraction de seconde ; ensuite,
ractions secondaires en chanes, variables selon les proportions d'antignes et d'anticorps qui
aboutissent la formation des agrgats et leur insolubilisation ventuelle. Ce deuxime
stade se droule beaucoup plus lentement que le premier et sa vitesse dpend des rapports de
concentration des espces molculaires prsentes et de caractristiques propres chaque
systme.

Ces donnes permettent d'envisager l'valuation quantitative de deux types de paramtres : le


temps d'apparition des prcipits et la quantit d'anticorps prcipit. Selon le paramtre choisi,
36
deux mthodologies diffrentes s'appliquent. Celle base sur le temps de prcipitation
(techniques dites de floculation de Ramon et de Dean et Webb) n'est utilise que de manire
limite et s'applique au dosage des toxines bactriennes ou de venins et de leurs anticorps. En
revanche, la mesure de la quantit d'anticorps prcipit, c'est--dire l'tablissement de la
courbe de prcipitation quantitative antigne anticorps, est de porte beaucoup plus gnrale
et trs largement utilise. Outre son intrt thorique mentionn plus haut, elle permet le
dosage prcis des antignes et de leurs anticorps prcipitants. Elle sert aussi de base pour les
autres techniques de mesure de la raction Ag-Ac pour estimer les rapports ventuels entre les
titres en anticorps trouvs par ces techniques et la teneur en anticorps prcipitants.

37
Figure 23. Courbe de prcipitation quantitative antigne-anticorps : la mthode exprimentale
utilise consiste mlanger dans une srie de tubes sous un faible volume (< 2 ml) une
quantit fixe d'immunsrum ou de solution d'anticorps et des quantits croissantes d'antigne
homologue en solution. Les mlanges sont incubs pendant 1 2 heures 37 C puis
maintenus +4 C pendant 2 8 jours. Des prcipits (complexes Ag-Ac insolubles) se
forment, dont l'importance augmente de tube en tube jusqu' passer par un maximum dans les
tubes centraux pour diminuer ensuite progressivement. Les prcipits sont spars par
centrifugation puis lavs par une solution tampon. On dtermine ensuite soit leur teneur en
protine par spectrophotomtrie ou colorimtrie.

La figure 23 rassemble l'ensemble des rsultats exprimentaux et leur interprtation. Pour la


plupart des immunsrums humains ou de diffrentes espces animales (sauf pour certains
srums quins), le graphe qui reprsente la quantit de complexe Ag-Ac prcipit en fonction
de la quantit d'antigne possde une allure parabolique (courbe 1). La quantit de complexe
augmente pour atteindre un point maximum puis diminue. L'analyse des surnageants et des
prcipits montre que l'on peut distinguer trois zones : une zone centrale II, dite zone
d'quivalence pour laquelle l'antigne et l'anticorps introduits sont totalement dans le
prcipit, entoure gauche par une zone d'excs d'anticorps (I) mais o tout l'antigne est (en
principe) dans le prcipit et, droite, par une zone d'excs d'antigne (III), o une partie de
celui-ci est sous forme de complexe soluble et l'autre partie est dans le prcipit. Plus la
quantit d'antigne sera leve plus la fraction de complexe soluble sera importante.

Une fois connus les poids des complexes immuns prcipits, on peut valuer la quantit
d'anticorps prcipit. Si l'antigne n'est pas protique, la totalit des protines du prcipit
reprsentera l'anticorps. La situation est plus complexe lorsque l'antigne est protique car il
faudra dduire de la quantit totale d'azote ou de protine du prcipit, celle correspondant
l'antigne (courbe 2). Cette opration n'a de sens que dans la zone d'excs d'anticorps et
d'quivalence o, a priori, tout l'antigne introduit est dans le prcipit. Si l'on dsire connatre
la quantit d'anticorps prcipit en zone d'excs d'antigne (courbe 2 en pointill), celui-ci
devrait pouvoir tre reprable par marquage avec un radio-isotope ou par une fluorochrome.
Connaissant la quantit d'anticorps dans les prcipits, il est alors possible de calculer, pour

38
chaque mlange Ag-Ac tudi, le rapport de molcules d'Ac et d'Ag dans les complexes
insolubles. Ce rapport dcrot pour beaucoup de systmes linairement avec la quantit x
d'antigne introduit (courbe 3).

La stoechiomtrie complexe de la raction de prcipitation s'explique par l'implication


simultane de trois facteurs : divalence ou multivalence des anticorps ; multivalence (structure
multipitopique) des antignes ; rversibilit partielle (lente mais relle) des complexes.

Ces caractristiques rendent compte de la variabilit de la composition relative en antigne et


en anticorps des prcipits et des complexes solubles en zone d'excs d'antigne tout le long
de la courbe. En excs d'anticorps, chaque molcule multipitopique d'antigne s'unira avec
beaucoup plus de molcules d'anticorps que dans les zones d'quivalence ou d'excs
d'antigne. Inversement, en excs d'antigne, le prcipit sera plus riche en molcules
d'antigne que d'anticorps. On remarquera que l'extrme limite atteinte pour un complexe
soluble en grand excs d'antigne est du type Ag2-Ac qui dmontre la divalence de l'anticorps.
La courbe (3) extrapole son point d'intersection avec l'axe des ordonnes du rapport
molaire Ag-Ac (c'est--dire en grand excs d'anticorps) permet de calculer la valence
minimum de l'antigne.

La prcipitation Ag-Ac s'interprte correctement par la thorie de Marrack (1933)


ultrieurement affine par divers auteurs sur le plan mathmatique. Cette thorie postule la
formation d'un rseau tridimensionnel intermolculaire entre les divers pitopes de l'antigne
et les molcules d'anticorps spcifiques.

Prcipitation en milieu glifi

Les techniques d'analyse immunochimique qualitative ou quantitative en milieu


glifi peuvent tre divises en deux groupes : immunodiffusion des antignes et des
anticorps en l'absence de champ lectrique et immunodiffusion associant l'action d'un tel
champ. Dans les deux types de mthodes la diffusion peut tre unidimensionnelle ou
bidimensionnelle.

Immunodiffusion en l'absence d'un champ lectrique

Deux modalits techniques ont t proposes par Oudin en 1946 : l'antigne en solution
diffuse dans un gel contenant l'anticorps : c'est la diffusion simple ; les deux ractifs (antigne

39
et anticorps) diffusent l'un vers l'autre dans une couche de gel vierge : c'est la diffusion double
(technique la plus utilise).

Figure 24. Limmunoprcipitation en tube (Mthode dOudin)

Ces deux types d'analyse peuvent tre effectus en tubes, en cuves faces parallles
(technique d'Oudin) ou en plaque (technique prconise en 1948 par Elek et Ouchterlony).
Dans la diffusion double, en tubes ou en cuves, le systme est form de trois couches : une
premire couche contenant l'immunsrum ou la solution d'anticorps incorpors dans de la
glose (couche infrieure) ; une deuxime couche contenant la glose seule ; une troisime
couche contenant la solution d'antigne qui est ou qui n'est pas glose.

Dans la diffusion double en plaques, le gel vierge est coul sur une surface de verre (plaque
de verre ou bote de Ptri). Les ractifs diffusent soit partir de bandes de papier disposes
la surface du gel (technique d'Elek relativement peu utilise), soit partir de rservoirs
mnags dans le gel (technique d'Ouchterlony d'un emploi universel). Les sources de
diffusion peuvent tre disposes de diffrentes manires : puits circulaires (le plus
frquemment), triangulaires ou rectangulaires creuss avec un emporte-pice dans la glose.

40
Figure 25. La technique d'immunodiffusion
sur plaques (Ouchterlony) : les lignes de
prcipits en continuit (c'est--dire
coalescents par leurs extrmits) traduisent
l'identit de l'antigne utilis, alors que les
images d'intersection rvlent la non-identit
de ces antignes ; dans le cas d'une
communaut antignique partielle,
autrement dit de raction croise, il y a
coalescence de l'une des lignes, l'autre se
prolongeant au-del du point de contact.

Quel que soit le type de diffusion tudi, les rgles suivantes ont t nonces par Oudin :

La ractivit d'un seul antigne donne naissance une seule zone de prcipitation ;

Si plusieurs antignes sans ractivit croise ragissent simultanment dans un mme gel
avec leurs anticorps respectifs, ils se comportent d'une manire indpendante. Les diffrentes
zones de prcipitation (au maximum autant de zones que d'antignes diffrents) apparaissent
et voluent indpendamment les unes des autres ;

41
Le mouvement ou l'immobilit d'une zone de prcipitation dpend essentiellement du
rapport des concentrations initiales Agi d'antigne et Aci d'anticorps. Si ce rapport correspond
l'quivalence dans la raction en milieu liquide, la zone de prcipitation sera immobile.
Dans le cas contraire, la zone se dplace au cours du temps en s'loignant de la source de
ractif qui est en excs ;

La distance de la frontire de la zone de prcipitation l'interface entre les deux couches est
trs sensiblement proportionnelle la racine carre du temps coul :

Pour un temps donn, la pntration (h) de la zone de prcipitation est proportionnelle au


logarithme de la concentration de l'antigne (Ag). La pntration h ne s'carte quasi pas d'une
ligne droite et se conforme sensiblement l'quation :

o Ag est la concentration initiale de l'antigne diffusant, et g0, des constantes ;

La concentration des anticorps exerce sur la pntration de la zone de prcipitation h une


influence analogue celle de la concentration de l'antigne, mais en sens inverse de celle-ci.
La pntration h de la zone de prcipitation, pour un temps donn, est une fonction linaire du
logarithme de la concentration des anticorps :

Ces techniques analytiques permettent le dnombrement des antignes contenus dans un


mlange, et leur identification. Elles permettent galement le dosage des antignes et
ventuellement des anticorps.

42
Dnombrement des antignes

Le nombre observ des zones de prcipitation peut tre raisonnablement considr comme le
nombre minimal des antignes qui ragissent, le nombre des antignes prsents pouvant
toujours tre plus grand que le nombre des zones de prcipitation si l'on tient compte de la
possibilit pour certains antignes de ne pas donner de zone visible ou distincte.

Identification des antignes

L'identification consiste reconnatre la prsence ou l'absence d'un mme antigne dans


plusieurs solutions, dans le cas le plus frquent reconnatre la zone d'un mme antigne dans
la raction de deux ou plusieurs solutions avec le mme immunsrum ou avec plusieurs
immunsrums diffrents. Un des moyens les plus utiliss consiste tudier les ractions de
voisinage en plaque .

Lorsqu'un mme antigne est prsent dans des puits voisins, les zones de prcipitation n'en
seront qu'une seule (coalescence). Il s'agira donc d'identit antignique totale. Si les antignes
n'ont aucun dterminant commun et sont donc totalement diffrents, les zones de prcipitation
se coupent mutuellement. Enfin, en cas de prsence de dterminants communs entre deux
antignes ayant par ailleurs des dterminants spcifiques de chacun d'eux, on observera une
coalescence partielle qui se traduit par la formation d'un peron entre les zones ragissant et
par un affaiblissement de l'intensit du prcipit au-del du point de jonction des deux zones.

Dosage des antignes et des anticorps

Ce dosage peut s'effectuer par les techniques de diffusion simple en tube, en se basant sur les
lois linaires auxquelles obit la distance h, en un temps donn par la zone de prcipitation, en
fonction du logarithme de la concentration initiale d'antigne et celui de la concentration
initiale d'anticorps.

Diffusion simple

Actuellement une technique simple dite d'immunodiffusion radiale, dcrite par Mancini,
permet le dosage de l'antigne en milieu glose en plaque, en se basant sur les lois
prcdentes.

43
Figure 26. Immunodiffusion de Mancini. Il existe une proportionnalit entre le carr du
diamtre de diffusion et la concentration en antigne.

Il a t montr que, lorsqu'un antigne soluble est mis diffuser radialement partir d'un
rservoir creus dans un gel contenant l'immunsrum ou les anticorps homologues, il se
produit un prcipit annulaire dont le diamtre D est proportionnel la racine carre de la
concentration (C) de l'antigne (loi parabolique de Sandor). Cette relation s'crit

o A et B sont deux constantes dpendant respectivement de l'ordonne l'origine et de la


pente de la droite de rfrence. En portant, sur un systme d'axes, le diamtre des anneaux de
prcipitation et la racine carre des concentrations d'antignes, on obtient une droite. Une
autre mthode d'valuation est la mthode prconise par Mancini qui relie la surface S du
prcipit annulaire la quantit Q d'antigne selon l'quation :

44
o K est la pente de la droite d'talonnage.

Immunodiffusion associant l'action d'un champ lectrique

Cette mthodologie concerne les diffrents aspects de l'analyse immunolectrophortique


(souvent dsigne immunolectrophorse), mise au point par Grabar et Williams, et
concernant actuellement de nombreuses techniques qui en drivent .

Dans un gel aqueux transparent, on fait migrer par lectrophorse les constituants du liquide
examiner. On fait ensuite diffuser perpendiculairement l'axe de migration un immunsrum
contenant des anticorps prcipitant les constituants (antignes) du mlange. Lorsque ces
anticorps rencontrent les antignes homologues en proportions convenables, des arcs de
prcipitations spcifiques se forment dans le gel. Ce dernier tant transparent, les arcs sont
visibles et peuvent tre photographis. Il est cependant prfrable de colorer ces arcs par des
colorants appropris. Les prcipits contenant surtout des anticorps, donc des protines, sont
facilement colorables par les colorants classiques des protines. Des colorants spciaux
permettent de prciser la nature chimique des antignes s'ils contiennent des lipides, des
glucides, des acides nucliques, des mtaux, etc. ou si les antignes possdent une activit
enzymatique.

L'analyse immunolectrophortique est devenue bidimensionnelle en 1960 (Ressler, Laurell),


puis quantitative en 1966 (Clarke et Freeman), puis elle s'est affranchie de la ncessaire
prcipitation l'quilibre par les diverses techniques d'immunodtection ou d'immuno-affinit
(Awdeh, 1968 ; Keck, 1973). Par ces techniques, les antignes spars par lectrophorse sont
fixs chimiquement et dtects par des anticorps spcifiques marqus par des enzymes ou par
des radio-isotopes. En 1975, Southern mettait au point la technique des immunoempreintes
sur feuille de nitrate de cellulose qui immobilise les constituants spars, permettant ainsi
d'viter la fixation chimique peu efficace et en partie dnaturante. La dtection
immunochimique sur l'empreinte s'effectue par des anticorps marqus par un isotope, une
enzyme ou une molcule fluorescente. On dsigne souvent par le terme de western blot ce
type de mthodologie.

En fonction de ces donnes, les techniques actuelles immunolectrophortiques impliquent la


combinaison selon diverses modalits des deux tapes de l'analyse :a) Sparation
lectrophortique : lectrophorse de zone, isolectrofocalisation dans un gradient de pH,

45
isotachophorse, combinaison bidimensionnelle de deux techniques de principes diffrents,
supports varis (agarose, gels de polyacrylamide, gels mixtes, actate de cellulose).b)
Reconnaissance ou dtection immunochimique :

soit par prcipitation Ag-Ac : double diffusion, migration lectrophortique des antignes
et des anticorps appele contre-immunolectrophorse ou lectrosynrse dcrite par Bussard,
immunolectrophorse en fuse ( rocket ) de Laurell, migration lectrophortique des
antignes pralablement spars par lectrophorse orthogonalement dans un gel contenant
les anticorps, selon Rissler et Laurell, appele lectrophorse croise ;

soit par immunomarquage aprs immobilisation des antignes par prcipitation Ag-Ac,
aprs immobilisation chimique ou physique des antignes spars par isolectrofocalisation,
aprs immobilisation sur une empreinte ou rplique des antignes (Southern, Towbin, Peltre)
aprs sparation similaire.

46
Figure 26. Les immunolectrophorses.
http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/lafont/electrophorese/E2.html

A.Trac densitomtrique du
protinogramme d'un srum
humain normal

B.Les protines migrent dans un


gel d'agarose, puis on les rvle
par une technique de double
diffusion des antignes et des
anticorps, donnant des arcs de
prcipitation. Avec un
antisrum total, on peut par
exemple distinguer 30-40
protines dans le srum
humain. On peut bien sr
l'utiliser galement avec un
antisrum spcifique.
C.Electro-immunodiffusion
double (= lectrosynrse)
Cette mthode drive en fait de
la technique d'immunodiffusion
double d'Ouchterlony. Elle
consiste acclrer la diffusion
par un champ lectrique. Les
conditions lectrophortiques
sont choisies de faon ce que
les antignes et les anticorps
migrent en sens inverse (ceci
est possible car le pHi des
Immunoglobulines est
suprieur celui de beaucoup
de protines).

47
D.Electro-immunodiffusion
monodimensionnelle (Laurell).
Les protines sont dposes sur
des gels contenant l'antisrum.
On se place pH o les Ig
migrent peu. Les protines se
dplacent et rencontrent les
anticorps qui forment alors des
prcipits en forme de fuse
appels "rockets" dont la
hauteur est proportionnelle la
concentration en protine. On
utilise une partie des puits pour
faire un talonnage.
E.Electro-immunodiffusion
bidimensionnelle (Laurell)
On spare les protines dans
une premire dimension en gel
d'agarose. On coule ensuite un
gel contenant l'immunsrum
polyspcifique, puis on ralise
la seconde dimension.

48
LES CONJUGS

De nombreuses mthodes immunologiques utilisent des anticorps conjugus. Il sagit d


danticorps auxquels on a ajout une molcule dintrt. Il peut sagir dun fluorochrome pour
les techniques dimmunofluorescence, lune enzyme dans les tests immunoenzymatiques ou
dune molcule radioactive pour le Radio-immuno-assay ou RIA.

En effet, on peut lier de faon covalente (ou "conjuguer") sur un anticorps secondaire une
molcule facile dtecter, un traceur ("marker"), comme une enzyme, un radio-isotope, un
chromophore, un fluorophore, etc. Si on revient l'exemple ci-dessus, on peut donc obtenir,
en faisant ragir le complexe X:anti-X avec de l'anti-lapin conjugu avec un traceur (par
exemple anti-lapin/enzyme), un complexe ternaire X:anti-X:anti-lapin/enzyme. On peut alors
facilement dtecter cette enzyme dont la quantit sera proportionnelle la quantit de protine
X originale. On peut facilement retrouver dans le commerce des anticorps conjugus toutes
sortes de marqueurs (enzymes, fluorophores, radio-isotopes, etc.)

Elles doivent tre faciles obtenir et purifier, stables, et mettre en jeu une raction produisant
un compos color (cas le plus frquent).

Tableau 5 : quelques enzymes utilises pour former des conjugus

Enzyme Source
Peroxydase Raifort
Phosphatase alcaline Escherichia coli ou intestin de veau
-Galactosidase Escherichia coli

L'enzyme (marqueur) est couple l'antigne (ou haptne) ou l'anticorps. Ce couplage doit
prserver :
le site actif de l'enzyme
le site de liaison Ag ou Ac

49
Le couplage covalent direct est
ralis l'aide d'un ractif
bifonctionnel comme le
glutaraldhyde, qui tablit un
pont covalent entre deux atomes
d'azote (fonctions amines) des
protines.

Le couplage indirect fait


intervenir deux molcules
prsentant de l'affinit l'une pour
l'autre, chacune tant fixe par
un pont covalent l'antigne
d'une part et l'enzyme d'autre
part ; c'est le cas du systme
avidine-biotine.

50
Tableau 6. Les ractions enzymatiques

Enzymes Substrats Produits


Phosphatase PNPP (4-nitrophnyl-phosphate) PNP (4-nitrophnol) (jaune)
alcaline incolore 405 nm
Peroxydase H2O2 + OPD (orthophnylne Produit color (orange)
diamine) 492 nm
H2O2 + TMB((3,3',5,5'- Produit color jaune
tetramethylbenzidine)+H2SO4 (405 nm)
H2O2 + luminol Produit luminescent

425 nm
-galactosidase ONPG (2-nitrophnyl - galactoside) ONP (2-nitrophnol)
(jaune) 405 nm
+
Glucose 6- Glucose 6-phosphate + NAD ou NADH ou NADPH, 340 nm
+
phosphate NADP
dshydrognase

La rvlation consiste mesurer l'activit catalytique de l'enzyme : pour cela on mesure la


vitesse initiale de la raction catalyse par l'enzyme, aprs addition du (des) substrat(s) de
l'enzyme, et incubation. En gnral, on travaille en mthode "2 points" : on dose le produit
aprs addition d'un ractif d'arrt. Dans certain cas, on peut aussi procder par mthode
cintique.
L'activit enzymatique est mesure par spectrophotomtrie d'absorption molculaire,
fluorimtrie ou luminomtrie.
On travaille le plus souvent dans des plaques de microtitration 96 puits qui permettent de
traiter un grand nombre d'chantillons simultanment.

51
INDIRECT FLUORESCENCE ANTIBODY TEST: IFAT

Cest une technique qui utilise un conjugu coupl une molcule fluorescente, le plus
souvent lisothiocyanate de fluorscine (FITC). Lantigne (virus, bactrie, parasite) est fix
sur une lame de microscopie. La lame est ensuite incube avec le srum pour lequel la
prsence danticorps spcifiques est recherche. Les anticorps fixs sont ensuite mis en
vidence par incubation avec le conjugu fluorescent. Aprs montage, la lame est examine
sous microscope epifluoresence.

La fluorescence est un mcanisme physique qui fait quune molcule absorbe la lumire une
longueur donde donne dite longueur dexcitation. Ceci entrane lexpulsion dun lectron de
la couche lectronique externe de la molcule vers un tat excit et donc instable. Cet lectron
va regagner sa position initiale en mettant un photon une longueur donde dite longueur
donde dmission. La longueur donde dmission est suprieure la longueur donde
dexcitation. Cest ce quon appelle le dplacement de Stoke.

En effet, E=h et =C/ donc E=hC/

E=Energie ; h=constante de Planck, = frquence, C= vitesse de la lumire l=longueur donde

Donc si la longueur donde augmente, lnergie diminue. Cest ce quon attend en vertu des
principes de la thermodynamique.

52
Figure 27. Fluorescence versus phosphorescence.

Figure 28. Dplacement de Stokes/ Intensit de la lumire en fonction de la longueur donde.

PRINCIPE DE L'PIFLUORESCENCE
Les longueurs d'onde de la source d'excitation doivent toujours tre courtes si l'on veut
utiliser des substances qui fluorescent dans le visible. L'utilisation de sources fournissant
une importante quantit de bleu, de violet et mme trs souvent d'ultraviolet est donc
requise. Il faut alors gnralement remplacer la simple lampe incandescence (lampe
halogne) utilise en microscopie optique classique par un brleur' au Xnon ou un
brleur' HBO vapeur de mercure. De surcrot, ces courtes longueurs d'onde imposent
l'usage d'optiques en matriaux spciaux tels la fluorine ou le quartz, les verres optiques
standards absorbant fortement dans ce domaine spectral, la plupart tant mme opaque
dans l'ultraviolet. Tous les constructeurs proposent de telles optiques incorporant des
lments en fluorine, matriau qui permet par ailleurs d'amliorer la correction
chromatique des objectifs en raison de sa dispersion trs faible. Certains constructeurs
proposent en plus des objectifs faits avec des matriaux de trs grande puret n'ayant
aucune fluorescence propre qui pourrait voiler les images.

Le principal problme de la dtection de la fluorescence des objets microscopiques


provient du trs faible rendement nergtique de ce mcanisme de conversion de longueur

53
d'onde de flux lumineux. Les flux que l'on veut dtecter sont extrmement faibles alors
mme que l'clairement, et sa diffusion standard par la prparation, sont violents. Pour
rendre l'observation possible il faut amener le rapport signal sur bruit un niveau
acceptable. Pour cela on met usuellement profit la sparation spectrale de l'excitation et
du signal utile qu'il est donc possible de sparer par des filtrages appropris.

Une mthode permettant de surmonter les difficults prcdemment voques est


dnomme pifluorescence : la prparation est claire par le dessus avec un illuminateur
piscopique et l'observation de la fluorescence est effectue dans une configuration de
type microscopie par rflexion.

Un des avantages de ce rtro-clairage provient du fait que les prparations observes


sont usuellement plus transparentes que rflchissantes. La lumire d'excitation rflchie
et rtro-diffuse, qui forme ici le flux lumineux parasite liminer, est donc nettement
plus faible que la lumire transmise et diffuse vers l'avant qui formerait le flux parasite
dans une configuration d'clairage en ligne. Comme l'mission par fluorescence est un
phnomne usuellement isotrope, le signal utile ne dpend pas du sens de l'clairage, et le
rapport signal sur bruit est donc nettement meilleur en piscopie. Cet avantage est encore
renforc si l'on prend en compte la traverse de la prparation. Dans un cas, l'excitation ne
doit traverser que la lamelle couvre objet (0,17 mm), qui peut fort utilement tre en quartz
(ou mme absente) si l'on travaille avec de l'UV, alors que dans l'autre cas elle doit
traverser la lame porte objet (~1 mm) quasiment toujours en verre.

Un deuxime avantage de la configuration piscopique rside dans la possibilit de


raliser un filtrage spectral efficace de l'excitation et du signal utile au niveau du bloc
illuminateur. Pour travailler en pifluorescence on remplace la lame semi-rflchissante
de l'clairage Khler par rflexion par un cube constitu de deux filtres et d'un miroir
dichroque dont le schma est donn ci-dessous.

54
Figure 29: Cube pour illumination en pifluorescence

Le filtre d'excitation slectionne dans le flux lumineux issu de la source les seules
longueurs d'onde appropries l'excitation de la fluorescence de l'chantillon. Le miroir
dichroque rflchit les courtes longueurs correspondant l'excitation et transmet les plus
grandes longueurs d'onde. Il renforce donc dans un premier temps l'effet du filtre
d'excitation. La lumire issue de l'chantillon, qui contient la lumire de fluorescence et la
lumire parasite de rtro-diffusion de l'excitation, frappe le miroir dichroque. La
fluorescence est transmise avec trs peu de pertes alors que la majeure partie de la lumire
parasite est rflchie. Le faisceau lumineux atteint ensuite le filtre d'arrt qui, par
dfinition, bloque la lumire d'excitation parasite rsiduelle et laisse passer la
fluorescence. Avec des filtres et des miroirs de grande qualit, cette disposition permet
d'obtenir d'excellents rsultats avec une mise en uvre trs simple et trs sre pour
l'utilisateur. Les constructeurs proposent en gnral de trs nombreuses combinaisons de
filtres et de miroirs dichroques adaptes aux substances et fluorochromes couramment
utiliss.

L'pifluorescence possde galement l'avantage de permettre l'utilisation conjointe de la


lumire transmise. Les images obtenues en fluorescence sont en effet gnralement

55
constitues de petites zones missives dissmines dans un champ sombre et il est dans
ces conditions trs difficile d'identifier les objets l'origine de la fluorescence. Il est ds
lors trs utile de pouvoir simultanment observer la prparation en diascopie. Ceci ne
pose aucun problme pratique sur les microscopes rcents disposant de deux blocs
d'illumination spars, l'un diascopique et l'autre piscopique, dont on peut sparment
rgler la puissance. Il est de surcrot usuel d'utiliser la voie diascopique en contraste de
phase pour amliorer la visualisation et l'identification des objets.

Figure 30. Reprsentation schmatique dun microscope pifluorescence

56
LELISA. ENZYME LINKED SORBENT ASSAY

La mthode immuno-enzymatique ELISA (de l'anglais enzyme-linked immunosorbent assay,


littralement dosage d'immunoadsorption par enzyme lie , c'est--dire dosage immuno-
enzymatique sur support solide) est un examen de laboratoire. Cette mthode est
principalement utilise en immunologie pour dtecter la prsence d'un anticorps ou
d'un antigne dans un chantillon.

Ce test entre dans le cadre plus gnral des EIA (enzyme immunoassays), dans lequel le
dosage est coupl une raction catalyse par une enzyme qui libre un composant color
suivi par une spectroscopie, par opposition aux RIA (radio immunoassays) dans lesquels
l'anticorps est marqu par un radiolment et dont le dosage mesure un nombre de
dsintgrations par seconde.

L'ELISA est une technique biochimique utilisant un ou deux anticorps. L'un de ceux-ci
est spcifique de l'antigne, tandis que l'autre ragit aux complexes immuns (antigne-
anticorps) et est coupl une enzyme. Cet anticorps secondaire, responsable du nom de la
technique, peut aussi causer l'mission d'un signal par un substrat chromogne ou fluorogne.
L'ELISA pouvant tre utilis tant pour valuer la prsence d'un antigne que celle d'un
anticorps dans un chantillon, c'est un outil efficace la fois pour dterminer des
concentrations sriques d'anticorps, que pour dtecter la prsence d'un antigne. Il a
galement trouv des applications dans l'industrie alimentaire, pour dtecter des allergnes
alimentaires, comme le lait, les cacahutes, les noix et les ufs. C'est un test simple, facile
d'emploi et peu coteux. Il est limit par la disponibilit en anticorps spcifique.

2 HISTORIQUE

Rosalyn Sussman Yalow et Solomon Berson sont crdits du dveloppement des premiers
tests immunoenzymatique dans les annes 1950. Yalow obtiendra le prix Nobel de mdecine
en 1977. Les immunoessais sont devenus plus simples mettre en oeuvre et donc plus
populaire avec le dveloppement des techniques chimiques de couplage des enzymes aux
anticorps la fin des annes 1960. En 1983 le Professeur Anthony Campbell lUniversit de
Cardiff remplacera lusage de liode radioactif dans les immunoessais par lester dacridinium
qui gnre sa propre chmiluminescence. On estime que par an plus de 100 millions de ces

57
tests immunoenzymatiques sont maintenant utiliss partout dans le monde pour les tests de
diagnostic clinique.

3. PRINCIPES DE BASE

Les tapes de l'ELISA dit indirect, la plus couramment utilise, pour dterminer la
concentration en anticorps du srum sont :

1. l'application d'un chantillon d'un antigne connu sur une surface, le plus souvent celle
d'un puits d'une plaque de microtitration. L'antigne est fix la surface, de faon le
rendre immobile.
2. le recouvrement des puits (ou toute autre surface) par les chantillons de srum tester
(ou tout autre solution tester), dont la concentration en anticorps est, par dfinition,
inconnue, et habituellement dilue dans le srum d'une autre espce. L'utilisation de
srum non-humain empche la liaison l'antigne par des anticorps non-spcifiques
contenus dans le sang du patient.
3. le rinage de la plaque, de faon retirer les anticorps non-lis. Aprs rinage, seuls
les complexes antigne-anticorps demeurent attachs la surface du puits.
4. l'ajout aux puits des anticorps secondaires qui se lieront l'anticorps primaire, (il s'agit
dans ce cas d'une antiglobuline). Ces anticorps secondaires sont coupls l'enzyme
modificatrice de substrat qui permet de suivre l'volution de la raction.
5. le second rinage de la plaque, de sorte liminer les anticorps non lis.
6. l'application d'un substrat qui, s'il est converti par l'enzyme, met un signal
chromognique ou fluorescent.
7. la quantification du rsultat, la vue ou, le plus souvent, par spectrophotomtrie ou
tout autre appareil d'optique.

L'enzyme agit comme amplificateur : quand bien mme peu d'anticorps conjugus l'enzyme
seraient attachs, l'enzyme catalyserait la formation de nombreux signaux, ce qui rend ce test
trs sensible, mais augmente galement le nombre de faux positifs. Il faut donc, comme
d'habitude, prvoir des puits contrle .

58
Figure 31. Le principe de lELISA

L'ELISA peut tre ralis vise quantitative ou qualitative :

un rsultat qualitatif indiquera la prsence ou l'absence d'un antigne dans l'chantillon.


Les valeurs-seuil sont dtermines par l'analyste et peuvent tre bases sur la statistique.
Deux ou trois carts-types sont gnralement utiliss pour distinguer l'chantillon positif
du ngatif.

dans l'utilisation quantitative de l'ELISA, la densit optique ou les units de fluorescence


de l'chantillon sont interpoles sur une courbe d'talonnage en gnral une dilution
srielle de la cible.

59
3.1. LES SUBSTRATS CHROMOGENES

Les substrats en ELISA diffrent par leur prix, leur facilit dusage, leur sensibilit (la limite
de dtection) et la compatibilit avec les quipements doptique.

Les substrats en ELISA ncessitent des procdures pour la prparation de la solution de


travail et pour la dtection du signal. Certains substrats sont prts lusage alors que dautres
ncessitent du matriel supplmentaire pour tre prpars. De plus, chaque substrat ncessite
son optimisation particulire En gnral, il est plus difficile doptimiser un ELISA avec un
substrat sensible tant donn la faible marche quil y a entre un faible positif et un faux
positif. Aucun chercheur ne veut passer trop de temps loptimisation par consquent, il est
prfrable de choisir un substrat dELISA qui fonctionne la limite de dtection voulue et
ensuite loptimiser.

http://www.piercenet.com/guide/guide-elisa-substrates

Le PNPP (p-Nitrophenyl Phosphate, Disodium Salt) est un substrat largement utilise en


ELISA avec la phosphatase alkaline.Le PNPP produit un compos jaune qui absorbe la
lumire 405 nm. Le PNPP est disponible sous forme dune poudre ou sous forme dune
solution prte lemploi.
L ABTS (2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt) est
utilis comme substrat de lHRP et donne un produit soluble vert aprs raction. Ce
produit absorbe la lumire 410 nm et 650 nm. LABTS est un substrat de lHRP moins
sensible que lOPD et le TMB. La couleur apparat lentement (20 minutes) ce qui peut tre
un avantage si un bruit de fond inacceptable apparat avec lOPD ou le TMB en raison de
leur trop grande sensibilit.. LABTS est disponible ne tablette ou en solution prt
lusage.
LOPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) est utilis comme substrat de lHRP et
donne un produit soluble jaune-orange qui absorbe la lumire 492 nm. LOPD est
disponible soit sous forme de poudre ou de tablette et est facilement prpar par
dissolution dans un tapon stable de peroxyde dhydrogne
Le TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) est un substrat soluble de lHRP qui donne un
produit de couleur bleu dont labsorbance est maximale 370 nm et 652 nm. La couleur
est change en jaune par laddition dun acide fort (acide sulfurique ou acide
phosphorique) avec une absorbance maximale 450 nm. Le TMB est trs sensible et peut

60
produire du bruit de fond si on utilise trop dantigne ou trop danticorps. Le TMB est plus
rapidement oxyd que les autres substrats de lHRP donnant plus rapidement la coloration.

3.2 RADIOACTIVE ISOTOPES

Des isotopes radioactifs peuvent tre incorpors dans les ractifs des immunoessais pour
produire un radioimmunoessai (RIA). La radioactivit mise par les complexes antigne-
anticorps peuvent alors tre dtect par des mthodes conventionnelles. Les RIA sont les
premiers tests immunologiques dvelopps, ils sont trs sensibles mais leur usage est en
dclin en raison de la prsence de mthodes alternatives et du danger li la radioactivit.

3.3 ELISA PCR

Une nouvelle approche est de combiner limmunoessai avec la PCR en temps rel. Cette
approche appele ELISA PCR (ne pas confondre avec PCR ELISA) utilise comme marquage
des conjugus une sonde ADN. Cette sonde sera amplifie par PCR en temps rel et le signal
fluorescent analys.

3.4 FLUOROGENIC REPORTERS

Des molcules fluorescentes comme la phycorythrine sont utilises dans certains


immunoessais. Les micropuces protines sont des immunoessais qui utilisent souvent la
fluorescence.

4 CLASSIFICATIONS ET FORMATS

4.1. ELISA indirect classique.

LELISA indirect classique a t dcrit ci-dessus et reste le format le plus rpandu et le plus
facile utiliser.

4.2 ELISA de comptition

Dans un ELISA de comptition, les plaques sont coates avec lantigne. Ensuite, on les
incube avec le srum tester. Aprs lavage, on vient avec un anticorps monoclonal conjugu
spcifique de lantigne. Ensuite, toujours aprs lavage, le compos chromogne est ajout et
la densit optique est mesure. Celle-ci sera dautant plus faible que beaucoup des pitopes
ont t recouverts par le srum tester. Par consquent, contrairement un ELISA classique
plus la DO est faible plus le srum est positif.

4.2. ELISA davidit

Comme dj dcrit prcdemment, les anticorps produit lors dune rponse immunitaire
secondaire ont une avidit plus grande que lors dune rponse primaire en raison dune
meilleure adquation molculaire entre lpitope et le paratope. On peut investiguer lavidit
dun srum dans un ELISA davidit. Les premires tapes sont les mmes que dans un
ELISA classique. On mesure une premire fois la densit optique. Ensuite, on lave la plaque
61
et on la traite lure afin denlever les anticorps les moins bien fixs cest--dire ceux de
faible avidit. Ensuite, on mesure de nouveau la densit optique. Ensuite on fait la diffrence
entre les deux mesures de densit optique. Cette diffrence sera dautant plus grande que le
srum a une faible avidit et inversement.

4.3. ELISA Sandwich

Dans un ELISA Sandwich, les plaques sont dabord coates avec un anticorps monoclonal
spcifique de lantigne. Ensuite, lantigne est ajout, puis le srum, le conjugu et le ractif
chromogne. Ce type dELISA donne en gnral moins de bruit de fond.

Remarque :Ici, nous avons dcrit les ELISA utiliss en srologie cest--dire pour dtecter des
anticorps spcifiques prsents dans un srum mais lELISA est aussi trs utilis pour dtecter
des antignes spcifiques et dans ce cas, lELISA sandwich est souvent le plus utilis.

5. LECTEUR DE PLAQUES

En gnral, la lecture dune Plaque ELISA se fait grce un lecteur de plaques. Il sagit dun
spectrophotomtre dont le format a t adapt la lecture de plaques 96 puits.
D'aprs la loi de Beer-Lambert, l'absorbance A est fonction de la concentration C de la
solution, du coefficient d'absorption molaire et de la longueur de solution traverser L
A=C

Labsorbance est proportionelle la concentration( C) de la substance analyse.


Il est donc important de connatre la longueur donde dabsorption du produit color analys.

Figure 32. Principe du spctrophotomtre.

62
WESTERN BLOT OU IMMUNOBLOT

TECHNIQUE

Cette technique ne des progrs utilise l'lectrophorse sur gel de polyacrylamide pour sparer
des protines, pralablement dnatures, selon leur masse. Ces protines sont ensuite
transfres depuis le gel sur une membrane (typiquement en nitrocellulose), o elles sont
exposes un anticorps spcifique de la protine d'intrt. Il est possible grce cette
technique de dtecter la prsence d'une protine dans un tissu, d'valuer sa taille, sa
concentration, les variations de cette concentration, effectuer des comparaisons de
concentrations entre diffrents groupes, etc.

La mthode fut mise au point dans le laboratoire de George Stark Stanford en 1979. Le nom
du western blot, donn la technique par Burnette (1981) , est un jeu de mot partir de la
technique du Southern blot ou transfert de Southern, technique de dtection d'ADN nomme
d'aprs son inventeur, Edwin Southern et non d'aprs le point cardinal. La dtection
d'ARN est appele northern blot ou transfert de northern. Toutes ces techniques drivent leur
nom de l'tape de transfert sur membrane, compare une empreinte sur buvard (blot =
tache en anglais).

DIFFRENTES TAPES DU TRANSFERT DE WESTERN

PRPARATION DES CHANTILLONS


Les chantillons (d'un tissu ou d'une culture cellulaire) sont rapidement refroidis, voire
rfrigrs (en dessous de 0 C). Ils sont homogniss par sonication (utilisation d'ultra-sons
pour rompre les membranes), contrainte mcanique ou simplement lyss par utilisation de
tampons haute concentration en sels. Il en rsulte un homognat de tous les compartiments
cellulaires, pouvant tre utilis tel quel ou tre soumis plusieurs tapes de centrifugation
diffrentielle afin d'isoler les fractions cytosolique, nuclaire et membranaire. L'chantillon
est ensuite trait de faon recueillir un taux constant de protines partir de chaque
chantillon diffrent. Cela implique un dosage des protines par la mthode du Biuret ou
du bleu de Coomassie (Mthode de Bradford).

Les chantillons sont ensuite bouillis de 1 5 minutes dans une solution tampon (par exemple
le tampon de Laemmli), contenant une substance tampon, gnralement du Tris, un colorant,
un composant sulfhydryl (typiquement du beta-mercaptothanol ou du dithiothritol ou plus

63
simplement DTT), un dtergent anionique lipophile (sodium dodcyl sulfate ou SDS) et
du glycrol pour augmenter la densit de la prparation.
L'bullition dnature les protines en brisant les faibles liaisons intramolculaires, ce qui a
pour consquence de les drouler compltement. Le SDS leur procure alors un environnement
riche en charges ngatives afin de les solvater et prvenir la prcipitation, et le composant
sulfhydryl empche la rgnration des ponts disulfure. Le glycrol augmente la densit de
l'chantillon par rapport au tampon dans la partie suprieure du rservoir du gel, facilitant la
mise en place des chantillons qui descendront plus facilement au fond des compartiments du
gel.

LECTROPHORSE SUR GEL


Les protines de l'chantillon sont spares selon leur taille par lectrophorse sur gel, dont la
composition varie en fonction du laboratoire, du poids molculaire des protines d'intrt et
des tampons disponibles. Les gels de polyacrylamide sont les plus frquents. Les protines ne
traversant le gel que dans une dimension (du haut vers le bas), les chantillons sont chargs
l'un ct de l'autre dans des puits forms dans le gel. Les protines sont spares par masse
en bandes dans chaque couloir form sous les puits. Un couloir est rserv un
marqueur ou chelle standard , une mixture de protines possdant des poids
molculaires dfinis disponibles dans le commerce.

Il est galement possible d'employer un gel 2D qui, partir d'un seul chantillon, permet de
faire migrer les protines dans deux dimensions. Les protines sont alors spares par leur
point isolectrique (c'est--dire le pH auquel leur charge nette est neutre) dans la premire
dimension, et selon leur poids dans la seconde.

La composition d'un tampon d'lectrophorse (running buffer) pour western blot est d'un
volume de tampon TGS (Tris-glycine-SDS) concentr 10 fois dans 9 volumes d'eau distille.

64
Figure 33. Une cuve d'lectrophorse. Les puits de dpt des chantillons sont colors en vert, en
haut du gel. Un courant lectrique est appliqu pour faire migrer les protines vers le bas.

Le systme le plus utilis pour l'analyse de la taille des protines d'un mlange est
le gel de SDS (ou SDS-PAGE, pour sodium docecyl sulfate -polyacrylamide gel
electrophoresis).

La sparation lectrophortique d'une protine, tout comme celle de n'importe


quelle molcule charge d'ailleurs, est l'effet de son mouvement sur ou dans une
matrice approprie soumise un courant lectrique. Plus une molcule est massive
ou biscornue, plus elle se dplacera lentement ; plus elle sera petite, plus elle ira
vite.

Il serait avantageux, comme ce l'est pour l'ADN, de pouvoir sparer les protines
les unes des autres par une simple sparation lectrophortique ne dpendant que de
la taille des molcules. Mais alors que l'ADN est uniformment charg et que sa
structure est essentiellement la mme quand il est sous forme linaire, les protines,
elles, varient normment non seulement en poids mais aussi en charge et en forme.
Pour les sparer selon leur masse uniquement, il faut contrecarrer l'effet de leur
charge et de leur forme.

Ce tour de passe-passe est accompli en mettant 1% de SDS dans le gel


d'lectrophorse et dans le tampon de migration. On utilise aussi 0,1M -
mercaptoethanol (HO-CH2-CH2-SH) dans le tampon de largage des chantillons, et
ceux-ci sont bouillis de surcrot avant la migration sur gel.

65
Le sodium dodecyl sulfate (SDS) est un dtergent anionique qui dnature les
protines en enveloppant la chane polypeptidique selon un ratio de masse de 1,4
pour 1. Le SDS confre aux protines une charge ngative proportionnelle leur
longueur; plus elles sont longues, plus il y a de SDS. Les polypeptides deviennent
donc des chapelets de charges ngatives partageant une mme densit de charge par
unit de longueur.

Le -mercaptoethanol, lui, (un agent rducteur qui ne sent pas bon), en


combinaison avec la chaleur, brise les ponts disulfures internes des protines que la
chaleur ont dnatures. Il brise aussi les ventuels ponts disulfures inter-protiques.

Les protines ainsi dplies et uniformment charges en fonction de leur masse


peuvent ds lors tre spares par lectrophorse, de la cathode (-) l'anode (+).
Puisqu'elles sont uniformment charges par le SDS, leur vitesse de migration sur
gel sera proportionnelle leur seule masse, les petites protines tant les plus
rapides.

On utilise d'ordinaire un gel discontinu: c'est dire qu'en haut du gel de sparation
proprement dit, (le "running gel;" en bon franglais) se trouve une bande plus petite
d'acrylamide de composition diffrente, le gel de concentration ou stacking gel.

Figure 34. Le principe du gel SDS PAGE

Alors que le gel de sparation a des pores petits et un pH de 9, le stacking gel a des pores
plus grands et un pH de 6,8. La taille des pores dans un gel de polyacrylamide est fonction
du degr de pontage entre les chanes d'acrylamide, pontage qui est proportionnel la
quantit de N,N,N',N',-mthylne bisacrylamide dans le gel; plus il y en a, plus les chanes

66
sont pontes et plus petits sont les pores.

Figure 35. La polymrisation de lacrylamide

De plus, les ions des deux gels au moment du dpt des protines sont des ions
chlorure alors que ceux du tampon sont des ions glycine. Les ions glycine qui
entrent dans le gel de concentration pH 6,8 sont prs de leur point isollectrique
et ont une trs faible mobilit. Les ions chlorures, eux, conservent une grande
mobilit. Les protines charges par le SDS sont plus lentes que le chlorure mais
plus rapides que la glycine.

67
Figure 36. Le principe de lisotachophorse dans le gel de concentration

Quand le courant est appliqu, les ions chlorures filent vers l'anode, laissant derrire elles un
vide ionique temporaire qui n'a qu'une faible conductivit.

Manquant d'lectrolytes dans leur entourage immdiat, les protines dans le gel de
concentration ne peuvent pas migrer vers l'anode. En fait, elles ne peuvent bouger que
quand le front d'ions glycine finit par les rattraper, parce que ces ions remplacent alors les
ions chlorure comme lectrolytes. Mme alors, parce que les grands pores du gel de

68
concentration permettent aux protines d'tre aussi rapides que les ions glycine, elles ne se
sparent pas les unes des autres mais sont toutes ramasses au passage par le front d'ions.

(Imaginez que les protines sont des barques choues sur la grve, nez point vers la terre
ferme, et qu'elles sont soudain pousses par une vague (le front d'ions). Vous aurez une ide
assez correcte de ce qui se passe dans cette partie du gel. Mme les barques les plus rapides
ne peuvent pas aller plus vite que la vague, parce qu'elles manqueraient tout simplement
d'eau pour les porter).

Ce front d'ions qui pousse et empile les protines devant lui induit la concentration de toutes
les protines en une mince bande qui migre avec le front jusqu'au bout du gel de
concentration.

Quand le front d'ions atteint la discontinuit de pH et de porosit entre le gel de


concentration et le gel de sparation, le pH soudain plus lev permet aux ions glycine de
prendre leur envol. Ils deviennent beaucoup plus chargs et rapides et dpassent les
protines.

Maintenant qu'il y a assez d'lectrolytes en avant d'elles, les protines peuvent migrer
librement en fonction de leur masse. (La porosit du gel, qui est plus faible dans le gel de
sparation que dans le gel de concentration, assure que les ions glycine seront plus rapides
que les protines).

Soyons honntes avant de continuer: il nous faut avouer que la mobilit des protines dans un
gel de SDS n'est pas absolument proportionnelle leur masse. En effet, on peut observer une
variation de vitesse de migration par rapport la masse dans une majorit de protines, allant
de trs petites variations jusqu' des rsultats franchement dsaronnants. La cause peut en
tre variable : par exemple, certaines protines ont naturellement une faible affinit pour le
SDS et le ratio masse/charge s'y trouve modifi. Certaines modifications post-traductionnelles
peuvent aussi jouer un rle: la glycosylation interfre avec la liaison au SDS. Il convient donc
de ne pas se dsesprer si nos protines purifies ont sur gel de SDS une taille apparente
diffrente de ce quoi on s'attendait!

Les trs petites protines (moins de 15 kDa), en outre, courent de faon trs alatoires dans les
gels de glycine. C'est qu'elles peuvent tre captures dans des micelles de SDS qui se tiennent
69
prs du front de migration. On peut les en librer en utilisant la tricine la place de la glycine
dans le tampon de migration. La tricine aide la libration de ces petites protines. On offre
commercialement des gels de SDS Tris-tricine pour l'tude des protines de plus petit poids
molculaire.

Une fois les protines dment spares selon leur taille, il reste rvler leur prsence. Les
deux approches les plus courantes sont de les colorer, ou d'utiliser un anticorps spcifique qui
permette de localiser une raction chimique quelconque (mais donnant un rsultat visible) l
o se trouve une protine particulire (type westernblot).

On peut colorer les protines directement sur le gel, ou les colorer aprs les avoir transfr sur
une membrane (quoique dans ce dernier cas, il ne s'agisse d'ordinaire que d'un rapide contrle
pour vrifier la qualit du transfert; on colore presque toujours les protines directement dans
le gel).

Les techniques les plus courantes sont la coloration au bleu de Coomassie et au nitrate
d'argent. Le bleu de Coomassie servait jadis colorer les chandails de laine en bleu; son nom
commmore la prise de la ville Ashantie de Kumasie, au Ghana, pendant l'poque coloniale.
Le bleu de Coomassie colore les protines de faon peu prs gale mais est de dix cent fois
moins sensible que la technique de coloration au nitrate d'argent.

Cette dernire repose sur la rduction, facilite par la prsence des protines, de sels d'argent
en argent mtallique (qui prcipite). Il existe plusieurs protocoles de coloration au nitrate
d'argent (choisissez la vtre en fonction de sa facilit d'excution et du temps qu'elle requiert)!
Cette technique est cependant sensible plusieurs facteurs et ne colore pas toutes les protines
de faon gale.

TRANSFERT SUR MEMBRANE


Afin de rendre les protines accessibles la dtection par anticorps, elles sont transfres
depuis le gel sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF (Le polyfluorure de
vinylidne). La membrane est place face--face avec le gel, et un courant lectrique est
appliqu aux grandes plaques sur l'un des deux cts. Les protines charges migrent depuis
le gel vers la membrane en conservant l'organisation relative qu'elles avaient dans le gel. Il
rsulte de ce transfert que les protines sont exposes sur une surface mince, ce qui facilite les
70
tapes de dtection ultrieures. Tant les membranes de nitrocellulose que de PVDF sont
collantes , liant des protines de manire non-spcifique (c'est--dire qu'elles lient toutes
les protines prsentes dans l'chantillon de la mme faon). La fixation des protines la
membrane se fait grce des interactions hydrophobes et ioniques entre la membrane et les
protines. Bien que les membranes de nitrocellulose soient moins chres que celles en PVDF,
elles sont moins solides et ne peuvent tre employes plusieurs fois. la diffrence de celles
en nitrocellulose, les membranes de PVDF doivent tre imbibes de mthanol ou
d'isopropanol 100 % avant leur utilisation.

La composition pour un litre d'un tampon de transfert type est de :

700 ml d'eau distille


100 ml de tampon TG (Tris-glycine) concentr 10 fois
200 ml de mthanol (produit toxique substituable par de l'thanol tout en conservant une
bonne qualit de transfert)4
4 ml de SDS

BLOCAGE

La membrane ayant t choisie pour ses proprits de liaison non-spcifique, comme tant la
protine-cible que les anticorps sont des protines, des prcautions doivent tre prises pour
minimiser les interactions entre membrane et anticorps. Le blocage des sites d'interactions
non spcifiques entre la membrane et les anticorps est ralis en plongeant la membrane
dans une solution dilue de protines - le plus souvent de l'albumine de srum bovin (BSA
en anglais) ou du lait sans matires grasses (lait dilu 5 % - 5 g pour 100 ml) - en prsence
de dtergent, typiquement du Tween 20), pendant une heure temprature ambiante.
Les protines dans la solution dilue se lient la membrane dans tous les sites non-occups
par la protine-cible. De la sorte, lorsque les anticorps sont appliqus lors de l'tape
suivante, ils ne peuvent (idalement) plus s'attacher la membrane que sur les sites de
liaison de la protine-cible, ce qui rduit le bruit de fond dans le produit final du transfert
de western, donne des rsultats plus clairs et limine les faux positifs.

DTECTION

Au cours de la dtection, la membrane est sonde pour la protine d'intrt avec des
anticorps, lis ensuite une enzyme mettant un signal photomtrique ou colorimtrique, ou
bien des photons. Pour plusieurs raisons, ceci se produit classiquement en deux tapes,
bien que des mthodes en une tape soient disponibles pour certaines applications.

71
MTHODE EN DEUX TAPES
ANTICORPS PRIMAIRE

Les anticorps sont gnrs par inoculation l'animal (gnralement un lapin ou une chvre)
ou exposition d'une culture de cellules immunitaires la protine d'intrt dans son intgralit
ou seulement sur l'une de ses fractions (pitope). Toutefois, les protines ayant t dnatures
lors de l'lectrophorse sur gel, il faut utiliser des anticorps qui reconnaissent spcifiquement
la protine dnature, et non la protine native.

La rponse immunitaire normale est dans ce cas exploite afin de gnrer des anticorps qui
sont rcolts et utiliss comme outils de dtection possdant la fois une bonne sensibilit et
une bonne spcificit, se liant directement la protine - d'o leur appellation d'anticorps
primaire . Quelques anticorps monoclonaux, beaucoup plus difficiles raliser et dont
l'affinit est beaucoup plus leve peuvent galement tre utiliss en transfert de western.

Aprs le blocage, une solution dilue d'anticorps primaire (gnralement comprise entre 0,5 et
5 micros grammes/ml) est incube avec la membrane sous agitation modre. La solution se
compose typiquement d'un tampon salin proche du pH neutre (gnralement, une faible
quantit de chlorure de sodium), d'un petit pourcentage de dtergent, et parfois de protines
(BSA ou lait 5 %) dilues. La solution d'anticorps et la membrane peuvent tre scelles dans
un sachet en plastique et incubes ensemble pour une dure allant de 30 minutes une nuit.
Elle peut aussi tre incube diffrentes tempratures, les tempratures plus leves tant
associes plus de liaisons plus spcifiques.

ANTICORPS SECONDAIRE

Aprs rinage de la membrane afin d'enlever les anticorps primaires non lis, celle-ci est
expose un autre anticorps, dirig contre une portion espce-spcifique de l'anticorps
primaire. Cet anticorps est connu comme anticorps secondaire , et tend tre rfr, du fait
de ses proprits de ciblage, comme anti-souris , anti-chvre , anti-lapin , etc. Les
anticorps sont de source animale (mais gnralement, d'espces diffrentes), ou de cultures
d'hybridomes d'origine animale ; un anticorps anti-souris se liera pratiquement tout anticorps
primaire d'origine murine, ce qui permet de raliser des conomies en laissant le laboratoire
partager une seule source d'anticorps secondaire, et permet des rsultats plus reproductibles.
L'anticorps secondaire est gnralement li la biotine ou une enzyme qui permet
l'identification visuelle de la protine tudie sur la membrane, comme une phosphatase

72
alcaline ou la peroxydase de raifort. Cette tape confre un avantage, en ce que plusieurs
anticorps secondaires se lieront un anticorps primaire, permettant d'amliorer le signal.

Le plus communment, un anticorps secondaire li la peroxydase de raifort (horseradish


peroxidase) est utilis en conjonction avec un agent luminescent, et le produit de la raction
met une luminescence proportionnelle la concentration en protine. Un film
photographique sensible est plac contre la membrane et, sous l'exposition de la lumire
due la raction, cre une image des anticorps lis la membrane. Plus souvent
maintenant, une camra CCD (charge coupled device) est utilise en place des films
photographiques.
Comme pour les procdures dELISA, l'enzyme peut tre fournie avec une molcule-substrat
qui sera converti par l'enzyme pour mettre un produit de raction color, visible sur la
membrane.

Une troisime possibilit consiste utiliser un marqueur radioactif plutt qu'une enzyme
couple l'anticorps secondaire, par exemple en marquant une protine liant les anticorps,
telle que la protine A du staphylocoque avec un isotope radioactif de l'iode. Cependant, les
autres mthodes tant plus sres, plus rapides et moins chres, cette mthode est plus ou
moins tombe en dsutude, mais demeure parfois utilise dans certaines circonstances.

MTHODE EN UNE TAPE ]


Lorsque la technique est apparue, le processus de dtection tait ralis en deux tapes, du fait
de la relative facilit de production des anticorps primaires et secondaires en deux procds
distincts. Cela permet aux chercheurs et fournisseurs une certaine souplesse l'emploi, et
ajoute une tape d'amplification du signal au processus de dtection. Toutefois, depuis
l'arrive d'analyses de protines haut rendement et marge de dtection plus basse, c'est--
dire dtectant des protines trs faible concentration, il est devenu intressant de dvelopper
des systmes de sondage en une tape unique qui permettront un gain de temps et une
conomie de matire premire. Ces systmes ncessitent un anticorps de dtection pouvant
la fois dtecter la protine d'intrt et mettre un signal dtectable, lesquelles sont souvent
disponibles pour des marqueurs de protine connus. La sonde primaire est incube avec la
membrane la manire de l'anticorps primaire dans le procd en deux temps, et est ensuite
prte pour la dtection directe aprs une srie d'tapes de rinages.

ANALYSE
Aprs rinage des anticorps secondaires non-lis, le western blot est prt pour la dtection des
sondes marques et lies la protine d'intrt. En pratique, tous les transferts de western ne

73
rvlent pas la protine sur une bande donne de la membrane, les gels n'tant pas
compltement exempts de protines aprs avoir t pongs. Une approximation sur la taille
est ralise en comparant les bandes marques celles des marqueurs de la gamme talon
charg durant l'lectrophorse dans un puits part. Le processus est rpt pour une protine
de structure, comme l'actine ou la tubuline, dont la concentration ne devrait pas varier entre
les chantillons (contrle interne). La concentration de la protine-cible est indexe celle de
la protine servant de contrle interne, afin de normaliser les expriences. Cette pratique
permet la correction par rapport au taux de protines total sur la membrane, en cas d'erreur ou
de transfert incomplet.

DTECTION COLORIMTRIQUE
Cette mthode est tributaire, lors de l'incubation du transfert de western, de la prsence d'un
substrat qui ragit au dclencheur prsent sur l'anticorps secondaire (comme la phosphatase
alcaline). Cela convertit un colorant soluble en une forme insoluble, de couleur diffrente, qui
prcipite ct de l'enzyme, teintant donc la membrane de nitrocellulose. Le dveloppement
du transfert de western est alors arrt par rinage du colorant soluble. La concentration de
protine est value par densitomtrie, valuation de l'intensit de la bande ou
par spectrophotomtrie.

DTECTION PAR CHIMIOLUMINESCENCE

Figure 36. Exemple de Western blot coupl avec une ECL

74
Cette mthode ncessite, lors de l'incubation du transfert de western, la prsence d'un substrat
qui met de la lumire aprs exposition au dclencheur prsent sur l'anticorps secondaire. La
lumire mise sert impressionner un film photographique, ou plus rcemment, par des
camras CCD qui restituent une image numrique du transfert de western. L'image est
analyse par densitomtrie, qui value le taux relatif de marquage de la protine, et quantifie
les rsultats en termes de densit optique. Des logiciels permettent une analyse plus pousse
des donnes, comme l'analyse du poids molculaire si les standards appropris sont utiliss.
Cette mthode appele dtection amliore de la chimiluminescence (enhanced
chemiluminescent, ECL) est considre comme l'une des mthodes de dtection les plus
sensibles pour l'analyse des western blots.

DTECTION PAR AUTORADIOGRAPHIE

Le marquage radioactif ne ncessite pas de substrat enzymatique, mais permet l'utilisation


de films utiliss en mdecine pour l'imagerie rayons X. Le film est directement plac sur le
transfert de western, qui se dveloppe lors de son exposition au marqueur et cre des
rgions sombres, lesquelles correspondent aux bandes de la protine d'intrt
(cf. illustration). L'importance des mthodes de dtection par radioactivit est en dclin, du
fait de son cot et de techniques plus sres comme l'ECL.

DTECTION PAR FLUORESCENCE


La sonde couple l'anticorps est excite par un rayon monochromatique et l'mission qui en
rsulte est alors dtecte par un photosenseur, par exemple une camra CCD quipe des
filtres en transmission appropris, qui restitue une image numrique du transfert de western et
permet une analyse plus fine telle que l'analyse du poids molculaire ou quantitative du
transfert de western. La fluorescence est considre comme d'un niveau peu prs quivalent
la chimiluminescence pour l'analyse des transferts de western. Elle ncessite un outillage
plus coteux toutefois.

Diffrence entre fluorescence et chimiluminescence

Bien que de mcanisme photophysique similaire, chimiluminescence et fluorescence ne sont


pas la mme chose :

la fluorescence fait rfrence l'excitation d'une molcule depuis un tat stable vers
un tat excit, et son retour l'tat basal par mission d'une radiation dans le spectre
lectromagntique d'une longueur d'onde donne, et spcifique de la molcule.

75
la chimiluminescence fait rfrence la situation dans laquelle une molcule est forme
dans un tat excit, en tant que produit d'une raction chimique, et retombe vers un tat
basal avec mission d'une radiation dans le spectre lectromagntique d'une longueur
d'onde donne.

SONDAGE SECONDAIRE
L'une des plus grandes diffrences entre les membranes en nitrocellulose et celles en PVDF
est lie leur capacit de supporter l' arrachage (stripping) d'anticorps et la rutilisation
des membranes pour des sondages par d'autres anticorps. Bien qu'il existe des protocoles bien
tablis pour la rutilisation des membranes de nitrocellulose, le PVDF, plus pais, permet de
raliser ces manuvres en toute scurit et facilit, et davantage d'utilisations ultrieures
avant d'tre, tel un palimpseste (manuscrit rutilis), recouvert de signaux parasites. Une autre
diffrence importance est que le PVDF, contrairement la nitrocellulose, doit tre tremp
dans de l'thanol 95 % ou de l'isopropanol avant usage. Les membranes en PVDF tendent
aussi tre plus paisses et plus rsistantes aux dommages physiques lis leur utilisation
normale.

APPLICATIONS MDICALES EN DIAGNOSTIC

Les tests VIH de confirmation emploient la mthode du transfert de western afin de


dtecter un anticorps anti-HIV dans un chantillon de srum. Des protines de cellules
que l'on sait infectes par le VIH sont spares et transfres sur membrane comme dcrit
ci-dessus. Le srum tester est appliqu. L'tape d'incubation dans l'anticorps primaire ;
les anticorps libres sont limins par rinage de la membrane, et un anticorps dirig contre
les protines humaines secondaires associ une enzyme ou un chromophore est ajout.
Les bandes marques indiquent ensuite les protines contre lesquelles le srum du patient
contient des anticorps.
Le transfert de western est galement utilis pour le test de confirmation de l'ESB (dite
'maladie de la vache folle').
Certaines formes de dtection de la maladie de Lyme utilisent le transfert de western.

76
CYTOMTRIE DE FLUX

INTRODUCTION

Quest ce que la Cytomtrie en flux?


Cest une technologie qui permet la mesure simultane de plusieurs caractristiques physiques
dune cellule.

Quelles sont les informations sur la cellule apportes par la cytomtrie en flux (CMF)?
Sa taille relative (Forward Scatter),
Sa granularit ou sa complexit interne relative (Side Scatter),
Son intensit relative de fluorescence.

HISTORIQUE

Les mthodes danalyse des cellules individuelles sont essentielles pour la comprhension des
fonctions des cellules normales et la possibilit de modulation des cellules pathologiques. La
cytomtrie en flux (CMF) est ne du besoin dautomatisation du comptage des constituants
cellulaires du sang.
Les origines de la CMF sont anciennes puisque cest en 1934 que Moldavan conut le premier
appareil avec lequel il ralisait des numrations cellulaires en faisant dfiler les cellules dans
un fin capillaire o elles taient vues par un capteur photo lectrique. Dans les annes 70, les
chercheurs de Los Alamos et de Stanford associaient des mthodes de mesure individuelle du
volume ou de la fluorescence de cellules entranes par un flux avec des mthodes
lectrostatiques permettant le tri cellulaire dans des conditions vitales. La diffusion de la
lumire complta rapidement la liste des proprits capables de discriminer plusieurs types
cellulaires. Le dveloppement simultan dappareillages commercialiss polyvalents et
lapparition des hybridomes pour la production danticorps monoclonaux a conduit une
explosion des activits impliquant la cytomtrie en flux. Lutilisation des proprits
cellulaires intrinsques (diffusion, auto fluorescence) et le dveloppement permanent de
fluorochromes capables de traduire de nombreuses proprits et fonctions cellulaires ont
conduit la mise en oeuvre de mthodes de plus en plus fines pour lanalyse de populations
de cellules htrognes.

77
DEFINITIONS

La CMF est dfinie comme ltude prcise de cellules isoles entranes par un flux liquide.
Cest une technique de caractrisation individuelle, quantitative et qualitative de particules en
suspension dans un liquide.
Elle consiste analyser les signaux optiques ou physiques mis par une particule coupant le
faisceau lumineux dun laser ou dune lampe arc. Les signaux mesurs sont essentiellement
relatifs:
-aux proprits optiques intrinsques des particules qui correspondent aux phnomnes de
diffusion lumineuse lis aux dimensions de la particule, leur structure interne, ou lauto
fluorescence de certaines cellules comme les vgtaux, le phytoplancton...
-aux proprits optiques induites de fluorescence obtenues par des marquages spcifiques de
structures ou de fonctions cellulaires.
Ces signaux spars par des filtres optiques sont collects par des photomultiplicateurs,
amplifis, numriss, traits et stocks par un ordinateur.
Ce procd danalyse individuelle (cellule par cellule) est multiparamtrique et peut
seffectuer la vitesse de plusieurs milliers dvnements par seconde. Lordinateur calcule
les donnes statistiques associes aux distributions des paramtres mesur et les reprsente
sous la forme dhistogrammes (1 paramtre) ou de cytogrammes (2 paramtres) sur une ou
plusieurs populations dont les proprits cellulaires sont ainsi values.
La fonction tri des cytomtres en flux les plus volus permet de trier physiquement une ou
deux populations cellulaires dfinies par leurs proprits optiques.

78
PRINCIPES TECHNIQUES DE LA CMF
Les principes de la cytomtrie sont rsums dans la figure 37.

Figure 37 : Principe simplifi d'un cytomtre en flux

Pour fonctionner un cytomtre en flux ncessite une combinaison de:


Fluidique: Pour introduire et canaliser les cellules,
Optique: Une source dexcitation et de rcupration des signaux,
Electronique: Pour convertir les signaux optiques en des signaux lectroniques
proportionnels et les numriser pour les analyser avec un ordinateur.

LES ECHANTILLONS CELLULAIRES

Les cellules doivent tre mises en suspension pour pouvoir tre analyses. Lanalyse du sang
ne pose aucun problme les cellules tant dj en suspension. Par contre les tissus cellulaires
doivent tre dissocis et les agrgats limins afin de pouvoir tre analyss.

79
LE CENTRAGE HYDRODYNAMIQUE

Les cellules sont amenes au centre de la buse de mesure et alignes les unes derrire les
autres (au moyen du systme de centrage hydrodynamique de lchantillon) afin dtre
excites une par une avec le faisceau lumineux. Le liquide de gaine subit une acclration
progressive ce qui entrane un tirement du liquide chantillon et ainsi aligne les cellules au
centre du jet (Figure 38).

Figure 38 : Principe du centrage hydrodynamique

CIRCUITS OPTIQUES

La source dexcitation lumineuse doit permettre une illumination des colorants une longueur
donde proche de leur maximum dabsorption. Elle doit tre puissante, stable et ncessite une
bonne focalisation.
Deux types de sources sont actuellement utilises :
Les lasers (les plus frquemment utiliss) qui prsentent un grand nombre davantages :
puissance, stabilit, finesse du faisceau. Les lasers ont des spectres dmission discontinus.

Les lasers ions dargon permettent dexciter entre autres la fluorescine, la phycorythrine,
liodure de propidium 488 nm ainsi que dans lU.V. pour des colorants comme le Hoechst
33342.
La prsence de plusieurs lasers de type diffrents permet de multiplier le nombre de
fluorochromes aux caractristiques spectrales diffrentes.
Les lampes vapeur de mercure ou au xnon sont aussi utilises. La focalisation est moindre
que dans le cas du laser, mais le spectre est assez large et leur cot est limit.

80
COLLECTE DE LA LUMIERE EMISE

Les diffrents signaux optiques mis par la cellule doivent tre focaliss, spars, puis
achemins vers des systmes de dtection, photomultiplicateurs ou photodiodes. Ils sont pour
cela, slectionns par diffrents circuits optiques, composs dune alternance de miroirs et de
filtres.
Un miroir est une surface rflchissante. Suivant le traitement de sa surface, on peut obtenir
trois types de miroirs : passe-haut, passe-bas et passe bande (Figure 39, 40). De plus, les
longueurs donde rflchies varient aussi avec langle form par le rayon incident et la surface
du filtre.

Figure 39: Les diffrents types de filtres utiliss en cytomtrie (R: Rflection, : longueur
d'onde)

81
Figure 40 : Les diffrents types de filtres utiliss en cytomtrie

Si les longueurs donde non rflchies sont transmises, on obtient ainsi des miroirs
dichroques.
Pour les filtres, on retrouve en transmission les mmes courbes que pour les miroirs, par
contre les longueurs donde non transmises ne sont pas rflchies. Elles sont soit absorbes
soit dtruites.
Aprs avoir travers cette succession de miroirs et de filtres, la lumire est recueillie et
transforme en signal lectrique par un photomultiplicateur ou une photodiode.

82
Figure 41 : Exemple de trajet optique dans un cytomtre en flux

LES SIGNAUX RECUEILLIS


Les signaux optiques recueillis ont une intensit corrle avec des proprits cellulaires
(tableau 7).

PARAMETRE SIGNIFICATION UTILISATION


Diffusion de la lumire aux Proportionnel au diamtre Identification morphologique des
petits angles cellulaire cellules
Diffusion de la lumire angle Proportionnel au contenu Identification morphologique des
droit cellulaire cellules
Fluorescences Proportionnelles Marqueurs cellulaires, ADN, ARN,
lintensit de marquage fonctions cellulaires...
Tableau 7: Signification des principaux signaux obtenus en cytomtrie en flux.

LA LUMIRE DIFFUSE
La lumire diffuse renseigne sur la morphologie et la structure de la cellule. Si la diffusion
de la lumire est mesure dans laxe du rayon incident, lintensit du signal peut tre corrle
avec la taille et la viabilit cellulaire.
Sous un angle de 90, la mesure correspond la structure intracellulaire de la cellule
(rfringence du cytoplasme, morphologie, rapport nuclo-cytoplasmique). Lutilisation

83
simultane de ces deux paramtres permet de distinguer, dans un sang priphrique par
exemple, les plaquettes, les lymphocytes, les monocytes et les polynuclaires (figure 42).

Figure 42: Utilisation de la double diffusion de la lumire pour distinguer les diverses
sous populations sanguines (FSC: diffusion aux petits angles, SSC diffusion aux grands
angles).

LA LUMIRE ABSORBE

Cette mesure volue proportionnellement au diamtre de la cellule (suppose sphrique) et


lindice dabsorption des constituants cellulaires.

LA FLUORESCENCE MISE

Cette fluorescence peut tre spontane, mais le plus souvent, elle est apporte la cellule par
un fluorochrome. Le fluorochrome absorbe lnergie du LASER et remet lnergie absorbe
par vibration et dissipation de chaleur, mission de photons dune longueur donde plus
leve):

84
Tableau 8: Caractristiques des principaux fluorochromes utiliss en cytomtrie. (*:
longueur donde dexcitation, @: longueur donde dmission).

- Fluorochromes affinit propre pour un constituant cellulaire: par exemple pour les mesures
dADN, dARN, de protines, du pH, de calcium contenus dans la cellule.
- Fluorochromes coupls un ligand spcifique. Cette spcificit peut tre amene par un
couplage du fluorochrome un anticorps ou un ligand spcifique dun constituant cellulaire.
Nous avons donc:
- Cr une zone dillumination avec les optiques dexcitation,
- Introduit une cellule dans linstrument au moyen de la fluidique,
- Fait pass prcisment les cellules dans la zone dillumination par centrage
hydrodynamique,
- Dirig les signaux lumineux gnrs vers les dtecteurs spcifiques au moyen de loptique
collectrice.

85
Llectronique va maintenant traiter les signaux pour quils soient exploitables par
loprateur.

CONVERSION DES SIGNAUX

Les signaux optiques sont convertis en signaux lectriques par les photomultiplicateurs. Ces
signaux lectriques ont une valeur comprise le plus souvent entre 0 et 10 volts (signal
analogique). Lordinateur ne peut traiter ces donnes que si elles sont sous forme binaire
(signal digital). Le rle du convertisseur analogique-digital est de convertir, comme son nom
lindique, un signal analogique (valeur continue) en signal digital (valeur discontinue)
assimilable par lordinateur. Cest dire de transformer une valeur comprise entre 0 et 10
volts en une valeur binaire comprise entre 0 et 255 pour un convertisseur 8 bits (28) ou entre 0
et 1023 pour un convertisseur 10 bits (210) (figure 43).

Figure 43: Principe de fonctionnement dun convertisseur

PRESENTATION DES RESULTATS

Les valeurs numriques issues des convertisseurs sont stockes par linformatique et
prsentes sur les crans des cytomtres sous deux formes :
des histogrammes monoparamtriques o laxe des abscisses reprsente lintensit du signal

86
analys et laxe des ordonnes le nombre de cellules (figure 44).
des histogrammes biparamtriques ou cytogrammes prsentant deux signaux simultanment.

Figure 44: Prsentation des rsultats en cytomtrie en flux.

LE TRI CELLULAIRE

Lanalyse multiparamtrique dune suspension cellulaire htrogne permet de dfinir des


sous-populations qui peuvent tre spares physiquement de la population globale. Pour cela,
des critres de sparation sont dtermins par lutilisateur (dfinition des zones dintrt du
tri) et toute cellule dont les caractristiques seront comprises entre les valeurs choisies sera
isole.
Dans ce but, la veine liquide sera charge lectriquement, puis fractionne en une succession
de gouttelettes. La gouttelette contenant la cellule voulue est dvie en passant dans un
champs lectrostatique et rcupre dans un rcipient collecteur. Si la cellule appartient une
sous-population non slectionne ou si la gouttelette forme ne contient pas de cellule, la
veine liquide ne sera pas charge et la gouttelette limine.

87
AVANTAGE ET LIMITES DE LA CMF

Ce qui distingue la CMF des autres techniques analytiques et prparatives est quelle runit
les cinq caractristiques essentielles suivantes: analyse quantitative, sensibilit de dtection,
rapidit, analyse multiparamtrique cellule par cellule, tri.

ANALYSE QUANTITATIVE

Cest un atout majeur par rapport la microscopie optique courante que de pouvoir quantifier
les paramtres observs. En effet, au microscope, il est difficile de classer des cellules en plus
de quatre catgories selon leur fluorescence: ngatives, faibles, moyennes, fortes. Un
cytomtre avec amplificateur logarithmique permet de quantifier rigoureusement chaque
critre optique sur une gamme de 1 10000 units arbitraires de fluorescence. Mais le nombre
de paramtres intervenant dans toute analyse de CMF (rglages optiques, fluorochromes,
marqueurs) impose, dans le cadre dune quantification absolue, lutilisation de standards
calibrs (billes fluorescentes par exemple).

SENSIBILITE DE DETECTION

En immunofluorescence, il est possible de discerner du bruit de fond une population de


cellules lymphodes portant environ 1000 dterminants antigniques par cellule.

VITESSE DE TRAVAIL

La vitesse moyenne danalyse dun cytomtre est de 1000 cellules par seconde bien quil soit
possible, sur les appareils modernes, danalyser de manire fiable jusqu 10000 vnements
par seconde sur plusieurs paramtres. En quelques secondes, la signification statistique du
comptage est bien suprieure celle obtenue classiquement par un microscope optique, mme
pour une sous-population de cellules trs minoritaires.

LANALYSE SIMULTANEE DE PLUSIEURS PARAMETRES

La CMF offre la possibilit de travailler simultanment sur plusieurs paramtres, ce qui


permet de mesurer, par exemple, deux ou trois paramtres simultans sur une population
lymphocytaire du sang ou de la moelle. Aucune autre mthode, quelle soit physico-chimique
(centrifugation en gradient, lutriation) ou immunologique (colonnes, rosettes) noffre cette
88
polyvalence.

LE TRI

Les cellules peuvent tre isoles avec des taux de puret suprieurs 99%. Ces cellules
peuvent tre remises en culture. Il ne faut pas pour autant oublier la relative lenteur du tri:
pour obtenir 106 cellules dune population reprsentant initialement 1% de la population de
dpart, il faudrait, la vitesse thorique de 1000 cellules par seconde environ 30 heures de tri.
La grande puret des populations tries par CMF ne peut donc tre obtenue quau prix dune
srieuse limitation du nombre de cellules recueillies et dune surveillance critique constante
lors de la sparation.

PRINCIPALES APPLICATIONS

Lhmatologie a t lune des premires disciplines mdicales bnficier des applications


cliniques de la CMF. Certaines de ces applications sont maintenant utilises rgulirement
pour le diagnostic ou le suivi thrapeutique de diffrentes affections. Ces applications
concernent aussi bien ltude fonctionnelle de cellules saines que la mise en vidence du
caractre pathologique des cellules analyses.

IMMUNOFLUORESCENCE POUR LA CARACTERISATION DES SOUS-POPULATIONS CELLULAIRES

Lassociation de l'immunofluorescence et de la cytomtrie en flux (CMF) est devenue un


lment essentiel dans ltude des systmes biologiques, surtout dans la discrimination entre
cellules dune population htrogne. En effet, lutilisation des anticorps monoclonaux
(AcM), dirigs contre des composants membranaires spcifiques, permet de distinguer des
sous-populations lymphocytaires. Ces dernires annes, lidentification et la caractrisation
des antignes (Ag) de surface des lymphocytes a progress trs rapidement. Cependant, il
nexiste pas dAcM pouvant reconnatre lui seul une cellule particulire pourvue de
certaines fonctions. Cette limitation a conduit les utilisateurs de la technique
dimmunofluorescence passer des simples aux multiples marquages en utilisant des
combinaisons dAcM rvls par des fluorochromes diffrents.
Par rapport aux investigations initiales ralises au microscope, la CMF apporte en plus la

89
quantification lchelon cellulaire individuel du nombre de sites reconnus et la possibilit de
trier ces cellules selon lintensit de leur marquage en vue dtudes fonctionnelles ultrieures.

PRINCIPES DE LIMMUNOFLUORESCENCE

Les mthodes dimmunofluorescence se rpartissent en deux groupes:


Les ractions directes o lAcM est directement coupl un fluorochrome :

Figure 45. Principe de limmunofluorescence

Les ractions indirectes o lAcM est rvl par un second ractif coupl au fluorochrome :

90
Figure 46. Variantes de limmunofluorescence

Ces deux mthodes font appel des ractifs fluorescents: les fluorochromes. Un exemple de
spectres dmission de fluorochromes utilis en immunofluorescence est reprsent figure 46.

91
Figure 47: Spectres dmission des principaux fluorochromes utiliss en immunofluorescence.

Pour les marquages multiples plusieurs fluorochromes sont utiliss simultanment. Dans ce
cas, il faut que:
-leurs longueurs donde dexcitation correspondent la source lumineuse du cytomtre (en
gnral 488 nm pour les cytomtres les plus courants),
-leurs longueurs donde dmission soient suffisamment loignes pour que leurs signaux
soient analyss sparment.
Lobstacle majeur dans les analyses multiparamtriques est constitu par le chevauchement
important des spectres dmission des fluorochromes employs pour rvler les AcM.
Lintroduction dun second laser a permis de vaincre une telle interfrence en rendant possible
lexcitation de plusieurs fluorochromes spectres dexcitation et dmission bien distincts.
Mais cette technique tait trop lourde et complexe pour tre couramment utilise. En effet, les
analyseurs du march ne disposent que dune seule source lumineuse.
92
Actuellement la ncessit dun troisime marqueur pour caractriser les populations
cellulaires a conduit llaboration de nouveaux fluorochromes dont le principe de
fonctionnement est bas sur le transfert dnergie entre plusieurs constituants. Le premier
colorant est excit 488 nm, il rmet sa longueur donde dmission qui est la longueur
donde dexcitation du second colorant.

PRINCIPES DE LA COMPENSATION DE FLUORESCENCE

Les chevauchements des spectres dmission des divers fluorochromes utiliss en cytomtrie
ncessite lemploi de compensations lectroniques de fluorescence afin de soustraire la
superposition des deux signaux de fluorescence (figure 48).

Figure 48: Fuites de fluorescence.

93
Ainsi, sans compensation de fluorescence, une population cellulaire marque en fluorescence
verte (FITC) mais non marque en fluorescence orange (PE) est positionne sur la bissectrice
de lhistogramme biparamtrique des deux fluorescences (figure 49a).
Le systme de compensation permet de soustraire artificiellement la fluorescence orange qui
rsulte de la fuite de fluorescence du FITC dans le canal de la PE (figure 49b).

Figure 49.
Chaque pourcentage de compensation sera ainsi dtermin par lanalyse des cellules
simplement marques par les divers colorants.

94
AUTRES RACTIONS CELLULAIRES

LE CHIMIOTACTISME

Dans les premires tapes de la rponse inflammatoire, les leucocytes polymorphonuclaires


sont capables de quitter la circulation sanguine pour gagner le site de linfection. Cette tape
correspond la diapdse. Cest un mcanisme complexe qui sera voqu lors du cours sur la
rponse inflammatoire. Les molcules chimiotactiques librs au site de linflammation vont
crer un gradient de concentration qui va attirer les PMN qui possdent des rcepeteurs pour
ces agents chimiotactiques. Parmi ceux-ci, citons notamment les formyl-methionyl peptides
produits par les bactries ou la molcule C5a du complment. Il est possible de mimer in vitro
cette rponse chimiotactique.

Une large gamme de techniques est disponible pour valuer lactivit chimotactique des
cellules ainsi que le caractre chimioattractant ou chimioreppelant des ligands. Les exigences
de base des mesurages sont les suivantes :

que le gradient de concentration puisse se dvelopper relativement vite et puisse subsister


pendant longtemps dans le systme.
que les activits chimiotactiques et chimiocintiques soient distinguables.
que la migration des cellules soit libre dans les deux directions opposes suivant laxe du
gradient de concentration
que la rponse dtecte soit le rsultat dune migration active des cellules.

Malgr le fait que lessai chimiotactique idal ne soit toujours pas disponible, il existe
pourtant certains protocoles et pices dquipement offrant une correspondance acceptable
avec les conditions numres ci-dessus. Les plus utiliss sont :

AGAR PLATE ASSAYS (MIGRATION SOUS AGAROSE)

Cette technique consiste en des couches semi-solides d'agar-agar ou glatine. Les


petits puits sont creuss dans la couche et remplis de cellules et de la substance d'essai.
Les cellules peuvent migrer vers le gradient chimique dans la couche semi-solide ou
sous la couche ainsi. Certaines variations de la technique avec des puits et des canaux
parallles relies par une dcoupe au dbut de l'exprience (PP-technique). La
disposition radiale des PP-technique (3 canaux ou plus) offre la possibilit de

95
comparer l'activit chimiotactique des diffrentes populations cellulaires ou tudier
prfrence entre ligands.

Comptage de cellules: les cellules rpondant positivement peuvent tre calcules


partir de l'apex des cellules qui migrent, aprs coloration ou dans des conditions
natives en microscope optique.

Figure 50. La technique en agarose

LES TECHNIQUES DES DEUX CHAMBRES

Figure 51. les tests des deux chambres

96
LA CHAMBRE DE BOYDEN
Les chambres isoles par des filtres sont des outils appropris pour la dtermination prcise
du comportement chimiotactique. Le premier type de ces chambres a t construit par
Boyden. Les cellules mobiles sont places dans la chambre suprieure, tandis que le fluide
contenant la substance tester est introduite dans le niveau infrieur. La taille des cellules
mobiles tudier dtermine la taille des pores du filtre; il est essentiel de choisir un diamtre
qui permet la transmigration active. Pour la modlisation des conditions in vivo, plusieurs
protocoles prfrent couvrir le filtre avec des molcules de la matrice extracellulaire
(collagne, lastine, etc) les mesures de l'efficacit a t augment de dveloppement de la
chambre puits multiples (par exemple, Neuroprobe), o 24, 96, 384 chantillons sont
valus en parallle. L'avantage de cette variante est que plusieurs substances sont testes en
parallle dans des conditions identiques.

LES CHAMBRE PONTES


Dans une autre configuration les chambres sont relies cte cte l'horizontale (chambre
Zigmond) ou comme des anneaux concentriques sur un coulisseau (chambre Dunn). Un
gradient de concentration se dveloppe sur un troit pont de liaison entre les chambres et le
nombre de cellules en migration est galement compt sur la surface du pont par microscope
optique. Dans certains cas, le pont entre les deux chambres est rempli avec de l'agar et les
cellules peuvent "glisser" dans cette couche semi-solide.

LES TECHNIQUES CAPILLAIRES

Certaines techniques capillaires fournissent galement une chambre comme principe,


cependant, il n'y a pas de filtre entre les cellules et la substance d'essai. Les rsultats
quantitatifs sont obtenus par le type multi-puits de cette sonde en utilisant des pipettes 4-8-12-
canal. La prcision de la pipette et l'augmentation du nombre des chantillons traits en
parallle sont les grands avantages de ce test.

Le comptage des cellules: Les cellules rpondeuses sont comptes partir de la chambre
infrieure (temps d'incubation) ou du filtre ( court temps d'incubation). Pour la dtection de
cellules des techniques de coloration (par exemple, le bleu Trypan) ou des sondes spcifiques
(par exemple, dtection de m-dshydrognase par test MTT) sont utiliss.

97
1.2.2.3. COMPARAISON DES DEUX TECHNIQUES

Dans la chambre de Boyden, on tient compte de la capacit de dformation de la cellule et de


son dplacement dans un milieu trois dimensions. Dans la migration sous agarose, on fait
intervenir la capacit d'adhsion de la cellule.

Comparaison dans des conditions pathologiques :

ex 1: syndrome de Chediak Higashi (neutrophiles contenant des granules gants). Les


neutrophiles sont peu dformables et migrent mal dans la chambre de Boyden. Par contre leur
migration sous agarose est normale.

ex 2 : syndrome LAD (Leucocyte Adhesion Defficiency). Les leucocytes ne migrent pas sous
agarose mais se dplacent bien dans la chambre de Boyden.

1.3. LES SUBSTANCES CHIMIOTACTIQUES

1.3.1. FORMYL MTHIONYL PEPTIDES

Les cellules phagocytaires peuvent tre attires directement par les bactries. Le
chimiotactisme des substances bactriennes est d la prsence de formyl mthionine, place
sur les peptides lors de l'initiation de leur synthse (ce qui n'est pas le cas chez les eucaryotes).

Des expriences de stimulation des phagocytes ont montr que le motif formyl met leu phe
(FMLP) tait trs bien reconnu, et ce avec une forte affinit (1 nM)

1.3.2. PRODUITS D'OXYDATION DE DGRADATION DE LA MEMBRANE

La phagocytose permet l'limination des produits altrs de l'organisme (cellules mortes) et


des agents trangers.

Exp de RESSIS: tude de l'limination des hmaties altres. Ds que l'hmatie est altre, en
voie de dgradation, elle libre des facteurs chimiotactiques qui attirent les phagocytes. Ce
sont les produits ncrotoxiques.

1.3.3. CHMOKINES

Ce sont des substances chimiotactiques libres en grand nombre par les cellules
immunitaires. Elles sont formes de 70 aa et sont reconnues par des rcepteurs qui ont des
98
analogies de structure (rcepteurs des grandes protines G 7 segments transmembranaires).
Elles sont classes en deux familles et ont des spcificits un peu diffrentes :

* CC (2 cystines proches): attraction des monocytes et des lymphocytes

* CXC : attraction des granulocytes.

ex : IL-8, MIP I, II, III (Macrophage Inflammatory Protein), MCP (Monocyte


Chemoattractant Protein), RANTES (restreint aux thymocytes normaux activs, exprime et
scrte).

Les chmokines ont souvent une action double :

* faible concentration, elles sont chimio-attractives

* forte concentration, elles induisent la scrtion de facteurs cytotoxiques par les cellules
phagocytaires.

1.3.4. PRODUITS DE L'ACTIVATION DU COMPLMENT

Ils sont de deux types :

* fragments protiques trs ractifs qui s'accrochent ex : C3b

* fragments protiques circulants ex : C5a

99
LE BURST OXYDATIF

Le burst oxydatif ou flambe oxydative correspond une brusque augmentation de la


consommation en oxygne qui a pour finalit la production danion superoxyde (O2-), de
perhydrol et loxydation du glucose par le shunt des hexoses monophosphates. Lactivation
dune enzyme, la NADPH oxydase, est la cl de ce burst : elle permet de catalyser la
transformation de lO2 en O2- en transformant le NADPH en NADP+ + H+. Les principales
ractions chimiques mises en uvre sont :

O2- + H2O2 OH. + OH-+ O2

O2- + OH. 1
O2 + OH-

O2- : anion superoxyde

OH. : radical hydroxyl

H2O2 : peroxyde dhydrogne

1
O2 : oxygne singulet

Ainsi donc, les phagocytes professionnels et principalement les macrophages et les PMN sont
capables de produire de tels drivs actifs de loxygne qui augmentent dautant leur potentiel
microbicide.

La phagocytose stimule cette flambe oxydative et cest donc une mesure indirecte de la
phagocytose par les phagocytes professionnels/

Les composs activs drivs de loxygne produits lors de la flambe oxydative (O2-, H2O2,
OH., 1O2) sont des composs instables et donc fortement ractionnel. Il sont
capable doxyder une molcule comme le luminol (5-amino-2,3,-dihydro-1,4-
phtalazinedione) en un ion aminophtalate instable qui regagne son tat fondamental
en mettant un photon (Figure 52). On peut compter le nombre de photons mis dans
un luminomtre. Le nombre de coups par minute est proportionnel la quantit de
composs actifs produits et rend donc compte de la manire quantitative de la flambe
oxydative des PMN en rponse un stumulus chimiotactique ou phagocytaire.

100
Figure 52. La chmiluminescence au luminol.

101
LE TEST DE PROLIFRATION LYMPHOCYTAIRE

Les ractions de prolifration in vitro explorent la croissance des lymphocytes aprs


stimulation
1) par des mitognes.
Les lectines Concanavaline A et PhytoHmagglutinine A stimulent les lymphocytes T de
faon lective. Le Pokeweed mitogen (PWM) stimule la fois les lymphocytes T et B.
L'extrait de Nocardia opaca (NWSM ) est un stimulant spcifique des lymphocytes B.
2) par des antignes solubles
Cette stimulation explore la prsence de lymphocytes T qui ont rpondu un antigne
spcifique. Cette rponse antignique est rarement dtectable lorsque les lymphocytes
proviennent d'un sujet non pr-iummunis.
En pratique on utilise des antignes vis vis desquels le sujet a t prsensibilis in vivo
soit du fait d'une vaccination antrieure (anatoxine ttanique ou diphtrique), soit pour des
raisons de frquence (Ag du virus de l'Herpes, Cytomegalovirus, Candida). La prolifration
obtenue value la fonction de reconnaissance des lymphocytes T CD4+ qui rpondent l'Ag
prsent par les monocytes sanguins en association avec les produits de classe II du CMH.
3) par des cellules alloractives
La culture mixte lymphocytaire explore la prolifration spcifique une rponse allognique.
La culture mixte consiste cultiver ensemble des suspensions de cellules mononucles
provenant de 2 individus gntiquement diffrents. Ces cultures peuvent tre bilatrales ou
unilatrales. Dans la culture mixte bilatrale, la prolifration concerne les cellules des 2
suspensions lymphocytaires.
Dans la culture mixte unilatrale, l'une des 2 populations mlanges est mitomycine ou
irradie pour y stopper les mitoses. Dans la culture mixte unilatrale, les cellules qui se
multiplient, portent l'Ag CD4 (ce sont les cellules T stimules). Les cellules stimulantes qui
ne se multiplient pas, sont principalement les cellules dendritiques et les macrophages, et plus
accessoirement les lymphocytes B. Les cellules CD4+ rpondantes ont des rcepteurs
spcifiques pour les Ag du CMH de classe II allogniques ports par les cellules stimulantes
La capacit de rponse allognique est prsente ds la naissance. La rponse allognique
entraine une forte prolifration lymphocytaire dtectable en l'absence de toute pr-
immunisation.

102
Figure 53. Le test de prolifration lymphocytaire mixte.

103
LELISPOT OU ENZYME LINKED IMMUNOSPOT

Le dosage immuno-enzymatique (ELISPOT) est une mthode largement utilise pour


contrler les rponses immunitaires cellulaires chez l'homme et d'autres animaux, et a trouv
des applications cliniques dans le diagnostic de la tuberculose et de la surveillance de la
tolrance du greffon ou le rejet chez les patients greffs. La technique ELISPOT s'est avre
tre l'un des moyens les plus utiles disponibles pour la surveillance de l'immunit mdiation
cellulaire, en raison de la dtection sensible et prcise de cellules T (ou B) spcifiques
dantignes rares et sa capacit visualiser des cellules positives uniques au sein d'une
population des cellules mononuclaires du sang priphrique (PBMC).

La mthode ELISPOT a t dveloppe par le groupe de Cecil Czerkinsky Gteborg, en


Sude en 1983, dans le but de dtecter des cellules scrtrices d'anticorps spcifiques de
l'antigne (ASC) dans un test ELISPOT des cellules B, qui a t une modification d'un ELISA
sandwich classique. Le test ELISPOT a depuis t plus largement adopt pour l'identification
et le dnombrement des cellules productrices de cytokines au niveau d'une seule cellule, mais
est encore utilis pour la dtection de l'ASC.

Autrement dit, dans les conditions appropries l' ELISPOT permet de visualiser les produits
de scrtion des cellules individuelles actives. Chaque spot qui apparait dans l'essai
reprsente une seule cellule ractive. Ainsi, le test ELISPOT fournit la fois une information
qualitative (En ce qui concerne la cytokine spcifique ou une autre molcule immunologique
scrte) et quantitative (la frquence des cellules rpondant sein de la population d'essai).

En raison de la sensibilit extrme de l'ELISPOT, les analyses de la prsence de cellules


spcifiques d'antignes rares au sein d'une population, qui taient impossibles avant son
dveloppement, sont devenues relativement simple. Cette sensibilit exceptionnelle drive de
la mthode de dosage elle-mme.

Dans un essai ELISPOT, des membranes PVDF contenues dans une plaque de microtitration
96 puits sont revtues avec un anticorps de capture qui se lie un pitope spcifique de la
cytokine doser. Au cours de l'tape d'incubation et de stimulation cellulaire, des PBMC sont
ensemences dans les puits de la plaque en mme temps que l'antigne, et forment une
monocouche sur la surface de la membrane du puits. Comme les cellules spcifiques de
l'antigne sont activs, elles librent la cytokine, qui est capture directement sur la surface de

104
la membrane par l'anticorps immobilis. La cytokine est donc "capture" directement dans la
zone entourant la cellule scrtrice, avant qu'elle ait une chance de diffuser dans le milieu de
culture, ou d'tre dgrade par les protases et li par des rcepteurs sur les cellules voisines.
Les tapes de dtection ultrieures permettent de visualiser la cytokine immobilise comme
un immunospot (dot blot) reprsentant, l'empreinte scrtoire de la cellule active (voir ci-
dessous).
Ce mcanisme de capture de la cytokine scrte rend la mthode ELISPOT beaucoup plus
sensibles que les tests qui mesure la cytokine libre dans les surnageants de culture. Le
Cytokine beads Array (CBA) et les ELISA classiques peuvent fournir des informations trs
utiles dans certains contextes, mais il leur manque la sensibilit et la prcision de lELISPOT
pour la dtection et le dnombrement des cellules spcifiques d'antignes rares.
Les limites de dtection pour ELISPOT sont gnralement fonction du nombre de cellules
ensemences dans un puits d'essai. Typiquement 200.000 400.000 PBMC seront utilises
par puits pour un essai, mais jusqu' un million de cellules sont couramment utilises pour la
dtection d'vnements rares. L'ELISPOT est capable de dtecter un seul cellule positive au
sein de la population, ce qui lui donne une limite de dtection thorique trs basse d'une
cellule sur un million.

PROCEDURE

Figure 54. Illustration du test ELISPOT.

Comme indiqu ci-dessus, les dosages ELISPOT emploient une technique trs similaire la
technique de dosage immuno-enzymatique en sandwich (ELISA-sandwich). Soit un anticorps

105
monoclonal (pratique pour une plus grande spcificit) ou des anticorps de capture
polyclonaux sont coats strilement sur une microplaque dont les puits sont recouverts d'une
membrane PVDF. Ces anticorps sont choisis pour leur spcificit pour l'analyte en question.
La plaque est bloque, habituellement avec une protine de srum qui ne ragit pas avec un
des anticorps utiliss dans le dosage. Aprs cela, des cellules d'intrt sont tales des
densits diffrentes, avec un antigne ou un mitogne, puis un plac 37 C dans un
incubateur CO2 pendant une priode de temps dtermine.

Les cytokines (ou un autre produit d'intrt) scrtes par les cellules actives sont captures
localement par l'anticorps dpos sur la membrane de PVDF. Aprs lavage des puits pour
liminer les cellules, les dbris et les composants du milieu, un anticorps biotinyl spcifique
de l'analyte choisi est ajout aux puits. Cet anticorps ragit avec un pitope distinct de la
cytokine cible et est donc utilis pour dtecter la cytokine capture. Aprs un lavage pour
liminer tout anticorps biotinyl non li, la cytokine est dtecte, la cytokine dtecte est
visualise par la streptavidine conjugue la peroxydase de raifort (HRP) ou la phosphatase
alcaline (AP) - et un substrat de prcipitation (par exemple, AEC, BCIP / NBT). Le produit
color final (un spot, gnralement rouge (HRP) ou d'un bleu noirtre (pour AP)) reprsente
typiquement une cellule individuelle productrice de cytokine. Les taches peuvent tre compts
manuellement (par exemple avec un microscope dissection) ou en utilisant un lecteur
automatique pour capturer les images des micro-puits et analyser le nombre de spots et leurs
tailles.

FLUOROSPOT ASSAY

Le dosage FLUOROSPOT est une modification de l'essai ELISPOT, et est fonde sur
l'utilisation de plusieurs anticorps anti-cytokine marqus par un fluorochrome ce qui permet
de mesurer deux cytokines dans le mme dosage.

APPLICATIONS

En 2011, des tests in vitro bass sur la dtection de l'immunit mdiation cellulaire pour le
diagnostic de la tuberculose ont t commercialiss. Ces tests utilisent des antignes de
Mycobacterium tuberculosis (MTB) spcifiques Eearly Secretory Antigenic target-6 (ESAT-
6) et les peptides de Culture Filtrate Protein 10 (CFP-10) pour stimuler des cellules T
sensibilis par MTB pour la production d'IFN . Le antignes ESAT-6 et CFP-10 sont
spcifiques de MTB et sont produits partir de la zone gnomique appele Rgion de

106
diffrence 1 (RD1). Par consquent, la dtection de CME base sur l'ELISPOT peut fournir
des informations prcieuses sur le diagnostic de la tuberculose. Plus important encore, une
tude rcente a rvl que ce test ne semble pas avoir une ractivit croise avec la lpre,
mme si L-ESAT, un antigne de M. leprae est trs homologue de T-ESAT-6 utilis dans
l'essai. Par consquent, ce test peut tre utilis mme dans les pays o la lpre est encore
endmique. Le test ELISPOT a t dvelopp pour la dtection de la maladie de Lyme de
l'infection.

BIBLIOGRAPHIE

Sites et documents consults pour rdiger ces notes

http://biochimiedesproteines.espaceweb.usherbrooke.ca/5b.html

http://cytobase.montp.inserm.fr/Cours/Cours.html

http://www.assim.refer.org/raisil/raisil/L02_files/page82-6.-anticorps.pdf

http://www.cours-pharmacie.com/immunologie/les-lymphocytes-b.html

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http://www.microbiologybook.org/French-immuno/immchapter7.htm

http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/lafont/electrophorese/E2.html

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http://www.cours-de-biochimie.fr/western-blot.php

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