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Abstracto

Fondo

El Plasmodium falciparum multirresistencia 1 transportador, pfmdr1, contiene cinco


polimorfismos de aminocidos que se sugiere que participen en el transporte de drogas
alterada de citosol del parsito en la vacuola digestiva (DV). Transporte de un sustrato a otro
compartimento intracelular influye en la disponibilidad del frmaco en su sitio de accin, por
lo tanto haciendo que el parsito ms susceptible o resistente a un frmaco. Fluo-4 es un
sustrato fluorescente conocido que puede ser utilizado como una herramienta molecular para
investigar la dinmica de transporte de pfmdr1 en muchas cepas de parsitos.

mtodos

Seis cepas de P. falciparum con diferentes mutaciones pfmdr1 se cargaron con Fluo-4 PM. La
acumulacin del fluorforo en el DV se midi utilizando microscopa confocal. El papel de un
aminocido mutacin clave se verific utilizando parsito clones seleccionados con mutaciones
puntuales en pfmdr1 aminocido posicin de 1042. Igualdad de expresin de pfmdr1 fue
confirmada por Western blot.

resultados

Fluo-4 fue transportado por pfmdr1 en el DV de la mayora de los parsitos sensibles a


frmacos y resistentes. Asparagina en la posicin del aminocido pfmdr1 1042 fue crucial para
el transporte de Fluo-4, mientras que la sustitucin N1042D aboli el transporte Fluo-4. Se
llevaron a cabo estudios de competicin de Fluo-4 con cloroquina, quinina y mefloquina sobre
los parsitos que albergan asparagina en la posicin 1042. Un Fluo-4 patrn de inhibicin del
transporte distinto para cada medicamento contra la malaria prueba se observ en cepas de
parsitos de diferentes antecedentes genticos.

Conclusin

Este estudio demuestra que Fluo-4 se puede utilizar para investigar pfmdr1 dinmica de
transporte en ambos parsitos sensibles a frmacos y resistentes a. Adems, la evidencia
directa de transporte alterado Fluo-4 en pfmdr1 est vinculado a una nica mutacin de
aminocidos en el bolsillo de unin al sustrato. Este sistema ofrece una gran herramienta para
investigar el papel del transporte sustrato por pfmdr1 y las mutaciones necesarias para apoyar
el transporte, lo que llevara a nuevas perspectivas para el desarrollo de nuevos frmacos
contra la malaria.
material complementario electrnico

La versin en lnea de este artculo (doi: 10.1186 / s12936-015-0791-3) contiene material


complementario, que est disponible para los usuarios autorizados.

Palabras clave: Plasmodium falciparum, la malaria, Fluo-4, medicamentos contra la malaria, la


cloroquina, mefloquina, quinina, vacuola digestiva, Transporte

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Fondo

resistencia a los medicamentos antipaldicos de uso comn que emerge es un importante


revs en la lucha contra la malaria en todo el mundo [1]. La comprensin de los mecanismos
moleculares de resistencia a los medicamentos es de gran importancia en los esfuerzos en
curso para controlar esta enfermedad.

Al principio, los investigadores encontraron una correlacin entre la resistencia contra la


malaria y el Plasmodium falciparum multirresistencia 1 transportador (pfmdr1) [2, 3]. Pfmdr1
es un homlogo de la glicoprotena P (Pgh1) y pertenece a la superfamilia de transportadores
ATP casete de unin (ABC). Es una protena 162 kDa con dos dominios de unin de nucletidos
(NBD) y doce dominios transmembrana (TMDS), con un substrato putativo bolsillo de unin en
TMD11 [4]. El transportador se encuentra en la membrana de la vacuola digestivo (DV) [5], el
transporte de sustratos de citoplasma del parsito en el DV [6].

Hay dos factores que se han propuesto para desempear un papel en la alteracin de
sensibilidad a los medicamentos especficos para medicamentos contra la malaria:
polimorfismos pfmdr1 y duplicaciones de genes pfmdr1. La resistencia se ha asociado con una
o ms variaciones en cinco posiciones de aminocidos en el transportador, con pfmdr1 de tipo
salvaje pfmdr1 que contiene los aminocidos N86, Y184, S1034, N1042, D1246. El aumento de
pfmdr1 nmero de copias se han vinculado a la mefloquina (MQ), lumefantrina (LF),
halofantrina (HF), la quinina (QN) y la artemisinina (AS) Resistencia [7-9], mientras que las
mutaciones de aminocidos pfmdr1 S1034C, N1042D, eran D1246Y encontrado para mejorar
la susceptibilidad del parsito a MQ, HF y AS, independiente del nmero de copias de genes [2,
10].

Pruebas adicionales para el transporte del frmaco alterada en de tipo salvaje frente a
mutante pfmdr1 se muestra a travs de la expresin de diferentes variantes pfmdr1 en oocitos
de Xenopus laevis. De tipo salvaje pfmdr1 transportado QN y la cloroquina (CQ), pero no HF,
mientras que el mutante pfmdr1 transportado HF pero no QN o CQ [11]. Adems, los residuos
184 altera la cintica de transporte independientes de la unin de drogas especificidad [12].
modelos computacionales de pfmdr1 describen un bolsillo de unin al sustrato, que incluye los
residuos de aminocidos 1034 y 1042 [4, 13]. La unin de varios medicamentos contra la
malaria se investig el uso de simulaciones de acoplamiento dentro del bolsillo de unin al
sustrato pfmdr1. Entre los frmacos probados, MQ era el nico candidato cuya capacidad de
formar un enlace de H con residuos de 1042 fue abolido por completo a travs de la
sustitucin N1042D [13].

Aparte de transporte de frmacos contra la malaria, se demostr que varias variantes


resistentes a los frmacos pfmdr1 podran transportar el sustrato fluorescente Fluo-4 en el DV
del parsito [6]. Por el contrario, el transporte Fluo-4 fue abolida en HB3 parsitos sensibles a
los medicamentos que albergan la variante pfmdr1 N86, F184, S1034, D1042, D1246. En un
documento de seguimiento, se determin la velocidad de la bomba de pfmdr1 (F / Y86, Y184,
S1034, N1042, D1246) para los parsitos Dd2 utilizando imgenes de clulas vivas de los
eritrocitos infectados intactas [14].

En este estudio, resistentes a las cepas de P. falciparum de diferentes antecedentes genticos


y diversos polimorfismos pfmdr1 sensible a los frmacos y se utilizaron para investigar las
mutaciones esenciales necesarios para el transporte de Fluo-4. Adems, se analizaron clones
de P. falciparum que albergan una sola mutacin en la posicin 1.042. Se encontr que el cido
asprtico en la posicin 1042 de abolir el transporte Fluo-4 en el DV. Esto podra ser
restaurada mediante la sustitucin de cido asprtico en la posicin 1042 con asparagina.
Adems, la sustitucin N1042D produjo un aumento de la sensibilidad a MQ. El uso de Fluo-4
como un sustrato competitivo ofrece una herramienta poderosa para investigar el papel de
pfmdr1 en el transporte de medicamentos contra la malaria que actualmente se utilizan para
los parsitos, tanto sensibles a frmacos y resistentes.

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mtodos

Cepas y condiciones de cultivo de parsitos

Tres CQ-sensible (CQS) (3D7, D10, HB3) y tres CQ-resistente (CQR) (Dd2, FCR3, FCB) cepas de P.
falciparum, as como transfectadas de forma estable clones de P. falciparum, derivadas de las
lneas parentales GC03 y 3BA6, se utilizaron en este estudio. Las dos cepas GC03 y 3BA6 son la
progenie del cruce gentico HB3 Dd2 [15] y el puerto de la variante de pfmdr1 HB3 pero
difieren en su fenotipo y el genotipo PfCRT (Tabla 1). pfmdr1 mutantes derivados de GC03 y
3BA6 fueron producidos por Sidhu y colegas a travs de la sustitucin de genes pfmdr1 parcial
que sustituy el cido asprtico en la posicin 1042 con asparagina, dejando los residuos de
aminocidos en 1034 y 1246 sin cambios. Los clones resultantes fueron: SNDGC03 (S1034,
N1042, D1246 en un fondo gentico GC03), SND3BA6 (S1034, N1042, D1246 en un fondo
gentico 3BA6), as como el control de SDDGC03 recombinante y SDD3BA6 [10]. Todas las
cepas se cultivaron de forma continua, como se describe por Trager y Jensen [16], con
modificaciones. Brevemente, los parsitos se propagan a 5% de hematocrito en medio de
cultivo que contiene RPMI 1640 (Life Technologies, Burlington, ON, Canad) suplementado con
HEPES 25 mM, 2 mM L-glutamina, gentamicina (20 mg / ml) (Life Technologies, Burlington, ON,
Canad), 100 mM de hipoxantina (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canad), 0,5% Albumax I (Life
Technologies, Burlington, ON, Canad). Los parsitos se mantuvieron a 37 C con una
atmsfera de 5% de CO2, 3% de O2 y 92% de N2. glbulos rojos A + se obtuvieron del Banco de
Sangre de un estado a otro (Memphis, TN, EE.UU.). frotis de sangre teidos con Giemsa se
prepararon diariamente para controlar el crecimiento del parsito. Para la sincronizacin, los
parsitos se trataron con 5% d-sorbitol (Bioshop Canad, Burlington, ON, Canad) durante 10
min a 37 C; sorbitol se retir y los parsitos se lavaron una vez antes de ponerlos de nuevo en
la cultura. Para obtener cultivos de parsitos altamente sncronos, se repiti el tratamiento de
sorbitol despus de 6-8 h.

tabla 1

tabla 1

mutaciones principal PfCRT y pfmdr1 de parsitos Plasmodium falciparum utilizaron en este


estudio

aislamiento del ADN y anlisis de la secuencia

La secuencia de longitud completa de la secuencia pfmdr1 y parcial de pfcrt fue verificada para
todas las cepas. cepas de parsitos se cultivaron a 5% de parasitemia y el ADN se extrajo
usando el kit de ADN QIAamp Blood Mini (Qiagen, Toronto, ON, Canad) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. ADN se amplific en la superposicin de las fracciones de PCR
usando ADN polimerasa HotStarTaq (Qiagen, Toronto, ON, Canad). Para tener en cuenta el
contenido de nucletidos rica en AT en el genoma de P. falciparum, dNTPs (Invitrogen Canad,
Burlington, ON, Canad) se mezclaron a 75% a 25% y GC. Para la optimizacin de PCR, MgCl2 2
mM, 300 mM dNTPs y 300 nM primers se utilizaron para la reaccin. Para cada mezcla de
reaccin, se utiliz ADN genmico 20 ng. Las reacciones de PCR consistieron en una etapa de
activacin inicial de 94 C durante 3 min, seguido de 35 ciclos de 94 C durante 60 s, 49 a 61
C (ajustado para cada par de cebadores) durante 30 s, y 72 C durante 1 min. Los cebadores
usados para la secuenciacin de genes pfmdr1 se describen en [14]. Los cebadores utilizados
para la secuenciacin de la regin del gen pfcrt que contiene los principales sitios de mutacin
fueron: pfcrt_F: 5'-GGAGGTTCTTGTCTTGGTAAATG, pfcrt_R: 5'-
TGGTAGGTGGAATAGATTCTCTTATAAA. Las muestras fueron enviadas para la secuenciacin del
genoma de Quebec, Canad y analizados utilizando el software Bioedit [17].

expresin de protenas

Para determinar los niveles de protena pfmdr1, 20 g de protena de clulas enteras lisados se
cargaron en cada carril de un gel de acrilamida 8% que contiene SDS. Las protenas se
transfirieron a una membrana de PVDF, que despus se bloque O / N a 4 C con 5% de leche
(w / v) y 0,05% de Tween-20 (ACP Chemicals, St-Leonard, QC, Canad) en fosfato tamponada
de solucin salina (PBS). La membrana se incub con la dilucin adecuada de primaria anti-
pfmdr1 (amablemente proporcionado por el profesor Cowman, Walter y Eliza Hall Institute,
VIC, Australia) o anti-PfHSP70 (Genway Biotech, San Diego, CA, EE.UU.) anticuerpo (1: 2.000)
en PBS-T + 5% de leche durante 1 h (RT), despus se lav y se incub con HRP-conjugado anti-
IgG de conejo secundaria de anticuerpos (Abcam, Toronto, ON, Canad) (1: 20.000) durante 1
h (RT ). Las bandas inmunorreactivas se detectaron con ImmunStar WesternC
quimioluminiscente Kit (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON, Canad) usando un myECL
Imager (Thermo Scientific, Burlington, ON, Canad). Para confirmar la igualdad de protenas de
carga, la intensidad de la quimioluminiscencia de los pfmdr1 se calcularon para cada clon
parsito con relacin a la respectiva quimioluminiscencia PfHSP70 usando ImageJ 1.47q
(Institutos Nacionales de Salud, EE.UU.).

ensayo de inhibicin de crecimiento

ensayos de inhibicin de crecimiento se realizaron como se describe anteriormente [18], con


modificaciones. Brevemente, parsitos en fase de anillo sincronizados se diluyeron hasta una
parasitemia final de 0,5% y un hematocrito de 2%. Se prepar un total de 100 l de medio de
cultivo por pocillo en una placa de ensayo de 96 pocillos, con una serie de diluciones de
frmaco de 1: 3, que van desde 1 mM a 0,15 nM. Las placas se incubaron a 37 C, 5% de CO2,
3% de O2 y 92% de N2 durante 72 h, a continuacin, congelados y almacenados a -80 C. Las
placas se descongelaron a temperatura ambiente y 100 l 2 x tampn de lisis (20 mM Tris pH
7,5, EDTA 5 mM, 0,008% de saponina, 0,08% de Triton X-100, 0,2 l de SYBR Green I / ml) se
aadi a cada pocillo. Las placas se incubaron en la oscuridad durante al menos 1 h. La
intensidad de fluorescencia se determin usando un lector de placas de Synergy H4 (Fisher
Scientific, Nepean, ON, Canad) con 485 nm de excitacin y 520 nm de emisin longitudes de
onda. Los valores de IC50 se determinaron mediante curvas de respuesta a la concentracin de
instalacin con un procedimiento de medida para IGOR Pro 6.2 basada en un guin R
amablemente proporcionados por Le Nagard [19, 20].

imgenes de clulas vivas

parsitos en fase de trofozoto sincronizados se cargaron con 5 mM de Fluo-4 de AM (Life


Technologies, Burlington, ON, Canad) en solucin de Ringer (mM NaCl 122,5, KCl mM 5,4,
CaCl2 1,2 mM, MgCl2 0,8 mM, 11 mM de D-glucosa, 10 HEPES mM, NaH2PO4 1, pH 7,4)
durante 50 min a 37 C. Las clulas fueron lavadas dos veces con solucin de Ringer y se
transfirieron a una cmara de microscopio. Los parsitos se mantuvieron a 37 C durante la
microscopa utilizando una incubadora de etapa superior (Hit Tokai, Shizuoka-ken, Japn). Una
serie de cuatro imgenes por parsito fue tomada utilizando un microscopio confocal Zeiss
LSM710 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania) equipado con un objetivo corregido-agua (C-
Apocromtico 63 / 1,20 W Korr M27) y un lser de 488 nm (12,5 mW , 2% de intensidad). La
gama de fluorescencia emitida se midi 493-622 nm. Las imgenes fueron analizadas usando
ImageJ 1.47q (Institutos Nacionales de Salud, EE.UU.).
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Resultados y discusin

Pfmdr1 transporta Fluo-4 en la vacuola digestiva

Un ligamiento gentico entre Fluo-4 acumulacin en el DV y el transportador pfmdr1 fue


descrito previamente [6]. Aunque se observaron variaciones en Fluo-4 acumulacin entre
cepas de parsitos que albergan mutaciones diferentes pfmdr1, la mutacin (s) de
aminocidos responsable del transporte de Fluo-4 queda por determinar. Para identificar la
mutacin pfmdr1 (s) crucial para el transporte de Fluo-4, varias cepas sensibles a frmacos y
resistentes a P. falciparum de diferentes orgenes genticos fueron probados para la
acumulacin de Fluo-4 en el DV. Se seleccionaron tres CQS y CQR tres cepas que albergan
mutaciones diferentes pfmdr1 para estos experimentos (Tabla 1). Mientras pfmdr1 se ha
sugerido que desempear un papel en la resistencia CQ, el indicador gentico clave para CQS
frente a parsitos CQR se atribuye a la K76T mutacin de aminocidos en el transportador de
P. falciparum resistente a la cloroquina (PfCRT) [21]. Esta mutacin fue tomada en
consideracin en este estudio y la relevancia de los polimorfismos pfmdr1 se discute para las
cepas que albergan ya sea lisina (K76) o treonina (K76T) en PfCRT.

De los cinco sitios de mutacin en pfmdr1 sabe que juega un papel en la resistencia a los
medicamentos, las cepas de parsitos utilizados para estos experimentos contenan
mutaciones en las posiciones de aminocido 86, 184 y 1042, que se encuentran principalmente
en los aislados asiticos [7 africano y, 22-24 ]. Para determinar si las mutaciones en estos
residuos influyen en el transporte de Fluo-4 a travs de pfmdr1, la acumulacin de Fluo-4 en el
DV se midi en parsitos vivos utilizando microscopa confocal. Todas las cepas de parsitos,
excepto HB3, mostraron alta acumulacin de Fluo-4 en el DV (Figura 1a, b). Fluo-4
acumulacin en el DV fue impedida por pre-incubacin de los parsitos con tariquidar (TQ)
(Figura 1b), un inhibidor especfico de los transportadores de Pgp [25]. Es importante destacar
que, Fluo-4 acumulacin en el DV se demostr que era independiente de la mutacin PfCRT
K76T, lo que sugiere que la mutacin PfCRT solo no tiene ningn efecto Fluo-4 de acumulacin.

Figura 1

Figura 1

Fluo-4 de fluorescencia en los parsitos P. falciparum. Los parsitos se incubaron con 5 M Fluo-
4. unas imgenes representativas de los eritrocitos infectados por P. falciparum. La barra de
escala 5 micras. b Proporcin de media de fluorescencia Fluo-4 (DV / citosol) SEM. ...

transporte fluo-4 se asocia con pfmdr1 N1042

El HB3 cepa del parsito, que no se acumula Fluo-4 en el DV, alberga dos polimorfismos de
Y184F y pfmdr1 N1042D-no se encuentra en las otras cepas de P. falciparum ensayadas (Tabla
1), lo que sugiere que uno de estos dos residuos es responsable de la alteracin del transporte
de Fluo-4 visto en los parsitos HB3. Previamente se ha demostrado para el homlogo humano
de pfmdr1 que la mutacin Y184F no influye en la especificidad de drogas [12]. Adems, este
residuo aument slo ligeramente la resistencia a frmacos en comparacin con otros sitios de
mutacin pfmdr1 [4]. Por el contrario, la posicin de aminocido 1042 se cree que es parte de
las interacciones de bolsillo y forma electrosttica con amodiaquina, CQ, MQ (slo en
presencia de asparagina), HF, vinblastina y vincristina [4, 10, 13] de unin a transportador. Por
lo tanto, el papel de las mutaciones pfmdr1 en la posicin 1042 se investig con ms detalle.

Para comprobar la influencia de PfCRT en el transporte de Fluo-4, fueron seleccionados y


compara parsito clones que contenan lisina o treonina en el residuo 76 en PfCRT existente.
Para esto, transfectadas de forma estable clones de P. falciparum derivados de las lneas
parentales se utilizaron GC03 y GC03 3BA6, donde alberga el genotipo K76 PfCRT y es CQ
sensible, y 3BA6 contiene la mutacin PfCRT K76T que confiere resistencia CQ (Tabla 1). Tanto
GC03 y 3BA6 contienen la secuencia pfmdr1 N86, F184, S1034, D1042, D1246, idntica a la
cepa HB3. Los experimentos verifican que ni GC03 ni 3BA6 fueron capaces de acumular Fluo-4
en el DV, como se esperaba (figura 2a, b).

Figura 2

Figura 2

Fluo-4 de fluorescencia en los clones de P. falciparum con diferentes mutaciones pfmdr1 y


PfCRT. Los parsitos se incubaron con 5 M Fluo-4 a.m. en solucin de Ringer durante 50
minutos a 37 C, despus se lavaron con Ringer ...

Como control, los clones parsito SDDGC03 y SDD3BA6, que alberga la misma mutacin que
GC03 y 3BA6, revel que la mutacin pfmdr1 N1042D no transport Fluo-4 en el DV (figura 2a,
b). transporte Fluo-4 solamente se estableci con la introduccin de asparagina en el residuo
1042 para ambos clones (SNDGC03 y SND3BA6). El transporte era independiente de la
mutacin PfCRT K76T, ya que el transporte de Fluo-4 se vea afectada por igual en GC03 y 3BA6
lneas parentales, as como los controles y SDDGC03 SDD3BA6, y slo se ve en los clones
SNDGC03 y SND3BA6 (Figura 2a, b). especificidad de transporte para pfmdr1 en los clones
SNDGC03 y SND3BA6 se confirm a travs de pre-incubacin de las muestras con el TQ
inhibidor de Pgp (Figura 2b; archivo adicional 1: Figura S1). Estos resultados indican un papel
fundamental para la asparagina en la pfmdr1 residuo 1042 en el transporte de Fluo-4,
independiente de PfCRT.

Adems de los polimorfismos pfmdr1, aumento del nmero de copias del gen pfmdr1 [8, 9, 26]
y los niveles de expresin de protenas tambin se ha sugerido que desempear un papel en la
resistencia a frmacos o la susceptibilidad. Para verificar que Fluo-4 acumulacin en el DV de
clones SNDGC03 y SND3BA6 no estaba vinculado a una mayor expresin pfmdr1, se analizaron
los niveles de protena pfmdr1 de estos clones parsito (Figura 2C). No se detect ningn
aumento significativo en la expresin pfmdr1 para el GC03 y 3BA6 lneas parentales o sus
clones que albergan la sustitucin D1042N (p> 0,05). Por lo tanto, Fluo-4 acumulacin en el DV
de estos clones se halla asociada con la mutacin en el residuo pfmdr1 1042.
Efecto del polimorfismo N1042D de sensibilidad a los medicamentos

Dado que el transporte de Fluo-4 era dependiente de polimorfismos especficos pfmdr1, se


deduce que la sustitucin N1042D en el bolsillo pfmdr1 sustrato de unin no slo puede
alterar el transporte de unin y de Fluo-4, sino tambin influir en otros sustratos, tales como
frmacos contra la malaria . Para determinar si la sustitucin de aminocido en el residuo 1042
result en sensibilidad a los frmacos alterada o resistencia de los clones de parsitos, se
llevaron a cabo ensayos de inhibicin de crecimiento. Un cambio en la IC50 de un frmaco
dado indicara un papel para la posicin pfmdr1 amino cido 1042 en su transporte. valores CQ
IC50 para clones CQS se encontr que eran 47 2,6 nM para GC03, 46 2,2 nM para SDDGC03
y 49 2,8 nM para SNDGC03, mientras que los valores CQ IC50 para clones CQR eran 262 5,7
nM para 3BA6, 204 9,4 nM para SDD3BA6 y 274 5,6 nM para SND3BA6 (Tabla 2). Esto
sugiere que una mutacin de aminocido en pfmdr1 residuo 1042 no afecta a la
susceptibilidad o resistencia a CQ. resistencia CQ podra invertirse en el CQR cepas a travs de
la adicin de 1 verapamil mu M, mientras que no se observ ninguna diferencia significativa en
las cepas CQS (p> 0,05), como se esperaba. Del mismo modo, los clones CQS eran ms
susceptibles a la quinacrina (QC) con valores de CI50 de 11 0,3 nM para GC03, 13 0,3 nM
para SDDGC03 y 14 0,4 nM para SNDGC03 en comparacin con los valores ms altos de
control de calidad de CI50 de 43 3,4 nM para 3BA6 , 41 1,0 nM para SDD3BA6 y 42 2,3
nM para SND3BA6. Aqu de nuevo, como para CQ, una mutacin de aminocido en pfmdr1
residuo 1042 no afect a la susceptibilidad o resistencia a QC. Lo mismo se encontr para la
dihidroartemisinina (DHA). clones CQS eran cuatro veces ms resistente que clones CQR (4
0,1 vs 1 0,1 nM) y la resistencia DHA no fue reversible por la adicin de 1 M verapamil. Por lo
tanto, la mutacin pfmdr1 N1042D s sola no parece ser un factor determinante para el CQ,
control de calidad o resistencia DHA en estos parsitos (Tabla 2).

Tabla 2

Tabla 2

valores de IC50 de los parsitos Plasmodium falciparum usados en este estudio

Curiosamente, la mutacin N1042D proporcion los cambios en la sensibilidad a los


medicamentos para el QN medicamentos contra la malaria y MQ. Se observ una disminucin
significativa en los valores QN de IC50 en el GC03 y 3BA6 derivados de clones SNDGC03 y
SND3BA6 en comparacin con las lneas parentales GC03 y 3BA6 o sus controles SDDGC03 y
SDD3BA6 recombinante (p <0,005) (Tabla 2), que est de acuerdo con los resultados anteriores
[10]. Se observ el efecto opuesto para MQ. Para el SNDGC03 clones y SND3BA6clones, la
sustitucin D1042N condujo a un aumento de tres veces en la resistencia a aproximada MQ.
los valores de IC50 MQ aumentaron de 6 0,9 nM en GC03 a 19 0,6 nM en SNDGC03, y de 5
0,3 nM en 3BA6 a 14 0,5 nM en SND3BA6. Este fue un aumento significativo en los valores
de IC50 para la MQ clones SNDGC03 y SND3BA6 en comparacin con las lneas parentales (p =
0,0003 para GC03 vs SNDGC03; p = 0,0001 para 3BA6 vs SND3BA6). Incrementos similares en
la resistencia MQ (aproximadamente tres veces) se han encontrado en los aislamientos de
campo de frica y Asia [27, 28]. Un aumento de tres veces en la resistencia MQ tambin fue
confirmada in vitro a travs de intercambio de alelos pfmdr1 [2]. Por lo tanto, es probable que
desempee un papel en el aumento de la resistencia MQ en el campo de la mutacin pfmdr1
crucial para la resistencia MQ in vitro. Sin embargo, los experimentos de inhibicin del
crecimiento no dilucidar plenamente el transporte alterado de MQ pfmdr1. Por esta razn, la
co-incubacin de medicamentos contra la malaria con Fluo-4 puede arrojar nueva luz sobre el
papel del transporte en pfmdr1 resistencia a los medicamentos.

competicin por el sustrato de medicamentos contra la malaria con Fluo-4 para determinar el
transporte de frmacos por pfmdr1

Pfmdr1 est implicado en el transporte de sustratos, incluyendo varios medicamentos contra


la malaria, desde el citosol a la DV [10, 11], pero el papel de los polimorfismos pfmdr1 en
resistencia a los medicamentos no se entiende completamente. Las mutaciones en el residuo
86 ha sido sugerido para influir alostrica del sitio de unin de drogas TMD11 [4], mientras que
los residuos pfmdr1 1034 y 1042 se encuentran en un bolsillo de unin propuesto.
interacciones electrostticas con tanto asparagina y cido asprtico en la posicin 1042 se ha
demostrado in silico para CQ, QN y MQ [4, 13]. Mientras que CQ fue incapaz de formar un
hidrgeno (H) -bond con asparagina o cido asprtico en el residuo 1042, asparagina en el
residuo 1042 fue capaz de formar un enlace de H con MQ [4, 13]. No existe informacin
disponible sobre la formacin del enlace de H QN con residuos de 1042.

Una mayor comprensin de la importancia de pfmdr1 en el transporte del frmaco se puede


lograr a travs de estudios de competicin utilizando dos sustratos potencialmente
competitivos, cantidades por ejemplo, fijos de Fluo-4 y concentraciones crecientes de la droga.
Para este propsito, dos cepas de parsitos fueron elegidos para evaluar las diferencias
potenciales en el transporte de frmacos contra la malaria en los parsitos sensibles (3D7) y
resistentes (Dd2). 3D7 es sensible a CQ, QN y MQ (Tabla 2), mientras que Dd2 es resistente a
estos frmacos. HB3 no fue utilizado, ya que no es capaz de transportar Fluo-4 en el DV. Los
cambios medidos de Fluo-4 acumulacin en el DV en presencia de los frmacos contra la
malaria se compararon para 3D7 y Dd2 parsitos.

Para 3D7 parsitos, aumentando la concentracin CQ condujo a la fuerte disminucin de Fluo-


4 acumulacin en el DV (Figura 3a). Mientras TQ es un inhibidor no competitivo de MDR1
travs de la inhibicin de la actividad de ATPasa [25], se cree que CQ para unirse al bolsillo de
unin al sustrato del transportador y es probable un inhibidor competitivo de Fluo-4. Pre-
incubacin de parsitos 3D7 con 250 nM CQ dio lugar a disminucin de la acumulacin Fluo-4
en el DV, donde slo se midi 5 1,0% Fluo-4 de fluorescencia en comparacin con los
parsitos no tratados con el frmaco. En parsitos Dd2, pre-incubacin con 250 nM CQ reduce
Fluo-4 fluorescencia en el DV por medio (48 3,0%). MQ reduce transporte Fluo-4 en el DV a
45 2,0% en parsitos 3D7 y slo 82 6,0% en Dd2 parsitos (Figura 3a). Para MQ, una
disminucin en el transporte de Fluo-4 en comparacin con 3D7 parsitos Dd2 no se puede
atribuir a una mutacin de aminocido en la posicin 1042 pfmdr1 solo desde ambas cepas
puerto de tipo salvaje N1042. Sin embargo, los parsitos Dd2 albergan una mutacin de
aminocido en pfmdr1 residuo 86, que se describi para influir en la sensibilidad MQ en los
aislados de campo de frica [24, 30, 31]. Esta mutacin N86Y puede alterar el transporte de
MQ por pfmdr1, como se muestra en los experimentos presentados aqu. QN fue menos eficaz
en la reduccin de Fluo-4 acumulacin de CQ o MQ y slo disminuy Fluo-4 fluorescencia en el
DV a 59 2,9% en los parsitos 3D7 y no de forma significativa en los parsitos Dd2 (92 3,4%)
(Figura 3a). Las diferencias entre 3D7 y Dd2 parsitos en el nivel de reduccin de Fluo-4
pueden estar vinculados a pfmdr1 residuo 86, que se sugiere para influir en la susceptibilidad
CQ [29]. Es concebible que N86Y puede influir alostrica del sitio de unin de drogas en
TMD11, como se sugiere en [4]. Residuo 86 no fue examinado en este estudio.

figura 3

figura 3

La competencia del transporte de Fluo-4 con medicamentos contra la malaria. una parsitos se
pre-incubaron con diferentes concentraciones de cloroquina (CQ), mefloquina (MQ) o quinina
(QN), o se deja sin tratar antes de la adicin de Fluo-4 a.m.. b Los parsitos se preincubaron ...

Fluo-4 competicin con medicamentos contra la malaria tambin se prob en el SNDGC03


parsito clones y SND3BA6. El uso de una sola concentracin de frmaco de 250 nM, Fluo-4
acumulacin se redujo en el DV de SNDGC03 y SND3BA6 parsitos a 33 1,9% y 39 3,0% para
el CQ, 61 3,1% y un 65 4,8% para MQ y 58 3,9% y un 91 4,4% para QN, respectivamente.
Casi todos los frmacos contra la malaria analizados disminuyeron la acumulacin de Fluo-4 en
el DV en ambos clones SNDGC03 y SND3BA6, a excepcin de QN (Figura 3b). De nuevo, esto
sugiere que la influencia de medicamentos contra la malaria en el transporte de sustrato por
pfmdr1 no slo depende de polimorfismos pfmdr1 sino tambin de los antecedentes genticos
variable de la cepa del parsito.

La influencia de la sustitucin N1042D en el transporte de Fluo-4 se explica en un modelo


propuesto (Figura 4). Fluo-4 est cargado negativamente y la sustitucin de una asparagina
neutral en el residuo 1042 con un cido asprtico cargado negativamente altera el medio
ambiente local, lo que es menos favorable al transporte Fluo-4. TQ no influye Fluo-4 afinidad
por el sustrato vinculante de bolsillo, pero impide la hidrlisis de adenosina trifosfato (ATP) de
pfmdr1. Dado que ambos NBDs actan en concierto [32], la inhibicin completa de la actividad
ATPasa por TQ se puede lograr cuando un sitio de unin a nucletidos es bloqueado.

Figura 4

Figura 4

Modelo de transporte de Fluo-4. El acoplamiento de sustratos en el bolsillo de unin pfmdr1


est influenciado por el tamao, la carga y la polaridad de aminocidos locales. Asparagina (N)
y cido asprtico (D) son a la vez polar, hidrfila y de pequeo volumen. Mientras que N es un
...

cintica de transporte detallados de cepas de parsitos de diferente origen proporcionarn


informacin adicional sobre el transporte de sustrato a travs de pfmdr1. El uso de Fluo-4
como un sustrato competitivo elude la cuestin del etiquetado directo de medicamentos
contra la malaria con una etiqueta fluorescente que puede alterar sus propiedades de
transporte. Por lo tanto, Fluo-4 es una poderosa herramienta para estudiar la cintica de
transporte de forma selectiva pfmdr1 en los eritrocitos infectados por P. falciparum intactas.

Ir:

Conclusin

Este estudio proporciona evidencia directa para el transporte de sustrato impulsado por
pfmdr1 reducido a travs de la mutacin de un solo aminocido N1042D, que se encuentra en
el bolsillo de unin al sustrato. La relevancia de esta mutacin de aminocidos puede haber
sido subestimado y necesita ms investigacin. Adems, ahora es posible probar mutaciones
adicionales dentro del bolsillo de unin de pfmdr1 para verificar su papel potencial en el
transporte de frmacos. En consecuencia, el uso de Fluo-4 en ensayos de competicin de
drogas proporciona una poderosa herramienta para examinar mejor la cintica de transporte
de frmacos a travs de pfmdr1. Esta informacin recin adquirida puede ayudar a dilucidar el
papel de pfmdr1 en el transporte de drogas, que se ha mantenido controvertido durante
dcadas. Por ejemplo, mientras que las investigaciones anteriores han sugerido una relacin
entre la resistencia MQ y asparagina en la posicin pfmdr1 aminocido 86 en aislados
procedentes de Tailandia y frica Occidental [30, 33], otros han asociado de tipo salvaje
pfmdr1 y el aumento de nmero de copias de genes con resistencia MQ [ 3, 34]. publicaciones
ms recientes han encontrado una fuerte evidencia de un papel para el N1042 en la resistencia
MQ en los aislados de Tailandia [35, 36], lo que sugiere que la importancia de esta mutacin se
ha subestimado en estudios de campo anteriores. La importancia de N1042 para la resistencia
MQ se demostr de manera similar in vitro a travs de sustituciones de aminocidos
combinados que generaron una cepa del parsito que alberga las mutaciones S1024C,
N1042D, D1246Y [2]. Esta cepa recin generado era aproximadamente tres veces ms
susceptibles a la exposicin MQ comparacin con la cepa parental [2]. Los resultados
presentados aqu apoyan el papel potencial de la pfmdr1 N1042 en la resistencia del parsito a
MQ. Ms investigaciones ayudarn a esclarecer el significado de este polimorfismo en el
transporte de sustrato.

Ir:

Contribuciones de los autores

SJR y PR dise el estudio; SJR realiz experimentos y se cuantifica los datos; SJR y PR escribi
el manuscrito. Ambos autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Expresiones de gratitud

Este estudio fue apoyado en parte por becas del Servicio Alemn de Intercambio Acadmico
(DAAD) (SJR), la Beca Robert P. Harpur (SJR), el Centro de Interaccin parsito-anfitrin
(FRQNT) (SJR), y subvenciones del Natural Ciencias e Ingeniera de Investigacin (NSERC)
Descubrimiento Grant (PR) y la Fundacin Canadiense para la Innovacin (CFI) Lderes
Opportunity Fund (PR).
El cumplimiento de las normas ticas

Conflicto de intereses Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

la disposicin

archivo adicional 1: (122K, png)

Figura S1. La inhibicin del transporte de Fluo-4 a travs tariquidar. clones de Plasmodium
falciparum se pre-incubaron con 100 nM tariquidar durante 10 min a 37 C, a continuacin, se
aadi 5 M Fluo-4 a.m. para 50 min. Fluo-4 acumulacin en la vacuola digestivo fue
disminuida. Los experimentos se realizaron por triplicado en das diferentes. Estas imgenes
son suplementarios a los datos obtenidos para la Figura 2. La barra de escala, 5 micras.

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