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Aislamiento y obtencin de cultivos puros de hongos y bacterias, evaluacin de crecimiento

de hongos en diferentes medios de cultivo, e identificacin de gneros de bacterias


fitopatgenas (Prcticas N 3 y 4)

Nombres y cdigos: Helber Eliecer Cano, Omar Gustavo Montero. Grupo: ______ Fecha: 03 de
Abril del 2017

1. Introduccin.

En todos los ambientes naturales del planeta tierra habitan mltiples organismos de diversos tipos y
actividad fisiolgica, que permiten, en asociacin con los seres inertes o factores abiticos la
existencia de los ecosistemas; desde el organismo ms grande, hasta parsitos, bacterias y hongos,
destacando de entre este grupo los hongos, organismos eucariotas que habitan en gran variedad de
superficies, en lechos y otras especies; cuyas formas vegetativas son extremadamente diversas
desde las ms simples formadas por una sola clula o con caractersticas, como la presencia de
estructuras filamentosas de mucho ms tamao y caractersticas morfolgicas complejas
diferenciadas. Desde el punto de vista de su supervivencia, los hongos son organismos hetertrofos y
obtienen los nutrientes por absorcin de un sustrato determinado. Por otra parte, es imposible dejar
de lado organismos como las bacterias, los cuales representan los individuos ms abundantes del
planeta, presentes en todos los hbitats del globo, con alto grado de adaptacin a condiciones
extremas como altas temperaturas, o incluso a entornos de alta salinidad; algunas con funciones
fundamentales como el reciclado de nutrientes y con un papel importante en los ciclos
biogeoqumicos. (Gonzales, 2015)

No obstante en la naturaleza, la mayora de los microorganismos no se encuentran aislados, sino


integrados en poblaciones mixtas, razn por la cual para efectuar el estudio de un microorganismo,
para ello se han establecido tcnicas que permiten su desarrollo bajo condiciones artificiales, proceso
entendido como cultivo de microorganismos, el cual consiste en promover intencionalmente su
desarrollo en condiciones experimentales controladas, la poblacin del microorganismo se desarrolla
en un medio denominado cultivo, el cual provee al individuo de las nutrientes bsicos y factores
fsicos para el mantenimiento de su vida, estas necesidades varan segn el tipo de microorganismo y
es necesario conocerlas para cultivarlos en el laboratorio. Adems para el estudio de las bacterias y
otros microorganismos cultivables, es necesario adems, conocer y reconocer la morfologa
microscpica y macroscpica a partir de su crecimiento en medios de cultivo; adicionalmente, es
posible evaluar el comportamiento de ellas frente a los diferentes compuestos nutritivos o
proporcionarles aquellos nutrientes adecuados para favorecer su desarrollo. (Rojas, 2011)

Por lo anterior, los mtodos de aislamiento y seleccin de microorganismos permiten la identificacin


precisa de los mismos con el objeto de realizar trabajos experimentales, en aras de determinar
agentes causales de una enfermedad y realizar un diagnstico acertado de la misma y brindar
estrategias acertadas de control, lo cual solo se hace posible bajo criterios cientficos claros, como el
uso de herramientas tecnolgicas o avances cientficas, por ejemplo las pruebas bioqumicas, que
consisten en la identificacin de la presencia o ausencia de una enzima, de un grupo de enzimas, o
de una va metablica completa en uno o ms microorganismos (Rojas, 2011), fundamental en la
identificacin de bacterias, es por ello que en este escrito se busca dar a conocer las formas y
procedimientos para la identificacin de hongos y bacterias, as como la clasificacin de los mismos y
su importancia en la produccin agrcola mundial.

Objetivos.
1. Identificar los diferentes medios de cultivo y las condiciones de incubacin para el aislamiento de
microorganismos con caractersticas especficas.
2. Conocer y aplicar las diferentes tcnicas para el aislamiento de microorganismos (hongos y
bacterias), para la conservacin de cultivos a corto y mediano plazo.
3. Caracterizar algunas colonias obtenidas a partir del aislamiento de microorganismos obtenidos del
tejido vegetal y clasificarlos segn su gnero a partir de pruebas bioqumicas.

Metodologa.
Aislamiento de hongos y bacterias a partir de tejido vegetal:

Para realizar el procedimiento se utilizaron tomates de la variedad chonto para el caso de hongos y
cebolla de bulbo para el caso de bacterias, teniendo en cuenta que el tipo de aislamiento a utilizar,
est sujeto a la presencia o no de sintomatologa, es decir, si existe presencia de sintomatologa
asociada a una enfermedad, se realiza un aislamientos directo, de no ser as se procede al
aislamiento indirecto.

En el caso de hongos, para el aislamiento indirecto se procedi a lavar con agua corriente los frutos
de tomate chonto, y se secaron con una toalla de papel estril. Los tejidos de inters se obtuvieron
con la ayuda de un bistur estril, cortando fragmentos de tejido infectado y sano aproximadamente
de 5x5 mm. Estos fragmentos se sumergieron durante 30 segundos en etanol al 70 %,
posteriormente se sumergen en hipoclorito de sodio durante 30 segundos a una concentracin de 2%
con el fin de eliminar la flora normal presente en el tejido. Posteriormente, los fragmentos se
enjuagaron sumergiendolos en agua destilada estril para eliminar los residuos de desinfectante que
pudiesen interferir con el desarrollo normal del patgeno. Despus, bajo condiciones aspticas, se
secaron los fragmentos de tejido utilizando una toalla de papel estril, para eliminar los excesos de
humedad que contribuyen con la contaminacin del aislamiento; estos finalmente se transfieren a una
caja de Petri 5 explantes con medio de cultivo agar PDA, se incubaron durante 8 das a 25 0C. (Roa,
2010)

Para el aislamiento de bacterias se realiza el mismo tratamiento para la esterilizacin del material
vegetal, y cerca de un mechero se transfiere un de los explantes a un tubo PE con agua destilada, y
se macera hasta obtener una consistencia cremosa, posteriormente se toma una asada de la
suspensin y se siembra en medio de cultivo, teniendo en cuenta que para el caso de bacterias se
usa el medio de cultivo agar nutritivo, adicionalmente, cabe aclarar que para este aislamiento se
utiliz como material vegetal cebolla de bulbo; esta siembra se incuba a 28 0C.

Cultivos puros de hongos y bacterias

A partir de los aislamientos realizados anteriormente de bacterias y hongos obtenidos a partir de


material vegetal y se procede a realizar la descripcin macroscpica comprende aspectos como el
color de las colonias, teniendo en cuenta el tipo de micelio y la tasa de crecimiento, estos aspectos
han sido empleados para realizar y dar a conocer una descripcin morfolgica, esto pare le caso de
la caracterizacin de hongos, en comparacin, para la descripcin de bacterias se debe adicionar en
la observacin caractersticas como el tamao. Los bordes, superficie consistencia, etc. (Contreras,
2006)
A continuacin se procede a la determinacin de la frecuencia de la colonias, esto con el uso de un
contador de colonias teniendo en cuenta las caractersticas macroscpicas anteriormente
mencionadas, esto a fin de realizar la purificacin de cultivos de hongos y bacterias, dicha
purificacin de cultivos se realiza a partir de los mtodos establecidos en cada caso, es decir, se
realiza en primer lugar una transferencia de punta de hifa, que consiste en cortar trozos de micelio y
transferirlos a un nuevo medio de cultivo; en segunda instancia se realiza un microcultivo, que es
sencillamente el crecimiento de un hongo en una lmina porta objetos, finalmente se realiza un
cultivo monosporico, que como su nombre lo indica, consiste en hacer crecer una nueva colonia a
partir de una espora, estos mtodos corresponden a las tcnicas utilizadas para realizar cultivos
puros en hongos, por el contrario para bacterias se utiliza el mtodo conocido como estras en medio
de cultivo, que no es ms que la siembra del microorganismos en una caja de Petri con medio de
cultivo.(Ramrez, et. al, 2012)

Cultivos puros para hongos

Transferencia de hifas: se identifica la colonia con la mayor ocurrencia en el aislamiento con ayuda
del contador de colonias y procede a cortar trozos de micelio de aproximadamente 0.5 cm usando un
bistur previamente esterilizado, estos trozo son transferidos aun un tubo con medio de cultivo,
asegurndose que el trozo entre en contacto con el medio de cultivo, esto con el apoyo de una aguja
micolgica, sellar adecuadamente el recipiente e incubar durante 7 das a una temperatura de 25 0C,
al cabo de los cuales se realiza la observacin y comparacin de la nueva colonia con la inicial que
se tena en la caja de Petri.

Microcultivo: para la realizacin de este tipo de cultivos se ubica en el fondo de una caja de Petri
papel absorbente, sobre este se coloca un ngulo de vidrio para soportar la lmina portaobjetos,
adicionalmente, con la ayuda de un bistur previamente esterilizado cortar trozo de medio de cultivo
limpio de aproximadamente 1cmx1cm, y transferirlo a la lmina portaobjetos con las pinzas de
diseccin estriles, ubicndolo en el centro de la lmina; posteriormente, se realiza la inoculacin de
cada uno de los cuatro puntos del cuadrado de medio limpio, transfiriendo parte del micelio del hongo
al montaje mediante una aguja micolgica; colocar la lmina cubreobjetos sobre el trozo de agar, y
humedecer el papel absorberte, incubar a 25 0C durante una semana, procurando que durante el
tiempo de incubacin se mantenga hmedo el papel absorbente. Observar el montaje bajo el
microscopio.

Cultivo monosporico: para el caso del cultivo moosnporico se utilizaron aislamientos en cajas de
Petri, en las cuales ya se haba hecho una identificacin previa la colonia de mayor ocurrencia,
evitando los pasos iniciales requeridos para este cultivo, limitndose simplemente a la observacin de
puntos marcados en la caja de Petri bajo el microscopio con el objetivo de transferir una de las
esporas que probablemente germin a un nuevo medio de cultivo e incubar durante 7 das a una
temperatura de 250C, al final de los cuales se debe observar y comparar las caractersticas
macroscpicas.
Cultivos para bacterias

Tomar una muestra de una colonia de bacterias, la cual fue previamente aislada e identificada con un
asa bacteriolgica y suspender en 10 ml de agua destilada, agitar hasta homogenizar, tomar 100ul de
esta dilucin y suspender nuevamente en 10 ml de agua destilada, repetir hasta obtener una
suspensin bien diluida, finalmente con ayuda de un asa bacteriolgica realizar un rayado sobre la
superficie de un nuevo medio de cultivo, e incubar a 30 0C, observar a las 24, 48, 72 h y transferir las
colonias a un nuevo medio de cultivo, e incubar nuevamente a 30 0C

Adicionalmente durante la prctica se realizaron las pruebas de germinacin, las cuales consisten en
la siembra de patgenos en tres diferentes hospederos, zanahoria, arroz y trigo, estos fueron
inoculados con sclerotium sp (zanahoria) y penicillium sp (trigo), incubados durante 8 das a
temperatura ambiente en tarros compoteros sellados con papel aluminio, esto con el objeto de
observar la especificidad de los patgenos frente a los hospederos.

Resultados y discusin

4.1. Sntomas. Describa los sntomas de la enfermedad que el grupo asoci con un posible
hongo y con una posible bacteria y a partir de las cuales se realizaron los aislamientos,
adicionalmente, especifique el hospedante a parir del cual se realizaron los aislamientos y el
origen de la muestra (Tabla 1). Relacione las sintomatologas observadas con las enfermedades
reportadas en la literatura para este hospedante y segn su anlisis mencion cul podra ser el
agente causal de las alteraciones observadas (Tabla 1).

Tabla 1. Resultados. Sntomas asociados a hongos y bacterias.

Descripcin del
Tipo sntoma
sntoma Posible
rgano
Planta Origen de la agente
afectad (necrosis, clorosis,
Hospedante muestra Sea lo ms detallado causal
o alteracin de desarrollo,
posible (distribucin porque?
marchitamiento)
en planta y rgano)

H Tomate Supermerc Fruto Dao en la corteza Presencia del geotrichu


O chonto ado de del fruto, com dao en el zona m Sp.
N
G
(Solanum barrio presencia de ecuatorial del
O lycopersic exudados con olor fruto, con una
S um) fuerte de extensin de
fermentacin y con ms de 2
presencia de centmetros de
estructuras alto y un
reproductivas centmetro de
ancho

B Cebolla de Material Bulbo Bao en las se presentan en Pantoea


A bulbo del primeras capas del cualquier parte Sp.
C
T
laboratorio bulbo, con una del bulbo con
( Allium zona de cambios una parte circula
E
R cepa) de color, a un color afectada con
I pardo con radio de 2cm
A
ablandamiento y
S
presencias de
exudados

4.2. Aislamientos. Analice los resultados obtenidos, mencionando aciertos y desaciertos del proceso y
aspectos que modificara para un prximo trabajo de este tipo. En la Tabla 2, presente los resultados obtenidos.
Describa las colonias aisladas a partir de los explantes y para el caso de hongos determine la frecuencia de
aislamiento.

Tabla 2. Resultados. Aislamiento de hongos y bacterias a partir de tejido sintomtico.

Tipo de
Resultados Indique la colonia
aislamiento Es seleccionada para
realizado (describa las candidato a realizar las curvas de
Medio
caractersticas ser el agente crecimiento/microcul
de directo/indirect Frecuenci
macroscpicas de causal de la tivo (hongos) o
cultivo o a de la (s)
colonias obtenidas sintomatolog pruebas bioqumicas
emplead colonia (s)
a partir de los a inicialmente (bacterias)
o fue acertado
explantes (hongos) descrita?
el
macerado de tejido Porque? Cules fueron los
procedimiento?
(bacterias) criterios de seleccin?
Porque?

H
O
N
G
O
S
B
A
C
T
E
R
I
A
S

4.3. Identificacin del agente causal ms probable. Para hongos, describa las estructuras
observadas en los microcultivos. Coinciden las estructuras observadas con las esperadas del
posible agente causal segn los sntomas observados en la literatura? (Tabla 3). Para bacterias,
incluya en su reporte los resultados obtenidos para la tincin de Gram Coinciden las estructuras
observadas con las esperadas del posible agente causal segn los sntomas observados en la
literatura? (Tabla 3). Si el hongo empleado para el microcultivo o la bacteria tienen una
procedencia diferente a los aislamientos de su muestra original (punto 4.1.), mencione la
informacin que tenga disponible y que aporte en el proceso de identificacin, para ello tenga en
cuenta la informacin que se le solicita en los puntos 4.1 y 4.2.

Tabla 3. Resultados. Identificacin y descripcin de estructuras del agente causal ms


probable (hongos) y tincin de Gram para bacteria problema.

Descripcin
Fotografa Describa de forma detallada las estructuras observadas,
corresponden a lo reportado en la literatura para el posible
(escoja la mejor y que mejor represente
agente causal asociado a la enfermedad inicialmente
la descripcin de estructuras obtenidas
descrita y a partir de la cual se realizaron los asilamientos?
en el microcultivo (hongos) o resultado
No olvide entregar una lmina fijada producto de su
de la tincin de Gram (bacterias) no
microcultivo (esto solo para hongos). Para bacterias
olvide incluir la amplificacin (4x, 10x,
mencione las pruebas bioqumicas que le permitieron
40 x o 100x) en la que logr
aproximarse al gnero; estos resultados debe coincidir con
lo presentado en la Tabla 4 para la bacteria problema

H
O
N
G
O
S
B
A
C
T
E
R
I
A
S

4.4. Identificacin Bioqumica de bacterias: Registre los resultados obtenidos en la Tabla 4


y discuta brevemente los resultados obtenidos. Contrstelos con los resultados tericos esperados,
analizando especialmente las pruebas que permiten identificar bacterias fitopatgenas hasta el
nivel de gnero. Qu aciertos o desaciertos explican estos resultados?

Tabla 4. Resultados de la identificacin bioqumica de bacterias

Genero Genero
Genero 1: Genero 3: Genero 4:
2: problema

Prueba 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1

Tincin de Gram

Prueba KOH

Forma

Produccin de
catalasa
Prueba de
Oxidasa

Requerimiento
de oxigeno

Utilizacin de
azucares y
liberacin de
sulfuros

Hidrlisis de
gelatina

Hidrolisis de
almidn

Produccin de
pigmentos
fluorescentes

Pigmentos
amarillos en
YDCA

Observaciones
4.5. Efecto del medio de cultivo en el crecimiento in vitro de hongos fitopatgenos.
De los sub-cultivos del hongo de inters en tres medios diferentes (Agar Papa Dextrosa, Agar
Agua y Agar Sauro), presente en una grfica los resultados del crecimiento radial en los diferentes
medios y analice los resultados obtenidos. Corresponden las caractersticas macroscpicas a los
de la colonia inicialmente aislada?, Si es distinta a qu se puede atribuir la diferencia?, incluya
fotografas del tiempo de evaluacin, puede ser la primera observacin, una intermedia y la final.

5. Conclusiones: Presente cinco conclusiones de la prctica realizada (procure estn en sintona


con cada uno de los acpites abordados en los resultados (4.1, 4.2, 4.3, 4.4 y 4.5) y que tambin
estn en sintona con los objetivos inicialmente planteados)

6. Referencias bibliogrfica

Contreras. C. 2006. Caracterizacin y pruebas de patogenicidad cruzada entre aislamientos de


colletotrichum spp. Obtenidos de frutos de lulo (solanum quitoense lam), tomate de rbol (solanum
betacea sendt), granadilla (passiflora ligularis juss), mango (mangifera indica l) y tallos de mora
(rubus glaucus benth) con sntomas de antracnosis. Pontificia universidad javeriana. Facultad de
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https://repository.javeriana.edu.co/bitstream/handle/10554/8661/tesis614.pdf;jsessionid=149209CD5A
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Ramrez. F. et al.2012. Manual de prcticas de laboratorio. Microbiologa General. Universidad


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