You are on page 1of 8

PRODUCCIN DE UNA ENZIMA EN BIORREACTOR CON CLULAS LIBRES

Marco terico

Las enzimas como metabolitos. Los metabolitos primarios producidos durante


un proceso de fermentacin representan productos finales de bajo peso molecular
usados para la produccin de macromolculas. Asimismo, los metabolitos
primarios pueden ser productos intermediarios en vas metablicas relacionadas
con los productos finales. Los aminocidos, vitaminas, los nucletidos y ciertas
enzimas son considerados productos primarios.

En el caso de las enzimas, stas son consideradas metabolitos primarios cuando


la evolucin de su produccin guarda una relacin estrecha con el crecimiento
microbiano. Existen diversos tipos de enzimas y pueden ser obtenidas de
diferentes fuentes.

Tipos de enzimas y sus fuentes. Al menos 75% de todas las enzimas


industriales son de accin hidroltica y son usadas para la despolimerizacin de
sustancias naturales. Las proteasas representan el tipo de enzimas industriales
predominantes (40%) utilizadas en la industria lechera y detergentes. Las
carbohidratasas utilizadas en las industrias de panificacin, cervecera, destilacin,
almidn y textiles representan el segundo grupo ms grande de enzimas
industriales.

Las enzimas pueden ser obtenidas de diversas fuentes como tejidos animales,
plantas, hongos y bacterias. Las enzimas microbianas representan 90% de las
enzimas industriales. Las enzimas de origen vegetal ms importantes son la
papana, la bromelina, algunas enzimas amilolticas de cereales, lipoxigenasas de
soya y enzimas de frutas ctricas. En cuanto a las enzimas de origen animal, estas
incluyen a las lipasas y proteinasas pancreticas, pepsinas y esterasas.

Levadura. Saccharomyces cerevisiae es un hongo unicelular, es decir, un tipo de


levadura que ha servido como uno de los modelos ms adecuados para el estudio
de problemas biolgicos, por ser un sistema eucariota, con una complejidad slo
ligeramente superior a la de las bacterias pero compartiendo con ella muchas de
sus ventajas tcnicas.

Las utilidades industriales ms importantes de esta levadura son la produccin de


cerveza, pan y vino, gracias a su capacidad de generar dixido de carbono y
etanol durante el proceso de fermentacin. En condiciones de escasez de
nutrientes, la levadura utiliza otras rutas metablicas que le permiten obtener un
mayor rendimiento energtico, y por tanto no realiza la fermentacin. Bsicamente
el proceso de fermentacin se lleva a cabo cuando esta levadura se encuentra en
un medio muy rico en azcares, como la sacarosa, y es por ello que en su
metabolismo necesita sintetizar una enzima que catalice la hidrlisis de sacarosa
en glucosa y fructosa, siendo una fuente productora de invertasa.

Invertasa. La invertasa, tambin conocida como sacarasa, es una enzima de


inters industrial utilizada en la hidrlisis de sacarosa para la obtencin de jarabes
fructosados, los cuales son empleados ampliamente en la industria de los
alimentos como en la industria refresquera, la de conservas, lcteos, pastelera y
confitera.

La invertasa desdobla la sacarosa en fructosa y glucosa, donde a la mezcla


resultante de estos se le denomina azcar invertido debido a la inversin de sus
propiedades pticas de una rotacin positiva a una negativa. Tambin se cambian
las propiedades qumicas, por ejemplo, en el caso de la sacarosa, el tipo de
enlace que subsiste entre sus molculas entrelazadas ( para la glucosa y para
la fructosa) impide que dicha molcula contenga terminales reductores, por lo que
al hidrolizarse, estas molculas que quedan libres recuperan su poder reductor.

Esterilizacin de medios de cultivo. Una fermentacin se debe llevar a cabo, en


general, en un medio ambiente controlado, independientemente de que el
propsito sea de investigacin acadmica, desarrollo de producto o proceso. Esto
implica que debe garantizarse el crecimiento del microorganismo, as como la
obtencin del producto deseado (clulas y/o metabolitos) libres de contaminacin
biolgica. De ah que la esterilizacin sea una parte del proceso de fermentacin
que permite alcanzar este objetivo.

Objetivo general

Adquirir los conocimientos prcticos para producir una enzima extracelular por
medio de una fermentacin con clulas libres en medio lquido.

Objetivos especficos

1. Producir invertasa con clulas libres de levaduras en cultivo sumergido.


2. Monitorear y obtener la cintica de crecimiento de biomasa, de consumo de
sustrato y de produccin de enzima.
3. Determinar la actividad cataltica de la invertasa.
4. Establecer las constantes cinticas (Km, Vmax) de la invertasa.

La prctica se divide en tres secciones: La primera, consiste en la preparacin del


medio y la esterilizacin del biorreactor con el medio; la segunda, es el
seguimiento del cultivo con Saccharomyces cerevisiae; y por ltimo, la
determinacin de la produccin de enzima.
Materiales:

- Vasos de precipitado de diferentes volmenes


- Barras magnticas para agitacin (mosca)
- Esptula
- Piseta
- Piseta con alcohol
- Jeringa de 50 mL estril
- Mechero de alcohol
- Guantes de asbesto
- Pipetas de 1 y 10 mL
- Tubos falcon de 50 mL
- Portaobjetos
- Cubreobjetos
- Filtros de celulosa de 0.45
- Pinzas para papel filtro (diseccin o planas)
- Tiras de pH
- Pipetas Pasteur

Reactivos:

- Medio de cultivo para levaduras


- Solucin del reactivo DNS
- Solucin de glucosa, 2 g/L
- Solucin del reactivo de Bradford
- Solucin del reactivo de Anthrona
- Solucin de sacarosa, 20 g/L
- Solucin buffer a pH 4 y 7
- Solucin estril de cloruro de sodio, 9.5 g/L
- Colorantes y soluciones para tincin de Gram
- Solucin de H3PO4 1 N
- Solucin de NaOH 1 N
- Antiespumante

Equipos:

- Biorreactor de laboratorio New Brunswick Scientific modelo Bioflo/CelliGen 115


de jarra de 3 L con su mdulo de control, partes y electrodos.
- Centrfuga para tubos falcn de 50 mL
- Balanza analtica
- Espectrofotmetro visible
- Incubadora orbital con control de agitacin y temperatura
- Autoclave elctrica
- Campana de flujo laminar
- Microscopio ptico
- Agitador Vortex
- Potencimetro
- Parrilla de agitacin
- Bao de agua con control de temperatura
- Bomba de vaco
- Kit de filtracin

Desarrollo esperimental:

A) Preparacin del medio de cultivo

1. Preparar 2 L de medio de cultivo para levadura, composicin por litro de medio:

Sacarosa, 20 g; Bactotriptona, 5 g; NaH 2PO4, 0.3 g; Na2HPO4, 0.3 g; (NH4)2SO4,


0.5 g; NaCl, 0.3 g. Ajustar a pH a 6.5.

2. Verter en el biorreactor el medio de cultivo sin esterilizar.


3. Esterilizar en la autoclave:
1 Verificar que la autoclave contenga agua hasta el nivel marcado.
2 El biorreactor con todo y su contenido se introduce a la autoclave. Verificar que
la salida de aire del biorreactor est abierta, de lo contrario se corre el riesgo
de que el biorreactor o alguna de sus partes se rompan durante el proceso de
esterilizacin.
3 Cerrar la puerta de la autoclave
4 Encender la autoclave para provocar la generacin de vapor.
5 Verificar que la salida de la vlvula de purga se encuentre totalmente abierta,
de esta forma, el aire contenido en la autoclave ser excluido por el vapor que
se genera.
6 Una vez que el vapor generado se escapa de forma importante por la vlvula
de salida de la autoclave, se cierra.
7 Esperar que la presin dentro de la autoclave sea de 1.05 Kg/cm 2 o 15 lbs
(indicado por el medidor de presin) que equivale a 121C (indicado por el
medidor de temperatura) y mantener (por medio del apagado y encendido de la
autoclave o controlando la flama) durante 20 minutos.
8 Posterior al proceso de esterilizacin apagar o cerrar el gas y esperar a que la
presin llegue a 0.1Kg/cm 2 abrir lentamente la vlvula de salida y dejar escapar
el vapor que an no se ha condensado. Evitar que la presin caiga por debajo
de cero (bajo vaco), ya que ello provoca riesgos de contaminacin del material
ya esterilizado.
9 Abrir la puerta de la autoclave y con la ayuda de guantes de asbesto sacar el
biorreactor esterilizado.
4. Una vez esterilizado el biorreactor, dejar enfriar hasta temperatura ambiente
antes de utilizarlo.

B) Preparacin del inculo

Para la preparacin del inculo, se puede partir de un cultivo en tubo inclinado o


en placa, o tambin podra ser de un preinculo o precultivo lquido de la cepa
deseada. En el caso de levaduras puede ser de alguna presentacin comercial
como pasta o polvo.

Si la levadura proviene de una presentacin comercial, suspender en condiciones


aspticas 0.5 g de levadura en polvo en 50 mL de agua fisiolgica estril (9.5 g de
NaCl/L) y centrifugar a 8,500 rpm durante 10 minutos. Recuperar el precipitado y
nuevamente resuspender en 50 mL de solucin fisiolgica y centrifugar.
Resuspender en medio de cultivo estril e inocular el biorreactor con ayuda de una
jeringa de 50 mL.

Si la levadura proviene de una placa o tubo inclinado en agar, tomar una asada del
cultivo de Saccharomyces cerevisiae y se transfiere a un matraz de 150 mL con 50
mL de medio de cultivo nuevo y estril. Se incuba a 30C durante 12 h a 18 h con
una agitacin de 120 rpm.

Antes de inocular el biorreactor con el medio de cultivo ya estril, se prepara un


frotis de cada inculo y se tie con la tcnica de Gram para corroborar la pureza
del inculo.

C) Inoculacin y puesta en marcha del biorreactor

Posteriormente de confirmar la pureza del inculo y la esterilidad del medio, con


ayuda del profesor se proceder a inocular, con 50 mL del inculo, el biorreactor.
Antes de inocular se verifica que el medio de cultivo del biorreactor est libre de
contaminantes. Despus de inocular el biorreactor se toman muestras de 30 mL
para cada tiempo de acuerdo al programa de muestreo (Tabla 1).

La muestra del tiempo cero (T0) se toma justo despus de inocular el biorreactor.
Si en los tiempos T6 y T8, no hay cambios significativos en la evolucin del
crecimiento celular y en la produccin de invertasa, se procede a detener la
fermentacin.
Tabla 1. Programa de muestreo

Tiempo Hora* Horas


T0 (da 1) 10:00 0
T1 13:00 3
T2 16:00 6
T3 19:00 9
T4 22:00 12
T5 (da 2) 10:00 24
T6 13:00 27
T7 16:00 30
T8 19:00 33
* NOTA: El programa de muestreo anterior es una propuesta susceptible a
modificacin.

Condiciones de fermentacin: aireacin de 1 VVM, temperatura de 35C, pH


inicial de 6.5 y agitacin de 150 rpm.

De acuerdo al programa de muestreo, se ir llenando la Hoja de control de la


cintica de produccin de enzima con clulas libres (se anexa al final de la
prctica), con los datos de los parmetros establecidos.

Se evaluarn los siguientes parmetros para cada una de las muestras:

1. Realizar un frotis de cultivo del biorreactor para realizar tincin de Gram y


observar al microscopio, para comprobar pureza.
2. Leer la temperatura que marca el mdulo de control del biorreactor.
3. Determinar el pH del caldo de cultivo.
4. Establecer la biomasa por densidad ptica a 600 nm.
5. Establecer la concentracin de biomasa por peso seco.
6. Determinacin de la produccin de protena extracelular (invertasa) por medio
del mtodo de Bradford, utilizando al sobrenadante como muestra problema y
agua como blanco
7. Azcares totales del sobrenadante libre de clulas (mtodo de Anthrona).
8. Determinacin de la actividad enzimtica (mtodo DNS).

D) Al final de la fermentacin

- Detener la fermentacin apagando la agitacin y el mdulo de control. Cerrar el


flujo de agua de enfriamiento.
- Desmontar el biorreactor de su mdulo y esterilizarlo junto con su contenido
utilizando la autoclave elctrica, no olvidando dejar la salida de aire del
biorreactor abierta.
- Despus de la esterilizacin, desmontar el biorreactor y sus partes y efectuar
su limpieza.

E) REPORTE DE RESULTADOS

1. Elaborar una tabla de los datos obtenidos.


2. Elaborar una grfica de los resultados de biomasa obtenidos por densidad
ptica a 600 nm contra biomasa obtenida por peso seco (mg de biomasa
seca/mL de caldo de cultivo) a fin de determinar si existe una correlacin entre
estos parmetros.
3. Elaborar una grfica de los resultados de la produccin de biomasa (mg de
biomasa seca/mL), invertasa producida (mg de protena/mL) y consumo de
sustrato (mg de sacarosa/mL) contra tiempo (h).
4. Calcular los valores de velocidad especfica de crecimiento, produccin de
protena y consumo de sustrato, as como los rendimientos de producto (Yp/s)
y de biomasa (Yx/s) a partir de sustrato. Graficar los resultados obtenidos en
funcin del tiempo.
5. Determinar la actividad enzimtica de la invertasa (U/mL o U/mg protena) y
graficarla en funcin del tiempo (h).
6. Elaborar una grfica del monitoreo de pH y de la temperatura.
7. Discutir sobre el comportamiento de las cinticas, explicando lo que ocurri en
cada fase del cultivo.
8. Comparar los resultados obtenidos con los reportados en la literatura.
9. Anexar la Hoja de control de la cintica de produccin de enzima con clulas
libres utilizada durante el desarrollo de la prctica.

BIBLIOGRAFA:

- Bailey, J. E., and Ollas, D. F. (1986). Biochemical Engineering Fundamentals.


2nd Edition. McGraw-Hill International Editions. New York, USA. 984p.
- Doran, P. M. (1995). Bioprocess Engineering Principles. Academic Press. San
Diego, USA. 439p.
- Lpez, A., and Quintero, R. (1987). Tecnologa Enzimtica. UNAM. Mxico.
- Scragg, A. (1999). Biotecnologa para Ingenieros. Sistemas biolgicos en
procesos tecnolgicos. Editorial Limusa. Mxico.
- Segel H. I. (1976). Biochemical Calculations (How to solve mathematical
problems in general biochemestry). Editorial John Wiley & Sons. 2nd edition.
USA.
- Stanbury, P. F., and Whitaker, A. (1984). Principles of fermentation technology.
Pergamon Press. Oxford, USA. 255p.
- Vogel, H. C., and Todaro, C. L. (1997). Fermentation and biochemical
engineering handbook. 2nd edition. Noyes Publications. New Jersey, USA.
801p.