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Anlisis gentico de una mutacin inducida que confiere

resistencia a la imidazolinona en el girasol


ABSTRACTO
Las malezas afectan negativamente los rendimientos de girasol (Helianthus annuus L.) y hasta la fecha se
han desarrollado pocos mutantes que confieren tolerancia a herbicidas. Nuestros objetivos fueron identificar,
caracterizar y determinar la herencia de la resistencia a herbicidas en una nueva lnea de girasol derivada de
mutaciones resistentes a imidazolinona. Esta lnea se obtuvo mediante mutagnesis de semillas de
metanosulfonato de etilo y seleccin con cido {2 - [(RS) -4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2 il]
nicotnico de imazapir} de una poblacin M2 de casi 600.000 plantas. Un M2: 4 lnea homocigotos para el
rasgo fue seleccionado para estudios genticos y fue designado como CLHA-PLUS. Esta lnea mutante
posee niveles ms altos de tolerancia al imazapir e imazamox {2 - [(RS) -4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-
imidazolin-2-il] -5metoximetilnicotnico} que el observado en las lneas de girasol Llevando el ya descrito
gen Imr1 que se remonta a las poblaciones silvestres. A partir del anlisis de las poblaciones F1, F2 y BC1
F1, se concluy que la resistencia en CLHA-PLUS se hereda como un solo gen nuclear parcialmente
dominante. Una prueba de alelismo realizada con dos tasas de aplicacin de herbicida diferentes y una
prueba de cosegregacin de resistencia a un marcador de repeticin de secuencia simple perfecto para el gen
AHASL1 de girasol nos permiti concluir que la mutacin presente en CLHA-PLUS es diferente de Imr1 y
que ambas Son variantes allicas del locus AHASL1.

Se ha demostrado que la clase de herbicidas imidazolinona (IMI) tiene un amplio espectro de actividad de
control de malezas, flexibilidad en el momento de aplicacin, tasas de uso bajas y toxicidad baja para
mamferos (Tan et al., 2005). Estos herbicidas inhiben la actividad enzimtica de la acetohidroxicido sintasa
(AHAS, EC 4.1.3.18 tambin conocida como acetolactato sintasa, Shaner et al., 1984), la primera enzima en
la va para la sntesis de los aminocidos de cadena ramificada valina, leucina y Isoleucina (Singh, 1999).
Esta misma enzima ha demostrado ser el sitio de accin de las sulfonilureas (SU) (Ray, 1984),
triazolopirimidinas (Subramanian y Gerwick, 1989), pirimidiloxibenzoatos (Subramanian et al., 1990) y
sulfonilaminocarbonil-triazolinonas (Santel et al. Al., 1999).

En muchas especies se han descubierto plantas tolerantes a imidazolinona con genes y enzimas AHAS
alterados, lo que permiti el desarrollo y comercializacin de varios cultivos tolerantes al IMI (Tan et al.,
2005). Se han producido con xito plantas resistentes a uno o ms de estos herbicidas a partir de semillas,
microsporas, polen y mutagnesis de callos, o seleccin de clulas somticas en maz (Zea mays L.)
(Newhouse et al., 1991), Arabidopsis thaliana .) Heynh. (Haughn y Somerville, 1986, Sathasivan et al., 1991,
Mourad et al., 1993), la remolacha azucarera (Beta vulgaris L.) (Hart et al., 1992, Wright y Penner, 1998),
canola (Brassica napus L (Swanson et al., 1989), el algodn (Gossypium hirsutum L.) (Subramanian et al.,
1990, Rajasekaran et al., 1996), la soja [Glycine max (L.) Merr. , 1989), el tabaco (Nicotiana tabacum L.)
(Chaleff y Ray, 1984, Creason y Chaleff, 1988) y el trigo (Triticum aestivum L.) (Newhouse et al., 1992;
Pozniak y Hucl, 2004). La resistencia en la mayora de estos casos se debe a una forma de la enzima de la
subunidad grande de AHAS (AHASL) que es menos sensible a la inhibicin de herbicida y que es conferida
por un solo gen nuclear parcialmente dominante (Tan et al., 2005).
Se han descubierto poblaciones de girasol silvestre (Helianthus annuus L.) resistentes a IMI o SU (AlKhatib
et al., 1998, White et al., 2002). El rasgo resistente a los herbicidas se introgres en lneas endogmicas de
girasol de lite mediante mtodos de cra convencionales con el propsito de desarrollar y desplegar
cultivares resistentes al IMI y resistentes al SU (Miller y al-Khatib, 2002, 2004). El gen IMI-resistente
(Imr1) se introdujo de una poblacin silvestre salvaje recogida en Kansas (EE.UU.) en la lnea HA425.
Estudios de Bruniard
Y Miller (2001) demostraron que este gen era parcialmente dominante. El grado de resistencia en esta lnea
fue afectado por un segundo gen (Imr2) en algunos antecedentes genticos (Bruniard y Miller, 2001;
Kolkman et al., 2004). Sobre la base de estudios moleculares, Kolkman et al. (AHASL1, AHASL2 y
AHASL3) y demostraron que los genes resistentes al IMI y SU eran variantes allicas del mismo locus
(AHASL1). De hecho, AHASL1 de endogmicos resistentes al IMI como HA425 alberga una mutacin de C
a T en el codn 205 (nomenclatura de A. thaliana), mientras que AHASL1 de endocrinas resistentes a SU
alberga una mutacin de C a T en el codn 197 (Kolkman et al. Al., 2004). Las mutaciones puntuales que
resultan en sustituciones de prolina (Pro) 197 confieren altos niveles de resistencia SU con slo pequeos
aumentos de resistencia a los IMI y las triazolopirimidinas (Haughn et al., 1988, Lee et al., 1988, Guttieri et
al., 1992, 1995, Harms et al., 1992, Mourad y King, 1992, Wright y Penner, 1998). Las sustituciones de
alanina (Ala) 205, por otro lado, confieren resistencia moderada a todos los inhibidores de AHAS
(Woodworth et al., 1996; Jander et al., 2003). Este moderado nivel de resistencia debe ser mejorado con otros
factores genticos (como el gen Imr2) para obtener niveles aceptables de tolerancia. Esta interaccin entre el
gen de resistencia y el antecedente gentico, actualmente necesario para alcanzar niveles comerciales de
tolerancia, podra ser eliminada por el descubrimiento de mutaciones que confieren niveles superiores de
tolerancia a herbicidas. Por esta razn iniciamos un programa de mejoramiento de mutagnesis dirigido a
descubrir nuevas fuentes de resistencia a IMIs en girasol. Los objetivos de este trabajo fueron: (i) identificar
y caracterizar una nueva lnea de girasol derivada de la mutacin resistente al IMI, y (ii) determinar la
herencia de resistencia IMI en esta lnea y las relaciones allicas con los genes de resistencia previamente
caracterizados.

MATERIALES Y MTODOS

Mutagnesis de semillas y
Seleccin de Plantas Resistentes

Aproximadamente 60.000 semillas de la lnea mantenedora experimental BTK47 se trataron con


metanosulfonato de etilo al 0,25% (v / v) en buffer de fosfato de potasio 0,1 M (pH 7) durante 15 a 25 C.
Despus de este tratamiento, las semillas se remojaron en una solucin al 1,5% (p / v) de tiosulfato de sodio
durante 0,5 h, se lavaron continuamente con agua del grifo durante 1 h, se secaron sobre toallas de papel y se
sembraron en el campo. Las plantas que surgieron de estas semillas fueron plantas de generacin M1. Se
cosecharon semillas de M2 de estas plantas al vencimiento. Se sembraron 20 semillas de cada capitel en
condiciones de invernadero en la siguiente generacin y se pulverizaron en la etapa V2 a V4 (Schneiter y
Miller, 1981) con imazapir {2 - [(RS) -4 isopropil-4-metil-5-oxo- 2 - imidazolin - 2 - il] nicotnico} a una
velocidad de 80 g de ai Ha-1 en un volumen de pulverizacin de 100 L ha-1. Se identificaron ocho plantas
resistentes a M2 pertenecientes a diferentes familias, autofecundadas y cosechadas individualmente. Se
sembraron veinte semillas de cada una de estas plantas M2 resistentes bajo condiciones de invernadero y se
pulverizaron con imazapir en la etapa V2 a V4. Siete de las ocho familias M2: 3 slo dieron progenie
susceptible y fueron consideradas como escapes. El tratamiento de las plntulas M3 de la planta S4897-1
produjo tres fenotipos distintos: un fenotipo resistente (R) sin lesin (seis plantas); Un fenotipo intermedio
(I) con reduccin de altura en comparacin con la lnea original BTK47 utilizada como control (13 plantas);
Y un fenotipo susceptible (S) que se mat (cinco plantas). Plantas frtiles resistentes fueron auto-polinizadas
y cosechadas individualmente. Las seis lneas M2: 4 resultantes se cultivaron bajo condiciones de campo, se
tamizaron con imazapyr (160 g a.i. ha-1) para confirmar el fenotipo resistente, autofecundarse y cosecharse.
M2: 4 lneas fueron homocigotos para el rasgo, ya que la prueba de progenie no detect segregacin para la
resistencia a imazapyr. Una de las lneas, muy parecida a la lnea original BTK 47 en otros atributos, fue
seleccionada para estudios genticos y fue designada como CLHA-PLUS.

Nivel de Resistencia Relativa


De CLHA-PLUS a Imidazolinones
Se sembraron las semillas de CLHA-PLUS, las lneas consanguneas que portaban el gen IMR resistente
Imr1, HA425 y RHA426 (Miller y AlKhatib, 2002) y se sembraron las lneas susceptibles RHA801 (una
lnea restauradora desarrollada por Roath et al., 1981) y BTK47 En macetas bajo condiciones de
invernadero. Se pulverizaron al menos 20 plantas de cada lnea con cuatro dosis diferentes de imazapir (sin
tratamiento, 80 g ia ha-1, 160 g ai ha-1 y 320 g ai ha-1) e imazamox {2 - [(RS (Sin tratamiento, 50 g de ia
ha-1, 100 g de ma ha-1 y 200 g de ai-ha-1) 1) en la etapa V2 a V4. Los fenotipos se puntuaron 14 das
despus del tratamiento como R (sin sntomas) o S (plantas muertas).

Herencia de Imazapyr
Resistencia en CLHA-PLUS

Las plantas CLHA-PLUS fueron cruzadas con las lneas endgenas susceptibles BTK47 y RHA801. Las
plantas F1 hbridas derivadas de estos cruces se auto-polinizaron y retrocruzaron a los padres susceptibles
para obtener las generaciones F2 y BC1 F1, respectivamente. Semillas de los padres susceptibles, CLHA-
PLUS y F1, F2 y BC1 F1 generaciones fueron sembradas en condiciones de invernadero y fueron desafiados
con 80 g a.i. Ha-1 de imazapyr en la etapa V2 a V4. Los fenotipos se puntuaron 14 das despus del
tratamiento como R, S o I. Las plantas se puntuaron como R si no mostraban dao herbicida, S si murieron o
I si presentaban reduccin de altura o clorosis.

Prueba de Alelismo

Las plantas CLHA-PLUS se cruzaron con HA425 para determinar si la mutacin inducida en CLHA-PLUS
es allica a Imr1, la mutacin ya descrita en lneas consanguneas resistentes al IMI. Las plantas hbridas F1
fueron auto-polinizadas y retrocruzadas a HA425 para obtener las generaciones F2 y BC1 F1,
respectivamente. Las semillas de los padres y F1, F2 y BC1 F1 fueron desafiadas con 80 g a.i. Ha - 1 y 160 g
a.i. Ha-1 de imazapir en la etapa V2 a V4 y se anot como se ha descrito anteriormente.

Cosegregacin Haplotipo AHASL1


Con resistencia a los herbicidas

Se aisl ADN a partir de hojas jvenes de las lneas BTK47, CLHAPLUS y HA425, as como de plantas F1
y F2 individuales de la cruz CLHA PLUS / HA425 usando el mtodo de Dellaporta et al. (1983). Los
fragmentos del gen AHASL1 fueron amplificados mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
usando los cebadores p-AHAS18 y p-AHAS19 (Kolkman et al., 2004). Los productos de reaccin en cadena
de la polimerasa se amplificaron en una reaccin de 15 L que contena 1 g de DNA polimerasa Taq
(Biotools, Madrid), 70 ng de ADN de girasol genmico, 25 g de albmina de suero bovino, con una
concentracin final de 100 M de dNTP, 0,25 M de Cada cebador, TrisHCl 90 mM pH 8, (NH 4) {2 SO 4}
20 mM y MgCl{2} 2,5 mM. El programa de PCR consisti en una etapa de desnaturalizacin inicial a 94 C
durante 2 min, seguida de 40 ciclos de 30 s a 94 C, 30 s a 56 C y 30 s a 72 C, seguido por una etapa de
alargamiento final A 72 C durante 10 min. Los productos de amplificacin (3 L por carril) se separaron en
un gel de secuenciacin estndar que contena 6% de poliacrilamida, urea 8 M y 1 TBE, a potencia
constante de 60 W durante 2 a 3 h, y se detectaron mediante tincin con nitrato de plata (Silver Sequence
Promega Biotech, Madison, WI). El tamao de cada alelo de secuencia simple (SSR) se estim usando un
marcador de peso molecular y una reaccin de secuenciacin estndar en lneas adyacentes del gel.

RESULTADOS Y DISCUSIN
Como en muchos otros casos reportados en la literatura para diferentes especies (Haughn y Somerville, 1986,
1990, Heim et al., 1989, Pickett et al., 1990, Sebastian et al., 1989, Newhouse et al., 1992, Pozniak Y Hucl,
2004), se demostr que el cribado de progenie de semillas tratadas con un mutgeno era un mtodo eficaz
para identificar mutaciones tolerantes a herbicidas en girasol, como el que se encuentra en la lnea CLHA-
PLUS descrita aqu.

Nivel de Resistencia Relativa a Imidazolinonas en CLHA-PLUS

Las plantas de las lneas susceptibles (RHA801 y BTK47) murieron de 6 a 7 das despus del tratamiento a
cualquier dosis de aplicacin de imazamox o imazapyr (Tabla 1). Las lneas que llevaban el alelo Imr1
(HA425 y RHA426) eran completamente resistentes a velocidades de herbicida de 80 y 160 g a.i. Ha-1 de
imazapir o 50 y 100 g de a.i. Ha - 1 de imazamox. Estos resultados son consistentes con los observados por
Bruniard y Miller (2001) para HA425 a una tasa de imazamox de 35 y 70 g a.i. Ha-1 y con la prctica actual
de control de malezas para girasoles Clearfield, que son homocigticos para el alelo Imr1. Sin embargo, a
mayor tasa de aplicacin de imazapyr (320 g ia ha-1) o imazamox (200 g ai ha-1), las plantas de HA425 y
RHA426 desarrollaron clorosis y retraso del crecimiento y finalmente murieron con la quema completa del
pice (Tabla 1) . Por el contrario, las plantas de CLHA-PLUS fueron completamente resistentes y no
mostraron sntomas de clorosis o necrosis 14 das despus del tratamiento, incluso a las tasas ms altas de
aplicacin de ambos herbicidas (Tabla 1). Estos resultados indican que CLHA-PLUS posee un mayor nivel
de resistencia a IMIs que el observado en lneas que transportan Imr1 de poblaciones de girasol silvestre.
Herencia de la resistencia a la imidazolinona en CLHA-PLUS
A una velocidad de aplicacin de imazapir de 80 g a.i. Ha-1, las plantas de CLHA-PLUS, BTK47, RHA801,
y sus F1, F2 y BC1 F1 poblaciones fcilmente podra ser puntuada en una de las tres clases fenotpicas
discretas (R, I o S) 14 das despus de la aplicacin de herbicidas. Se us HA425 como control en todos los
experimentos y produjo consistentemente un fenotipo resistente cuando se pulveriz con 80 g a.i. Ha-1 de
imazapyr, mientras que BTK47 y RHA801 murieron. Las plantas F1 de la cruz CLHA-PLUS / BTK47 y
CLHA-PLUS / RHA801 fueron fenotpicamente intermedias entre sus padres, ya que mostraron una
reduccin en altura en comparacin con plantas tratadas de CLHA-PLUS o plantas de control no tratadas de
los padres susceptibles. No se observaron diferencias fenotpicas entre plantas F1 derivadas de cruces
recprocos, lo que indica que la resistencia a imazapir en CLHA-PLUS no es heredada citoplasmticamente
(Tabla 2). Se realiz una prueba de herencia citoplsmica en la generacin de F2 probando la homogeneidad
de las desviaciones de las relaciones de segregacin entre las dos poblaciones recprocas de F2. Chi-
cuadrado anlisis no revel desviaciones significativas entre las poblaciones recprocas (Tabla 2], lo que
confirma la ausencia de la herencia citoplsmica. Las poblaciones F2 resultantes de cruces resistentes
resistentes dieron un buen ajuste a una relacin R / I / S 1: 2: 1, indicando la segregacin de un solo gen para
resistencia al imazapir. Para confirmar estos resultados de las poblaciones de F2, las plantas F1 se sometieron
a ensayo cruzado a los padres susceptibles y la progenie resultante se evalu para la reaccin al imazapyr.
Las poblaciones de BC1 F1 dieron un buen ajuste a una relacin I / S 1: 1, confirmando la hiptesis de locus
nico (Tabla 2). Los resultados del estudio gentico indican que la resistencia en CLHA-PLUS se hereda
como un rasgo parcialmente dominante conferido por un solo gen codificado nuclear. Este patrn de herencia
es consistente con otros hallazgos que han reportado el control gentico de la resistencia a los herbicidas que
inhiben AHAS. En el maz, la soja, el A. thaliana, el trigo y el tabaco, la resistencia a los inhibidores de
AHAS es parcialmente dominante y se hereda como un nico gen nuclear (Chaleff y Ray, 1984, Sathasivan
et al., 1991). En contraste con este resultado, la resistencia a la imazamox encontrada en poblaciones de
girasol silvestre no es conferida por un solo gen (Miller y Al-Khatib, 2002). El alelo Imr1 en el girasol es
parcialmente dominante y no confiere resistencia completa a los herbicidas IMI (Bruniard y Miller, 2001;
Kolkman et al., 2004). De hecho, un segundo gen (Imr2) con un efecto modificador cuando el gen principal
Imr1 est presente es necesario para lograr una resistencia completa (Bruniard y Miller, 2001).

Prueba de Alelismo

Para determinar la relacin entre el gen de resistencia presente en las poblaciones de CLHA -PLUS e Imr1,
F1, F2 y BC1 F1 de la cruz CLHA PLUS / HA425 se evaluaron dos tasas de aplicacin de herbicidas (80 y
320 g ai ha-1) de imazapir . Si los genes de resistencia en CLHAPLUS y HA425 estn en el mismo locus, no
se observara progenie intermedia o susceptible en una poblacin F2 resultante del cruce de las dos lneas
resistentes, cuando se evalu a menor velocidad. No se observaron plantas sensibles en las poblaciones F2 y
BC1 F1 resultantes de este cruce cuando la progenie se evalu a una menor tasa de herbicida (Tabla 3),
indicando que los genes de resistencia en CLHA-PLUS y HA425 son alelos del mismo locus. Cuando las
poblaciones F2 y BC1 F1 fueron puntuadas a la tasa de herbicida ms alta (320 g a.i. ha-1) que discrimina a
ambos padres (Tabla 1), se observ segregacin de susceptibilidad. Slo se pudieron detectar dos clases
fenotpicas, una clase resistente compuesta de plantas sin ninguna lesin o sntomas leves y un fenotipo
susceptible que muri como la lnea de control HA425. Las relaciones de segregacin observadas sobre 450
plantas F2 examinadas no eran significativamente diferentes de una relacin de segregacin 3: 1 (Tabla 3).
Para confirmar estos resultados, las plantas F1 fueron retrocruzadas a HA425 y las plantas BC1 F1
resultantes se tamizaron a 320 g a.i. Ha - 1 de imazapir. Las relaciones de segregacin observadas dieron un
buen ajuste a una relacin R / S 1: 1, confirmando que el gen resistente en CLHA-PLUS mostr dominancia
completa sobre el gen resistente en HA425 y que ambos eran alelos del mismo locus, AHASL1. Para
confirmar estos resultados, se utiliz un marcador molecular. El gen AHASL1 en girasol presenta un
polimorfismo SSR que permite la discriminacin de las lneas que llevan el alelo Imr1 de cualquier otro
genotipo de girasol (Kolkman et al., 2004). La amplificacin de la reaccin en cadena de la polimerasa del
fragmento del gen AHASL1 que contiene este SSR usando los cebadores p-AHAS18 y p-AHAS19 produjo
un producto de 321 pb para CLHA PLUS y BTK47 y un fragmento de 312 pb para HA425. Esta longitud
variante polimorfismo detectado en CLHA PLUS y HA425 se explot para investigar la segregacin en el F2
y BC1 F1 poblaciones derivadas de cruzar ambas lneas. Se seleccionaron al azar 80 plantas de la poblacin
F2 y 50 plantas de la poblacin BC1 F1, muestreadas para aislamiento de ADN, desafiadas con una tasa de
aplicacin de imazapir de 320 g a.i. Ha-1, y genotipo utilizando este marcador. En la poblacin F2, 22
plantas fueron sacrificadas por el herbicida (S) y 58 no mostraron sntomas o una lesin leve (R) (Tabla 4).
La relacin de segregacin observada para la resistencia no fue significativamente diferente (P <0,61) de la
razn de segregacin esperada para un factor completamente dominante segregando en F2 (3R / 1S). La
segregacin observada para el marcador AHAS1 SSR (19 A / A: 39 A / B: 22 B / B) se ajusta a una relacin
de segregacin esperada para un marcador codominante que segrega en F2 (1: 2: 1, P <0,87). Todas las
plantas susceptibles genotipadas para el AHAS1 SSR fueron homocigotos para el haplotipo HA425 (B / B),
mientras que las plantas R fueron heterocigotos (A / B) o homocigotos para el haplotipo CLHA -PLUS (A /
A) . La cosegregacin de los fenotipos de resistencia a los herbicidas y haplotipos AHAS1 se evalu
adicionalmente en 50 progenie BC1 F1 segregando por resistencia. Las relaciones de segregacin observadas
para la resistencia se ajustaron a una relacin 1: 1 (P <0,78) como se esperaba para la segregacin de un
locus en BC1 F1. AHAS1 SSR haplotipos completamente cosegregated con fenotipos para la reaccin de
herbicida, 23 A / B: 27 B / B. Las progenies susceptibles fueron homocigticas para el haplotipo HA425 (B /
B), mientras que la progenie resistente fue heterocigtica para HA425 y haplotipos CLHA-PLUS (A / B).
Estos resultados confirman que el gen resistente en CLHAPLUS es diferente del gen de resistencia en
HA425 y que ambos son variantes allicas del locus AHASL1. El anlisis bioqumico y secuencial de esta
nueva mutacin se publicar en otra parte.

CONCLUSIONES

El nivel de resistencia relativa a IMIs en CLHA-PLUS fue mayor que el observado en las lneas resistentes al
IMI que portaban el alelo Imr1 de poblaciones de girasol silvestre. El rasgo de resistencia en esta nueva lnea
se hereda como un nico gen nuclear parcialmente dominante. Tanto una prueba de alelismo como un
anlisis de la cosegregacin de resistencia y un marcador AHASL1 confirmaron que el alelo mutante
presente en CLHA-PLUS es diferente de Imr1 y que ambos son variantes allicas del locus AHASL1 de
girasol.