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Cdigo 123- LAA-INT-53

VICERRECTORIA DE INVESTIGACIONES, Versin 1


Fecha 18/09/12
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INSTRUCTIVO PARA CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO


MTODO ECOMTRICO

Describir la metodologa empleada para realizar el control de calidad a los medios de


cultivo destinados para los diversos anlisis microbiolgicos realizados por el laboratorio
de aguas y alimentos de la Universidad Tecnolgica de Pereira

1. CONTENIDO
El anlisis microbiolgico es una herramienta fundamental para el monitoreo y control de
calidad en los diversos procesos productivos , permitiendo determinar los focos de
contaminacin por los cuales se est generando un producto deficiente, adems de ser
clave para el manejo, monitoreo y control de sistemas en los cuales la inocuidad de los
productos sea uno de los principales objetivos; estos anlisis se realizan de manera
rutinaria en muchas empresas para determinar la aptitud en los productos generados.

Basados en la naturaleza del producto, se aplican diversos protocolos, los cuales


permitirn aislar microorganismos de inters, y que son comunes encontrar en este, si se
han presentado falencias en las etapas de procesamiento y elaboracin, pudiendo llegar
a ser nocivos para los consumidores; a razn de lo anterior, los resultados obtenidos del
anlisis microbiolgico son determinantes.

Conociendo la gran responsabilidad que tienen los laboratorios de microbiologa al dar un


dictamen final, se hace necesario realizar pruebas de verificacin que certifiquen el
perfecto estado de los equipos, materiales, y reactivos que se usan a la hora de ejecutar
dichos anlisis.

Para evaluar un medio de cultivo se realiza frecuentemente una tcnica llamada Mtodo
Ecomtrico, el cual fue descrito por Mosselt et al., 1983, y que permite medir la
Productividad que es la capacidad de los medios de cultivo para favorecer el crecimiento
y desarrollo de un microorganismo, esta caracterstica se determina a travs de la
comparacin que se realiza entre el medio por evaluar y un medio control (Soler, 2006).
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Otro aspecto es la Selectividad referida a la resistencia que genera el medio de cultivo a


la colonizacin por microorganismos interferentes o indeseados ( Doyle, et al., 1997 ;
Villalobos et al.,2007)

Figura 1 Representacin grfica de marcaje y siembra en mtodo ecomtrico

Nota: Realizar el mismo procedimiento tanto para el medio prueba como el medio de
referencia, al realizar esto se verifica la productividad del medio y, con el ensayo
del microorganismo interferente , se determinara la selectividad.

2. INFORMACION ANTES DE INICIAR EL PROCESO

Para llevar a cabo la prueba de control de calidad de medios de cultivo (Mtodo


Ecomtrico), se usa como medio de referencia, aquel medio de cultivo cuya composicin
sea muy completa y permita el crecimiento de un gran numero de microrganismos; tales
medios pueden ser: Agar tripticasa de soya, Agar BHI, Agar nutritivo, Agar Standard plate
Count.
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Al momentos de incubar las pruebas tener en cuenta los requerimientos tales como
temperatura, atmsfera (Presencia o ausencia de oxgeno), tiempo de incubacin del
microorganismo prueba e interferente para as contar con resultados reales.

2.1. Interferencias.
Se pueden presentar interferencias en la lectura final debido a la manipulacin de material
y reactivos no estriles o contaminacin por agentes presentes en la atmsfera. Influyen
tambin factores como la temperatura y tiempo de incubacin, adems se puede
presentar contaminacin de la muestra.

2.2 Condiciones Ambientales.


Los cultivos de organismos infecciosos deben realizarse en cabina de flujo laminar
inoxidable y/o en un rea de trabajo previamente desinfectada. Las mesas de trabajo
deben ser superficies lisas fciles de limpiar y desinfectar. Evitar las corrientes de aire y
restringir el paso de personas ajenas a la prctica en dicha rea. Trabajar en el rea de
esterilidad que genera un Bactoincinerador.

3. DESCRIPCIN DE MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

3.1. Reactivos

Medio de referencia
Agar BHI o Tripticasa de Soya o Standard Plate Count.
Medio prueba
Depende de los medios a los que se les realice la prueba.
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3.2 Materiales
Cajas Petri pequeas con 20 ml de medio de cultivo.
Asa Calibrada.
Caldo BHI

3.3 Equipos

Bactoincinerador ; Marca Mc Cormick Scientific; Cdigo de inventario 315141.


Cuenta Colonias; Marca JP Selecta, s.a, Serial 0456452, Cdigo de inventario
310981.
Vortex Mixer, marca Labnet International, Inc; Cdigo de inventario; 313581
Autoclave; Marca CI Dental XRAY SAS. Automat 3400
Incubadora a 22 C; Marca Velp SCIENTIFICA. Cdigo de inventario 310209
Incubadora a 37 C; Marca Binder; Cdigo de inventario 308742

MANIPULACIN Y ALMACENAMIENTO

Asegurar de que la ventilacin sea la apropiada. No respirar el polvo. Evitar


contacto con piel y ojos.

Conservar el envase hermticamente cerrado en un lugar seco y bien ventilado.


Proteger contra la humedad.

IDENTIFICACIN DE LOS PELIGROS

Clasificacin de la sustancia o de la mezcla REGLAMENTO (CE) No 1272/2008


No peligroso
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Clasificacin de acuerdo con las Directivas de la UE 67/548/CEE 1999/45/CE


Elementos de la etiqueta
R22 - Nocivo por ingestin
R37 - Irrita las vas respiratorias.
H302 - Nocivo en caso de ingestin
H335 - Puede irritar las vas respiratorias

3.1.1 Residuos Generados.

Cdigo de Cdigo de Riesgos Consejos de


Nombre
colector color especficos prudencia
Antes de descartar
Muestra Bolsa roja ----- Biolgico someter a
esterilizacin.

4. PROCEDIMIENTO

4.1 Preparacin de Caldo BHI

Disolver 37 g (CM1135, Oxoid) en Disponer 6 ml en tubos de ensayo de


INICIO 1000 ml de agua destilada. 10 ml, cerrar los tubos

Esterilizar en autoclave a 121


FINAL En caso de uso posterior
C, 15 Libras de presin, 15
almacenar a 4C.
minutos
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4.2 Preparacin Agar Standard Plate Count

INICIO Disolver 23,5 g de Agar Standard Plate Calentar ligeramente hasta observar
Count (OXOID,CM 0463) en 1L de agua
una completa disolucin del Agar
destilada.

Servir en cajas de Petri Llevar a 50 C Esterilizar en autoclave a 121 C, 15


previamente estriles Libras de presin, 15 minutos

Conservar a 4C, FINAL


hasta su uso

4.3 Preparacin Agar Nutritivo

Disolver 28 g de Agar Standard Calentar brevemente hasta


INICIO Plate Count (OXOID,CM 0003) en observar una completa disolucin
1L de agua destilada. del Agar

Servir en cajas de Petri Esterilizar en autoclave a 121 C, 15 Libras


previamente estriles Llevar a 50 C
de presin, 15 minutos

Conservar a 4C, hasta FINAL


su uso

4.4 Preparacin de inculo

INICIO A partir de la cepa contenida en


Incubar a 37C/ 18-24 Horas
caja de petri a 4C realizar un
repique a caldo BHI

FINAL
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MTODO ECOMTRICO

Nota: Transcurrido el periodo de incubacin realizar la prueba, de lo contrario mantener


en refrigeracin (No por mucho tiempo, ya que el inoculo debe ser fresco)

4.5 Mtodo Ecomtrico

Sembrar previamente los Dividir la base de las cajas petri en cuatro


INICIO microrganismos: cuadrantes y marcar cada uno de estos como
El de inters y el interferente 1, 2, 3, 4, trazar cinco estras en cada uno de
en caldo BHI e incubar durante ellos y una lnea en la interseccin de los
18-24 Horas a 37C. cuadrantes (Ver Fig 1).
(Por separado) para bacterias.

Con un asa tomar muestra del cultivo y proceder a


Disponer el medio prueba y medio
sembrar de acuerdo a la secuencia de rotulado de la
control (en sus respectivas cajas ya
caja 1,2,3,4 sin volver a tomar inculo, realizando
esterilizadas y esperar a que solidifique.
estras en forma paralela a las dibujadas en la base de
la caja Petri, por ultimo sembrar la lnea central (Ver
Fig1).

Incubar a la temperatura,
atmsfera y tiempo Transcurrido el tiempo de
indicado, segn sea el incubacin, realizar lectura de FIN
microorganismo resultados

5. CLCULOS Y RESULTADOS

Figura 1 Representacin grfica de marcaje y siembra en mtodo Ecomtrico


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Nota: Realizar el mismo procedimiento tanto para el medio de prueba como el medio de
referencia, al realizar esto se verifica la productividad del medio y, con el ensayo del
microorganismo interferente, se determinara la selectividad.

5.1 Lectura de resultados


Se considera vlida cualquier estra que tenga un crecimiento superior al 25% de la lnea
total, teniendo cada estra (Color Azul) un valor de 0,2 y la lnea central (Color Naranja) un
valor de 1, por lo tanto el valor mximo para crecimiento en este ensayo es de 5, y esto
es denominado ndice de Crecimiento Absoluto (ICA) (Tortora,1993 ; Mossel, 2003).

Por ello el Indice de Crecimiento Absoluto indica la productividad del medio de prueba,
para lo cual se considera que (Vase Tabla 1):

Tabla 1: Valores asignados para determinar la productividad de un medio de cultivo

ICA PRODUCTIVIDAD
4,5 - 5 ALTA
2,5 - 4,5 MEDIA
< 2,5 POCA
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0 NO
PRODUCTIVOS

El ICA permite determinar la selectividad del medio cuando se siembra en este, el


microorganismo interferente y para ello entre menos sea el valor del ICA mayor es la
selectividad del medio (Mossel et al., 1983).

Tabla 2: Valores asignados para determinar la selectividad de un medio de cultivo


ICA SELECTIVIDAD
4,5 - 5 NO HAY
SELECTIVIDAD
2,5 - 4,5 BAJA
< 2,5 MEDIA
0 ALTA

Existe otro parmetro que se considera y es el Indice de Crecimiento Relativo (ICR) el


cual determina la capacidad que posee el medio de prueba para recuperar la flora,
respecto al medio de cutivo control (Mossel, 2003).
Se determina aplicando la siguiente frmula:

6. DOCUMENTOS DE REFERENCIA
Doyle,M.P., Beuchat,L.R., Montville,T.J 1997. Food Microbiology : Fundamental and
frontiers. American Society For Microbiology Press.Washington D.C.
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Kornacki, J., Gurtler, J., Yan, Z. y Cooper, M. Evaluation of several modification of an


ecometric tecnique for assessment of media perfonrmance. Journal of Food Protection,
2003, 66 (9), 1727-32.

Michanie, S. Comparacin de tres mtodos empleados para la calidad de


medios de cultivo slidos. Acta Bioqumica Clnica Latinoamericana, 1992, 3, 311-7.
Mossel, D.A.A. Microbiologa de los alimentos, 2 edicin, Acribia, Zaragoza,Espaa,
2003, 703.

Mosselt, D. A. A., Rees, M .G., Bonants- V AN laarhoven, A., Ligtenberg-Merk, T. H. y


Werdle, M. 1983. Quality assurance of selective culture media for bacteria, moulds and
yeasts: an attempt at standardization at the international level. Journal of Applied
Bacterioioqy,54: 313-327.

Romero,M.L 2005. Validacin secundaria del mtodo de siembra en placa profunda para
aerbios mesfilos,hongos y levaduras, y ausencia/presencia de Salmonella sp., en
muestras de alimentos bajo el contexto de la norma ISO NTC 17025. Trabajo de grado.
Microbiologa Industrial. Pontificia Universidad Javeriana, Departamento de Microbiologa.
Bogot, Colombia.

Soler J.P. 2006. Validacin secundaria de nmero ms probable y recuento en placa para
coliformes totales y termotolerantes en muestras de ensalada y arroz basado en la norma
ISO NTC 17025. Trabajo de grado. Microbiologa Industrial. Pontificia Universidad
Javeriana, Departamento de Microbiologa. Bogot, Colombia.

Thermo SCIENTIFIC, Oxoid Microbiology Products, Disponible (on line)


http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM0463&c=UK&lang=EN
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Thermo SCIENTIFIC, Oxoid Microbiology Products, Disponible (on line)


http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM0003&c=UK&lang=EN

Thermo SCIENTIFIC, Oxoid Microbiology Products, Disponible (on line)


http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM1135&c=UK&lang=EN

Tortora,G.J.1993. Introduccin a la Microbiologa. Editorial Acribia S.A. Zaragoza,Espaa.

Villalobos, A., Calderon, L., Figueroa, C., Fierro, J. G., Otalora,R., Alvarez, B. et al. 2007.
Evaluacion por mtodo ecometrico de agar obtenido de algas rojas colombianas.
Universitas Scientiarum, 12 (III): 57-65.

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Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:

Personal UTP Jefe de Calidad Director del Laboratorio de Anlisis


de Aguas y Alimentos
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