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Centro de Bachillerato Tecnolgico

Industrial y de Servicios No. 107

Tema: Medios de cultivo y


bioqumicas

Alumno: Alberto Cuz Sosa.

Catedrtico: Q.C. Octavio Carmona Rodrguez.

Materia: Identifica microorganismos con base en


tcnicas bacteriolgicas.

Especialidad: Laboratorio Clnico.

Grado: Tercer Semestre. Grupo: CLC-M

Tuxtepec, Oaxaca
Fecha: 10/11/14
Medios de cultivo

Clasificacin de los medios de cultivo basndose en su composicin qumica

A.- Medios sintticos o qumicamente definidos. Llevan fuente de carbono, fuente


de nitrgeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca), otros elementos como son
estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella abortus) pero siempre a
concentraciones conocidas.

B.- Medios complejos o de composicin indefinida. Estos medios llevan


ingredientes como extracto de levadura, peptona, infusin de cerebro, extracto de
carne, etc. que contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la
composicin cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes.

C.- Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con aditivos


adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos
(particularmente hetertrofos exigentes). Ejemplo: adiccin de sangre, suero o
extractos de tejidos de animales y plantas.

D.- Medios selectivos. Son aquellos que favorecen por su diseo el crecimiento
especfico de un microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es de
gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una poblacin
microbiana mixta. Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para
auttrofos; adicionando cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram. (+);
utilizando maltosa como nica fuente de carbono slo crecern los que usen
maltosa.

E.- Medios diferenciales. Son aquellos destinados a facilitar la discriminacin de


microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento
en dichos medios. Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolticos de no hemolticos;
McConkey diferencia lactosa (+) de lactosa (-).

F.- Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento ptimo ya


que el crecimiento rpido y prolfico suele ocasionar la muerte rpida de las
clulas. Ejemplo: al aadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen
cidos, acidificndose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los
medios de mantenimiento.
Medios de cultivo

Base agar gelosa sangre

Medio para propsitos generales, para el aislamiento y cultivo de numerosos


microorganismos. Con la adicin de sangre, el medio es til tanto para el
aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente
exigentes a partir de una gran variedad de muestras, como para la observacin de
reacciones de hemlisis.

Tambin, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base para preparar
el medio agar chocolate.

Fundamento
Frmula (en gramos por litro) Instruccin
Infusin de msculo de 375.5 Suspender 31 g de polvo por litro de agua
corazn. destilada. Mezclar y dejar reposar 5 minutos.
Peptona. 10.0 Calentar suavemente agitando y hervir 1 o 2
Cloruro de sodio. 5.0 minutos hasta su disolucin. Distribuir y
Agar 15.0 esterilizar a 121 C durante 15.

pH final: 7.3 0.2

Es un medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus


requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores del desarrollo bacteriano.

La pluripeptona es la fuente de carbono y nitrgeno para el desarrollo bacteriano.

El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero


u otras sustancias para facilitar el cultivo de microorganismos exigentes.
Mueller Hintol agar

Este medio de cultivo ha sido recomendado universalmente para la prueba de


sensibilidad a los antimicrobianos. Adems es til con el agregado de sangre para
el cultivo y aislamiento de microorganismos nutricionalmente exigentes.

Frmula (en gramos por litro) Instruccin


Infusin de carne 300. Suspender 37 g del medio deshidratado en un
0 litro de agua destilada. Dejar embeber de 10 a
Peptona cida de 17.5 15 minutos. Calentar con agitacin frecuente y
casena hervir durante 1 minuto. Esterilizar a 121 C
Almidn 1.5 durante 15 minutos. Enfriar a 45 -50 C y
Agar 15.0 distribuir a cajas de Petri (o agregar los
suplementos que se desee) hasta un nivel de
4 mm sobre una superficie horizontal (25-30
ml en placas de 9 cm de dimetro).

pH final: 7.3 0.1

Fundamento

El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), recomend su uso en forma


rutinaria para la realizacin del antibiograma en medio slido, debido a una serie
de factores :

Presenta buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad,


Su contenido en inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina es
bajo,
La mayora de los patgenos crece satisfactoriamente

Cuando se suplementa con sangre de carnero al 5%, es til para realizar las
pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos en especies de estreptococos.
E.M.B agar
Este medio es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de
rpido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de
todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.

Frmula (en gramos por litro) Instruccin


Peptona 10.0 Suspender 36 g del polvo en un litro de agua
Lactosa 5.0 destilada. Reposar 5 minutos; mezclar,
Sacarosa 5.0 calentando a ebullicin durante 1 o 2 minutos
Fosfato dipotsico 2.0 hasta su disolucin. Esterilizar en autoclave a
Agar 13.5 no ms de 121 C durante 15 minutos. Enfriar
Eosina 0.4 a 45 C y distribuir agitando suavemente.
Azul de metilo 0.065
pH final: 7.2 0.2

Fundamento

Este medio combina las frmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para
obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y
otras especies de bacilos Gram negativos.

La diferenciacin entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y


aquellos que son incapaces de hacerlo, est dada por los indicadores eosina y
azul de metileno; stos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram
positivas.

Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un caracterstico


brillo metlico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia
azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras.

Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes


Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y
transparentes,

La siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans

Mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias
de color azul lavanda. esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de
acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporacin de azul de
metileno a sus membranas. En este medio se obtiene adems, un buen desarrollo
de especies de Salmonella y Shigella.
Sal y manitol agar
Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y
diferenciacin de estafilococos. Es recomendado para el aislamiento de
estafilococos patognicos a partir de muestras clnicas, alimentos, productos
cosmticos y otros materiales de importancia sanitaria.

Frmula (en gramos por litro) Instruccin


Extracto de carne 1.0 Suspender 111 g de polvo por litro de agua
Pluripeptona 10.0 destilada. Reposar 5 minutos y mezclar
d-Manitol 10.0 calentando a ebullicin durante 1 o 2 minutos.
Cloruro de sodio 75.0 Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121
Agar 15.0 C durante 15 minutos.
Rojo de fenol 0.025

pH final: 7.4 0.2


Tambin, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halfilas de
Vibrio, si no se dispone de medios apropiados (TCBS Medio, Medio Marino, etc.),
aunque algunas especies pueden no desarrollar.

Fundamento

Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina.

Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el


medio; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante.
Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una
zona roja o prpura. Las colonias sospechosas, se repicarn en un medio
sin exceso de cloruro de sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba
de la coagulasa.

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente


de carbono, nitrgeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono
fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentracin) es el
agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompaante, y el rojo fenol es
el indicador de pH. Las bacterias que crecen en un medio con alta concentracin
de sal y fermentan el manitol, producen cidos, con lo que se modifica el pH del
medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo.

Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar


el manitol. Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se
visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color. Los
estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas,
rodeadas de una zona del mismo color o prpura.
Salmonella Shigella agar
Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas
especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los
cuales se sospeche su presencia.

Frmula (en gramos por litro) Instruccin


Pluripeptona 5.0 Suspender 60 g del polvo por litro de agua
Extracto de carne 5.0 destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta
Lactosa 10.0 homogeneizar. Calentar a ebullicin durante
Mezcla de sales biliares 8.5 2 o 3 minutos. NO ESTERILIZAR EN
Lactosa 8.5 AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50 C y distribuir
Tiosulfato de sodio 8.5 unos 20 ml por placa. Secar la superficie del
medio unos minutos en la estufa.
Citrato frrico 1.0
Agar 13.5
Verde brillante 0.0003
3
Rojo neutro 0.025
pH final: 7.0 0.2

Fundamento

Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, esta dada por la


sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram
positivas, de la mayora de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp.

Es diferencial debido a la fermentacin de la lactosa, y a la formacin de cido


sulfhdrico a partir del tiosulfato de sodio.

Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar,


acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obtenindose colonias
rosadas o rojas sobre un fondo rojizo.

Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen


bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes. La produccin de
cido sulfhdrico se evidencia como colonias con centro negro debido a la
formacin de sulfuro de hierro.
Hektoen Entrico Agar.

Este es un medio ideal para el aislamiento selectivo de Salmonella y Shigella spp.,


a partir de heces y alimentos.
Frmula (en gramos por litro) Instrucciones
Proteosa peptona 12.0 Suspender 76 g del medio deshidratado
Extracto de levadura 3.0 en un litro de agua destilada. Dejar
Sales biliares 9.0 reposar de 10 a 15 minutos. Calentar y
Lactosa 12.0 hervir hasta lograr una disolucin
Sacarosa 12.0 completa. NO ESTERILIZAR EN
Salicina 2.0 AUTOCLAVE. Enfriar a 45C y distribuir
Cloruro de sodio 5.0 en cajas de Petri.
Tiosulfato de sodio 5.0
Citrato de hierro y amonio 1.5
Agar 14.0
Azul de bromotimol 0.065
Fucsina cida 0.1
pH final: 7.5 0.2

Fundamento

El medio de cultivo contiene sales biliares que inhiben el desarrollo de la flora


acompaante, y 2 sistemas indicadores: (i) azul de bromotimol y fucsina cida
como indicadores de la fermentacin de carbohidratos, y (ii) el citrato de hierro
como un indicador de la formacin de SH 2 a partir del tiosulfato.El desarrollo de
Shigella spp. es adecuado debido a que la inhibicin de estos microorganismos
por las sales biliares est disminuida por la adicin de cantidades relativamente
elevadas de peptona y carbohidratos.El medio de cultivo, permite una buena
diferenciacin de las colonias e inhibe el desarrollo de algunos coliformes y otras
bacterias no fermentadoras de lactosa, facilitando as la identificacin de
Salmonella y Shigella a partir de la muestra.

Agar chocolate base con MH


Frmula (en gramos por litro) Instrucciones
Extracto de carne bovina 2.0 Suspender 31 g de polvo por litro de agua
Hidrolizado cido de casena 17.5 destilada. Mezclar y dejar reposar 5 minutos.
Almidn 1.5 Calentar suavemente agitando y hervir 1 o 2
Hemoglobina 10.0 minutos hasta su disolucin. Distribuir y
IsoVitaleX 10.0 ml esterilizar a 121 C durante 15.
Agar 17.0
pH final: 7.3 0.2

BD Mueller Hinton Chocolate Agar (agar chocolate Mueller Hilton) se utiliza para
el aislamiento y cultivo de bacterias exigentes a partir de muestras clnicas.
Tambin se puede utilizar para las pruebas de sensibilidad de Neisseria
gonorrhoeae.

Fundamento

El isovitalex es un suplemento qumico de enriquecimiento desarrollado para


potenciar el crecimiento del Gonococo, Meningococo, Pneumococo y el
Haemophilus.

Este agar contiene GC agar base, Hemoglobina, e isovitalex. La base GC contiene


nutrientes un buffer fosfatado para mantener el pH, la Hemoglobina provee el
factor X a las especies de Haemophilus proporciona nutrientes y el factor V para
las especies de Haemophilus.

Cuando se le adiciona Bacitracina al medio lo hace selectivo para las especies de


Haemophilus, inhibiendo el crecimiento de Gram positivos y de Neisserias.

Agar verde brillante


Es un medio altamente selectivo utilizado para el aislamiento de mi-
croorganismos pertenecientes al gnero Salmonella con excepcin de la
Salmonella typhi.

Fundamento

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones


Extracto de levadura 3.0 Suspender los ingredientes en el agua
Dirigido pptico de tejido animal 5.0 destilada. Calentar agitando frecuentemente
Dirigido pptico de tejido vegetal 5.0 y dejar hervir hasta disolver completamente.
Lactosa 10.0 Esterilizar en autoclave a 121oC (15 lb de
Cloruro de sodio 5.0 presin) durante 15 minutos. Se debe evitar
Sacarosa 10.0 el sobrecalentamiento. Enfriar entre 45oC y
Rojo fenol 0.08 50oC, colocar 20 mL de medio por cada
Agar 20.0 placa y dejar solidificar. Este medio se debe
Verde brillante 0.125 preparar poco tiempo antes de su uso.
Agua destilada 1.000 ml
pH final: 6.9 0.2
En el medio de cultivo, la pluripeptona y el extracto de levadura, constituyen la
fuente de nitrgeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la sacarosa son los
hidratos de carbono fermentables, el rojo fenol es el indicador de pH, que vira al
amarillo cuando hay produccin de cido a partir de la fermentacin de azcares,
el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el verde brillante acta como
agente selectivo.

Mac Conkey agar


Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil
desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que
utilizan o no, lactosa en muestras clnicas, de agua y alimentos. Todas las
especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones


Peptona 17.0 Suspender 50 g del polvo por litro de agua
Pluripeptona 3.0 destilada. Reposar 5 minutos y mezclar
Lactosa 10.0 hasta uniformar. Calentar suavemente y
Mezcla de sales biliares 1.5 hervir 1 a 2 minutos hasta disolver.
Cloruro de sodio 5.0 Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15
Agar 13.5 minutos.
Rojo neutro 0.03
Cristal violeta 0.001
pH final: 7.1 0.2

Fundamento

En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el


desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla
de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el
desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Por fermentacin de la lactosa,
disminuye el pH alrededor de la colonia.

Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en
las colonias, y la precipitacin de las sales biliares.

Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

Pruebas bioqumicas
En el laboratorio disponemos de numerosas tcnicas para la caracterizacin
bioqumica de una especie.

Adems de los productos finales de los procesos metablicos, tambin se necesita


conocer con detalle como se producen estos cambios, como ocurren paso a paso
las reacciones qumicas, cules enzimas intervienen, cuales son los productos
intermediarios adems de que se deben reconstruir las secuencias de las
reacciones bioqumicas que tienen lugar dentro de la clula.

En general el microorganismo se cultiva en medios que contienen una sustancia


nutritiva especfica o sustrato y despus de la incubacin del cultivo se examina
para ver los cambios qumicos que hayan ocurrido.

Las pruebas bioqumicas consisten en distintos test qumicos aplicados a medios


biolgicos, los cuales, conocida su reaccin, nos permiten identificar distintos
microorganismos presentes.

Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad


de una va metablica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de
cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no.

Para realizar las pruebas bioqumicas se dispone de multiples medios, los cuales
se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio. De la
amplia variedad de pruebas bioqumicas, nosotros en laboratorio utilizaremos 10,
aplicados a 5 especies de microorganisos.

Adems estudiaremos los resultados que estos test arrojan, comparando


resultados experimentales entre los distintos grupos de trabajo de nuestro
laboratorio.

Pruebas bioqumicas
MIO medio
Medio usado para la identificacin de Enterobacteriaceae en base a su movilidad,
actividad de ornitina decarboxilasa y produccin de indol.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones


Dextrosa 1.0 Suspender 31 g del polvo en un litro de agua
Extracto de levadura 3.0 destilada. Calentar a ebullicin hasta
Peptona 10.0 completa disolucin. Distribuir en tubos y
Triptena 10.0 esterilizar 15 minutos a 121 C.
Clorhidrato de L-ornitina 5.0
Agar 2.0
Prpura de bromocresol 0.02
pH final: 6.5 0.2

Fundamento
Medio de cultivo semislido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto
de levadura, peptona y triptena. Adems, la triptena aporta grandes cantidades
de triptofano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realizacin de la prueba
del indol. La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el
sustrato para la deteccin de la enzima ornitina decarboxilasa, el prpura de
bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color prpura y en
medio cido es amarillo.

Por su composicin, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo:


movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol. La movilidad se demuestra
por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas all de la lnea
de inoculacin.

La reaccin positiva a la ornitina est dada por un color prpura del medio. Debido
a la fermentacin de la glucosa se reduce el pH produciendo una condicin cida y
originando que el indicador de pH prpura de bromocresol vire al amarillo. La
presencia de acidez, otorga condiciones ptimas para la actividad de la enzima
ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente.

Por decarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador


hacia el color prpura. El indol, es producido a partir del triptofano por los
microorganismos que contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color
rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovac s o de Erlich, indica un
resultado positivo.

Kligler hierro agar


Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiologa de alimentos para la
diferenciacin de enterobacterias, en base a la fermentacin de glucosa y lactosa,
y a la produccin de cido sulfhdrico.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones


Peptona de carne 13.0 Suspender 54.8 g del polvo por litro de agua
Cloruro de sodio 5.0 destilada. Mezclar bien y calentar con
Lactosa 10.0 agitacin frecuente, hervir 1 o 2 minutos
Triptena 10.0 hasta disolucin total. Llenar hasta la tercera
Glucosa 1.0 parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a
Citrato de hierro y amonio 0.05 121 C por 15 minutos. Enfriar en pico de
Tiosulfato de sodio 0.03 flauta profundo.
Rojo de fenol 0.025
Agar 15.0
Agua destilada 1.000 ml
pH final: 7.3 0.2
Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona de carne y la triptena, aportan los
nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano.

La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables.

El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido


sulfhdrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe 3+, los
cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de
color negro.

El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el


balance osmtico. El agar es el agente solidificante.

Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por


medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en
medio cido.

El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona


luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de
color negro.

Lisina hierro agar


Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente
Salmonella spp., basado en la decarboxilacin / desaminacin de la lisina y en la
produccin de cido sulfhdrico.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones


Peptona de gelatina 5.0 Suspender 35 g del medio deshidratado en
Extracto de levadura 3.0 un litro de agua destilada. Dejar embeber
Glucosa 1.0 unos 15 minutos. Calentar cuidadosamente,
Lisina 10.0 agitando con frecuencia y hervir durante un
Citrato de hierro y amonio 0.5 minuto hasta la disolucin completa.
Tiosulfato de sodio 0.04 Distribuir y esterilizar a 121 C durante 15
Prpura de bromocresol 0.02 minutos. Enfriar en pico de flauta dejando
Agar 15.0 un fondo vertical apto para la puncin.

pH final: 6.9 0.2


Fundamento

En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes


para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la
lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas
decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio,
son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. El purpura de
bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor
a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.

Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el


medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin de
la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesario que la glucosa sea
previamente fermentada.

Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son


fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de
cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubacin se observa el pico de color
violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo. La produccin de
sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la
formacin de sulfuro de hierro.

Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella,


desaminan la lisina, esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal
de hierro y bajo la influencia del oxgeno forma un color rojizo en la superficie del
medio.

Simmons citrato agar


Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la capacidad
de usar citrato como nica fuente de carbono y energa.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones


Citrato de sodio 2.0
Cloruro de sodio 5.0 Suspender 24,2 g del medio deshidratado
Fosfato de dipotsico 1.0 por litro de agua destilada. Dejar reposar 5
Fosfato monoamnico 1.0 minutos y mezclar calentando a ebullicin
Sulfato de magnesio 0.2 durante 1 o 2 minutos. Distribuir en tubos y
Azul de bromotimol 0.08 esterilizar en autoclave a 121 C durante 15
minutos. Enfriar en posicin inclinada.
Agar 15.0
pH final: 6.9 0.2

Fundamento

En el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y el


citrato de sodio es la nica fuente de carbono. Ambos componentes son
necesarios para el desarrollo bacteriano.

Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimtico.

El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el azul de bromotimol es el


indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino.

El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de


utilizar citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica
fuente de nitrgeno, con la consiguiente produccin de alcalinidad.

El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato


permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento del
citratoda progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en presencia de un
medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser utilizados como fuente de
carbono, producen carbonatosybicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al
azul y esto es indicativo de la produccin de citrato permeasa.

TSI agar
Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en
base a la fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido
sulfhdrico.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones


Extracto de carne 3.0 Suspender 62,5 g del polvo por litro de
Pluripetona 20.0 agua destilada. Mezclar bien y calentar
Cloruro de sodio 5.0 con agitacin frecuente, hervir 1 o 2
Lactosa 10.0 minutos hasta disolucin total. Llenar hasta
Sacarosa 10.0 la tercera parte de los tubos de ensayo.
Glucosa 1.0 Esterilizar a121 C por 15 minutos. Enfriar
Sulfato de hierro y amonio 0.2 en pico de flauta profundo.
Tiosulfato de sodio 0.2
Rojo de fenol 0.025
Agar 13.0
pH final: 7.3 0.2
Fundamentos

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los


nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano.

La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables.


El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido
3+
sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe , los
cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de
color negro.
El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el
balance osmtico.

Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del
indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en medio cido.

El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con


una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.

SIM medio
Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de
sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo. Es til para diferenciar miembros de la
familia Enterobacteriaceae.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones


Triptena 20.0 Suspender 30 g del polvo por litro de agua
Peptona 6.1 destilada. Mezclar hasta disolver; calentar
Sulfato de hierro y amonio 0.2 agitando y hervir durante un minuto.
Tiosulfato de sodio 0.2 Distribuir unos 4 ml en tubos de hemlisis y
Agar 3.5 esterilizar en autoclave a 121 C durante 15
minutos. Solidificar en posicin vertical.

pH final: 7.3 0.2

Fundamento

El triptfano es un aminocido constituyente de muchas peptonas, y


particularmente de la triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias para
formar indol.

En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa.

El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovac s o de Erlich,


para originar un compuesto de color rojo.

Las cepas mviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen
alrededor de la puncin de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de
sulfhdrico se distinguen por la formacin de un precipitado negro de sulfuro de
hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a
7.2.

MIN medio
Para identificacin bioqumica de microorganismos en base a la reduccin del
nitrato y formacin de indol.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones


Agar 1.0
Dextrosa 1.0 Rehidratar 25 g del medio en un litro de
Fosfato disdico 2.0 agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos.
Nitrato de nitrito 1.0 Calentar agitando frecuentemente hasta el
Peptona de casena 20.0 punto de ebullicin durante 1 minuto para
disolverlo por completo. Distribuir en tubos
de ensayo. Esterilizar en autoclave a 121oC
(15 lbs de presin) durante 10 minutos. NO
SOBREESTERILIZAR. Dejar solidificar en
posicin vertical. Conservar en refrigeracin
de 2o a 8oC. NOTA: Para observar
movilidad en el medio se recomienda
agregar 2 g/l de agar.

pH final: 7.2 0.2

Fundamento

La peptona de casena debido a su alto contenido en triptofano es adecuada para


la prueba del indol. El triptofano por accin de la triptofanasa puede ser oxidado
por ciertas bacterias dando como resultado indol y otros metabolitos. El indol se
manifiesta con el reactivo de Kovacs formando un anillo rojo en la superficie del
medio. El nitrato de potasio es un sustrato til para determinar la capacidad de
algunas bacterias de reducir nitratos a nitritos. El reactivo para comprobar la
presencia de nitritos ( Acido sulnanlico y N,N-dimetil-1-naftilamina), forma un
cromgeno rojo. La dextrosa es la fuente de energa. El fosfato de sodio ayuda a
contolar el pH.

Sembrar el microrganismo de prueba por picadura sin llegar al fondo del tubo.
Incubar 18 24 h a 35 2C. Para microorganismos anaerobios incubar en las
condiciones adecuadas para su desarrollo.
MR-VP Medio
Medio utilizado para la realizacin del ensayo de Rojo de Metilo y Voges
Proskauer.
Es particularmente til para la clasificacin de enterobacterias.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones


Pluripeptona 7.0 Suspender 17 g del polvo por litro de agua
Glucosa 5.0 destilada. Calentar suavemente agitando hasta
Fosfato dipotsico 5.0 disolver. Distribuir y esterilizar en autoclave a
118-121C durante 15 minutos.
pH final: 6.9 0.2

Fundamento
En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el
desarrollo bacteriano y la glucosa es el hidrato de carbono fermentable.

La glucosa puede ser metabolizada por los microorganismos, a travs de distintas


vas metablicas. Segn la va utilizada, se originarn productos finales cidos
(cido lctico, cido actico, cido frmico), o productos finales neutros (acetil
metil carbinol).

Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podra ser reconocida por la adicin


de un indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia de productos
cidos, y por la adicin de alfa naftol e hidrxido de potasio para evidenciar la
presencia de productos finales neutros.

Voges y Proskauer, describieron una coloracin rojiza que apareca despus de


adicionar hidrxido de potasio a los cultivos de ciertos microorganismos en medio
con glucosa. Esta coloracin se debe a la oxidacin del acetilmetil carbinol a
diacetilo el cual reacciona con la peptona del medio para dar un color rojo.
Urea
Medio utilizado para la identificacin de microorganismos, en base a la actividad
uresica. Es particularmente til para diferenciar Proteus spp. de otros miembros
de la familia Enterobacteriaceae.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones


Urea 20.0 Suspender 3, 87 g del medio deshidratado
Fosfato monopotsico 9.1 por cada 100 ml de agua destilada. Disolver
Fosfato disdico 9.5 sin calentar y esterilizar por filtracin.
Extracto de levadura 0.1 Distribuir en tubos pequeos estriles, entre
Rojo fenol 0.01 0,5 y 2 ml.

pH final: 6.8 0.2

Fundamento

Este medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuart, presenta bajo contenido
de nutrientes y alta capacidad buffer.

El extracto de levadura es la nica fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y


cofactores, y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo bacteriano. Las
sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es el indicador de
pH y la urea es el sustrato de la enzima ureasa.

Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa, pueden utilizar el nitrogeno


proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando amonaco y dixido de carbono.
Estos productos metablicos alcalinizan el medio, haciendo virar el indicador rojo
fenol del amarillo al rojo. Su uso, se recomienda para diferenciar Proteus spp. de
otros gneros.
Fenilalanina Agar.
Medio de cultivo utilizado para diferenciar Morganella morganii biogrupo 1 y 2,
Proteus spp. y Providencia spp., de la mayora de otros miembros de la familia
Enterobacteriaceae, en base a la presencia de la enzima fenilalanina deaminasa.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones


Extracto de levadura 3.0 Suspender 23 g del polvo en un litro de agua
DL-Fenilalanina 2.0 destilada. Calentar a ebullicin hasta disolucin
Fosfato disdico 1.0 total. Colocar en tubos y esterilizar a 121C
Cloruro de sodio 5.0 durante 15 minutos. Solidificar en posicin
Agar 12.0 inclinada para obtener picos de flauta alargados.
pH final: 7.3 0.2

Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de levadura aporta los nutrientes necesarios
para el adecuado desarrollo bacteriano.

El aminocido fenilalanina sufre la desaminacin oxidativa catalizada por la


enzima fenilalanina deaminasa (es una flavoprotena), para producir cido
fenilpirvico y amonaco. La presencia del cido fenilpirvico se demuestra con el
agregado de cloruro frrico en medio cido, con el cual se forma un quelato de
color verdoso entre el cido fenil pirvico y los iones Fe 3+.

Adems, en este medio se suele poner en evidencia la produccin de pigmentos


melnicos, como en el caso de Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa,
etc.