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García Cepero, Ana María; López Forero, Yamel; Riaño Herrera, Nestor Miguel

Aplicación de una técnica de Cromatografía de Exclusión molecular para la purificación
de ADN en plantas de Coffea sp.
Revista Facultad Nacional de Agronomía - Medellín, vol. 59, núm. 2, 2006, pp. 3499-
3507
Universidad Nacional de Colombia
Colombia

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Revista Facultad Nacional de Agronomía -
Medellín
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Agr. Fisiología Vegetal. Colombia.com> Recibido: Junio 1 de 2005. by means of the technique desribed by Chaparro (1993) and its further purification was achieved by molecular exclusion chromatography on Sephacryl S-1000 (Pharmacia). 2006. Yamel López Forero2 y Nestor Miguel Riaño Herrera3 ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ RESUMEN Uno de los mayores inconvenientes en la extracción y purificación de biomoléculas a partir de plantas del género Coffea. proteínas. 0237. Rev.. proteins.p. Palabras clave: Coffea arabica L.No.. _________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ____________________ _________________ ___ ABSTRACT APPLICATION OF A TECHNIQUE OF MOLECULAR EXCLUSION CHROMATOGRAPHY FOR THE PURIFICATION OF DNA FROM Coffea sp.Vol. café. En el presente artículo se describe una metodología que permite obtener ADN de alta pureza. Key Words: Coffea arabica L. <nestorm. 1 Microbióloga.. In this study a methodology is described that allows obtaining high purity DNA from leaf tissues of seven genotypes of Coffea sp.Fac.3499-3507. Los resultados muestran que la alta eficiencia de separación de ARN degradado.lopez@cafedecolombia. Colombia. . DNA. coffee.riano@cafedecolombia. Facultad de Ciencias Agropecuarias. ADN. Clínica Cardiovascular Santa María. Chinchiná.A. Caldas. La extracción del ADN del homogeneizado de tejido foliar en siete genotipos de Coffea sp.Nal. cromatografía de exclusión molecular. pigmentos y compuestos que absorben entre 220 y 300 nm. The results showed that the high separation efficiency of degraded RNA.com> 3 Investigador Científico II. <yamel. Coffea es un alto contenido de polifenoles y compuestos tánicos.2. Medellín. permiten obtener un ADN de alta pureza a juzgar por los datos espectrofotométricos y electroforéticos. A. Palmira. Universidad Nacional de Colombia. <instinve@une. pigments. aceptado: Febrero 6 de 2006. and other compounds that absorb between 220 and 300 nm allowed obtaining high purity DNA as judged by the spectophometric and electroforetic data. Calle 8B No. 75-21.net. Centro Nacional de Investigaciones de Café. APLICACIÓN DE UNA TÉCNICA TÉCNICA DE CROMATOGRAFÍA CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR MOLECULAR PARA LA PURIFICACIÓN PURIFICACIÓN DE ADN EN PLANTAS DE Coffea sp. PLANTS One of the greatest difficulties in extracting and purifying biomolecules from plants in the genus Coffea is the high polyphenol and tannin contents.co> 2 Profesor Asociado. se realizó mediante la técnica citada por Chaparro (1993) y su purificación se logró mediante cromatografía de exclusión molecular sobre una fase estacionaria de Sephacryl S-1000. CENICAFÉ. molecular exclusion chromatography.59. Colombia. Sede Palmira. Ana María García Cepero1.

1 mM. Se tomó (Guillemaut y Drovard 1992. Coffea eugenioides y el cas y metabólicas hacen que posea un Híbrido de Timor. Estos componentes son indeseables en Material vegetal. EDTA 20 mM. cuyas características bioquími. nes de buffer de homogeneización hiben la actividad de PPO facilitando la (SDS 1 %. lo cual exige la modificación momento de la homogenización de de las metodología para obtener mues- tejido foliar. cloroformo-alcohol isoamilico (24:1) y dativa. García. secundarios presentes en vacuolas. no hay en Tris-HCl 0.59. Coffea canephora.7 ml de Sephacryl S-1000 3500 Rev. Se empacó una columna Econo-column (Biorad) de 1 En café no se logra una inhibición total cm de diámetro y 30 cm de longitud de PPO y otras oxidasas a pesar del uso con 15. . absoluto.Vol.. se lavó con etanol al 70 %.M.2. Se precipitó con etanol muestras de ADN altamente purifica.0). Caturra. en el traciones. esto conlleva a utilizar méto. sacarosa 0. útiles en trabajos de biología molecular tales como complejos fenólicos que (Fuchs y Blakesley 1983). extraída dos veces con fenol saturado puestos antes mencionados. de la especie gran magnitud. Kanazawa tejido foliar (1-3 g) y se pulverizó en y Tsutsumi 1992). sirven de sustrato polifenóloxidasas (PPO). Coffea las de otras especies como Pisum arabica cv. N. pH 8. PVPP y DIECA en altas concen- café y otras plantas relacionadas. contenido más bajo de tales meta- bolitos y menores tasas oxidativas Aislamiento de ADN total. Y. se liberan metabolitos tras de ADN altamente purificadas. Por las características bioquímicas del de PVP. A. y das para lograr realizar exitosamente se resuspendió en agua destilada estéril los diferentes procesos enzimáticos (Chaparro 1993). indispensables en el desarrollo de la mayoría de las técnicas de biología Purificación del ADN por columna de molecular.Agr. además de liberar clorofilas y taninos que se encuentran en los MATERIALES Y MÉTODOS MÉTODOS organelos de las células del mesófilo. sativum.25 M. molecular. una vez con cloroformo-alcohol iso- dos adicionales que permitan obtener amílico (24:1). PVPP (Polivinilpolipirrolidona) y tejido. Al macerar se adicionaron 60 mg de PVPP La utilización de PVP (Polivinipirroli. presencia de nitrógeno líquido. Coffea congensis.p. exclusión molecular.Nal. en comparación con Coffea arabica cv.3499-3507. Colombia. Riaño. total. Se utilizaron hojas los procesos de extracción de ADN y jóvenes del segundo par de ramas de producen oxidaciones rápidas y de plantas de 1 año de edad. 8.0 y inhibición total de la actividad oxi. se agitó en vortex por 3 min y se llevó a incubación por 30 min a tem- En café a pesar de la utilización en peratura ambiente. y 90 mg de DIECA por cada gramo de dona). NaCl 50 extracción de las biomoléculas de los mM. Tris-HCl 50 mM. in. López.No.Fac. vegetal. La muestra fue altas concentraciones de los com. 2006. Luego se agregaron 2 volúme- DIECA (Diotiocarbamato de sodio).. pH tejidos (Couch y Fritz 1990).M.

La muestra fue espectrofotometría haciendo un barri. evaluada a través de una electroforesis do entre 220-320 nm y se determinó la horizontal en gel de agarosa al 0.3499-3507. con una buena inte- agarosa.2.8 % con bromuro de corridas en una electroforesis en gel de etidio y se utilizó el marcador de tamaño agarosa al 0. 1989). Palmer y Shields 1984. azul de bromofenol 0. a partir del ml 4-5 (Bookjans.8 % para determinar molecular y concentración “Low DNA integridad y presencia de ARN.0. agarosa. Las teñido con bromuro de etidio (Frischauf fracciones que presentaron picos de 1987.8 se precipitaron con etanol absoluto y Evaluación de la concentración de ADN.Agr. pigmentos y/o ml de buffer de carga 6X (Glicerol 30 proteínas no eliminados en el proceso de %.28) y la inhibición en el etidio (0. utilizando el A280 nm. NaCl 200 mM. Se muestra y la cromatografía se corrió determinaron las absorbancias a A260 y con un flujo de 1 ml min-1. La agarosa al 0. corrió a 60 voltios durante 2h y las HCl 10 mM. Se realizó análisis de restricción del ADN con la enzima Evaluación de las fracciones. pureza de la muestra. Rev.5 ml/min. En la columna se inyectaron entre 400-600 µl de la Análisis por espectrofotometría. El ADN se analizó por gridad evidenciada por las bandas de alto electroforesis horizontal en gel de peso molecular en la electroforesis.25 %). Se Fritsch y Maniatis 1989). minador (Sambroock.Aplicación de una técnica. Sambroock. Las Mass Ladder” de BRL-Gibco.8 % relación A260/280 de cada fracción.. resuspendidas en Se evalúo por electroforesis horizontal en 50 µl de agua desionizada estéril y gel de agarosa al 0. evaluada por Análisis por electroforesis en gel de espectrofotometría.Nal. Fritsch y Maniatis 1989). cianol 0.8 % con bromuro de relación A260/280 (1. extracción (Figura1). fracciones con mayor contenido de ADN. ácido bórico 45 mM) y 1 productos fenólicos.No. absorbancia alrededor de A260 y rela. obtuvo una concentración de 320 µg de ADN por gramo de tejido.25 %. pH 8.p. una (50 ml en total). Fritsch y Maniatis 1989). ciones A260/280 mayor de 1. Fritsch y Maniatis para eliminar contaminantes e impu. siguiendo los protocolos descritos de las fracciones fue evaluada por por Sambrook (1989). la relación A260/280 y se realizó mismo buffer de cromatografía.2006. Extracción inicial de ADN total.Vol. Análisis de restricción. xileno.2 mg ml-1) y se utilizó como corte con EcoRI mostraron una baja buffer TBE 1X (Tris-HCl 45 mM. La electroforesis se na se equilibró con 100 ml buffer (Tris... Stumman y Henningsen 1984). que no revelaron presencia de ARN y con relación A260/280 mayor de 1.0. acetato de sodio 3M.. Se un barrido entre 220 y 320 nm recolectaron 23 fracciones de 2 ml cada (Sambroock. pH 8.. bandas se visualizaron en un transilu- EDTA 0.. por la presencia de EDTA 10 mM. superfine (Pharmacia-Biotech). 3501 . Cada una EcoRI.Fac. La colum. rezas del soporte.59.8 RESULTADOS Y DISCUSIÓN se reunieron y fueron utilizadas para continuar el proceso (Sambroock.5 mM) con flujo de 0.

Nal. Carril 1: ADN total. Análisis de la cromatografía de de ellas con moléculas diferentes exclusión molecular.15 1.14 20* 44 . Y. arabica cv. .95 0.858 1.945 0.313 0.140 1.9 1. A.517 1.365 0. N. Electroforesis en gel de agarosa del ADN C..6 1.p.311 0.976 1.883 1.74 15 34 92. Evaluación por espectrofotometría de las fracciones obtenidas de la cromatografía de exclusión molecular de C. La flecha muestra el pico máximo de obsorción hacia 270 nm.322 pb 2.34 c 18 40 88. - 22* 48 .774 0.935 0.75 0.130 1. .5 1. - *De esta fracción en adelante no se tomaron datos de absorbancia ya que se obtuvo un perfil típico de fenoles.Fac.88 5 14 18. Carril 2: ADN total cortado con EcoRI. Curva espectrofotométrica del ADN.027 pb Figura 1.No. Se obtuvieron tres evidenciadas por espectrofotometría y grupos de fracciones a. 1 2 3 23..5 1.Vol. .M.770 1. en gel de 0.59.25 0. 0 0 - 3 10 0.00 0. B.Agr.135 1. A.360 0.00 0.845 1. B.245 0.5 1. b y c. Caturra. Marcador de peso molecular λ HindIII.167 1.50 17 38 85.080 1.09 9 22 28.442 2.3499-3507.174 2.481 1. cada una electroforesis (Tabla 1. Caturra extraído con la técnica descrita por Chaparro (1993).57 1. . - 21* 46 . FRACCIÓN ml [ ] µg/ml A260 A280 Rel. A.557 pb 260 + 4.55 1. - 23* 50 . arabica cv. 2006.005 2.62 16 36 90. 0 0 - 1 6 .810 1.2.05 1.204 1.741 1.M.130 pb 9. Tabla 1. Carril 3.579 0. García.90 13 30 88.189 1. .11 11 26 65.260 0. .65 0.269 2. .610 0.15 10 24 46. molecular.416 pb 6.81 14 32 94.19 19 42 87. 0 0 - 2 8 . Figura 2).92 8 20 18. (Ver Figura 3) 3502 Rev.87 7 18 13. .361 pb 280 + 2. Riaño.645 2. A260/280 0 1-5 . López.90 a 6 16 15. .712 1.272 1.8 % con bromuro de etidio.25 0.03 b 12 28 80.014 0.80 4 12 12.

posiblemente debido a la minada por la relación A260/280 fue muy presencia de ARN degradado. 3503 .15). con un pico máximo cerca a 220-320 nm fue normal. arabica cv. Relaciones 260/280 nm promedio de los grupos de fracciones a. estas volumen de elución (Tabla 1).2.. muestra bandas de alto peso hasta la fracción 7. a Su calidad deter. B.Aplicación de una técnica.92) con un promedio de relaciones A260/280 mostraron valores 1. Aunque la 260 nm..Vol. con un promedio de 1. Este fracciones fueron rechazadas por la grupo fue elegido como muestra presencia de ARN. La molecular de la muestra a purificar fue electroforesis del grupo b de fracciones el ADN total. a este se le molecular y barridos a lo largo de los denominó grupo a.89.96 y la comportamiento típico para ácidos curva del espectro de absorción entre nucleicos.p.. Rev. extraído por la técnica de Chaparro (1993) y purificado a través de columna de exclusión molecular Sephacryl S1000. el cual aumenta en magnitud pureza de la muestra fue buena y aun a medida que se incrementa el había ADN total íntegro. Gel de agarosa al 0. Figura 2. A. El componente de mayor tamaño óptima para continuar el trabajo.. el cual comenzó a eluir en correspondientes a las fracciones 8 a la fracción 3.88-1. tuvo el 2. Colombia. La curva del espectro de aparentemente normales (entre 1. Comportamiento electroforético y espectrofotométrico de las muestras de ADN de C.Nal. carriles.Fac.81 y absorción entre 220-320 nm.8 % con bromuro de etidio de las fracciones eluidas de la columna de exclusión molecular.Agr.2006. continuando su elución 13.3499-3507. b y c.No.59. Las buena (1.

obteniéndose Además en la electroforesis desaparece valores entre 1. B.Agr. ADN total contaminado con fenoles.2.Vol. Riaño. Figura Figura 3. C. ta el volumen de elución.No. con un casi totalmente la presencia de bandas promedio de 1. C. pondientes a proteínas (Figura 3). Y. la relación A260/280 y en algunos casos a 280 nm corres- comienza a bajar a medida que aumen.3499-3507. A.59.7.Fac. A..Nal..p. ADN total puro B. A. ADN total contaminado con proteínas. Hay deformación de y barridos lo que muestra ausencia de la curva del espectro de absorbancia ácidos nucleicos pero presencia de entre 220-320 nm. con aparición de otras moléculas que absorben en este picos de absorbancia hacia 270 nm que rango de longitud de onda. . Las flechas muestran la ubicación de los picos de absorción predominantes. En el grupo c correspondiente a las corresponden probablemente a fenoles fracciones 14 a 18.M. N.45. Espectros de absorción. 2006.14 y 1. López. 3504 Rev. García.M.

Rev. eugenioides Carril 13: C.No. Análisis del ADN sin cortar y cortado con EcoRI en gel de agarosa al 0. arabica cv..322 pb 564 pb B. Análisis del ADN extraído y purificado de todos los genotipos. Evaluación de la concentración de las muestras por electroforesis en gel de agarosa al 0. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 23. Carril 4: Hibrido de Timor.59.. A. la curva los genotipos extraídos y purificados. Carril7: Hibrido de Timor EcoRI. congensis. Carril 10: C. Carril 6: Hibrido de Timor. congensis. La peso molecular. eugenioides.3499-3507. congensis EcoRI Carril 12: C. Colombia EcoRI. tratadas con la enzima de restricción EcoRI producen barridos de mediano Análisis del ADN purificado.8% con bromuro de etidio. purificado. eugenioides EcoRI B. Carril 3: C. Carril 5: C..Vol. Mas allá de la fracción 19. Carril 6: C. Carril 11: C.8% con bromuro de etidio. Colombia. típicos de la acción de electroforesis del ADN total de todos esta enzima (Figura 4 A). canephora EcoRI.. canephora. Carril 2: C. Caturra EcoRI. Carril 5: C. canephora. arabica cv. Caturra.Carril 1: DNA Mass Ladder.Agr. Colombia. Caturra.Fac. Carril 4: C. Carril 1: λ HindIII. 1 2 3 4 5 6 7 100 ng 40 ng 20 ng [ ] ng/µl 40 40 50 40 60 40 Figura 4.p. Carril2: C.130 pb 6557 pb 2.2. arabica cv. Carril 3: C. arabica cv.Aplicación de una técnica.2006. Carril 7: C. arabica cv.Nal. A. Carril 8: C. toma el aspecto de los productos muestra bandas de alto peso mole- fenólicos y los valores de absorbancia cular sin degradación que al ser disminuyen hasta llegar casi a cero. Carril 9: C. 3505 . arabica cv.

Colombia 0. López.2741 0. eugenioides 0. García.3499-3507. Y. En: Plant Molecular Biology AGRADECIMIENTOS Reporter.59. . and es una buena alternativa para la puri. se encontró que mente baja (Figura 4 B).2483 0. 8-12. P.05 C. 8. 141.M. Vol. M. dentro del trucción de una biblioteca genómica de marco del proyecto “Estudio de la Coffea arabica L. Henningsen. 244-247.28 C. N.1331 2. of DNA from plants high in poly- phenolics. no.Agr. cons- Cafeteros de Colombia.1339 1. Universidad Nacional de sp”. B. Tabla 2.Nal. concentración aparente..1023 0. Al eva- obtenido de cada genotipo estaba entre luar la calidad de los materiales aislados 20-80 ng µl-1.1422 0.87 C. congensis 0.1093 2.25 De estos resultados se pude concluir BIBLIOGRAFÍA que la cromatografía de exclusión molecular utilizando Sephacryl S-1000.M. A. Con el marcador de tamaño molecular se terial suficiente para realizar más de 200 encontró que la concentración de ADN reacciones de PCR por muestra. obteniendo Couch. p. p.0623 2. Contribución al Colciencias y la Federación Nacional de estudio del genoma del cafeto. 3506 Rev. chloroplast DNA from pea plastides tipos con alto contenido de metabo.No. J. variedad caturra. lo cual proporciona ma.14 Híbrido de Timor 0.p. canephora 0. obtenido de la columna (Tabla 2). por espectrofotometría. Caturra 0.1. Colombia. GENOTIPO A260 A280 Rel. arabica cv. K. isolated in a medium of high ionic litos secundarios como es el caso del strenght. Sin embargo.. Actividad Fotosintética de Hojas y Frutos Bogotá. K. Análisis espectrofotométrico del ADN en los diferentes genotipos de café aislados. 1993.1023 0. and Fritz. Tesis Maestría en Ciencias de diferentes Especies de Café Coffea Agrarias. A.0557 2. 1990. ya que las moléculas Vol.Fac. Preparation of ficación de ADN originado de geno.2. no. Este trabajo fue cofinanciado por Chaparro. 2006. género Coffea.1. código:2251-07-002-93. G. Bookjans. presentes en la muestra se separan en fracciones discriminantes. Facultad de Agronomía.2509 0. En: Analytical Biochemistry.Vol. Stumman.. 1984.33 C. arabica cv. 82 h. W. Riaño. el las relaciones A260/280 fueron óptimas volumen de dilución del ADN nunca fue mostrando la alta pureza del material menor de 200 µl. A260/280 C. 2.0479 2. Isolation un ADN de excelente calidad.

307. 1992. Harbor Laboratory. 318. 3-38. p. 10. J. Part B.59. En: mitochondrial genome. M.3499-3507. E. 60-65. Vol. A.. F. R. Vol. 316- Methods in Enzymology.1. 3 ed. Rev. 1992.. and Maniatis. and Shields. Guide of Palmer. Frischauf. J. Fuchs.Nal. R. 152.Vol.2. En: Nature.. 100. Extraction of restrictable DNA from of Shelby L. no. P. 10. En: Biology Reporter. C. 437-440. 1989.Agr. M. p. Vol.No.. and Drovard.. Molecular cloning: a laboratory reliable method. size fractionation. En: Plant Molecular manual.p. Vol. Alan R. 183-189 En: Berger. the use of type II restriction endo. 3507 . p. 818 p.Aplicación de una técnica. p. Methods in Enzymology. and Blakesley. En: Plant Molecular molecular cloning thechniques. no. 1983. Guillemaut. A.Fac. D.2006. Vol. p. New York: Cold Spring Biology Reporter. Sambroock. and Kimmel. L. Digestion of ADN: Kanazawa. Fritsch. Isolation plant DNA: a fast inexpensive and T. 1984. 1987. and Tsutsumi. 4. 2300 p. Recombinant DNA. Tripartite structure of Brassica campestris nucleases. N. E. Guide to the genus Nelumbo.