You are on page 1of 9

Karakterisasi Nanopartikel

Nanopartikel umumnya ditandai dengan ukuran mereka, morfologi dan muatan p
ermukaan, dengan menggunakan teknik-teknik canggih seperti mikroskopis seba
gai pemindaian mikroskop elektron (SEM), mikroskop elektron transmisi (TEM)
dan mikroskopkekuatan atom (AFM)! "Diameter partikel rata-rata, distribusi ukur
an dan biayamempengaruhi stabilitas fisik dan distribusi in #i#o dari
nanopartikel! Teknik mikroskopelektron yang sangat berguna dalam memastikan
bentuk keseluruhan nanopartikel polimer,yang dapat menentukan toksisitas
mereka! Muatan permukaan nanopartikel mempengaruhistabilitas fisik dan
redispersibility dispersi polimer serta kiner$a mereka in #i#o

2. Karakterisasi Nanopartikel
2.1 Atomic absorption spectroscopy
Konsentrasi ion Fe ditentukan menggunakan metode spektrofometri
pada panjang gelombang 248 nm. Jenis spektrometer yang digunakan
adalah AAS iCE 3000 Series Thermo Scientific. Sebelumnya sampel
dilarutkan dalam HCl pekat (37%) lalu diencerkan dengan HCl 1%.
Kurva kalibrasi antara nilai absorbansi ion Fe pada panjang gelombang
248 dengan konsentari Fe (0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 mg/L) menghasilkan
nilai koefisien determinasi (R2) 0.9995.

AAS iCE 3000 Series Thermo Scientific
2.2 Transmissi electron
microscopy
Bentuk dan ukuran nanopartikel diperiksa menggunakan transmission
electron microscopy (JEOL JEM-1230 dengan resolusi 0.2 nm beroperasi
pada 120 kV). Sampel dilarutkan dengan air murni sehingga
didapatkan konsentrasi ion Fe sebanyak 200 mg/L lalu disimpan pada
jaringan tembaga berlapis karbon dan
dibiarkan mongering.

JEOL JEM-1230

. 40.0 atau 0. direkam dengan pita lebar 3 nm. menggunakan panjang gelombang eksitasi pada 650 nm untuk sianin dan berkisar antara 300 sampai 500 nm dengan panjang gelombang eksitasi pada 295 nm untuk peptide. Spektrum emisi tercatat berkisar 660 sampai 800 nm.5-PEG-gH625 dicatat dengan menggunakan Jasco J-715 spektrofolarimeter dalam sel kuarsa 1.4.5 Circular dicrhoism Spektrum CD SPIONs-Cy5. Edinburgh Instruments). dan 60%) dan dikoreksi untuk blank. dan kecepatan pemindaian 10 nm / menit.5-PEG dan SPIONs- Cy5. JEOL JEM-1230 2. Pengukurannya dilakukan pada suhu 25°C dengan konsentrasi besi 50 mg/L pada PH 7. Sampel diencerkan dalam buffer PBS pada pH 7. 20.1 cm pada suhu kamar. Semua pengukuran dilakukan secara rangkap tiga untuk masing- masing sampel. Spektrum rata-rata tiga kali berturut-turut scan dari 260 menjadi 195 nm. kekuatan ion dibuat konstan dengan menambahkan larutan NaCl untuk mendapatkan konsentrasi akhir 10 mM.5-PEG-gH625 diukur menggunakan Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instrumen. waktu konstan 16 detik. Untuk pengukuran zeta-potensial. Pengukuran dilakukan dengan spektrofotometer fluoresens (FS5 Spektrofluorometer. sampai konsentrasi besi 50 mg / L.2.4 Size and ζ–potential analysis Pengukuran potensi zeta dan ukuran SPIONs-Cy5.3 Fluorescence spectroscopy Adanya sianin dan kandungan peptida diselidiki dengan spektroskopi fluoresensi. Inggris). Spektrum itu dicatat dengan adanya konsentrasi trifluoroetanol yang berbeda (TFE) (0. Zetasizer Nano-ZS 2. Worcestershire.4.

sel dicuci 3 kali. Jerman). diperoleh dari American Type Culture Collection (LGC Promochem. Kacamata penutup kemudian ditempatkan di antara slide mikroskop dan penutup slip yang akan dipindai menggunakan LabRAM laser scanning confocal microspectrometer (Horiba SA. dan dimasukkan dalam larutan Trump yang terdiri dari buffer fosfat 0.8 lm. Analisis nanopartikel dilakukan pada selubung penutup sel. Bagian optik okuatorial dari masing- masing sel yang dipilih dipindai dengan jarak 0. Kemudian campuran sel diberi 2% osmium tekraoksida dan mengalami dehidrasi dengan peningkatan serangkaian larutan etanol. setiap spektrum fluoresensi cocok dengan jumlah spektrum model proporsional yang merupakan karakteristik lokasi subsellular dan/atau interaksi antar subsellular. karena potongan ultrathin yang diamati dipilih secara acak. Perancis). Darmstadt. Secara singkat. dan disematkan di resin Epon.1 M + paraformaldehida 4%. Baik perolehan dan pengerjaan dari peta spektral dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Lab-Spec. Mereka diberi benih dengan masing-masing 30. Daya cahaya laser pada sampel sekitar 0. Bagian ultratipis (90 nm) diberi uranyl acetate encer 2% dan timbal sitrat 1% (Merck. media diganti dengan SPIONs encer (200 mg/L besi) dalam PBS lalu sel diinkubasi dengan nanopartikel selama 30 menit. dipanen. dilengkapi dengan difraksi 300 ‘/mm Kisi dan detektor CCD berpendingin udara karena efek Peltier. Gambar diperoleh dengan menggunakan operasi JEOL 1011 TEM yang beroperasi pada tegangan akselerasi 100 kV.Villeneuve d'Ascq. Kaca penutup yang terbuat dari poli-D-lisin ditempatkan dalam 24 plate. Metode fitting coefficient dilakukan untuk mendapatkan peta spectral yang sesuai. . Sel MDA-MB-231 pertama kali dibiakkan secara rutin selama 24 jam dalam labu ukur. Prancis). di bawah 50 x panjang objektif mikroskop fokal. Media dipindahkan. Fluoresensi sianin tereksitasi menggunakan built-in Laser dari He-Ne.000 sel untuk 48 jam dalam medium kultur.5-PEG atau SPIONs-Cy5. Molsheim.1mW dan waktu perolehannya adalah 20 ms per spektrum. Kemudian. Jasco J-715 spektrofolarimeter 3. Gambaran yang diperoleh tidak harus mewakili seluruh populasi sel. Sel-sel itu kemudian diinkubasi dengan SPIONs-Cy5.5- PEG-gH625 pada konsentrasi besi 100 mg/L untuk beberapa interval 15-30 menit dan dicuci tiga kali dengan PBS. dipekatkan. Efek Nanopartikel pada Sel Kanker Garis sel kanker payudaraa. MDA-MB-231. Jalur sel dipertahankan di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ditambah dengan 10% fetal bovine serum (FBS) tananopartikela phenol merah dan 100 UI/mL penisilin G dan 100 μg/mL streptomisin pada 37°C dalam kondisi lembab 5% atmosfer CO2.

5 berlabel dan SPION berlapis PEG membentuk ikatan thio-ester melalui reaksi tiolmaleimide dengan Cys-gH625 (Gambar 1C). masing-masing melibatkan ikatan amida antara kelompok amino utama partikel dan gugus ester N-hidroksisuksimidil (NHS) dari molekul organik: NHS-PEG-Mal dan NHS-Cy5. yang secara steril menghambat penggumpalan.5 dikonfirmasi oleh sinyal kuat fluoresensi yang diidentifikasi pada SPION yang difungsikan yang tersuspensi dalam buffer PBS pada pH 7. Adanya pewarna Cy5. fungsi maleimide dinonaktifkan dari waktu ke waktu melalui hidrolisis dalam medium berair. Kemampuan mereka untuk dimodifikasi sangat tergantung pada rute sintesis. Pada tahap kedua. Untuk nanopartikel bebas CPP yang kami gunakan dalam penelitian ini sebagai sampel kontrol. Cara yang paling umum untuk memastikan stabilitas koloid SPION pada kisaran pH 5-8 adalah melapisinya dengan permukaan yang terbuat dari polimer netral seperti PEG.5. yaitu mendekati titik muatan nol. Oleh karena itu.8) dan pada pH netral.5 digabungkan secara kovalen ke permukaan SPION yang dilapisi dengan trialkoksisilana teraminasi (Gambar 1). Dalam media encer.4. Dengan demikian. Akhirnya. Dari CPP dengan nanopartikel. Rantai PEG dan pewarna fluorescent NIR Cy5. Selama tahap pertama. konjugasi molekul ini dengan inti oksida besi melalui ikatan kovalen mempertahankan aktivitas fluoresensi kromofor dan menghilangkannya kemungkinan kebocoran fluorophore. mereka cenderung mengendap. atom besi pada permukaan SPIONs menyajikan gugus hidroksil. pewarna Cy5. digabungkan secara kovalen dengan SPIONs. sifat magnetik dan optiknya. yang secara preliminarily diaktifkan dengan kelompok NHS (Gambar 1A). Fungsionalitas SPION silanisasi kemudian terjadi dalam dua tahap. sehingga menjamin konjugasi kovalen yang stabil dan spesifik lokasi. perubahan permukaan SPIONs berubah dengan pH (titik isoelektrik sekitar 6. yang membentuk ikatan Si-O kovalen dengan gugus hidroksil permukaan Nanopartikel. dan ini memainkan peran penting dalam pemuatan dan pengiriman molekul kecil. . kelompok amino SPION yang tersisa digunakan untuk menghubungkan secara kovalen rantai NHS-PEG5000-Mal (Gambar 1B).5.Ukuran dan sifat permukaan nanopartikel memainkan peran penting dalam stabilitas koloid dalam suspensi. kelompok maleimide yang tersedia di permukaan luar Cy5. dan nasib mereka dalam organisme dan farmakokinetik.

Pembentukan ikatan thio-ester .(A). PEGilasi (B). dan konjugasi dengan gH625 (C).

SPION tidak menunjukkan penggumpalan lebih jauh dari waktu ke waktu.5 berlabel SPIONs dengan PEG juga dikonfirmasi oleh penurunan nilai potensial zeta dari + 20 mV menjadi sekitar -5 mV.Potensi zeta. di mana tidak ada silan atau lapisan PEG dapat divisualisasikan karena kepadatan elektronik material yang tidak mencukupi. menunjukkan bahwa pelapisan dengan PEG efektif dan efisien. kontribusi statistik terhadap nilai z-rata DH dari sebagian kecil kelompok kecil inti oksida besi tidak dapat dikesampingkan.4. seperti yang perkirakan. yaitu diameter hidrodinamik dan potensial zeta.5 di bawah kulit polimer tidak memiliki pengaruh langsung terhadap potensi zeta. dan dapat disimpulkan bahwa shell PEG netral melindungi SPION dari agregasi karena hambatan sterik. diameter hidrodinamik dari awal. diperoleh sekitar 137 molekul PEG per SPION (diperkirakan memiliki diameter 8 nm. peningkatan diameter hidrodinamik nanopartikel setelah PEGilasi konsisten dengan lapisan polimer yang sangat terhidrasi. dan nanopartikel berlapis PEG secara signifikan lebih besar 10 nm daripada ukuran SPION yang diamati dengan TEM (Gambar 6A dari bahan Tambahan). Perbedaan ini dapat dijelaskan dengan adanya lapisan solvasi di sekitar nanopartikel. diukur dengan DLS. Namun. Data dinyatakan sebagai mean ± Standard deviations (SD) tiga Percobaan terpisah untuk masing-masing dua formulasi batch. dinyatakan sebagai z rata-rata. pada suspensi berair pada pH 7. Penurunan ini seiring dengan penutupan pewarna dan kelompok amina bermuatan positif dengan PEG netral. .2 menunjukkan distribusi ukuran yang agak sempit yang menguntungkan untuk ekstravasasi nanopartikel yang lebih efektif dan retensi lebih lama pada jaringan tumor. Namun. kehadiran Cy5. dengan luas sekitar 200 nm2) atau sekitar 0. dengan setidaknya 13 pengukuran untuk masing-masing. Dimulai dari anorganik: rasio massa organik 55:45 yang terbentuk dari data TGA. Setelah terlaipisi PEG. sampai 6 bulan. dan indeks polidispersitas (PDI).7 molekul PEG Per nm2 besi oksida. seperti yang ditentukan oleh spektroskopi serapan atom. diperoleh oleh DLS dan dirangkum dalam Tabel 1. Lapisan efektif tersilanisasi dan Cy5. terutama karena nilai PDI. Diameter hidrodinamika SPIONs-Cy5.5-PEG. bagian tersilanisasi. ukuran. Dibandingkan dengan diameter hidrodinamik 56 nm dari SPION silan.5-PEG adalah 87. Seperti yang diharapkan. Potensi zeta di bawah 20 mV (positif atau negatif) dianggap tidak memadai untuk stabilisasi nanopartikelst elektrostatik. Sifat koloid SPIONs-Cy5.2 nm dan menyajikan distribusi monomodal dengan Sebuah indeks polidispersitas (PDI) <0. Konsentrasi besi dalam suspensi biasanya berkisar 600-700 mg/L.

Reaksi konjugasi dilakukan pada PBS pada pH 7 dan pada suhu kamar untuk menjaga stabilitas kelompok maleimide dan untuk mendukung reaksi coupling.5-PEG-gH625 menegaskan bahwa gH625 terkonjugasi memiliki struktur heliks. coupling gH625-Cys ke permukaan polimer eksternal SPIONs-Cy5. dan 300 diuji. Seperti yang diharapkan.Seperti dijelaskan di atas. permukaan netral diketahui mendukung waktu paruh nanopartikel yang lama dalam darah setelah pemberian sistemik mereka dan DH <100 nm dimaksudkan agar sesuai dengan akumulasi tumor mereka karena efek EPR. Untuk dua rasio molar pertama. sebagai respons terhadap interaksi CPP dengan membran. agregasi dari CPP-nanopartikel diamati sementara untuk dua yang terakhir. (Gambar 1C). Indeks polidispersitas tetap di bawah sekitar 0. dan dengan demikian menyukai emisi yang lebih tinggi. seperti yang dijelaskan di bawah ini. kami menganalisis struktur sekundernya setelah biokonjugasi dengan nanopartikel. untuk menghindari penggumpalan nanosisstem biokonjugasi akhir. SPIONs-Cy5.5-PEGgH625 kami. bila diukur pada konsentrasi nanopartikel yang sama (Gambar 2). Karena sifat membranotropik peptida gH625 disukai oleh konformasi alfa-heliksnya. Data CD dari suspensi berair SPIONs-Cy5. akumulasi intratumoral berbasis EPR dimaksudkan untuk disertai dengan akumulasi intraselular yang meningkat. Konjugasi kovalen gH625 sedikit meningkatkan diameter hidrodinamik SPION yang dilapisi PEG (dari kira-kira 87 nm menjadi sekitar 98 nm) dan tidak mengubah fpotensialnya secara signifikan (Tabel 1). Kondisi reaksi dioptimalkan dalam hal rasio molar besi/peptida. Ini tidak mengubah keseluruhan properti nanopartikel. yang serupa dengan apa yang sebelumnya dilaporkan untuk peptida lain yang dikonjugasikan ke . yang terakhir lebih efisien untuk melindungi fluorophore. Konsentrasi besi dalam suspensi adalah 500-600 mg / L. yang menunjukkan bahwa peptida: rasio molar PEG adalah Hampir 0. Peningkatan sedikit dalam hasil fluoresensi tananopartikela perubahan pada profil spektral menunjukkan bahwa setelah fiksasi gH625 pada ujung rantai PEG.2. yang dianggap sebagai Jadilah mekanisme penargetan pasif. jumlah peptida tidak cukup untuk aktivitas biologis. seperti yang ditentukan oleh spektroskopi serapan atom. seperti yang dijelaskan selanjutnya.17 Meskipun label nanopartikel dengan fluoresfor sianin dilakukan sebelum PEGilasi mereka.5-PEG dilakukan melalui pembentukan ikatan thio-eter kovalen antara residu sistein di terminal C peptida dan terminal maleimida. Dengan menggunakan kurva kalibrasi yang telah ditetapkan sebelumnya untuk intensitas fluoresensi yang diberikan pada triptofan yang ada dalam urutan peptida. Besi: rasio molar peptida 6. Seperti dibahas di atas. Setelah pemurnian oleh Vivaspin dengan cut-off 30 kDa. tidak ada perubahan ukuran atau bentuk inti oksida besi yang diamati di TEM (Gambar 6B dari bahan Tambahan). fungsionalisasi dengan gH625 menyebabkan peningkatan intensitas fluoresensi kira-kira 20%. 32. menunjukkan distribusi sempit ukuran partikel. Untuk nanosystem SPIONs-Cy5. 20. ditetapkan bahwa kandungan gH625 yang menempel pada nanopartikel biokonjugan akhir adalah 23 molekul peptida per SPION.5-PEG- gH625 ditandai dengan beberapa teknik.

Mekanisme efek yang menarik ini.5 yang ditemukan di sel lebih signifikan bergeser dari karakteristik nanopartikel bebas yang sama pada penyangga PBS (spektrum dan zona merah pada peta spektral. Di bawah kondisi eksperimental ini. akan diselidiki dalam studi independen dan lebih ekstensif. Seperti dijelaskan di atas. yang secara logis dialihkan ke kompartemen endolysosomal. dan selanjutnya meningkat setelah 30 menit inkubasi (lihat histogram intensitas. diamati nanopartikel yang berada di luar sel yang dekat dengan invaginasi membran (Gambar 5A). yang mengeksploitasi spektrum fluoresensi penuh dari banyak titik bagian optik sel (Gambar 4).5-PEG-gH625 (Gambar 5). SPION PEGylated-Papped yang tersumbat tampaknya dibawa ke sel kanker melalui jalur endositik. nanopartikel pembawa GH625 (Gambar 4B). ikatan kovalen pewarna sianin ke inti SPION yang dilapisi dengan PEG adalah bagian dari strategi perancangan rasional. Gambar 4B) dengan nanopartikel yang berinteraksi dengan organel subselular di sitosol ( Spektrum hijau dan zona pada peta spektral. yaitu kemampuan gH625 untuk meningkatkan serapan NP dan apakah peptida tersebut akan memungkinkan NP keluar dari endosom.nanosystems [16. . Menurut data CSI. Spektrum hijau lebih sempit dan memiliki bahu lebih lemah pada panjang gelombang yang lebih tinggi - profil spektral ini harus menunjukkan bahwa lingkungan molekuler kromofor sianin menjadi kurang polar. Profil spektral fluoresensi Cy5. nanopartikel yang mengandung peptida gH625 pada permukaan polimernya menunjukkan kinetika serapan yang lebih cepat dan intensitas fluoresensi intraselular hampir 3 kali lebih tinggi. yang mengindikasikan bahwa 23 peptida pada setiap partikel SPION sudah cukup untuk meningkatkan internalisasi sebanyak tiga kali. Gambar 4B). Jalur endositik dikonfirmasi dengan menggunakan analisis TEM MDA-MB-231 pra-inkubasi dengan SPIONs-Cy5. Pertama. Dengan demikian. Gambar 4A). Selain itu. Kemudian. Gambar 4A). yang serupa dengan sebagian besar partikel nano PEGylated dengan diameter hidrodinamika dekat. sehingga selanjutnya memastikan pemberian sinyal fluoresensi ke nanopartikel. Struktur seperti ini melindungi fluorophore dari pendinginan dan pelepasan dari nanopartikel. partikel nano ditemukan pada vesikula endositik yang dikelilingi oleh membran (Gambar 5B). setelah internalisasi. karena fluoresensi sianin karakteristik diamati dimulai pada 15 menit setelah dimulainya inkubasi. kedua nanopartikel dengan dan tananopartikela gH625 dengan cepat dibawa ke dalam sitosol dari MDA-MB-231cells (lihat Peta intensitas yang ditunjukkan dengan warna biru. peptida ini membuat konformasi heliksnya dengan adanya tingkat TFE yang berbeda. yang memungkinkan solusi untuk meniru lingkungan membran seluler (Gambar 3). Data tersebut didapatkan bahwa internalisasi endositik pada waktu inkubasi singkat. yang konsisten dengan polaritas rendah lingkungan nanopartikel yang diamati oleh CSI. efek gH625 terdiri dari akumulasi nanopartikel yang ditingkatkan / dipercepat di lokasi sitosol polaritas rendah.17].