You are on page 1of 12

ACARA I

Pengenalan Alat
Pendahuluan
Untuk bisa mengerjakan praktikum pada acara-acara selanjutnya diperlukan
pengenalan dan pemahaman akanjenis dan fungsi dari beberapa alat yang akan
digunakan dalam praktikumTeknologi Molekuler ini. Peralatan tersebut antara lain
adjustable pipet, vortex, waterbath, centrifuge, alat amplifikasi, elektroforesa,
Safe Imager / UVTransiluminator. Deskripsi tentang alat-alat tersebut beserta
fungsi dan cara menggunakannya telah dijabarkan dalam Penuntun Praktikum
Biologi Molekuler (Listawan, 2008).

Tujuan
Tujuan praktikum acara ini adalah :
1. Memperkenalkan mahasiswa pada peralatan utama yang diperlukan dalam
penelitian biologi molekuler
2. Mahasiswa mengetahui dan memahami fungsi dan cara kerja alat-alat tersebut
diatas

Bahan dan Alat
Peralatan yang ada dan digunakan dalam praktikum acara ini adalah microwave,
adjustable pipet, vortex, waterbath, centrifuge, alat amplifikasi, elektroforesa.
Safe Imager / UV Transiluminatorl Gel Doc.

Cara Kerja
1. Dosen dan / atau Asisten Praktikum akan menunjukan dan menjelaskan
tentang jenis, fungsi, dan cara kerja dari suatu alat
2. Buatlah gambar/foto dari alat tersebut
3. Perkaya penjelasan dosen/asisten praktikum denagn referensi atau buku
manual (petunjuk kerja) yang tersedia dari tiap alat tersebut

dan kemudian memisahkan DNA dari komponen sel lainnya.menggunakan alat dan bahan yang mudah ditemukan 2. bahwa untuk mengisolasi DNA perlu memecah dinding sel dan inti sel. Isolasi DNA Secara Sederhana Pendahuluan DNA dapat ditemukan di semua sel hidup. Oleh karena itu bisa ditemukan di berbagai bentuk jaringan (hidup). Melakukan eksperimen sederhana tentang bahan-bahan materi sumber DNA 3. dengan menggunakan alat dan bahan yang bisa ditemukan dalam kehidupan sehari-hari. Tujuan: Tujuan praktikum acara ini adalah 1. Memperkenalkan mahasiswa dengan metode ekstraksi DNA dengan metode sederhana. Pada praktikum acara 1 ini akan dicoba protokol yang sederhana. Berbagai protokol telah dikembangkan untuk mengekstraksi DNA dari berbagai macam material dasar. hati ayam  garam non-yodium  pelunak daging/juice papaya/nanas/  sabun cair atau deterjen  aquades  ethanol (95%) dingin  tabung gel as atau beker glass . bukan hanya ditemukan dalam sel darah - seperti pendapat umum selama ini. Acara 2. Membandingkan secara kualitatifhasil ekstraksi DNA yang diperoleh dari materi sumber DNA tersebut Bahan:  Materi sumber DNA: bawang putih. Namun semuanya berdasar pada prinsip yang sama.

Potong-potong bahan dasar o Tiap kelompok mencoba salah satu bahan yang disediakan (bawang putih atau hati) o Lakukan pecobaan dengan perlakuan sebagai berikut: Jumlah/Berat bahan Pelunak daging Jus Papaya Jus Nanas 1 Bawang Putih (Hati): 6 √ √ √ siung (5 gram) 2 8 siung (10 gram) √ √ √ 3 12 siung (15 gram) √ √ √ . tabung test  pisau  blender  penyaring dan filter kopi Cara kerja: 1. tempatkan pada blender  Tambahkan 500 ml aquades hidupkan blender sampai papaya hancur  Saring dan tempatkan pada botol 2. larutan pelunak daging (5%). ~ 100 gr). jus nanas dan jus papaya. Buatlah beberapa larutan yang diperlukan: deterjen/garam. dengan kompisisi sebagai berikut: Larutan deterjen/garam:  20 ml sabun cair  20 g garam non yodium  180 mlaquades Larutan pelunak daging ( 5%)  5 gram pelunak daging ditambah 95 ml aquades Jus Papaya:  Potong papaya (muda. tempatkan pada blender  Tambahkan 500 ml aquades hidupkan blender sampai papaya hancur  Saring dan tempatkan pada botol Jus Nanas:  Potong nanas ( ~ 100 gr).

Biarkan selama 2-3 menit. Bandingkan hasil untuk tiap perlakukan . tampung dalam botol gelas atau beaker glass 6. secara hati-hati lewat didinging tabung 9.3. 7. Tambahkan 100 ml larutan deterjen/garam pada tiap perlakuan 4. Ambil 6 ml filtrat dalam tabung test 8. Tambah 20-30 ml larutan pelunak daging atau jus papaya/nanas dan aduk- aduk . Saring campuran dengan saringan dan filter kopi. Tuangkan 6 ml ethanol dingin. Blender dengan kecepatan tinggi selama 30 detik-1 menit 5. sampai gelembung hilang 10. DNA akan mengapung dalam lapisan alkohol (di bagian atas) 11.

5% SDS pH 7. 100mM Tris-HCl pH8 . Acara 3. Mahasiswa mampu melakukan isolasi DNA dengan metode PCE Bahan/Alat  Materi sumber DNA: darah burung yang disimpan dalam kertas filter  Extraction buffer: . 100mM NaCl . Isolasi DNA Metode PCE Pendahuluan Terdapat berbagai macam metode untuk mengisolasi DNA dari suatu materi sumber DNA. Cara mengisolasi DNA dapat dilakukan dengan mencernakan protein dengan memakai proteinase. Pada dasarnya metode tersebut bertujuan untuk menghancurkan protein dan memisahkan DNA dari bagian-bagian lainnya. atau mengikat DNA dengan Sephadex. DNA yang sudah dipisahkan ini kemudian dapat dikonsentrasikan dengan memakai metode presipitasi alkohol. 0.5  Phenol:Chloroform: Isoamyl (25:24:1)  Chloro form :Isoamyl (24:1)  Ethanol 100% dingin  Ethanol 70%  ddH2O . 5 mM EDTA pH8 . Pada praktikum ini akan dilakukan dengan memakai metode PCE Tujuan: Tujuan praktikum acara ini adalah 1. Memperkenalkan mahasiswa dengan metode PCE 2.

masukan ke dalam microtube (1. Setelah diinkubasi sampel ditambahkan 700 µl Phenol-Chloroform-Isoarnyl dan diletakkan dalam kotak es selama 10 menit. gel tray. Inkubasi dengan waterbath/shaking incubator pada suhu 37° C selama semalam. sendok kimia. Setelah disentrifuse akan terbentuk dua lapisan. 9. freezer. dan deskirpsinya adalah sebagai berikut: 1. dan gelas ukur Cara kerja Alur kerja ektstraksi dengan metode PCE dapat dilihat pada Gambar 1. Pipet. Sentrifuse dengan kecepatan maksimal selama 2 menit.5 ml). Potong kertas filter yang menandung sampel darah dengan ukuran ~ 2 x 2 mm. 7. tip. 5. 4. mikrotube. kemudian ditambahkan 20 ul Proteinase K dan 700 µl buffer ekstraksi. sentrifuse. 6. Setelah disentrifuse akan terbentuk dua lapisan. Supernatan diambil kemudian ditambah 400 µl Chlroform-Isoarnyl sebanyak. 10. 8. timbangan. Setelah inkubasi sampel kemudian disentrifuse dengan kecepatan maksimal (- . tube stand.kemudian disentrifuse dengan kecepatan maksimal (-15000 rpm) selama 2 menit. Bagian atas (supernatan) diambil dan dipindahkan ke dalam mikrotube baru. waterbath. 2. kemudian sentrifuse dengan kecepatan maksimal (-15000 rpm) selama 2 menit. Lapisan atas yang terbentuk kemudian dipipet dan dipindahkan ke dalam mikrotube baru. comb. kemudian dikocok menggunakan tangan. kemudian ditambahkan ethanol absolute (95%) sebanyak dua kali volume supernatan dan 20 µl NaCl. vortex. 3. bak elektroforesa. Bagian atas (supernatan) diambil dan dipindahkan ke dalam mikrotube baru. gel doc. thermocycler. Siapkan microtube seusai jumlah sampel yang akan diekstraksi. Tambahkan 400 µl Phenol-Chloroform-Isoarnyl pada supernatan dan diletakkan dalam kotak es selama 5 menit. gelas beker. masker. tulis label sampel pada tutup microtube dengan marker tahan air. glove. microwave.

. Supernatan yang terbentuk kemudian dituangkan 13. Mikrotube dikeringkan hingga tidak ada lagi ethanol yang tersisa. Supernatan dituangkan/ dibuang 12. Langkah ekstraksi DNA menggunakan Phenol-Chloroform-Isoamyl. 14. biarkan beberapa saat 15. 11. Tambahakan 500 µ1 ethanol 70% kemudian disentrifuse dengan kecepatan maksimal (-15000 rpm) selama 2 menit. Tambahkan double destilated H2O sebanyak 50 µl. Simpan microtube yang berisi hasil isolasi DNA dalam freezer Gambar 1. 15000 rpm) selama 15 menit.

Mahasiswa mampu melakukan visualisasi hasil ektraksi DNA dengan elektroforesa gel Bahan/alat  TBE(IX)  Sampel DNA  Loading dye (Blue juice) . Acara 4. Ion yang bermuatan positif akan bergerak ke elektrode bermuatan negatif. seperti: mass spectrometry. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). DNA sequencing. ukuran dan bentuk. atau protein. RNA. Memperkenalkan mahasiswa dengan aplikasi teknik elektroforesa dalam biologi molekuler 2. Laju migrasi/pergerakan ion berbeda-beda tergantung pada muatan total. selain itu juga digunakan untuk persiapan sebelum digunakan untuk metode lainnya. cloning. PCR. Elektroforesa Pendahuluan Elektroforesa adalah suatu teknik pemisahan yang berdasarkan pada pergerakan/mobilitas ion-ion dalam suatu medan elektrik. atau Southern blotting Tujuan Tujuan praktikum acara ini adalah 1. Elektroforesa gel ini digunakan untuk pemisahan DNA. Apliasi teknik elektrofersa pada biologi molekuler menggunakan media/matrik gel (agarosa atau poliakrilimida). Tujuan penggunaan elektroforesa ini adalah untuk analisis. dan sebaliknya ion bermuatan negatif akan bergerak menuju suatu elektrode positif.

5u.30 men it) 4.l/100 ml Gold View dan goyang pelan-pelan supaya tercampur sempurna.8%) dengan cara sebagai berikut:  Timbang serbuk agarosa 40 mg dan masukan dalam gelas elemeyer  Tambahkan 50 ml TBE (IX). Hasil pemisahan fragmen DNA dilihat dengan menggunakan alat Gel Logic 200 Imaging system. 10. sampai gel cair terlihatjernih  Biarkan sejenak sampai sedikit hangat. Buat gel agarosa (0. Bandingkan pula intensitas pita yang dihasilkan. ditambah satu untuk DNA ladder. Perhatikan ukuran DNA hasil isolasi dengan membandingkan dengan DNA ladder. Lakukan hal yang sama untuk sampel DNA yang akan diuji. biarkan mengeras (20 . 9. Jalankan elektroforesa pada tegangan 100 volt selama 30 menit. . sebelum ditambah 2. Keluarkan sampel DNA dari freezer 2. power supply Cara kerja 1. Pipet DNA ladder (2. 3. Foto dan simpan hasil visualnya dalam folder yang telah ditentukan. Pindah gel yang sudah mengeras ke dalam bak elektrofbresa. 11. tips. goyang sampai agarosanya tercampur merata  Panaskan dalam microwave selama 30-60 detik. dan tambahkan TBE (Ix) sampai gelnya terendam 5. alat elektroforesa horizontal. kemudian masukan dalam sumuran yang pertama pada gel yang sudah disiapkan. 8. Pipet loading dye dan letakan pada plastik/kertas parafm. Larutan agarose (yang sudah tercampur Gold View dan masih hangat) dituangkan kedalam cetakan gel. masing-masing 2 uJ sebanyak sampel DNA yang akan di visualisiasi dengan elektroforesa. pasang sisir sesuai dengan sumuran yang diperlukan. 7. DNA ladder  Agarosa  ddH20  Pipet.5 pi) campur kan dengan loading dye. pada kolom pertama. 6.

12. coli. Enzim yang dipakai pada proses PCR pada pertama kalinnya adalah Klenow - suatu enzim polimerase dari E. PCR telah menjadi metode pemeriksaan dasar dan penting untuk laboratorium riset dan analitik. Acara 5. Penemuan enzim polymerase yang berasal dari Thermus aquaticus. dan segera dirusak pada suhu tinggi. PCR dimanfaatkan untuk deteksi organisme patogen. yang ditemukan oleh Kary Mullis pada April 1983. Dasar-dasar PCR telah dimanfaatkan secara luas dan telah pula di aplikasikan untuk berbagai macam kepentingan khusus seperti karakterisasi gen. mengidentifikasi mutasi-mutasi yang bertanggung jawab terhadap berbagai penyakit keturunan. kloning dan ekspresinya dan juga diagnostik DNA. Polymerase Chain Reaction Pendahuluan Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu metode untuk memperbanyak suatu potongan sekuens secara in vitro. Sejak saat itu. Deskripsi mengenai prosedur metode ini untuk pertama kali dipublikasikan pada tahun 1985. yang tidak mudah rusak pada suhu tinggi dan alat otomatis yang dapat menaikkan suhu (Thermocycler). Buang gel pada tempat yang telah ditentukan dan bersihkan semua peralatan yang digunakan. Tujuan Tujuan praktikum acara ini adalah: . Selain itu DNA fingerprinting telah dimanfaatkan untuk keperluan dunia kedokteran dan kedokteran forensic serta pada ekologi molekuler. yang aktif pada suhu 37 °C . Karya yang menjadi salah satu tonggak penting perkembangkan biologi molekuler ini menganta Mullis memperoleh penghargaan Nobel pada tahun 1993. membuat metode PCR menjadi mudah dikerjakan.

buffer 5. Buat PCR master mix pada microtube (1. 3. 1. 1. dGTP. Gel Logic 200 Imaging system.5 mM MgCh. 0. Masukan ke dalam mesin amplifikasi yang telah diatur kondisi silus amplifikasinya . dan buffer.1. Memperkenalkan prinsip-pinsip dasar PCR 2. 2.5 ml) dengan kornposisi 0. Agarosa 10. Volume diseuaikan dengan banyaknya sampel 4. Coolish box Cara kerja 1. Mengaplikasikan PCR untuk mengaplifikasi suatu fragmen DNA Bahan/alat 1. dTTP). Siapkan cetakan DNA yang akan diamplikasi (hasil dari Acara 3) 3. power supply.5 unit Taq DNA polymerase.25mM dNTPs (campuran empat prekusor deoksinukleotida yaitu dATP. tips.6 mM primer. Tambahkan larutan master mix (24 µl. spin sebentar 6. dGTP. 50 ng cetakan/sampel DNA. alat amplifikasi (PCR) alat elektroforesa horizontal. l. Tag dicampur paling terakhir. dCTP.2 ml) 5. 0.25mM dNTPs (campuran empat prekusor deoksinukleotida yaitu dATP. dCTP. l. Pipet cetakan DNA (1 µl) pada microtube PCR (0. Loading dye (Blue juice) 8.5 mM MgCl2. 4. SampelDNA 7. Siapakan mesin amplifikasi dengan program/kondisi siklus yang diperlukan seusai dengan tujuan 2. dTTP).5 unit Taq DNA polymerase. TBE(IX) 6. Pipet. PCR microtube. DNA ladder 9. ddH2O 11. 1. untuk reaksi 25 µl).

produk PCR dielektroforesa (lihat cara kerja Acara 4) 9. Hasil elektroforesa dilihat dalam Gel Logic 200 Imaging system 10. Setelah selesai. Jalankan mesin amplifikasi 8. dan ukur panjang fragmen dengan membandingkan dengan ladder DNA yang digunakan.7. Perhatikan hasil visualisasinya. .