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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS
BIOLÓGICAS

INTEGRANTES:

 Alcocer Herrera Dulce Mariana
 Álvarez Rangel Jennifer
 Mendoza Gómez Areli Monserrat

PRÁCTICA 4. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA
FORMIATO DESHIDROGENASA Y NITRATO REDUCTASA EN
Escherichia coli

GRUPO: 5IV1 SECCIÓN: 1
EQUIPO: 2

PROFESORAS:

 Carlos Jorge Martínez Canseco

 Refugio Elisa Rivera Pérez

CALIFICACIÓN
ASPECTO MÍN-MAX CALIFICACIÓN
Hipótesis 0.0 – 1.0 puntos
Objetivo 0.0 – 1.0 puntos
Análisis de
resultados 0.0 – 1.0 puntos
finales
Discusión de
resultados 0.0 – 4.0 puntos
Conclusiones 0.0 – 2.0 puntos
Bibliografía 0.0 – 1.0 puntos
TOTAL 0.0 – 10.0
puntos

50 42. .76 extracto Actividad Específica de 0. Objetivo general  Analizar los factores que influyen en la actividad enzimática de formiato deshidrogenasa y nitrato reductasa en Escherichia coli utilizando cadenas de electrones artificiales y cuantificando los productos finales para determinar las condiciones óptimas de la reacción.7654 . Objetivos específicos  Determinar la actividad enzimática específica de formiato deshidrogenasa empleando una cadena artificial de electrones y cuantificar DCFIF reducido por métodos espectrofotométricos.Fecha de entrega: 21 de abril 2017 Hipótesis Si Escherichia coli puede favorecer la síntesis de la enzima nitrato reductasa y formiato deshidrogenasa en condiciones anaerobias.  Determinar la actividad enzimática específica de nitrato reductasa y cuantificar nitritos por el método de Griess. entonces dichas enzimas presentaran mayor actividad en esas condiciones que en aerobiosis. 0.27 38.5118 FoDHasa .65 33. Análisis de resultados finales Extracto de células de Escherichia coli nativa Contenido de crecidas en condiciones: Anaeróbicas Aeróbicas proteínas y Actividades 1 2 3 4 enzimáticas Sin NO3 Con NO3 Con NO3 con NO3 + + Sin + Oligoeleme Oligoeleme Oligoeleme Oligoeleme ntos ntos ntos ntos mg de Proteína/ mL 32.  Determinar la actividad específica del complejo enzimático formado por formiato deshidrogenasa y nitrato reductasa y cuantificar nitritos por el método de Griess.

mientras que en condiciones de aerobiosis el extracto 4 es el que presenta menor actividad de esta enzima.4352 378. Las bacterias tienen diversos tipos de cadenas transportadoras de electrones. si presenta proteínas.8847 477.  El complejo formiato deshidrogenasa –nitrato reductasa presenta mayor actividad en condiciones de anaerobiosis (extracto 1) seguido por el extracto 4 en condiciones de aerobiosis (que tenía en el medio nitrato y oligoelementos).0401 102.5726 NRasa (nMoles NO2 /min/mg Proteína) Actividad Específica del 116. Muchas cadenas respiratorias bacterianas presentan ramificaciones con vías alternativas que transportan los electrones hasta una amplia variedad de aceptores terminales de electrones reflejando la amplia versatilidad de las bacterias. 3) y que en condiciones de aerobiosis (matraz4) además que se observa que en condiciones de anaerobiosis (comparando el matraz 1 y 3) hay mayor actividad de nitrato reductasa sin la presencia de nitratos en el medio. Discusión de resultados Las cadenas respiratorias de las bacterias. 3.6908 37. 2.  En los extractos que se encontraban en condiciones de anaerobiosis se observó mayor contenido de proteínas (extractos 2 y 3) teniendo mayor cantidad el extracto que tenía nitratos y oligoelementos (2). Una determinada bacteria puede modificar su cadena respiratoria como respuesta a muchas variaciones del medio en donde está creciendo. pero son menores (extracto 4). mientras que en condiciones de anaerobiosis el extracto que presenta menor actividad de esta enzima es el 2. 493.4584. .  La enzima formiato deshidrogenasa presenta mayor actividad en el extracto 1 que se encontraba en condiciones de anaerobiosis. comparadas con las de las mitocondrias. el cual no carecía de NO3 ni de oligoelementos.9370 39.7069 complejo (nMoles NO2 /min/mg proteína) Análisis de resultados  En la actividad de nitrato reductasa se observa que se produce mayor cantidad de nitratos en condiciones de anaerobiosis (matraz 2) que en anaerobiosis (matraz 1. El extracto que se encontraba en aerobiosis. presentan 3 aspectos diferenciales característicos: 1. (Δ A 600 nm /min/mg Proteína) Actividad Específica de 177.

funciona una sola cadena respiratoria constituida por NAD. la α-cetoglutarato deshidrogenasa es muy sensible a las condiciones anaerobias. Durante el crecimiento aerobio. La quinona da a su vez electrones a las reductasas terminales y a los complejos de citocromos. Entonces el crecimiento sólo puede proseguir fermentativamente. Figura 1. Las . en este caso se acumulan en el medio una serie de catabolitos secundarios: ac. succinato. Cadena respiratoria con oxígeno como aceptor final de electrones. sin embargo.deshidrogenasa. el NADH + H + puede ser reoxidado por la cadena respiratoria. Láctico. citocromo a y citocromo d. ac. se sintetiza metaquinona. Cuando el nivel de oxigeno disponible es alto. ubiquinona. pero en condiciones anaerobias el NAD + se regenera de otro modo y tienen lugar cambios metabólicos importantes. Al mismo tiempo. El grupo de citocromos utilizados para la respiración con fumarato en ausencia de oxigeno está constituido por citocromos b555 . ac. pudiendo disminuir su actividad hasta interrumpir el ciclo. pero puede también utilizar fumarato y nitrato como aceptores finales de electrones en un sistema que comprende citocromos. cada una de las distintas deshidrogenasas unidas a la membrana (NADH +H + . Fórmico y Etanol.El desarrollo de E. el cual puede ser un producto de la fermentación de los azucares. Las bacterias tienen un ciclo del ácido tricarboxílico funcional. Las cadenas respiratorias pueden utilizar una gran variedad de sustratos.coli en condiciones anaerobias depende de la presencia de un aceptor de electrones apropiado. citocromo b558 . formiato o glicerol-3-fosfato deshidrogenasas) pueden dar electrones a un “pool” común de quinona (ubiquinona-8 en condiciones aerobias y metaquinona en condiciones anaerobias). lactato. El oxígeno accesible puede disminuir como consecuencia del rápido crecimiento bacteriano o cultivar en condiciones de anaerobiosis y entonces aparece citocromo a y un citocromo d que actúa de oxidasa terminal. Acético. En condiciones aerobias la cadena respiratoria tienen al oxigeno como aceptor final de electrones. citocromos b y citocromo oxidasa.

. La función de este enzima es reemplazada por la piruvato formiato liasa. a su vez. La anaerobiosis disminuye la formación de piruvato deshidrogenasa. La fumarato reductasa. aconitasa e isocitrato deshidrogenasa.bacterias de E. las bacterias pueden crecer anaeróbicamente con sustrato no fermentable siempre y cuando esté presente el fumarato como aceptor de electrones exógeno. impidiéndose la formación de succinato. de este modo. Figura 2. sin embargo anaeróbicamente se reducen los niveles de citrato sintasa. la cual produce acetil CoA y formiato. Ciclo de los ácidos tricarboxílicos y brazo reductor que posibilita la síntesis en condiciones anaerobias de succinato a partir de oxalacetato. que produce NADH. uno de los enzimas implicados en la generación de succinato a partir de fumarato. pero se genera el α-cetoglutarato necesario para la biosíntesis. al su vez la α-cetoglutarato deshidrogenasa es drásticamente reprimida en anaerobiosis. es una enzima respiratoria que genera fuerza protonmotriz. convertido en CO2 y H2 por la formiato deshidrogenasa e hidrogenasa.coli tienen un ciclo del ácido tricarboxílico funcional en condiciones aerobias. es necesario para la biosíntesis y se forma por reducción del oxaloacetato. este último. el cual a su vez se genera por carboxilación del piruvato. El formiato es.

tanto su ausencia como su alta concentración presente en el microorganismo puede ser perjudicial y tóxica para su crecimiento. el formiato es oxidado por una formiato deshidrogenasa diferente. deben comprender parte de la formulación del medio debido a que participa en la activación y son parte de las enzimas que catalizan muchas reacciones químicas que la bacteria necesita para reproducirse y seguir viviendo. NR. formiato deshidrogenasa-H. En presencia de nitrato. Cadena respiratoria con nitrato como aceptor final de electrones Los oligoelementos son bioelementos presentes en pequeñas cantidades tanto para los microorganismos como para los seres vivos. CoA. La cadena de transporte que se establece desde el formiato al nitrato permite generar ATP por fosforilación oxidativa. nitrato reductasa. Catabolismo de la glucosa por las bacterias fermentativas que respiran nitrato. Parte de esta práctica fue utilizar las enzimas Nitrato reductasa y Formiato deshidrogenasa en donde se sabe que estos oligoelementos son parte muy importante en su síntesis. siendo transferidos entonces los electrones al nitrato y no formándose hidrogeno. coenzima A. cumplen diversas unciones importantes para el desarrollo y crecimiento de bacterias y seres humanos. FDH-H.Figura 3. son muy necesarios para el crecimiento de las bacterias cuando se quieren aislar en un medio de cultivo. HYD-3 hidrogenasa isoenzima 3. Figura 4.  La enzima nitrato reductasa además de ser inducida por la presencia de Nitrato de Potasio como aceptor final de electrones en su cadena respiratoria para ser activada necesita de un oligoelemento muy importante y que es parte de la síntesis de otras enzimas importantes además de esta el cuál es el Molibdeno y el Fierro por ello está enzima es llamada enzima sulfomolibdeno flavoproteína porque en su .

es decir sin estos presentes en el desarrollo de la bacteria su actividad enzimática se reduce tanto hasta valores de 0. sitio catalítico necesita la incorporación de Fierro y Molibdeno para poder reducir al nitrato a nitritos.  Por otro lado la enzima Formiato deshidrogenasa también necesita la incorporación de Molibdeno y Selenio para que la enzima pueda utilizar al formiato una vez que Escherichia coli ha sido incubada en condiciones de anaerobiosis y con estos oligoelementos es inducida su síntesis tanto por ellos como la presencia de una fermentación ácido mixta donde uno de sus productos finales es el formiato que dará el incremento de la actividad de esta enzima importante para la respiración anaerobia de Escherichia coli. posteriormente se agregaron oligoelementos y nitrato de potasio según lo indica la tabla y se cultivaron los primeros tres en medio estacionario en condición de anaerobiosis mientras que el cuarto se cultivó en condiciones aeróbicas en medio agitado. La actividad del formiato deshidrogenasa determino se cuantificando el 2.coli que se muestran en la tabla de resultados se obtuvieron cultivando células en medios adicionados con glucosa por 18 horas a 37 ˚C.6 DCFIF reducido empleando la siguiente cadena artificial de electrones: . Los extractos celulares de E. Es importante aclarar que tanto la enzima nitrato reductasa y la formiato deshidrogenasa necesitan obligatoriamente estos oligoelementos para presentar su máxima función metabólica.

pero la actividad que se obtuvo experimentalmente no fue esa. La enzima nitrato reductasa es la encargada de la reducción de NO3 a NO2 en condiciones de anaerobiosis ya que al no estar presente el 02 como aceptor final de electrones en la cadena respiratoria de E. estaba en condiciones de anaerobiosis y tenía oligoelementos. de echo es el extracto donde hay menos actividad. pero experimentalmente si presento actividad. En el extracto 3 tenía que haber una actividad baja de la enzima pues aunque tenía el KNO3 y estaba en anaerobiosis. La desnitrificación requiere de un sustrato oxidable (orgánico o inorgánico) por lo que la desnitrificación la pueden realizar bacterias heterótrofas o autótrofas (1). En el extracto 1 se encontraba en anaerobiosis y no había presencia de KNO3 por lo que la nitrato reductasa no tenía que presentar actividad. no había presencia de oligoelementos que le permitan .coli que era de Sypher y Strauss estaba presente NO3 de alguno forma y por eso la enzima pudo presentar actividad.coli en anaerobiosis el NO3 será el encargado de aceptar los electrones. esto se puede deber a que el regulador errores del analista al no adicionar algún reactivo como el regulador de fosfatos para darle a la bacteria el pH que necesitaba para trabajar. pues estaban presentes KNO3 para usarse como aceptor de electrones. esta actividad se podría deber a que en el medio en el que creció E. Actividad de nitrato reductasa. a falta de corriente de nitrógeno en el envase o a un mal sellado del envase durante el proceso. En el extracto 2 se encontraban presente todas las condiciones para que la enzima tenga una actividad mayor a los otros extractos.

por lo tanto el crecimiento que presentara E. por lo que un incremento de proteína en el paquete celular indica que hay mayor concentración de células (2). En el extracto 3 hay una cantidad de proteínas mayor al extracto 1.coli producen nitrato reductasa en su cadena trasportadora de electrones y pueden usar el NO3 como aceptor de electrones en lugar de O2. pero menor al extracto 2 por que tenía NO3. no estaban presente lo oligoelementos. pero le hacía falta oligoelementos que son necesarios para su crecimiento. La producción de proteínas es proporcional al crecimiento de la bacteria. Algunas bacterias como E. . presencia o ausencia de o2. Para que el microorganismo pueda crecer requiere tener todas las condiciones necesarias como: nutrientes. por lo tanto el crecimiento tiene que ser menor al extracto 2.coli tiene que ser una fermentación acido mixta. En el extracto 3 a pesar de tener NO3 y estar en condiciones de anaerobiosis. En el caso del extracto 4 la cantidad de proteínas es baja aunque debería de ser mayor. que se encontraba en aerobiosis.  El crecimiento de una bacteria como E. El extracto 2 es el que presenta mayor cantidad de proteínas pues tenía las condiciones óptimas para crecer. por lo tanto la producción de proteínas también. En el extracto 4 E. incluso mayor a los extractos con condiciones de anaerobiosis. pero experimentalmente presenta una alta actividad. Y en el extracto 4. etc. NO3 y oligoelementos) pudiendo realizar la respiración anaerobia. coli está en condiciones de aerobiosis por lo tanto prefiere usar el O2 como aceptor de electrones que el NO3. donde la producción de proteínas es proporcional al crecimiento de la bacteria. el sustrato que uso la bacteria es glucosa y como las fermentaciones son oxidaciones incompletas del sustrato se espera poco crecimiento de la bacteria. En el experimento se observa que el extracto 1 se encuentra en anaerobiosis. por lo tanto el crecimiento tiene que ser mayor. tener una buena actividad. no tenía que haber nada de actividad de la enzima pues E coli prefiere usar el O2 como aceptor final de electrones en lugar de NO3.coli puede sintetizar nitrato reductasa el tener en el medio compuestos con NO3 y estar en condiciones de anaerobiosis. El extracto 2 contaba con todos los medios para un buen crecimiento (condiciones de anaerobiosis.coli y que solo oxido la glucosa de forma parcial. CONCLUSIONES:  E. no tiene NO3 ni O2. este resultado se puede deber a que la cantidad de O2 que se encontraba en el envase no estaba limitada. Experimentalmente el extracto 1 presenta poco cantidad de proteínas debido a las condiciones en las que se encontraba E.coli dependerá de las condiciones en las que se encuentre.  Determinación de proteínas.

Páginas: 135-139.G. Editorial Reverté S. pp: 182. Antonio Juárez. [2] D.unac. “Bioquímica de los Microorganismos”.PDF .BIBLIOGRAFÍA: [1] Ramón Parés. 1997. 1987.fquim.A.mx/amyd/archivero/U4c_MedicionCrecimiento_17 801.A México. México. (3)http://www. Nicholls "Bioenergética Introducción a la teoría quimiosmótica" es de Editorial Reverté S.edu. 191-198.pdf (4)http://depa.unam.pe/documentos/organizacion/vri/cdcitra/Informes_Fin ales_Investigacion/Octubre_2011/IF_DECHECO %20EGUSQUIZA_FIPA/CAPITULO%20N%BA%2005.