BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

LABORATORIO No 3: SEPARACIN POR GRADIENTES DE DENSIDAD

(FICOLL-HYPAQUE)

1. INTRODUCCIN

Es necesario para realizar los estudios funcionales de clulas mononucleares de

sangre perifrica, el aislamiento de stos a partir de muestras de sangre, rganos
linfoides u otros tejidos. Este aislamiento se puede realizar por varios mtodos
pero en esta ocasin vamos a hacer referencia a la Separacin por gradiente de
densidad, utilizaremos la centrifugacin sobre una solucin de densidad definida
como es el Ficoll-Hypaque. El Ficoll es un polmero de carbohidrato y metrizamida
(compuesto denso que contiene yodo) y que permite que se hundan los eritrocitos
y los granulocitos (debido a su mayor densidad = 1.077), y que floten las clulas
mononucleares (linfocitos y monocitos); por ello, que tras la centrifugacin nos
ser fcil obtener las clulas mononucleares de sangre perifrica.

2. OBJETIVOS

Identificar las etapas y fundamentos indispensables para la separacin de

CMSP.
Realizar un procedimiento rpido y accesible para la obtencin de CMSP
para su posterior utilizacin en la extraccin de ARN.

3. MARCO TEORICO

Es un sistema que se suele realizar empleando la ultracentrfuga. Consiste en la

separacin de las partculas en funcin de su densidad de flotacin. La muestra se
dispone por encima o se mezcla con un gradiente de densidad ms pronunciado
que el del caso anterior, y que contiene una concentracin muy elevada de
sacarosa o de cloruro de cesio. Al centrifugar cada componente subcelular se
desplazar hacia arriba o hacia abajo hasta que alcance una posicin en la que su
densidad sea igual a la de su entorno (situacin de flotabilidad neutra) y ya no se
desplazar ms. Como consecuencia se producirn una serie de bandas
discretas, las ms prximas al fondo del tubo contendrn las partculas con mayor
densidad de flotacin. Este mtodo tambin se conoce como equilibrio en
gradiente de densidad.

Se emplean diferentes sustancias para conseguir los gradientes de densidad,

como son sacarosa, percol, cloruro de cesio, y el Ficoll. Los gradientes pueden ser
autogenerados como es el caso de los basados en cloruro de cesio en que se
forman en el propio proceso de centrifugacin, o preformados como es el caso de
la sacarosa o del percol. En este ltimo caso la preparacin se realiza antes de la
centrifugacin mediante un formador de gradientes, dispositivo que consiste en
dos cubetas conectadas por la base y con agitacin en las que se colocan las
soluciones con los dos extremos de concentracin. A medida que se va sacando
de una de ellas la otra reemplaza el lquido extrado y modifica linealmente la
concentracin.

En la centrifugacin por gradiente de densidad, la separacin de una muestra se

logra por sedimentacin a travs de un gradiente de densidad, esto es, una
solucin que incrementa en densidad desde la parte superior hacia la inferior del
tubo de centrifuga. Dos aproximaciones distintas son posibles usando esta
tcnica; centrifugacin zonal y centrifugacin de equilibrio en gradiente.

Las soluciones de Ficoll-Hypaque consisten en un medio de polisucrosa y

radiopaco, la cual est ajustada a una densidad de 1,077. Cuando la sangre se
extiende sobre el Ficoll y se expone a fuerzas centrfugas, las clulas
mononucleares permanecen entre el plasma y la solucin HISTOPAQUE, mientras
que los eritrocitos y los granulocitos gravitan hacia el fondo. Sera viable crear un
sistema por el que las clulas de las series mieloides tambin pudieran ser
cosechadas empleando un procedimiento de un solo paso.

4. PRE-LABORATORIO

Explique detalladamente el fundamento de la separacin por gradientes de

densidad.

Detalle cmo se realiza una separacin por sacarosa, cloruro de cesio, percol.

5. PRECAUCIONES

Las muestras obtenidas si se destinan para cultivo se les deben realizar 3 lavados
con SSE, pues el Ficoll-Hypaque es una solucin a largo plazo txica para las
clulas.

6. MATERIALES Y REACTIVOS
MATERIALES

Tubos Falcn para centrfuga de 15 mL estriles (2 tubos)

Tubos Falcn de plstico de 50 mL estril (1 tubo)
Ficoll-Hypaque (4 mL)
Suero Fisiolgico estril (50 mL)
Pipetas Pasteur de plstico estriles
Guantes de ltex o vinilo estriles
Gradilla
 Centrfuga
Campana de flujo laminar (en caso de no disponer de una, disponer de un
ambiente donde trabajar con la mxima esterilidad posible)

7. PROCEDIMIENTO

1. Obtener la muestra de sangre en tubo lila o verde con medidas de

bioseguridad.

2. Diluir la sangre en proporcin 1:1 en Solucin Salina Estril (SSE)

3. Dispensar 2 mL de Ficoll-Hypaque en tubo Falcn de 15 mL

4. Cargar 8 mL de sangre diluida con suero fisiolgico y dispensar muy

cuidadosamente y lentamente sobre el Ficoll-Hypaque en el tubo de
centrifuga. Poner el tubo inclinado y apoyar la punta de la pipeta sobre la
pared del tubo para dejar deslizar la sangre suavemente sobre el Ficoll y
poder formar una interfase (Ficoll abajo y sangre arriba).

5. Centrifugar a 1500 r.p.m. durante 30 minutos, a temperatura ambiente y sin

freno al final de centrifugacin.

6. Retirar cuidadosamente de la centrifuga y llevar a la gradilla. Verificar la

formacin de las fases de gradiente de densidad (arriba el plasma
sanguneo, debajo la banda de clulas mononucleares, debajo el Ficoll-
Hypaque, debajo las clulas PMNs y debajo los eritrocitos aglutinados).
7. Extraer toda la banda de clulas mononucleares utilizando pipetas Pasteur
de plstico y dispensar en tubo de centrifugacin nuevo. Dispensar la
banda en un nico tubo de centrifugacin y luego completar hasta 10 mL
con suero fisiolgico. Cubrir tubo y llevar a centrifugacin.

8. Centrifugar con contrapeso a 1500 r.p.m. durante 10 minutos, a 4C

pudiendo utilizar freno al final de la centrifugacin.

9. Extraer tubo de la centrfuga sin agitarlo.

10. Decantar sobrenadante y resuspender clulas del fondo con un pulso de

vrtex o con golpes con las yemas de los dedos.

11. Completar nuevamente hasta los 10 mL con suero fisiolgico, cubrir tubo y
llevar nuevamente a centrifugar igual que en el paso anterior.

12. Centrifugar con contrapeso a 1500 r.p.m. durante 10 minutos, a 4C

pudiendo utilizar freno al final de la centrifugacin.

13. Decantar sobrenadante y resuspender clulas del fondo con un pulso de

vrtex o con golpes con las yemas de los dedos, y pasar a un tubo
eppendorf de 1,5 mL.

14. Agregar 1 mL de TRIzol y dejar incubar.

15. Realizar protocolo de extraccin de ARN.

8. POST-LABORATORIO

1. A qu se le denomina una centrifugacin diferencial?

2. En qu consiste una centrifugacin isopcnica?
3. Consulte y explique detalladamente otras tcnicas de centrifugacin

9. BIBLIOGRAFA

- English D, Andersen BR: Single-step separation of red blood cells.

Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density
gradient of ficoll-hypaque. J Immunol Methods 5:249, 1974
- Catlogos y fichas tcnicas 2012 de las casas comerciales: Invitrogene,
Promega, Biorad, Biologend, Bioline, etc.
- David, L.G. Dibner, M.D.& Battery, J.F. Bassin methods in molecular
biology. Elsiever Science Publishing Co. Ind. NY. 1986
- Perbal, B. A practical guide to molecular cloning. 2nd edition John Wiley 6
Sons, 1988
- Sambrook, J. et al. 1989 Molecular cloning: a Laboratory Manual, 2nd
edition, Col Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
- Catlogos de los Kit de Promega, Corpogen, Dnazol y Probes

10. AUTOEVALUACION.

NUMERO DE LOGRO FORTALEZAS DEBILIDADES SUGERENCIAS

LA PRACTICA (Objetivos A CADA
cumplidos) DEBILIDAD
SI NO