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Facultad biologa Xalapa


Manual de Prcticas Biomolculas

Prctica No. 1
Propiedades Qumicas de los Alcoholes

Sustento Terico
Las propiedades qumicas generales de los alcoholes, varan en su velocidad y en su
mecanismo, segn que el alcohol sea primario, secundario o terciario. Las que dependen del
desplazamiento del hidrogeno del grupo oxhidrilo son ms rpidas con los alcoholes
primarios, mientras que en las que se sustituye el oxhidrilo son ms fciles que en los
alcoholes terciarios. Los tres grupos de alcoholes poseen propiedades qumicas particulares,
las cuales permiten distinguirlos y adems usarlos para obtener diferentes tipos de
compuestos orgnicos. En todos los casos la velocidad disminuye con el incremento de la
cadena. As, los alcoholes primarios por oxidacin dan aldehdos o cidos carboxlicos,
mientras que los secundarios forman cetonas y los terciarios no se oxidan en medio bsico
o neutro. Otras, como la formacin de haloformos, son caractersticas del etanol y todos los
metilalquilcarbinoles y metilcetonas.

Los metales, particularmente los alcalinos, desplazan al hidrogeno del oxhidrilo formando
alcoxidos. Con los cidos grasos, los alcoholes forman esteres, usualmente con olores de
frutas o flores. Como el hidrogeno del oxhidrilo es desplazado por el grupo acilo del cido.
Los alcoholes primarios son muy reactivos y los terciarios son muy lentos; en cualquier
forma, es necesario aadir un catalizador (cido sulfrico, cloruro de hidrogeno, etc.), para
acelerar la reaccin.

Objetivos
Analizar las caractersticas de los alcoholes como grupos funcionales de otras molculas de
importancia Biolgica

Materiales y Mtodo
Materiales
Tubos de ensaye
Portaobjetos
vaso de precipitados de 100ml

Reactivos
Alcohol etlico
Lugol Alcohol Isoproplico
Hidrxido de potasio al 20%, Alcohol Amlico
cido Actico cido Sulfrico
Metanol cido Saliclico
cido Sulfrico Concentrado Dicromato De Sodio Al 10%
Etilenglicol Glicerina
Alcohol N-Amlico Octanol

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Manual de Prcticas Biomolculas

alcohol tert-amilco
Equipo
Bao Mara Microscopio

Procedimiento

Prueba del yodoformo


1. Etiquete un tubo de ensaye
2. Agregue 10 ml de alcohol etlico (etanol)
3. Adicione 10 ml de lugol (solucin de yodo-yoduro de potasio)
4. Agregue gota a gota una solucin de hidrxido de potasio al 20%, hasta que
desaparezca la coloracin del lugol.
5. Calentar en bao Mara 4 minutos
6. Deja enfriar
7. Coloque una gota de esta solucin sobre un porta objetos
8. Observe los cristales formados usando un microscopio o una buena lupa y dibuje el
campo microscpico
9. Recoja el precipitado formado
10. Lvelo con un poco de agua,
11. Squelo y determine el punto de fusin (yodoformo, p.f 119c).
12. Entregue este precipitado

Esterificacin
1. Etiquete tres tubos de ensayo de 20 mL para etanol otro para alcohol isoproplico y
el tercero para alcohol amlico
2. Adicionar 3 mL de cada uno de los alcoholes marcados
3. Agregar 3 mL de acido actico y 0.5 mL (10 gotas) de cido sulfrico, este ltimo
como catalizador
4. Calentar en bao Mara hasta la ebullicin durante 3 minutos
5. Verter la mezcla sobre 50 ml de agua helada, contenida en un vaso de precipitados
de 100ml.
6. Procure identificar el olor, observe si es agradable, si de frutas o flores
7. Por separado, esterifique 3 mL de metanol o etanol con 0.5 g de cido saliclico
8. Aada 1ml de cido sulfrico como catalizador
9. Huela el aroma de los productos obtenidos. Procure identificarlo con el aroma de un
producto medicinal es diferente o parecido el olor de los steres obtenidos en la
primera parte del experimento?

Oxidacin de alcoholes
1. Ponga en un tubo de ensayo de 20 mL,
2. Adicione 3mL de una disolucin acuosa de dicromato de sodio al 10%
3. Adale 4 gotas de cido sulfrico concentrado y 3mL de etanol.
4. Con precaucin caliente la mezcla.
5. Anote los cambios de color y olor de la disolucin.
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6. Repita el experimento usando alcohol isoproplico, etilenglicol, glicerina, alcohol


tert-amilco, alcohol n-amilco y octanol.
7. Resuma los resultados de los experimentos en la tabla siguiente
8. Disctalos y anote las conclusiones ms pertinentes.

Alcohol %de OH en Reaccin Olor del Formacin Tiempo de


ROH con ster de xantatos reaccin
Na2Cr2O7 con sodio

Escriba y balancee las ecuaciones correspondientes a un ejemplo de cada uno de los


experimentos.

Resultados

Discusin y conclusiones

Bibliografa
Ritter F. O. Differentiating between primary, Secondary and tertiary alcohols J. Chem.
Educ., 30, 395 (1953)

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Manual de Prcticas Biomolculas

Prctica No. 2
Caractersticas de los Carbohidratos por la Reaccin de Molish

Sustento Terico
Se sugiere hacer las siguientes pruebas en algunos carbohidratos que se consideran
tpicos de cada grupo. Monosacridos (glucosa, fructosa, galactosa (hexosa), rabinosa,
xilosa (pentosa). Disacridos (lactosa, maltosa, sacarosa) y polisacridos (celulosa,
glicgeno, insulina y almidn). Molish y antrona

Un azcar tratado con a-naftol y cido sulfrico concentrado, produce una coloracin
violeta. Se presume que el cido sulfrico acta como deshidratante

Formando derivados del tipo de los furfurales que reaccionan con el a-naftol para
dar productos coloreados.

Objetivos
Identificar carbohidratos presentes en diferentes muestras

Materiales y Mtodo
Materiales
Tubos de ensaye

Muestras Biolgicas
Muestras Biolgicas para
identificacin de carbohidratos
Reactivos
cido sulfrico concentrado Muestras de carbohidratos
degrado analtico
Reactivo de Molish. Preparar
fresco
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Procedimiento.

1 Prepare una serie de tubos limpios, conteniendo 2 ml de cada una de las muestras de
azcares
2 Agregue dos gotas del reactivo de Molish y mezcle
3 Con los tubos inclinados, agregue por la pared del tubo 1ml de cido sulfrico
concentrado, hasta formar dos capas (no mezcle).
4 Observe cualquier cambio de color en la interfase de los dos lquidos.
5 Prepare un control negativo, adicionando agua en lugar del carbohidrato a ensayar

Resultados

Discusin y conclusiones

Bibliografa
Berezov TT, Korovkin BF (1992) Chemistry and metabolism of carbohydrates. En Berezov
TT, Korovkin BF (eds): Biochemistry, 1 Ed. Editorial Mir Publishers Moscow (Mosc,
Rusia), pp. 215 256. 8
DOcon MC, Garca MJ, Vicente JC (1998): Estudio general del metabolismo de los
hidratos de carbono. En DOcon MC, Garca MJ, Vicente JC (eds): Fundamentos y
Tcnicas de Anlisis Bioqumico, 1 Ed. Editorial Paraninfo (Madrid, Espaa), pp. 53 72.
Harris RA (2004): Metabolismo glucdico I: Principales rutas metablics y su control. En
Devlin TM (eds): Bioqumica, 4 Ed. Editorial Revert (Barcelona, Espaa), pp. 597 664.
Muoz E (1988): Propiedades qumicas de los azcares. En Lozano JA, Tudela J (eds):
Prcticas de bioqumica. Experimentacin y Simulacin, 1 Ed. Editorial Sntesis (Madrid,
Espaa), pp. 65 70.

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Prctica No. 3
Caractersticas de los Carbohidratos por la Reaccin de Antrona

Sustento terico
La reaccin con antrona, es otra prueba general para carbohidratos. Para esta tcnica, el
furfural formado, reacciona con el reactivo de antrona (10 ceto 9,10 dihidroantraceno)
dando un complejo azul verdoso)

Objetivos
Identificacin de carbohidratos en muestras biolgicas

Materiales y Mtodo

Materiales
Tubos de ensaye

Material Biolgico
Muestras Biolgicas para
identificacin de carbohidratos
Reactivos
Solucin de antrona Muestras de Carbohidratos de
grado analtico

Procedimiento.

1. Prepare tubos etiquetados con las muestras a probar


2. Agregar 2 mL de antrona y cinco gotas de la muestra de carbohidratos
3. Mezclar fuertemente y observar cambio de color

Resultados

Discusin y conclusiones

Bibliografa
Shields, R. y W. Burnett. 1960 Anal Chem. 32, 88
Keleti, G. y W. Liederer. 1974. Handbook of micromethods for the Biological Sciences

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Prctica No. 4
Cuantificacin de Hexosas con reactivo de antrona (mtodo micro)

Sustento terico
El principio de la reaccin es la descondensacin de antrona con el derivado furfural del
azcar. Los aminoazucares y N acetilamino azucares no reaccionan con este reactivo
El principio de la reaccin es la descondensacin de antrona con el derivado furfural del
azcar. Los aminoazucares y N acetilamino azucares no reaccionan con este reactivo

Objetivos
Identificar carbohidratos presentes en muestras diferentes muestras

Materiales y Mtodo
Materiales
Tubos de ensaye
Pipetas de 10 Ml

Reactivos
Antrona 0.2% en Sulfrico. Stock de D- galactosa 100 g/mL
Prepararla al momento
Stock de D manosa 100 g/mL

Equipo
Bao Mara Espectrofotmetro
Nota: La solucin de trabajo, se preparara al momento diluyendo la solucin stock 1:10)

Procedimiento
1. Colocar 500 mL de muestra en tubos de ensayo en bao de hielo durante 45 minutos
2. Agregar gota a gota 1 mL de antrona 0.2%
3. Agitar en bao de hielo y tapar los tubos
4. Colocar en bao de agua a 92 durante 8 minutos
5. Retornar los tubos a bao de hielo para detener la reaccin. Coloracin Verde
azulosa
6. Leer a 620 nm
Resultados

Discusin y conclusiones

Bibliografa
Shields, R. y W. Burnett. 1960 Anal Chem. 32, 88
Keleti, G. y W. Liederer. 1974. Handbook of micromethods for the Biological Sciences

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Prctica No. 5
Cuantificacin de Glucosa (Mtodo de Fehling)

Sustento terico
Es una solucin que descubri el alemn Hermann Von Fehling y se caracteriza
fundamentalmente por su utilizacin como reactivo para la determinacin de azcares
reductores, es decir demostrar la presencia de glucosa o sus derivados como la sacarosa o la
fructosa, tambin se lo conoce como licor de Fehling.

Est formado por dos soluciones acuosas que son: sulfato de cobre cristalizado y sal
seignette o tartrato mixto de potasio y sodio. Es importante tener en cuenta que ambas se
guardan separadas hasta el momento en el que vayan a ser utilizadas para de esa manera
evitar la precipitacin del hidrxido de cobre.

Su accin se fundamenta en el poder reductor del grupo carbonilo de los aldehdos el cual
se oxida a cido y se reduce la sal de cobre en medio alcalino a xido de cobre, formando
un precipitado de color rojo.

El reactivo de Fehling se fundamenta principalmente, en su reaccin, la oxidacin de cobre,


el poder reductor de los azcares, sea este en monosacridos, polisacridos, aldehdos y en
ciertas cetonas.
Este ensayo pone de manifiesto la presencia de azucares reductores (aldosas: glucosa,
ribosa, eritrosa). Se trata de una reaccin redox en la que el grupo aldehdo (reductor) de los
azcares es oxidado a grupo cido por el Cu2+ que se reduce a Cu+ . Tanto los
monosacridos como los disacridos reductores reaccionan con el Cu2+ dando un
precipitado rojo de oxido cuproso. La reaccin tiene lugar en medio bsico por lo que es
necesario introducir en la reaccin tartrato sdico-potsico para evitar la precipitacin del
hidrxido cprico. La prueba de Fehling no es especfica; otras sustancias que dan reaccin
positiva son los fenoles, aminofenoles, benzona, cido rico, catecol, cido frmico,
hidrazobenceno, fenilhidrazina, pirogalol y resorcinol. La reaccin es la siguiente:

2 Cu 2+ + R-CHO Cu2O + R-COOH


(Azul) ( Rojo)

Objetivos
Identificacin de azcares reductores en muestras biolgicas

Materiales y Mtodo

Materiales
Tubos de ensaye

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Manual de Prcticas Biomolculas

Reactivos
Solucin de Tunstomolibdato Reactivo cupro-bisulfito
cido sulfrico 0.62 N Reactivo de cido fosfomolbdico
Reactivo de Fehling A Solucin patrn de glucosa
Reactivo de Fehling B

Equipo
Bao Mara

Procedimiento
1 Preparar y etiquetar una serie de tubos con 3 mL de muestra.
2 Incluya un control con 2 ml de agua destilada.
3 Agregue 1 ml del reactivo de Fehling A y 1 mL del reactivo B, mezclar
4 Calentar en bao de Mara a ebullicin durante 5 min.
5 Observar
La reaccin se considera positiva si se forma un precipitado rojo (oxido cuproso)

Resultados

Discusin y conclusiones

Bibliografa
Berezov TT, Korovkin BF (1992): Chemistry and metabolism of carbohydrates. En
Berezov TT, Korovkin BF (eds): Biochemistry, 1 Ed. Editorial Mir Publishers Moscow
(Mosc, Rusia), pp. 215 256.
DOcon MC, Garca MJ, Vicente JC (1998): Estudio general del metabolismo de los
hidratos de carbono. En DOcon MC, Garca MJ, Vicente JC (eds): Fundamentos y
Tcnicas de Anlisis Bioqumico, 1 Ed. Editorial Paraninfo (Madrid, Espaa), pp. 53 72.
Harris RA (2004): Metabolismo glucdico I: Principales rutas metablics y su control. En
Devlin TM (eds): Bioqumica, 4 Ed. Editorial Revert (Barcelona, Espaa), pp. 597 664.
Muoz E (1988): Propiedades qumicas de los azcares. En Lozano JA, Tudela J (eds):
Prcticas de bioqumica. Experimentacin y Simulacin, 1 Ed. Editorial Sntesis (Madrid,
Espaa), pp. 65 70.
McKee T, Mckee JR (2003): Hidratos de carbono. En Mckee T, McKee JR (eds):
Bioqumica. La base molecular de la vida, 3 Ed. Editorial McGraw-Hill Interamericana
(Madrid, Espaa), pp. 200 233.

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Prctica No. 6
Cuantificacin de Glucosa (Mtodo de Benedict)

Sustento terico
Reacciones de azuzares reductores
Los carbohidratos, que poseen un aldehdo libre o potencialmente libre o un grupo
cetnico, tienen propiedades reductoras en solucin alcalina. Adems, los monosacridos
actan como agentes reductores en soluciones dbiles cidas.

En la modificacin de la prueba de Fehling introducida por Benedict, se usa nicamente


una solucin, lo cual la hace mucho ms simple, con la ventaja adicional de que el reactivo
es ms estable que el Fehling.

La reaccin se efecta entre un reactivo cprico con bisulfito sdico y la glucosa. Otras
sustancias reductoras, diferentes de la glucosa, no reaccionan con este reactivo.

Si la intencin es medir la glucosa sangunea, previamente se tendr que desproteinizar por


precipitacin. Para ello puede efectuarse el filtrado de Folin-Wu. Reacciones para
aldehidos y azcares reductores

Azcares reductores tratados con solucin alcalina suave (citrato-carbonato de


Sodio) de in cprico, lo reducen a xido cuproso de color ladrillo.

Objetivos
Identificar azucares reductores y aldosas en muestras biolgicas

Materiales y Mtodo
Materiales
Tubos de ensaye

Material Biolgico
Muestra de sangre

Reactivos
Solucin de Tunstomolibdato Reactivo cupro-bisulfito
cido sulfrico 0.62 N Reactivo de cido fosfomolbdico
Disolucin de cido Solucin patrn de glucosa
tunstomolbdico
Reactivo cprico Reactivo de Benedict
Disolucin de metabisulfito sdico
al 1%

Equipo

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Centrifuga clnica Bao Mara


Espectrofotometro

Procedimiento
I. Carbohidratos en muestras de tejidos

1. En un tubo de centrifuga colocar 4.9 mL de solucin de cido tunstomolbdico y


agregar 0.1 mL de sangre
2. Mezclar bien y dejar reposar al menos 1 minuto, luego centrifugar durante 5
minutos en centrifuga clnica
3. Transferir a un tubo de ensayo 2 mL de sobrenadante, agregar 1 mL de reactivo
cupro-bisulfito y 1 mL de agua
4. Del patrn diluido, se tratan 2 mL de manera similar.
5. Calentar 5 minutos en bao de agua en ebullicin, enfriar y adicionar 2 mL de
reactivo fosfomolbdico.
6. Agregar 6.5 mL de agua desionizada. Mezclar y leer en el espectrofotmetro a 650 -
700 nm

Clculos
2 ml de lquido sobrenadante desproteinizado corresponden a 0.04 mL de sangre y 2 mL de
patrn diluido contienen 0.1 mg de glucosa

Entonces
mg de glucosa por 100 mL de sangre = lectura de problema/lectura del patrn 0.1
100/0.04
Si se trata de valores comprendidos entre 300 y 600 mg/100 mL se debe soluir hasta 25 mL

II. Carbohidratos en muestras biolgicas y de grado analtico

Procedimiento
1. En tubos etiquetados para cada muestra, agregue 5 gotas del carbohidrato a ensayar,
2. Adicione 2 mL de reactivo de Benedict
3. Coloque los tubos en un bao de agua hirviendo durante 5 minutos
4. Observe los resultados
5. Examine la sensibilidad de la prueba de Benedict usando diluciones crecientes de
glucosa

Resultados

Discusin y conclusiones

Bibliografa
Benedict, S. 1931. J Biol. Chem. 92: 141
Varley, H. 1958. Mtodos de Anlisis Clnicos y su interpretacin Bioquimica. Tecnos,
Madrid. 40-42

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Prctica No. 7
Cuantificacin de Cetosas o aldosas (Mtodo de Selivanoff)

Sustento terico
Los carbohidratos o hidratos de carbono estn formados por carbono (C), hidrgeno (H) y
oxgeno (O) con la frmula general (CH2O)n. Los carbohidratos incluyen azcares,
almidones, celulosa, y muchos otros compuestos que se encuentran en los organismos
vivientes.

Los carbohidratos bsicos o azcares simples se denominan monosacridos. Azcares


simples pueden combinarse para formar carbohidratos ms complejos. Los carbohidratos
con dos azcares simples se llaman disacridos. Carbohidratos que consisten de dos a diez
azcares simples se llaman oligosacridos, y los que tienen un nmero mayor se llaman
polisacridos.

Los azcares son hidratos de carbonos generalmente blancos y cristalinos, solubles en agua
y con un sabor dulce. Los glcidos cumplen un papel muy importante en nuestro
organismo, que incluyen las funciones relacionadas con el tema energtico, el ahorro de las
protenas, la regulacin del metabolismo de las grasas y el tema estructural. Esta prueba es
especfica para las cetosas. Las cetosas se deshidratan ms rpidamente que las aldosas,
dando furfurales. Estos se condensan con el resorcinol produciendo un complejo coloreado.
Si el tiempo de ebullicin se prolonga, puede dar tambin positivo para otros azcares

La prueba de Seliwanoff es una prueba qumica que se usa para distinguir entre aldosas y
cetosas. Los azcares son distinguidos a travs de su funcin como cetona o aldehdo. Si el
azcar contiene un grupo cetona, es una cetosa, y si contienen un grupo aldehdo, es una
aldosa. Esta prueba est basada en el hecho de que, al calentar las cetosas son deshidratadas
ms rpido que las aldosas.(paul ipiales)

Los carbohidratos se clasifican como cetosas o aldosas. Vale decir, que las cetosas en el
carbono 2 tienen una funcin cetona, que en presencia de un cido fuerte producen
rpidamente derivados furfricos que reaccionan con un difenol llamado resorcina que est
contenido en el reactivo de Seliwanoff. La sacarosa (un disacrido formado por glucosa y
fructosa) y la inulina (un polisacrido de la fructosa) dan positiva la reaccin, ya que el
HCl del reactivo provoca en caliente la hidrlisis del compuesto liberando fructosa
(responsable de la reaccin positiva).

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Objetivos
Identificar qu azcares problemas son cetosas o aldosas mediante la prueba de Seliwanoff.

Materiales y Mtodo
Materiales
Tubos de ensaye
Pipetas

Material Biolgico

Reactivos
Reactivo de Selivanoff Carbohidratos de grado analtico

Equipo
Bao Mara

Procedimiento
1 Etiquete un tubo de ensaye y coloque 1 ml del reactivo de Selivanoff
2 Agregue 1 ml de las soluciones de carbohidratos a determinar, agitar.
3 Calentar a ebullicin durante 1 minuto en bao Maria
4 Observe la aparicin de color rojo intenso (cetosas) o rosa (aldosas) e identifique el
complejo que lo forma.

Resultados

Discusin y conclusiones

Bibliografa
Berezov TT, Korovkin BF (1992) Chemistry and metabolism of carbohydrates. En Berezov
TT, Korovkin BF (eds): Biochemistry, 1 Ed. Editorial Mir Publishers Moscow (Mosc,
Rusia), pp. 215 256. 8
DOcon MC, Garca MJ, Vicente JC (1998): Estudio general del metabolismo de los
hidratos de carbono. En DOcon MC, Garca MJ, Vicente JC (eds): Fundamentos y
Tcnicas de Anlisis Bioqumico, 1 Ed. Editorial Paraninfo (Madrid, Espaa), pp. 53 72.
Harris RA (2004): Metabolismo glucdico I: Principales rutas metablics y su control. En
Devlin TM (eds): Bioqumica, 4 Ed. Editorial Revert (Barcelona, Espaa), pp. 597 664.
Muoz E (1988): Propiedades qumicas de los azcares. En Lozano JA, Tudela J (eds):
Prcticas de bioqumica. Experimentacin y Simulacin, 1 Ed. Editorial Sntesis (Madrid,
Espaa), pp. 65 70.
McKee T, Mckee JR (2003): Hidratos de carbono. En Mckee T, McKee JR (eds):
Bioqumica. La base molecular de la vida, 3 Ed. Editorial McGraw-Hill Interamericana
(Madrid, Espaa), pp. 200 233.

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Prctica No. 8
Cuantificacin de Cetosas o aldosas (Mtodo de Tollens)

Sustento terico
Esta prueba es anloga a la de Selivanoff, pero para el reconocimiento de
galactosa y sus derivados. La galactosa, algunas pentosas y el cido glucurnico
dan un color rojo con el HCl y floroglucina. La glucosa da tambin un color rojo
con la floroglucina, pero muy opaco, en contraste con el color rojo transparente
de la galactosa.

Objetivos
Identificacin de cetosas y aldosas en muestras biolgicas

Materiales y Mtodo
Materiales
Tubos de ensaye
Pipetas
Material Biolgico
Muestras Biolgicas de carbohidratos Carbohidratos de grado analtico
Reactivos
Reactivo de Tollens
Equipo
Bao Mara

Procedimiento
1. Etiquete tubos de ensaye para los carbohidratos a ensayar
2. Agregue 2 mL de las soluciones de azcar a probar en cada tubo
3. Agregue 2 mL de cido clorhdrico concentrado y mezcle
4. Adicione 0.1 mL de reactivo de Tollens
5. Caliente a ebullicin en bao Mara
6. Observe

Resultados

Discusin y conclusiones

Bibliografa
Morrison, J.Boyd, R. (1976). Qumica orgnica: Bioqumica. Estados Unidos
Morales. (2005)Reconocimiento de los monosacridos, disacridos y de los polisacridos,
Universidad Nacional del Callao, Lima-Per J. Ernesto Luquet. (2010). Bioqumica:
Carbohidratos, San Juan de Pasto
Teijn, J.Garrido, A, Villaverde, C. Blanco, M. Mendoza, C. Ramirez, J. (2005).
Fundamentos de Bioqumica Estructural: Hidratos de Carbono. Mxico, D.F.
Brown, L.Bursten, M. (2009). Qumica, La ciencia central: Carbohidratos. Mxico, D.F.
Wade L.G. (2004). Qumica Orgnica . Madrid, Espaa: Pearson Educacin S.A.

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Prctica No. 9
Cuantificacin de Cetosas o aldosas (Mtodo de Barfoed)

Sustento terico
Esta prueba sirve para el reconocimiento de monosacridos. En medio cido, tan
slo los monosacridos son capaces de reducir el Cu 2+ a Cu+. El Cu+ as
producido reduce al cido fosfomolbdico a un complejo de intenso color azul
oscuro.

Objetivos
Identificacin de cetosas o aldosas en muestras biolgicas

Materiales y Mtodo
Materiales
Tubos e ensaye Gradilla
Pipetas
Material Biolgico

Reactivos
Reactivo de Barfoerd Carbohidratos de grado analtico
Equipo
Bao Mara

Procedimiento

1 Coloque 1 ml de sus soluciones de monosacridos en tubos limpios, y como control


negativo, agregue un tubo con 1 ml de un disacrido.
2 Agregue 2 ml del reactivo de Barfoed, mezcle
3 Caliente a ebullicin durante 3 minutos
4 Enfriar en agua durante 2 minutos y observe.
La prueba es positiva si aparee una coloracin azul

Resultados

Discusin y conclusiones

Bibliografa
Mark Bergy , jeremy ; StryerLubert,John L. Tymoczko.: BIOQUMICA,PAG 309
John McMurry,CengageLearning, Octava Edicin,Biomolculas-Carbohidratos, pag 1001
KAIRUZ de Civeta, Luz A. Introduccin al estudio de la composicin de los alimentos.
Universidad Nacional de Colombia. Bogot. 1984. Pg. 31, 68, 108, 109.
HOULUM, Jhon R: PRACTICAS DE QUIMICA GENERAL QUIMICA ORGANICA Y
BIOQUIMICA. Centro de ayuda tecnica,Mexico-Buenos aires,1980, pag 405

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Prctica No. 10
Identificacin de Pentosas por el Mtodo de Bial

Sustento terico

Reaccin del furfural e hidroximetil-furfural con orcinol (Fig. en medio con HCl, dando
lugar a derivados de color azul. Es una prueba especfica de pentosas.

Objetivos
Determinacin de pentosas en muestras Biolgicas

Materiales y Mtodo
Materiales
Tubos de ensaye

Material Biolgico
Muestras Biolgicas

Reactivos
Reactivo de Bial (solucin de Carbohidratos de grado anatico
orcinol)

Equipo
Bao Mara

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Manual de Prcticas Biomolculas

Procedimiento
1. Etiquete un tubo de ensaye por cada muestra de carbohidrato a ensayar
2. Adicione 2 ml del reactivo (solucin de orcinol) en cada tubo
3. Agregue 1 ml de la muestra a ensayar y agite
4. Observe y anote tipo de color (coloracin azul-verdosa), intensidad, tiempo de
aparicin de cada muestra
5. Calentar a 60 durante 10 minutos
6. Observar y anotar algn cambio

Resultados

Discusin y conclusiones

Bibliografa
Berezov TT, Korovkin BF (1992): Chemistry and metabolism of carbohydrates. En
Berezov TT, Korovkin BF (eds): Biochemistry, 1 Ed. Editorial Mir Publishers Moscow
(Mosc, Rusia), pp. 215 256.
Ocon MC, Garca MJ, Vicente JC (1998): Estudio general del metabolismo de los hidratos
de carbono. En DOcon MC, Garca MJ, Vicente JC (eds): Fundamentos y Tcnicas de
Anlisis Bioqumico, 1 Ed. Editorial Paraninfo (Madrid, Espaa), pp. 53 72.
Harris RA (2004): Metabolismo glucdico I: Principales rutas metablics y su control. En
Devlin TM (eds): Bioqumica, 4 Ed. Editorial Revert (Barcelona, Espaa), pp. 597 664.
Muoz E (1988): Propiedades qumicas de los azcares. En Lozano JA, Tudela J (eds):
Prcticas de bioqumica. Experimentacin y Simulacin, 1 Ed. Editorial Sntesis (Madrid,
Espaa), pp. 65 70.
McKee T, Mckee JR (2003): Hidratos de carbono. En Mckee T, McKee JR (eds):
Bioqumica. La base molecular de la vida, 3 Ed. Editorial McGraw-Hill Interamericana
(Madrid, Espaa), pp. 200 233.

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Manual de Prcticas Biomolculas

Prctica No. 11
Obtencin de Osazonas de Carbohidratos

Sustento terico
Los compuestos que contienen el grupo CO-CHOH- forman oazonas cristalinas con
felinhidracina. Los cristales de osazona tienen forma y punto de fusin caracterstica, lo
cual ayuda a la identificacin de los azucares reductores. Otros datos que pueden ayudar
son el tiempo de formacin de los cristales y precipitacin de la osazona en frio o caliente.

La fenihidracina reacciona con el grupo carbonilo de los azucares, dando la fenihidrazona


que a su vez reacciona con dos molculas ms de fenilhidracina para formar la osazona. A
continuacin se describe la formacin una osazona a partir de una aldosa. La reaccin de
una cetosa es similar al de las aldosas.

Objetivos
Determinacin de cristales de azucares (Osazonas) en muestras biolgicas

Materiales y Mtodo
Materiales
Tubos de ensaye Espatula
Pipetas

Material Biolgico

Reactivos
cido actico glacial Muestras de Carbohidratos de
grado analtico
Solucin de Fenilhidracina
Acetato

Equipo
Bao Mara
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Procedimiento
1. Etiquete tantos tubos como muestras a analizar
2. Acidifique 5 mL de la solucin de las azucares con 10 gotas de cido actico glacial
3. Agregue 3 gotas de la solucin de fenilhidracina y agite
4. Agregue acetato (solo lo que tome con la punta de una esptula)
5. Caliente la mezcla en un bao de agua durante 5 minutos agitando ocasionalmente
6. Filtre y caliente el filtrado en un bao de agua por 20 minutos
7. Deje enfriar y examine los cristales utilizando un microscopio
8. Dibuje las formas de los cristales comparando con los de la figura

Resultados

Discusin y conclusiones

Bibliografa
Moore J.A. y Dalrymple D.L. Experimetal Methods in Organic Chemistry 5a. Edition W.B.
Saunders Co. U.S.A. (1976) pag 259-269.
Jacobs T.L., Truce W.E. y Robertson G. Ross Laboratory Practice of Organic Chemistry
5a. Ed. MacMilla Pub. Co. Inc. U.S.A. (1974) pag 311-316.
Hudlicky M. Laboratory Experimetns in Organic Chemistry 3a. Ed. Avery Publishing
Group Inc. U.S.A. (1985) pag 104-106.
Daniels, Rush, Baver J. Chem Ed. 1960, 37, 203. e) Streitwieser A., Heathcok H.C.
Introduction to Organic Chemistry MacMillan Pub. Co. Inc. U.S.A. (1976) pag 693-732.
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Manual de Prcticas Biomolculas

Domnguez , Xorge A. Mtodos de Investigacin Fitoqumica Editorial Limusa Mxico


(1973) Pag. 205
Bruice Yurkanis, P. 2008. Qumica Orgnica. Pearson Educacin Mxico, 5 Edicin, p.
987-988. Mxico.
Mc Murry, J. 2008. Qumica Orgnica. Thomson Paraninfo, 7 Edicin, p. 1013. Mxico.
Morrison, R. T., Boyd, R. N. 1990. Qumica Orgnica. Pearson Addison Wesley, 5
Edicin, p. 1265-1266. Mxico.
Solomons Graham, T. W. 2002. Qumica Orgnica. Editorial Limusa S.A. de C.V. 2
Edicin, p. 1215-1216. Mxico.
Wade, L. 2004. Qumica Orgnica. Pearson Prentice Hall, 5 edicin, p. 1080. Madrid.
Textos de Laboratorio y Manuales:
vila, J., Garca, C., Gaviln, I., et. al. 2001. Qumica Orgnica. Experimentos con un
enfoque ecolgico. UNAM, 1a Edicin, p. 418-419. Mxico.
The Merck Index. 2006. 14th Edition, p.145. Whitehouse Station, N.J., EUA.

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Prctica No. 12
Purificacin de un Polisacrido de Origen Vegetal
Identificacin de Unidades Monomricas

Sustento terico
De las caloras consumidas por los humanos, cerca del 70 al 80% provienen del almidn.
Es la principal fuente de almacenamiento de energa en los vegetales, ya que se encuentra
en grandes cantidades en las diversas variedades de plantas, como, por ejemplo, en los
granos de cereales, los cuales contienen entre 60 y 75% de su peso seco de almidn, as
como tambin, puede encontrarse en tubrculos, semillas de leguminosas y en algunas
frutas, y su concentracin vara con el estado de madurez de los mismos.

Estructuralmente, el almidn consiste de dos polisacridos qumicamente distinguibles: la


amilosa y la amilopectina. La amilosa es un polmero lineal de unidades de glucosa unidas
por enlaces (1-4), en el cual algunos enlaces (1-6) pueden estar presentes. Esta
molcula no es soluble en agua, pero puede formar micelas hidratadas por su capacidad
para enlazar molculas vecinas por puentes de hidrgeno y generar una estructura
helicoidal que es capaz de desarrollar un color azul por la formacin de un complejo con el
yodo. Mientras que la amilopectina es un polmero ramificado de unidades de glucosa
unidas en un 94-96% por enlaces (1-4) y en un 4-6% con uniones (1-6). Dichas
ramificaciones se localizan aproximadamente a cada 15-25 unidades de glucosa. La
amilopectina es parcialmente soluble en agua caliente y en presencia de yodo produce un
color rojizo violeta

Las clulas llevan a cabo la hidrlisis a travs de procesos enzimticos, pero en el


laboratorio podemos llevarla a cabo con cido. La hidrlisis del almidn se puede ser
verificad de dos formas, la desaparicin de la reaccin con el iodo a medida que avanza la
hidrlisis, o por la formacin de azcares reductores. Mientras ms hidrolizado este el
almidn, mas azcares reductores habr y menor ser la reaccin con el iodo hasta hacerse
totalmente negativa.

Objetivos
Identificar los productos de hidrlisis cida de polisacridos

Materiales y mtodo
Materiales
Tubos de ensaye Gradilla
Pipetas

Reactivos
Almidn
Solucin de Yoduro de Potasio
cido Clorhdrico Concentrado

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Equipo

Procedimiento
Hidrlisis de almidn
1. Triture un gramo de almidn en 10 ml de agua fra
2. Vierta la suspensin lechosa en 200 ml de agua hirviendo, deje enfriar la
mezcla
3. Parte del material formar una solucin coloidal
4. Ponga 5 ml de esta solucin en un tubo de ensaye y adale unas gotas de una
solucin de yodo en yoduro de potasio (lugol, muy diludo)
5. Al resto de la solucin agrguele 10 ml de cido clorhdrico concentrado y
caliente la mezcla a ebullicin

Determinacin de azucares reductores


6. Cada 5 minutos vierta 5 ml de la solucin en un tubo de ensayo, divdalos en
dos porciones, con una haga la prueba de Fehling y con la otra, previamente
enfriada en bao de hielo, repita la prueba del lugol.
7. Discontine estas pruebas peridicas cuando se no se observe ningn nuevo
cambio
8. Anote en forma de tabla, colores, tiempos y otras observaciones que considere
pertinentes
9. Interprete los resultados

Resultados

Discusin y conclusiones

Bibliografa
Eva Irma Vjar Rivera, Prcticas de Bioqumica Descriptiva I, Editorial Unison, 2005.
Lehninger, principles of biochemistry, David L. Nelson, Michael M. Cox, 4 Edition.
Thomas, H. D.; Atwell, W. A. Starches. Practical Guides For The Food Industry. American
Association Of Cereal Chemist. St. Paul Minnesota, Usa: Egan Press, 1999. P. 1-87
Knutzon, C. A.; Grove, M. J. Rapid Method For Estimation Of Amylose In Maize Starches.
Cereal Chemistry, V. 71, N. 5, P. 469, 1994.
Guan, J.; Hanna, A. M. Extruding Foams From Corn Starch Acetate And Native Corn
Starch. Biomacromolecules, V. 5, P. 2329-2339, 2004.

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Prctica No. 13
Purificacin de un Polisacrido de Origen Animal
Identificacin de Unidades Monomricas

Sustento terico
El glucgeno es la principal reserva de carbohidratos en tejidos de mamferos. El hgado es
una fuente rica de reserva de este polisacrido, pues se acumula cuando el animal est bien
alimentado pero se metaboliza rpidamente durante el ejercicio muscular.

Los polisacridos son considerablemente menos solubles que los monosacridos en


solucin alcohlica, el glucgeno puede separarse de los azucares otros compuestos
solubles en agua por precipitacin con alcohol. La cuantificacin puede hacerse
hidrolizando el glucgeno seguida de una prueba para azucares reductores. Puede utilizarse
el mtodo general para carbohidratos con la utilizacin de antrona (9-oxiantraceno) que
reacciona con los carbohidratos y produce un color azul caracterstico.
La antrona, reacciona con los monosacridos, disacridos y polisacridos, dextrinas
dextranas, almidones, gomas y glucsidos, pero el color producido no es el mismo para los
diferentes carbohidratos.

Objetivos
Extraccin y cuantificacin de glucgeno con el reactivo de antrona

Materiales y Mtodo
Materiales
Tubos para centrfuga Papel filtro
Pipetas Gradilla

Reactivos
Etanol al 95% Agua desionizada
Hidroxido de potasio al 30% Antrona al 0.2% en H2S04
(preparada al momento de
utilizarse)
Sulfato de Sodio Na2S04 en H2S04 concentrado
solucin saturada
Solucin patrn de glucosa (200
g/mL
Equipo
Balanza analtica Bao de hielo
Bao Mara Centrfuga
Espectrofotmetro

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Procedimiento

Lisis del Glucgeno


1. Pesar todo un hgado de pollo y tomar una fraccin de 0.5g
2. Colocarla en un tubo que contenga 3 mL de KOH al 30%
3. Someter a ebullicin hasta completar la digestin del tejido (aprox 10 minutos)
4. Aadir en caliente 0.1 mL de Na2S04 (solucin saturada) y precipitar con 2.5 de
etanol al 95%
5. Calentar ligeramente hasta lograr precipitacin completa y dejar reposar en bao de
hielo 30 minutos.
6. Centrifugar a 4 000 rpm durante 10 minutos, decantar y mantener el tubo invertido
sobre papel filtro durante 1 o 2 minutos
7. Disolver el precipitado en 2 mL de agua desionizada
8. Calentar el tubo y volver a precipitar con 1.8 mL de etanol al 95% hasta obtener una
precipitacin completa y dejar reposar 30 minutos en bao de hielo
9. Centrifugar a 4 000 rpm durante 10 minutos decantar y mantener el tubo invertido
sobre papel filtro durante 1 o 2 minutos
10. Disolver el precipitado en 2.10 mL de agua desionizada. De esta solucin tomar 0.5
mL para cuantificacin de antrona

Cuantificacin de glucosas con el reactivo de antrona


1. Disponer de una serie de tubos como sigue

1 2 3 4 5 6 7
Patrn de Glucosa --- 0.125 0.25 0.50 0.75 --- ---
Problema mL --- --- --- --- --- --- ---
Agua desionizada 2.5 2.375 2.25 2 1.75 2 1.5

2. Colocar los tubos en hielo


3. Agregar a cada tubo 5 mL de solucin de antrona
4. Mezclar y someter a ebullicin 10 minutos
5. Leer en el espectrofotmetro a 630 nm.
6. Elaborar la curva de calibracin para glucosa con los datos de concentracin de los
tubos 1 al 5
7. Interpolar el valor del problema en la curva patrn y determinar la concentracin
correspondiente

Calculo para determinar la concentracin de glucgeno


Al tomar en cuenta que el glucgeno es un polisacrido y que el peso molecular de la
glucosa es de 180 g/mol y que por cada unin se pierde una molcula de agua (PM 0 18
g/mol), se suma el peso molecular de 2 molculas de glucosa (360 g/mol) y se le resta el
peso molecular del agua, lo cual da 342 g/mol. Si se divide este valor entre el peso real de 2
molculas de glucosa, se obtendr el factor de correccin siguiente:

342/360= 0.95
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Una vez obtenido el resultado de la concentracin de glucosa en cada uno de los problemas,
expresado en mg por peso total de la muestra de tejido (peso total del hgado), se multiplica
este valor por el factor de correccin para obtener la concentracin total del glucgeno

Resultados

Discusin y conclusiones

Bibliografa
Carrol, N., R. Longley y J. Roe 1956. The determination of glucogen in liver and muscle by
use of anthron reagent. J Biol Chem. 220, 553
Clark, S. 1971. Experimental Biochemistry. W. H. Freeman. Sn Fco
Redira, G. 1974. Tcnicas de Bioqumica Aplicada. Mxico

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Prctica No. 14
Purificacin de lpidos de fuentes diferentes

Sustento terico
Los lpidos son una de las principales reservas energticas de la clula, adems de ser las
molculas principales que estructuran las membranas. Pero tambin son intermediarios de
los que derivan metabolitos tan importantes como el colesterol, las hormonas esteroides y
los compuestos de la serie del terpeno (aceites esenciales de los vegetales). Es necesario
conocer los cambios moleculares que originan tal diversidad, para poder hacer la
determinacin de los cambios bajo diversas condiciones metablicas como la
diferenciacin celular, la germinacin de semillas, as como para valorar los efectos del
ambiente sobre el metabolismo y evaluar el efecto de las hormonas o sustancias inductoras
sobre las reservas orgnicas.

Objetivos
Determinar el contenido de lpidos totales en rganos de animales

Materiales
Matraz Erlenmeyer de 250 mL con Hojas de papel aluminio (10x10
tapn esmerilado cm)
Embudo de filtracin Termmetro
Matraces Erlenmeyer de 125 mL Bolsa con cubos de hielo
Morteros con pistilo Gasas limpias (para filtrar)
Mechero Bunsen Varillas de vidrio para agitar
Probeta de 100 mL Crculos de papel filtro

Material Biolgico
Corazn, hgado y cerebro de pollo Huevo de pollo
Reactivos
Acetona ter de Petrleo
ter etlico Etanol

Equipo
Estuche de diseccin Bao Mara

Procedimiento
1. Prepare un hgado, un corazn y un cerebro de pollo recin muerto (rganos muy
frescos)

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2. Pese los rganos sobre papel metlico y corte en pequeos pedacitos sobre una
superficie fra (caja de Petri pre enfriada).

Extraccin de lpidos totales del hgado.


1. Mezcle el hgado con dos veces su peso de sulfato de sodio anhidro.
2. Muela la mezcla en el mortero hasta obtener una pasta homognea. Agregue 5mL
de etanol y siga homogeneizando.
3. Transfiera la papilla a un matraz Erlenmeyer. Lave el mortero con otros 15 mL de
etanol, para recuperar todo el tejido.
4. Coloque el matraz en un bao de agua a 70C y mantngalo por 10 min, agitando
con una varilla.
5. Deje enfriar y agregue 10 mL de ter de petrleo para completar la extraccin.
Agite bien y deje reposar hasta que se asiente el precipitado.
6. Separe el sobrenadante por decantacin; guarde este extracto en un matraz
etiquetado como lpidos/etanol/ter.
7. Agregue al residuo otra porcin de 10 mL de la mezcla de alcohol:ter etlico (3:1).
Tape y caliente a 70C. Decante la fase lquida, reuniendo el extracto con el
anterior.
8. Vuelva a extraer agregando al residuo otros 10 mL de la mezcla alcohol:ter.
Decante el sobrenadante en el mismo matraz.
9. Caliente el extracto para evaporar el ter, colocando el matraz de extractos en un
bao de agua preparado en la parrilla (a 50 o 70C). NO use flama.
10. Enfre y agregue 10 mL de ter de petrleo. Agite y cuando se disuelvan los lpidos,
filtre a una probeta limpia y seca.
11. Guarde los extractos para la Prctica No. 9.

Extraccin de colesterol del cerebro.


1. Corte el cerebro en fragmentos pequeos, homogenice en el mortero pre-enfriado,
pase a la campana de extraccin y agregue 10 mL de acetona (medidos en probeta
de 10 25 mL), agitando con una varilla de vidrio por 10 min.
2. Coloque el homogenizado en tubos de centrfuga de 10 mL. Tape los tubos,
squelos de la campana y centrifugue a 2000 rpm por 1 min.
3. Transfiera el sobrenadante a un matraz Erlenmeyer de 25 mL con tapn esmerilado.

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4. Vuelva a la campana de extraccin y extraiga el residuo agregando porciones de 5


mL de acetona. Centrifugue y junte el sobrenadante con el anterior. Mida el
volumen total.
5. Concentre el extracto hasta 1/5 de su volumen original, evaporando lentamente en
bao de vapor (usando una parrilla de calentamiento dentro de la campana. NO
USAR flama.
6. Deje el extracto concentrado en refrigeracin toda la noche, para que precipite el
colesterol.
7. Disuelva el precipitado en 2mL de acetona, filtre y deje secar hasta que recristalice
el compuesto puro.
8. Pese el producto seco, y calcule el rendimiento de lpidos por gramo de cerebro.
9. Repita el proceso con muestras de hongos.

Lpidos de la yema de huevo.


1. En un vaso de precipitados de 100 mL, mezclar media yema de huevo con 15 mL de
cloroformo-metanol (2:1).
2. Agitar enrgicamente con una varilla de vidrio por 20 min y filtrar. Medir la
cantidad del filtrado.
3. Mezclar el filtrado con 5 mL de KCl 0.1 M. Agitar.
4. Dejar reposar hasta que se separen 2 fases. Desechar la fase superior y usar la fase
orgnica. Rotular como lpidos de yema de huevo.

Bibliografa
Lehninger, A. 1995. Bioqumica. Ed. Omega. Barcelona.

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Prctica No. 15
Caracterizacin de lpidos de fuentes diferentes

Sustento Terico
Los lpidos se sintetizan como cidos grasos de cadena larga a partir del acetil-CoA. El
grupo carboxilo puede modificarse luego por la unin de grupos qumicos polares que dan
caractersticas propias a los diferentes derivados. Estos derivados tienen funciones muy
importantes, pues incluyen a los ganglisidos, cerebrsidos, etc.
As los ganglisidos se pueden caracterizar por su reaccin positiva a la prueba de Molisch
debido a la presencia de grupos azcar. Los fosfolpidos en general se pueden detectar por
la formacin de complejos con el molibdato, y la presencia de cadenas hidrocarbonadas con
doble enlace, hace que el agua de bromo se torne incolora. Pruebas como esta se utilizan
para identificar los lpidos presentes en muestras de diferente origen.
El contenido de derivados de cido graso vara en tejidos y rganos, por lo que es
importante conocer diversas estrategias de caracterizacin. La metodologa se puede aplicar
para detectar fuentes de compuestos de inters.

Objetivos
Identificar los lpidos presentes en diferentes muestras
Disponer de reacciones para caracterizar lpidos

MATERIAL
Materiales
tubos de ensaye pipetas 5 mL
probetas 20 mL vasos de precipitado de 100 mL
varillas de vidrio gasas estriles

Material Biolgico
Extractos de lpidos de Cerebro o Extracto de lpidos de Yema de
hgado de pollo, fresco huevo
Reactivos
Mezcla cloroformo metanol (2:1) KCl 0.1M
Reactivo de molibdato ninhidrina
Reactivo de bismuto Agua de bromo
cido sulfrico 2M cido actico 2M

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Equipo

Procedimiento

Reacciones especfica. Haga las siguientes pruebas a todos sus extractos de lpidos (huevo,
cerebro, hgado, etc.)

Glucolpidos
1. Tome 3 mL de sus extractos y aada 3 gotas de reactivo de Molisch (solucin de
alfa naftol en alcohol). Mezcle bien.
2. Aada lentamente 1 mL de cido sulfrico concentrado. Si se forma anillo violeta
en la interfase es que hay furfural o hidroximetilfurfural.

Fosfolpidos.
1. Coloque muestras de 1 mL de sus extractos de lpidos en diferentes tubos de ensayo
(de 10 20 mL)
2. Agregar 1 mL de reactivo de molibdato. Mezcle perfectamente.
3. Observe cambios de coloracin, e identifique los extractos con fosfolpidos.

Fosfolpidos con colina.


1. Repita el procedimiento, usando reactivo de bismuto.

Lpidos con grupos amino.


1. Coloque su serie de tubos, y agregue una gota de ninhidrina (cancergena). Tape los
tubos y caliente en bao de agua hirviendo por 2 3 min. Observe la aparicin de
coloracin caracterstica.

Lpidos insaturados.
1. Utilice otra muestra y agregue agua de bromo. Si se decolora, determine la
presencia de lpidos de cadenas insaturadas.

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F. Prueba de Liebermann-Burchard.
1. Mezclar 1 mL de la solucin clorofrmica de colesterol con 2 mL de cido actico
anhidro. Agregar 1 mL de cido sulfrico. Agitar e incubar 5 min a temperatura
ambiente. Observar la aparicin de una coloracin verde (prueba positiva)
2. Se puede cuantificar el colesterol presente leyendo a 640 nm.

Bibliografa: Lehninger, A. 1995. Bioqumica. Ed. Omega. Barcelona.

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Prctica No. 16
Extraccin de grasas por el mtodo Soxhlet

Sustento terico
Se considera grasa al extracto etreo que se obtiene cuando la muestra es sometida a
extraccin con ter etlico. El trmino extracto etreo se refiere al conjunto de las sustancias
extradas que incluyen, adems de los steres de los cidos grasos con el glicerol, a los
fosfolpidos, las lecitinas, los esteroles, las ceras, los cidos grasos libres, los carotenos, las
clorofilas y otros pigmentos. El extractor utilizado en el siguiente mtodo es el Soxhlet. Es
un extractor intermitente, muy eficaz, pero tiene la dificultad de usar cantidades
considerables de disolvente. El equipo de extraccin consiste en tres partes: el refrigerante,
el extractor propiamente dicho, que posee un sifn que acciona automticamente e
intermitente y, el recipiente colector, donde se recibe o deposita la grasa. El mecanismo es
el siguiente: al calentarse el solvente que se encuentra en el recipiente colector, se evapora
ascendiendo los vapores por el tubo lateral, se condensan en el refrigerante y caen sobre la
muestra que se encuentra en la cmara de extraccin en un dedal o paquetito. El disolvente
se v acumulando hasta que su nivel sobrepase el tubo sifn, el cual se acciona y transfiere
el solvente cargado de materia grasa al recipiente colector. Nuevamente el solvente vuelve
a calentarse y evaporarse, ascendiendo por el tubo lateral quedando depositado el extracto
etreo en el recipiente colector. El proceso se repite durante el tiempo que dure la
extraccin en forma automtica e intermitente y as la muestra es sometida constantemente
a la accin del solvente.

El contenido en lpidos libres, los cuales consisten fundamentalmente de grasas neutras y de


cidos grasos libres, se puede determinar en los alimentos por extraccin del material seco
y reducido a polvo con una fraccin ligera del ter di-etlico en un aparato de extraccin
continua. Se dispone de stos en numerosos diseos, pero bsicamente son de dos tipos. El
ms comn y utilizado es el de tipo Soxhlet que d una extraccin intermitente con un
exceso de disolvente reciente condensado. La eficiencia de este mtodo depende tanto del
pre-tratamiento de la muestra como de la seleccin del disolvente. Un procedimiento til
para la extraccin de grasas de alimentos hmedos y semislidos, que impiden el desecado
inicial, es mezclar la muestra con sulfato de calcio, sulfato de sodio anhidro o con
vermiculita. Cuando la muestra se hace pulverulenta y seca, se transfiere a un cartucho de
Soxhlet en un aparato de extraccin. El mtodo Soxhlet es un sistema de extraccin cclica
de los componentes solubles en ter que estn presentes en un alimento.

Objetivos
Determinacin de cidos grasos (extracto etreo) por el mtodo de Soxhlet (sistema de
extraccin de componentes solubles en ter), de una muestra de alimento slido.

Materiales y Mtodo
Materiales
Vaso de precipitados Papel Filtro
Algodn

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Material Biolgico

Reactivos
ter Etlico Hexano
ter de petrleo Tricloroetano
Equipo
Equipo Soxhlet Balanza Analtica
Foco con soquet y conexin

Procedimiento

1. Pesar 3 o 4 g de muestra seca y colocarlos dentro de un cartucho para extraccin con


una cama de algodn o fibra de vidrio. Tapar con la misma fibra y colocar en el
extractor del aparato cuyo matraz se ha puesto previamente a masa constante
2. Aadir suficiente disolvente anhidro sobre la muestra hasta que haga sifn dos
veces
3. Calentar el matraz con el foco hasta que la extraccin de la grasa sea completa (de 4
a 8 horas segn la cantidad de lpido que contenga la muestra)
4. Retirar la fuente de calor, sacar el cartucho y calentar de nuevo el matraz para
recuperar el disolvente, evitar que se haga sifn
5. Despus de haber eliminado el disolvente del matraz secar a 80-90 C hasta masa
constante

Clculos
% de grasa = Masa de residuo en el matraz /muestra en gramos X 100

La cuantificacin de grasa extrada por este mtodo, tambin puede hacerse si inicialmente
se pesa el cartucho a masa constante. Se colocan 3 a 4 g de muestra seca y se extrae en el
aparato Soxhlet. Cuando se ha extrado la grasa, se seca al aire y posteriormente a 80-90 C
hasta masa constante
La diferencia en masa del cartucho antes y despus de la extraccin, corresponde a la masa
de los lpidos totales extrados por el ter.

Resultados
Discusin y conclusiones

Bibliografa
A.O.A.C. Assoc Offic. Agr Chemist, 1965. Metods of analysis. Washington
Bloor, W. 1928. J. Biol Chem. 77:53
Folch, J., I Ascoli, M, Lees y J Meath. 1951. J Biol Chem. 91: 883
Klayder, T. y S. Fine. 1957. Detection of foreing fats in dairy products. JAsocc Offic Anal
Chemist. 40:509

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Prctica No. 17
Extraccin de lpidos Totales a partir de Tejidos Animales

Sustento Terico
Es posible extraer lpidos de un tejido animal al triturar con sulfato de sodio para extraer el
agua y despus hacer la extraccin con solucin de alcohol-ter caliente. Los extractos
combinados de ter-alcohol son tratados para quitar el alcohol y el ter, el residuo se extrae
con ter de petrleo caliente para obtener el extracto de lpidos totales.

Objetivos
Extraer y cuantificar lpidos totales a partir de tejidos animales

Materiales y Mtodo
Materiales
Mortero Esptula
Matraz de 125 mL Papel filtro
Vaso de precipitado de 500 mL Probeta
Embudo Frasco para almacenar muestra

Material Biolgico
Hgado fresco de pollo

Reactivos
Sulfato de sodio anhidro ter de petrleo
Etanol al 95%
ter dietlico

Equipo
Balanza granataria
Bao Mara

Procedimiento
1. Pesar 10 g de tejido y fragmentar en un mortero
2. Aadir dos tanto de sulfato de sodio anhidro y macerarlo hasta lograr una pasta de
aspecto homogneo y macerarlo hasta lograr una pasta de aspecto homogneo
3. Agregar 5 mL de alcohol, macerar, agregar otros 5 mL de alcohol hasta obtener una
pasta fina al macerar

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Manual de Prcticas Biomolculas

4. Con una esptula pasar la pasta un matraz Erlenmeyer de 125 mL. Enjuagar el
mortero, el pistilo y la esptula con tres porciones sucesivas de alcohol
5. Vaciarlo cada vez al matraz que tiene la pasta. Calentar inmediatamente el extracto
alcohlico colocando el matraz en un bao de agua caliente
6. Enfriar y agregar 5 mL de ter dietlico. Agitar con cuidado y colocar el contenido
en bao de agua caliente hasta ebullicin
7. Colocar un papel filtro pequeo en un embudo sobre un matraz Erlenmeyer de 125
mL. Decantar el lquido a travs del filtro. Reextraer el hgado y el sulfato de sodio,
agregar tres porciones adicionales de 10 mL de mezcla alcohol-ter 3:1
8. Calentar el solvente cada vez, como en la primera ocasin, y decantar el lquido al
mismo filtro para reunir todos los filtrados. Una vez terminada la extraccin,
desechar el sulfato de sodio y el residuo del tejido
9. Evaporar agitando constantemente el ter de los filtrados combinados, introducir el
matraz en un vaso de precipitado con agua caliente. Seguir calentado el agua en
ebullicin hasta que no quede olor a alcohol. Luego enfriar el matraz.
10. Agregar 10 mL
11. De ter de petrleo y disolver los lpidos solubles en l calentndolo en un vaso con
agua caliente. Proceder a filtrar por un filtro pequeo de papel, colocado en un
embudo de vidrio sobre un matraz o tubo de ensayo perfectamente seco. Si el
filtrado se separa en dos fases, agregar sulfato de sodio anhidro que fijara el agua
que est en la fase inferior y pasar el ter de petrleo a una probeta de 25 mL.
Lavar el residuo de sulfato de sodio con ms ter, el cual e recibir en una probeta.
Finalmente llevarlo a un volumen de 225 mL
12. Mezclar y pasar el contenido de la probeta a un recipiente cerrado para evitar
prdidas por evaporacin. El extracto contiene muestra suficiente para un anlisis
cromatogrfico y la determinacin de varios ndices.

Resultados

Discusin y conclusiones

Bibliografa
A.O.A.C. Assoc Offic. Agr Chemist, 1965. Metods of analysis. Washington
Bloor, W. 1928. J. Biol Chem. 77:53
Folch, J., I Ascoli, M, Lees y J Meath. 1951. J Biol Chem. 91: 883
Klayder, T. y S. Fine. 1957. Detection of foreing fats in dairy products. JAsocc Offic Anal
Chemist. 40:509
UNAM, Facultad de Medicina, 1967. Manual de Laboratorio de Bioqumica

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Manual de Prcticas Biomolculas

Prctica No. 18
Separacin de Lpidos por cromatografa en capa fina

Sustento Terico

Objetivos
Identificacin de lpidos en diversas muestras biolgicas y por diferentes mtodos de
revelado
Comprobar la solubilidad de los lpidos con solventes especficos

Materiales y Mtodo

Procedimiento
Preparacin de la muestra
I.Extracto lipdico de suero
1. Depositar con una jeringa una capar de 2 mL de una mezcla de ter isoproplico
etanol o ter isoproplico-metanol (1:1) en un tubo con tapn de rosca con 0.1 mL
de suero
2. Tapar el tubo, agitar fuertemente 30 minutos y centrifugar (el tapn debe ser de
tefln u otro material insoluble en los solvente utilizados). El mtodo permite
obtener una buena recuperacin de triglicridos y colesterol.

II Extracto lipdico de vegetales


1. Macerar las semillas y/o frutas antes de la extraccin con solventes
2. Obtener el extracto lipdico con el aparato de extraccin Soxhlet o Goldsfish.
Extraer con benceno, cloroformo, tetracloruro de carbono, hexano o ter de petrleo
3. Usar n-propanol o isopropanol en lu gar de ter, acetona o aetato de etil para
extraccin de fosfolpidos. Se ha observado que los teres, cetonas y esteres activan
la fosfolipasa C. Para prevenir autooxidacion de lpidos insaturados es
recomendable la extraccin en atmosfera de nitrgeno

III Extracto lipdico de animales


1. Agregar una parte de tejido homogeneizado a 20 partes de etanol-eter (3:1), segn el
mtodo descrito anteriormente
2. Dejar la mezcle toda la noche en atmosfera de nitrgeno a temperatura ambiente
3. Filtrar la mezcla para eliminar residuos de protena y concentrarla bajo N2 a 50 C,
pero sin permitir que se seque por completo
4. Reextraer la muestra con tres porciones de ter de petrleo, descartar los
componentes insolubles
5. Secar el residuo en sulfato de sodio anhidro. Los lpidos del cerebro son extrados
solo parcialmente. Como soporte se utilizan placas con gel de slice o cromatofolios
Merkc

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Mtodos de deteccin
cido sulfrico
1. Nebulizar el cromatograma n H2S04 AL 50% en etanol y calentarlo en un horno a
230 C durante 10 minutos.
2. Los lpidos aparecen como manchas negras.
Vapores de Yodo
Depositar unos cuantos cristales de yodo en un tanque revelador para que se desprendan los
vapores de este elemento
Introducir el cromatograma en la cmara. Los lpidos insaturados aparecen como manchas
de color caf y la mayora de los lpidos saturados tienen un ligero color amarillo
Rociar alternativamente el cromatograma con una solucin de yodo al 1% en metanol

27 diclorofluorescena
1. Nebulizar el cromatograma con una solucin de yodo 27 diclorofluorescena al
0.2% en alcohol.
2. La mayora de los lpidos aparecen con luz ultravioleta como manchas amarillo-
verdosas fluorescentes

Rodamina B
1. Rociar el cromatograma con una solucin de Rodamina B al 0.05% en alcohol
2. Lo lpidos aparecen como manchas rojo-violeta que fluorescen con luz ultravioleta

Azul de bromotimol
1. Rociar el cromatograma con reactivo azul de bromotimol (40 mg de azul de
bromotimol en 100 mL de NaOH 0.01 N).
2. Los lpidos aparecen como manchas amarillo-dorado en fondo azul. Si se expone el
cromatograma a vapores de amonio, los lpidos surgen con color azul

Mezcla sulfocrmica
Nebulizar el cromatograma on una solucin saturada de dicromato de potasio en cido
sulfrico concentrado.
Los lpidos insaturados surgen como manchas caf claro. Cuando se calienta el colesterol,
esteres de colesterol y vitamina A aparecen colores caracteristicos ante de tornarse a color
negro o caf

Mezcla de solventes
Para esteres de colesterol Iso-octano
Para colesterol y glicridos Iso-octano-ter etlico (100:8)
cidos grasos, alcoholes y aldehdos Iso-octano-ter etlico (20%)
Iso-octano-cido actico (100:5)
cido actico-agua desionizada (75:25

Lpidos polares Cloroformo-metanol-agua (66:25:4)


Iso-propanol-amoniaco 58% (100:7)
Cloroformo-(metano-amoniaco 58%)
90:10) o (100:10

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Iso-propanol-cido Actico 50% (100:7)


Cloroformo-(metanol + Actico glacial-
agua 90:5:5) (90:10)

Resultados

Discusin y conclusiones

Bibliografa
Haer, F 1969. An introduction to chromatography. On impregnated glass fiber. Ann Arbor
Science Pub Michigan

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Prctica No. 19
Cuantificacin de colesterol en extracto lipdico por el Mtodo de Lieberman-Buchard

Sustento Terico
El colesterol est presente en los tejidos como alcohol libre o en la forma de esteres.
Mediante el mtodo de Lieberman-Buchard el anhdrido actico puede combinarse con los
grupos OH de la posicin 3 del colesterol y esteroles relacionados y as producir el ter
correspondiente. Si el esterol original tiene instauracin 5, ocurre una epimerizacin a la
forma 3, adems de una deshidratacin con la formacin de un color caracterstico. La
reaccin sirve como prueba especfica para los 3-hidroxiesteroides con insaturacin 5

Objetivos
Cuantificar colesterol en muestras biolgicas

Materiales y Mtodo
Materiales
Tubos de ensaye Pipetas de 10 mL
Matraz de 50 mL Bureta
Vaso de precipitado

Material Biolgico
Extracto de lpidos

Reactivos
Cloroformo seco Anhdrido actico
cido sulfrico Solucin de colesterol en
cloroformo (10 mg en 100 mL)

Equipo
Bao Mara Espectrofotometro

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Procedimiento

1. Verter 1 mL del extracto de lpidos en un matraz de 50 mL, colocarlo en un vaso de


precipitados con agua caliente y evaporar a sequedad. No debe quedar el menor
vestigio de humedad
2. Enfriar y aadir 8 mL de cloroformo anhidro.
3. Agitar con suavidad para disolver los lpidos
4. En un matraz pipetear 8 mL dela solucin de colesterol patrn en cloroformo (con
un total de 0.8 mg de colesterol)
5. Preparar un blanco colocando 6 mL de cloroformo seco en un tercer matraz.
6. Aadir a cada uno de los matraces 4 mL de una mezcla recin preparada de anhidro
actico (40 mL) y cido sulfrico concentrado (2 mL). Cuidado, no se permita que
el anhdrido actico entre en contacto con agua o soluciones diluidas. Para aadir la
mezcla se debe usar bureta
7. Mezclar bien, tapar y dejar en la oscuridad 10 minutos.
8. Leer en el espectrofotmetro el tubo blanco, el patrn y la muestra problema
9. Calcular los miligramos de colesterol por 100 mL de extracto

Resultados

Discusin y conclusiones

Bibliografa
Brieston, C. Y H. Hersig. 1959. Arch. Pharm 272:485
Clark, J. 1971. Experimental Biochemistry, W.H. Freeman, Sn Fco.
UNAM, Facultad de Medicina. 1967. Manual de Laboratorio de Bioquimica

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Manual de Prcticas Biomolculas

Prctica No. 20
Extraccin y cuantificacin de lpidos totales

Sustento Terico
Este e un mtodo para extraccin y cuantificacin de lpidos totales en muestras de origen
biolgico. La muestra se homogeniza con una mezcla de cloroformo, metanol y agua. Se
forman dos fases, la fase clorofrmica contiene casi todos los lpidos, los cuales se
cuantifican por gravimetra

Objetivos
Extraccin y cuantificacin de lpidos en muestras biolgicas

Materiales y Mtodo
Materiales

Material biolgico
Muestras Biolgicas de lpidos

Reactivos
Metanol Anhidro fosfrico
Cloroformo

Equipo
Bao Mara

Procedimiento
1. Homogeneizar 10 g e material biolgico en 10 mL de cloroformo y 20 mL de
metanol
2. Agregar 10 mL de cloroformo y homogeneizar 1 minuto.
3. Adicional 10 mL de agua y volver a homogeneizar 1 minuto
4. Filtrar con papel Whatman No 1 en embudo Buchner al vacio.

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5. Transferir el filtrado a una probeta de 50 mL. Lavar el filtro y el homogeneizador


con 10 mL de cloroformo y volver a filtrar
6. Agregar este filtrado a la probeta, lavar el filtro con 5 mL de cloroformo y
adicionarlo a la probeta
7. Dejar que repose la solucin para que se separen las fases.
8. Medir el volumen de la fase clorofrmica y retirar la fase superior metanlica con
una pipeta Pasteur (para asegurar la completa eliminacin del metanol, aspirar con
una pipeta un volumen pequeo de la fase superior clorofrmica)
9. Medir nuevamente el volumen de la fase clorofrmica y transferir cuantitativamente
la fase clorofrmica a un matraz previamente pesado (primer pesado del matraz)
10. Evaporar a 40 o 50 C en bao Mara (de ser posible en un ambiente de Nitrgeno)
11. Secar el residuo sobre anhidro fosfrico en un desecador al vaco
12. Pesar el matraz por segunda vez y agregar 5 mL de cloroformo y decantar
cuidadosamente para extraer los lpidos
13. Secar el matraz nuevamente como se indica en el paso
14. Pesar el matraz por tercera vez

Clculos

El peso de los lpidos es igual a los pesos registrados,


(paso 12) (paso 9)
(paso 14) (paso 9)
El paso 9 es el peso del matraz vaco

Los lpidos totales equivalen a:

Peso de lpidos (paso 14) X Vol total de cloroformo (paso 8)/Vol cloroformo evaporado
(paso 9)

Resultados

Discusin y conclusiones

Bibliografa
Bligh, E. y W Dyer. 1959. Can J Biochem and Physiol. 37,911
Kelet, G. y W. Lederer. 1974. Handbook of micromethods for the Biological Sciences. Van
Nostrand Reinhol. New York

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Manual de Prcticas Biomolculas

Prctica No. 21
Hidrolisis Acida y Alcalina de Protenas

Sustento Terico

La velocidad de hidrolisis en solucin acida es extremadamente lenta, por ello se utilizan


catalizadores como cidos o lcalis fuertes para propsitos preparativos. No obstante, la
velocidad de hidrolisis depende de la naturaleza de los residuos adyacentes, algunos
aminocidos son degradados al liberarse. Por esta razn, adems de los efectos de
contaminacin en el proceso, son esenciales los detalles pequeos pero prcticos de la
tcnica.

La reaccin de hidrolisis de la unin peptdica se describe con la ecuacin siguiente

El mtodo ms utilizado para hidrolizar protenas y pptidos consiste en el calentamiento


de la muestra que contiene cido clorhdrico. Aun cuando varios aminocidos no se
recuperan totalmente y el triptfano se destruye completamente, el mtodo da buenos
resultados
Asumiendo una cantidad razonable de muestra de protena, el procedimiento es
recomendable para obtener un anlisis de la composicin, completamente reproducible

La muestra de protenas se equilibra segn las condiciones atmosfricas en un frasco


abierto. La muestra es utilizada para cuantificar la protena por los mtodos de Lowry,
Biuret o Bradford. De la protena restante se obtienen muestras para ser hidrolizadas en
diferentes tiempos. Es preciso que la hidrolisis se efectu en una atmosfera inerte o en
vaco, la muestra usualmente es transferida a una ampolleta o tubo de vidrio de
aproximadamente 20 cm el cual ha sido sellado por un extremo

Objetivos
Realizar la hidrolisis de muestras de protenas

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Materiales y Mtodo
Materiales
Tubos de ensaye Pinzas de electricista
Mechero Bunsen Bote para colocar las ampolletas
Pipeta de 1 mL Ampolletas de medicamento de 5
mL
Tubos de vidrio de 6 mm de
dimetro y 20 de largo
Material Biolgico

Reactivos
HCl 6N
Ba(OH)2 2M

Equipo
Bomba de vaco Balanza analtica
Horno

Procedimiento

Hidrolisis Acida
1. Pesar 5 o 10 mg de la muestra de protena y colocarlos en una ampolleta o tubo de
vidrio sellado por un extremo. En cualquier caso deben estar perfectamente lavado y
secos (hacerlo por triplicado)
2. Agregar 1 mL de HCL 6N a cada muestra (como blanco utilizar una ampolleta o
tubo sin muestra nicamente con 1 mL de HCl)
3. Sellar las ampolletas o tubo
4. Al vaco y ponerlos en un horno a 110 C durante 24-46 horas
5. Abrir las ampolletas y evaporar el HCl o neutralizar el cido con 1 mL de NaOH
6M
6. Si se va a cuantificar los aminocidos del hidrolizado por titulacin, evaporar a
sequedad en vaco y despus procesar la muestra segn el mtodo de titulacin con
NaOH en presencia de formol

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Hidrolisis alcalina
1. Pesar 5 o 10 mg de la muestra de protena y colocarlos en la ampolleta o tubo de
vidrio sellado por un extremo (hacer por triplicado)
2. Agregar 1 mL de Ba(OH)2 2M cada muestra (aadir a un tubo o ampolleta 1 mL de
Ba(OH)2 2M
3. Proceder como en la hidrolisis acida. En caso de neutralizar deber hacerse con
cido.

Resultados

Discusin y conclusiones

Bibliografa
Needleman, S.B. 1970. Protein sequence determination. A sourcebook of methods and
techniques. Springer-Verlag. New York
Plummer, D.T. 1971. An introduction to practical Biochemisry. Mc Graw Hill Y. Y.

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Manual de Prcticas Biomolculas

Prctica No. 22
Cuantificacin de Protenas (Mtodo de Biuret)

Sustento Terico
La concentracin total de protenas puede ser referida al contenido de nitrgeno de la
solucin, o se pueden utilizar mtodos que estiman grupos particulares
Varios anlisis colorimtricos rpidos son empleados con utilidad, estos proporcionan alta
precisin cuando se hacen controles adecuados y cuidadosa calibracin. Para este
propsito, el mtodo e Biuret y el de Lowry son los ms utilizados.
La reaccin de Biuret est basada en l formacin de un complejo entre los iones cobre y
varias uniones peptdicas, que adquieren color purpura. Esta reaccin puede medirse
cuantitativamente con un espectrofotmetro. El posible complejo es

Esta reaccin es medida en un intervalo aproximado de 0.5-5 mg de protena, sin ser


especifica

Objetivos
Cuantificar protenas en muestras de origen biolgico

Materiales y Mtodo
Materiales
Tubos de ensayo (10 mL)
Gradilla
Pipeta de 1 ml
Pipeta de 5 ml
Material Biolgico
Muestras biolgicas de protenas

Reactivos
Patrn de protenas (BSA 8 NaCl 0.9%
mg/mL)

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Reactivo de Biuret

Equipo
Espectrofotmetro a 540 nm Bao Mara

Procedimiento
1. Colocar en un tubo de ensayo 2 mL de la muestra conteniendo entre 4 y 6 mg de
protena
2. Completar el volumen a 3 mL con NaCl 0.9%
3. Agregar y mezclar 3 mL de reactivo de Biuret
4. Calentar la mezcla a 50 C en Bao Mara durante 10 minutos
5. Enfriar los tubos con agua corriente
6. Leer en el espectrofotmetro a 540 mn utilizando el tubo No. 1 como blanco
7. Establecer los datos comparativos con los valores de una curva obtenida con una
solucin patrn de protenas (8 mg/mL) tratada de la misma manera,
simultneamente hacer la calibracin del instrumento con un blanco de reactivo
(tubo No 1). El procedimiento simultneo para el problema y la curva patrn se
ilustra en el cuadro siguiente:

Sustancia 1 2 3 4 5 6
Patrn de protenas (mL) 0 0.25 0.50 0.75 1 0
NaCl 0.9 (mL) 3 2.75 2.50 2.25 2 1
Solucin problema (mL) -- --- ---- --- --- ---
Reactivo de Biuret (mL) 3 3 3 3 3 3

8. Calentar a 50 C en bao Mara durante 10 minutos


9. Enfriar en agua corriente
10. Leer en el espectrofotmetro a 540 mn

Resultados

Discusin y conclusiones

Bibliografa
Bradshaw, L.J. 1966. Introducction to molecular biological techniques. Prentice-Hall. N.Y.
Gornall, A.G., Bordowillm C.J., 1949 J. Biol Chem. 177.751

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Prctica No. 23
Cuantificacin de Protenas por el Mtodo de Bradford

Sustento Terico
El reactivo de Barfoed reacciona de esta forma ya que es dbilmente cido y se reduce por
monosacridos formando xido cuproso de color rojo ladrillo, ms rojizo que el precipitado
formado por el reactivo de Benedict, que tambin forma un xido cuproso (precipitado
pardo).

Objetivos
Cuantificar protenas en muestras de origen Biolgico

Materiales y Mtodo
Materiales
Tubos de ensayo
Pipeta de 1 mL

Material Biolgico
Muestras Biolgicas de protena
Vortex

Reactivos
Reactivo de Bradford Agua desionizada
BSA

Equipo
Espectrofotometro

Procedimiento
1. Pipetear en un tubo de ensayo 0.1 mL de la solucin de protenas con 10 -100 g,
agregar 0.9 mL de agua para completar el volumen a 1 m L
2. Aadir 5 mL de reactivo de Bradford y mezclar por inversin o vortex
3. Medir la absorbancia a 595 nm despus de 2 minutos o antes de una hora
4. El blanco de reactivo deber contener 1 mL del amortiguador adecuado o agua,
adems 5 mL de reactivo de Bradford
5. Calcular la concentracin por interpolacin en una curva patrn. El procedimiento
simultaneo para la curva patrn y el problema se ilustra en el cuadro siguiente

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Sustancia 1 2 3 4 5 6 7
Patrn de protena mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 ---
(mL BSA 100 g/mL)
Agua desionizada o 1 0.8 0.6 0.4 0.2 --- ---
amortiguador
Solucin problema ( -- --- ---- --- --- --- 1
conteniendo 10-100 g
de protena )

1. Mezclar bien cada tubo


2. Leer a 595 nm

Mtodo micro
1. Pipetear en un tubo de ensayo 0.1 mL de solucin de protena con 1 a 10 g
2. Agregar 1 mL de reactivo de Bradford
3. Mezclar bien y medir la absorbancia a 595 nm en celda de 1 mL
4. Construir la curva patrn manteniendo los mismos volmenes y condiciones

Resultados

Discusin y conclusiones

Bibliografa
Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of micro quanties
of protein. Anal Biochem. 72:248

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Prctica No. 24
Cuantificacin de Protenas por el Mtodo Lowry

Sustento Terico
Este mtodo de cuantificacin de protenas con el reactivo de Folin-Ciocalteau, se utiliza
con frecuencia para muestras de material en solucin y requiere como mnimo de 5 g de
protena
El color que se forma con el reactivo de Folin-Ciocalteau se debe a la reaccin de la
protena con cobre alcalino en el reactivo (como en el Biuret) y a la reduccin de las sales
de fosfomolibdato-fosfotunstato en el reactivo, la cual es ocasionada por la tirosina y el
triptfano de las protenas. Debido a que la reaccin involucra a estos aminocidos
aromticos especficamente, resulta conveniente que la curva patrn se elabore con el
mismo tipo de protenas a cuantificar

Objetivos
Cuantificar protenas de origen biolgico

Materiales y Mtodo
Materiales
Tubos de ensayo Pipeta de 5 mL
Gradilla
Pipeta de 1 mL

Material Biolgico
Muestras Biolgicas de Protenas

Reactivos
Solucin
a. CuSO4 5H20 al 5% d. Mezclar 1 volumen de a + 1
volumen de b
b.Tartrato de sodio y potasio al 2% e. Mezclar 50 volmenes de c +
un volumen de reactivo de Folin-
Ciocalteau (diluir 1 a 1 un
momento antes de iniciar la
tcnica)
c.Carbonato de sodio al 2% en Patrn de albumina de suero de
NaOH 0.1N bovino (BSA) 100 g/mL

Equipo
Espectrofotmetro

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Procedimiento
1. Verter 1 mL de solucin e protena problema (5-100 g) en un tubo de ensayo
(marcado con el numero 7)
2. Procesarlo junto con el patrn de albumina (20, 40, 60, 80 y 100 g) segn el caudo
siguiente:

Sustancia 1 2 3 4 5 6 7
Patrn BSA (mL) --- 0.2 0.4 0.6 0.8 1 ---
Agua desionizada (mL) 1 0.2 0.6 0.4 0.2 --- ---
Solucin problema -- --- ---- --- --- --- 1
Solucin e (mL) 5 5 5 5 5 5 5

3. Mezclar cada tubo y dejar reposar 10 minutos a temperatura ambiente


4. Agregar a cada tubo 0.5 mL de reactivo de Folin-Ciocalteau diluido 1 a 1 y agitar
inmediatamente
5. Dejar reposar 30 minutos
6. Leer en el espectrofotmetro a 750 nm
7. Elaborar la curva patrn graficando la concentracin de protena ( g) de los tubos
1 a 6 contra la absorbancia
8. Interpolar el valor del tubo 7 (problema) en la curva patrn y determinar la
concentracin de protenas

Nota: Si las protenas no se solubilizan fcilmente, calentar a flama suave o bao Mara en
0.5 mL de NaOH 0.1N

Resultados

Discusin y conclusiones

Bibliografa
Lowry, OH., N.J. Rosebraugh, A. L. Farr and R.J. Randall. 1951. Protein measurement
with the Folin-phenol reagent. J. Biol. Chem 193:265

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Manual de Prcticas Biomolculas

Prctica No. 25
Separacin de Aminocidos por Cromatografa

Sustento Terico
La cromatografia es una tcnica que se utiliza ordinariamente para separar una serie de
solutos mezclados en un solvente comn, utilizando uno a ms de los fenmenos
siguientes: adsorcin diferencial, particin liquido-liquido o intercambio inico. Las
variantes ms comunes empleadas para este fin son la cromatografa en columna,
cromatografa en papel y cromatografa por intercambio inico
La cromatografa en papel, es una tcnica sencilla en la cual son operativas la adsorcin
diferencial y la particin liquido-liquido. Este ltimo fenmeno se refiere a que una
sustancia (soluto) puede exhibir diferentes grados de solubilidad en dos o ms solventes
Usualmente en una pieza de papel filtro se aplican puntos (gotas) de una solucin acuosa
con la mezcla de compuestos, cerca del borde de uno de los dos mrgenes libres. Se
engrapan los bordes libres para formar un cilindro y se coloca en una cmara saturada con
vapor de un segundo solvente (orgnico). El fondo de la cmara contiene una cantidad de
solvente el cual migra a travs del papel por capilaridad, se cierra la cmara y se deja que
la cromatografia proceda hata que el solvente alcanza el tope del papel. Si las muestras no
son coloreadas, despus de la cromatografia se revelan hacindolas reaccionar con un
reactivo especfico
Las molculas pueden caracterizarse midiendo la distancia de migracin del solvente y la
distancia de migracin de una fraccin determinada. Si la relacin de tales distancias se
procesa como distancia del soluto/distancia del disolvente, se conoce el valor de Rf para esa
sustancia. Si las condiciones se mantienen constantes, este valor es reproducible y puede
utilizarse para caracterizar una molcula
Cabe enfatizar que el valor de Rf variara de acuerdo al solvente o mezcla de solventes,
temperatura y naturaleza del papel utilizados. Esta tcnica puede practicarse haciendo que
el solvente ascienda o descienda a travs del papel, denominndose para cada caso:
cromatografia ascendente y descendente

Objetivos

Materiales y Mtodo
Materiales
Tubos de ensayo Nebulizador o media caa de
acero inoxidable o vidrio,
Engrapadora capilares
Regla Pepel Whatman
Lpiz
Material Biolgico

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Manual de Prcticas Biomolculas

Reactivos
Solucin de butanol-cido actico- Solucin de ninhidrina 0.1% en
agua 4:1:1 v/v etanol
Coleccin de aminocidos cada
uno en solucin
Equipo
Cmara cromatogrfica Horno
Parrilla

Procedimiento
1. Segn la altura de la cmara cromatogrfica, cortar una hoja de papel Whatman No
1 de 35 cm de ancho
2. Trazar con un lpiz una lnea recta a 2 cm del borde inferior que estar en contacto
con el solvente
3. Con un lpiz y sobre la lnea recta, hacer marcas con una distancia de 1.5 cm (dejar
los mrgenes de 2.5 de ancho sin aplicar muestra en estas regiones)
4. Asignar un aminocido a cada marca, escribir con lpiz su abreviatura
5. Colocar con un capilar, una gota de la solucin de aminocidos en su respectiva
marca, procurando que el dimetro de la gota sea de aproximadamente 0.5 cm
6. Dejar secar perfectamente las muestras.
7. Engrapar el papel por los bordes laterales construyendo as un cilindro
8. Introducir el cilindro de papel (con las muestras en la parte inferior) en la cmara de
cromatografa conteniendo en la base una capa de aproximadamente 0.5 cm de
mezcla con solventes butanol-cido actico-agua 4:1:1, la cual ha sido cerrada
hermticamente horas antes para saturar con vapores del solvente
9. Cerrar la cmara y esperar a que se efectu el proceso (de 5 a 8 horas)
10. Cuando el solvente este por llegar al borde superior, retirar el cromatograma, marcar
la distancia de migracin del solvente (frente) y dejar secar el cromatograma
11. Nebulizar o sumergir el cromatograma en solucin de ninhidrina, espera a que seque
y calentar en un horno o parrilla a 100 C durante unos minutos. Marcar con un
lpiz cada mancha en el cromatograma indicando el centro de la misma
12. Obtener el valor de Rf para cada aminocido y construir una tabla de valores de Rf
par cada aminocido indicando las condiciones en que efectu la comatografia

Resultados

Discusin y conclusiones

Bibliografa
Bradshaw, L, J. 1966. Introduction to molecular biological techniques. Prentice Hall. New
Jersey

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Universidad veracruzana
Facultad biologa Xalapa
Manual de Prcticas Biomolculas

Prctica No. 26
Separacin de aminocidos por Cromatografa

Sustento Terico
En la cromatografa en capa fina el lecho cromatogrfico est formado por una capa
delgada de adsorbente soportada por una placa. El adsorbente de mayor uso es el gel de
slice. La superficie de este solido inorgnico deja expuestos los llamados sitio de
adsorcin, de tal manera que si se muele el gel hasta hacerlo polvo fino e incrementa el rea
expuesta y de este modo el nmero de sitios disponibles de adsorcin
El gel de slice actua como un soporte para una fase estacionaria acuosa y la fuerza de
retardamiento se convierte en particin liquido-liquido. El contenido de agua del gel de
slice determina el mecanismo de retardamiento
El trmino activacin se refiere al contenido de agua de un adsorbente. Un adsorbente
altamente activo es aquel que tiene pocas molculas de agua unidad a sus sitios de
adsorcin y as tiene tomos de hidrgeno y oxgeno disponibles para puente de hidrgeno.
La activacin del adsorbente determina la fuerza de retardo de la fase estacionaria. El gel de
slice es activado por calentamiento a 100 C durante 30 a 90 minutos.
En esta variedad cromatogrfica es necesario considerar las interacciones de soluto-
solvente y solvente de la fase estacionaria con la fase mvil. Se diferenciara as entre
solvente para la adsorcin cromatogrfica y solventes para la particin cromatogrfica
Adsorcin. Los solventes para una separacin por adsorcin deben tener suficiente
compatibilidad con los compuestos de la muestra disueltos en ellos
Particin. Si la muestra y dos solventes inmiscibles son introducidos en u embudo de
sepacion y se espera a que alcancen un equilibrio, la muestra se distribuye entre las fases
segn la naturaleza de las dos fases y la naturaleza de la muestra. El coeficiente de particin
es definido como la relacin en el equilibrio, de la concentracin de las muestras en el
lquido estacionario comparando a su concentracin en la fase mvil
En la cromatografa de particin ordinaria, la fase ovil es menos polar que el lquido
estacionario. La separacin se efecta debido a que los componentes de la muestra son
preferencialmente retardados a causa de los diferentes coeficientes de particin en los dos
solventes. Los solventes tpicos para esta cromatografia son butanol-cido, actico-agua y
cloroformo- metanol-amonio.

Objetivos
Separacin de aminocidos por cromatografa

Materiales y Mtodo
Materiales
Tubos de ensayo Regla
Nebulizador Lpiz
Capilares Cromatofolios o placas de vidrio
de 20 X 20 cm con una capa de
gel de slice de 200 m
Solucin de ninhidrina 0.1% en

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etanol
Material Biolgico
Muestras biolgicas de
aminocidos

Reactivos
Solucin de Butanol-cido actico
agua 4:1:1
Coleccin de aminocidos cada
uno en solucin

Equipo
Cmara cromatogrfica
Horno o parrilla

Procedimiento
1. Trazar una lnea recta con un lpiz a una distancia de 2 cm del borde regular de la
placa
2. Dejar mrgenes de 1.5 cm y marcar sobre la lnea la abreviatura de cada aminocido
procurando que la distancia de separacin entre cada aminocido sea de 1 cm
3. Aplicar con un capilar una gota de solucin de aminocidos en el sitio respectivo
(dimetro no mayor de 0.5 cm) y esperar a que seque perfectamente cada muestra
4. Introducir la placa con las muestras en la parte inferior en la cmara cromatografica,
la cual contiene una capa de aproximadamente 0.5 cm de butanol-cido actico-
agua 4:1:1 y que ha sido preparada y sellada hermticamente unas horas antes
5. Esperar a que se efectu la cromatografa (de 5 a 8 horas)
6. Retirar el cromatofolio y marcar el frente con lpiz, antes de que el solvente llegue
al borde superior (2 cm)
7. Esperar a que seque y nebulizar con la solucin de ninhidrina. Calentar en parrilla o
en el horno a 100 C durante algunos minutos. Marcar con lpiz el contorno de las
manchas y el centro de cada una.
8. Determinar el valor de Rf para cada aminocido y construir la tabla de valores de Rf
para el estndar de aminocidos indicando las condiciones en que se desarroll la
cromatografa

Preparacin de la placa con gel de slice


1. A un vidrio de 25 x 20 cm de 2 o 3 mm de grosor, colocarle una tira de maskin
tapealo largo de los mrgenes laterales en el lado de 25 cm

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2. Preparar una mezcla de 100 g de slice con 12 g de sulfato de calcio y 199 mL de


agua. La suspensin deber tener una consistencia espesa parecida a la del atole y si
fuera necesario, decantar el exceso de agua
3. Depositar parte de esta suspensin a lo largo de la parte superior de la placa
4. Colocar una regla o varilla de vidrio de modo que descanse la suspensin sobre los
dos mrgenes con maskin tape distribuir homogneamente para que quede pareja la
capa de gel
5. Secar la placa a 100 C durante 90 minutos en un horno

Resultados

Discusin y conclusiones

Bibliografa
Haer, F.C. 1969. An introduction to chromatography on impregnated glass fiber. An Arbor
Science Michigan

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