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BIOPOLMERO TERMOSENSIBLE Y BIOACTIVO Y MTODO DE RECOLECCIN CELULAR


ASOCIADO

La presente invencin pertenece al campo de la ingeniera de tejidos y se refiere a un biopolmero


y a un soporte de recoleccin celular que lo comprende, y que permite la recoleccin celular de
manera sencilla y eficaz. Las clulas adheridas al soporte se liberan mediante un simple cambio de
temperatura preservando las protenas de la superficie celular y manteniendo una elevada
viabilidad celular. Adems, la superficie puede presentar selectividad a diferentes lneas celulares
de manera global o localizada y no libera restos en el tejido generado, debido a que el biopolmero
termosensible est covalentemente unido al soporte.

ESTADO DE LA TCNICA

En el campo de la ingeniera de tejidos la combinacin de diferentes materiales con clulas vivas


proporciona una novedosa e interesante va para llevar a cabo terapias regenerativas. Las
superficies pueden ser funcionalizadas dotndolas con propiedades adherentes o antiadherentes,
grupos especficos que promueven las interacciones entre el material y las clulas, comportamiento
inteligente (sensibilidad a estmulos) o con micro o nanoestampados.

Tanto superficies inteligentes como sistemas de liberacin de drogas, rganos artificiales y


sistemas para medicina regenerativa se desarrollan normalmente a partir de nuevos materiales
biofuncionales con propiedades de gran inters para el campo de la investigacin biomdica y con
sensibilidad a diferentes estmulos. Ms concretamente, para estas aplicaciones, existen
materiales que son sensibles frente a una amplia variedad de estmulos como luz, temperatura, pH,
fuerza inica o campos elctricos. Un cierto estmulo puede modificar el estado o la configuracin
de diferentes biomolculas alterando su afinidad por una determinada superficie y en consecuencia
permitiendo impidiendo su adsorcin (Hyun, J. y colaboradores (cois.) 2004 Journal of the
American Chemical Society. 126, 7330-7335). Es decir, estos sistemas responden a estmulos.

Las superficies sensibles a la temperatura obtenidas a partir de determinados materiales


experimentan un cambio en su conformacin molecular como respuesta a cambios de temperatura
en el ambiente. Algunos polmeros muestran un comportamiento inverso en respuesta a la
temperatura. Llegan a estar menos solvatados cuando se incrementa la temperatura y precipitan
desde la solucin a la temperatura llamada "lower critical solution temperature" (LCST). Entre los
polmeros que responden a estas caractersticas, utilizados para bio-aplicaciones podemos
encontrar las poliacrilamidas N-alquil sustituidas, polialcoholes, o polipptidos. Estos ltimos
pueden ser tanto naturales como producidos a travs de tcnicas de ingeniera gentica y, en
consecuencia, poseer altos niveles de especificidad, contener grupos especficos para un gran
nmero de aplicaciones e incluso ser biodegradables. De entre ellos, los polmeros tipo elastina
(ELPs) son un excelente ejemplo (Col, M. A. y cois. 2009 Biomaterials. 30, 1827-50).

Una de las aplicaciones biomdicas ms estudiadas y de mayor inters en que se utilizan


superficies inteligentes sensibles a la temperatura, consiste en el crecimiento y liberacin de
clulas, y ms concretamente de lminas de clulas.

El modelo de sistema sensible a la temperatura ms comn y ampliamente estudiado ha sido el


poli(N-isopropilacrilamida) (PIPAAm) desarrollado por Okano. PIPAAm exhibe una LCST en medio
acuoso de 32 C. Por debajo de esta temperatura en solucin acuosa est completamente
hidratado con una conformacin extendida, mientras que por encima de la LCST esta deshidratado
y compactado. As, las superficies de PIPAAm permiten modular las interacciones moleculares en
funcin de la temperatura y podemos encontrar trabajos de adhesin/desadhesin reversible de
protenas, clulas de mamfero y bacterias dependientes de la temperatura (Col, M. A. y cois.
2009 Biomaterials. 30, 1827-50).

Existen polmeros con propiedades de respuesta a la temperatura similares al PIPAAm que


permiten el cultivo celular de una gran variedad de tipos de clulas, ya que adoptan un estado
colapsado por encima de su temperatura de transicin (37C). La reduccin de la temperatura por
debajo de esta temperatura crtica del polmero provoca que este se despliegue y comience a
liberar clulas vivas, o si stas han alcanzado la confluencia, una lmina celular intacta. As, es
posible recolectar rpidamente clulas individuales o lminas celulares intactas usando slo un
descenso de la temperatura (Kikuchi, A y cois. 1998. Journal of Biomaterials Science-Polymer
Edition. 9, 1331 -1348).

El despegue celular desde las superficies no solo involucra la reduccin de las interacciones entre
ellas y la superficie, por la hidratacin espontnea de las cadenas polimricas unidas a la misma,
sino que tambin implica un cambio activo en la morfologa celular y en la actividad metablica de
las clulas. Por tanto, este tipo de polmeros sensibles a la temperatura permiten mediante un
simple cambio de temperatura recolectar cultivos confluentes de un gran nmero de tipos celulares
como una capa de clulas, parecido a lo que puede ser un tejido, manteniendo las interacciones
entre clulas y de las clulas con las protenas de la matriz extracelular (Kushida, A., y cois. 1999.
Journal of Biomedical Materials Research. 45, 355-362). La sustraccin de clulas en un cultivo
siempre ha requerido fuertes mtodos enzimticos o mecnicos que tienen efectos nocivos en la
morfologa de las clulas que se estn recolectando. Estos cambios en la morfologa han sido
recientemente atribuidos a alteraciones de la membrana celular y el glicoclix, que a menudo
conllevan una prdida de actividad celular. Se ha comprobado que estos cambios tambin afectan
a la matriz extracelular, la cual es vital para la adhesin, la proliferacin y la diferenciacin de las
clulas, lo que tiene implicaciones importantes durante el cultivo celular. Se ha demostrado que el
mtodo del despegue celular mediante un descenso en la temperatura es mucho menos
destructivo para obtener una monocapa de clulas. Este mtodo adems provoca un efecto mucho
menor sobre la matriz extracelular en comparacin con los otros mtodos y tcnicas ms
tradicionales. De este modo, se pueden obtener lminas de clulas aparentemente sin ningn dao
a la matriz extracelular (Canavan, H. E., y cois. 2005. J Biomed Mater Res A. 75, 1 -13). Esta
tcnica ha sido aplicada con xito a una amplia variedad de tipos celulares incluyendo clulas del
msculo liso, hepatocitos, clulas endoteliales, fibroblastos, queratinocitos, clulas epiteliales,
macrfagos, clulas de la microglia y clulas madre.

Usando lminas celulares recolectadas a partir de superficies funcionalizadas con PIPAAm, Okano
y cois, han establecido lo que se conoce como ingeniera de lminas celulares para crear
multicapas de tejido funcionales con el objeto de tratar un amplio rango de enfermedades como
disfuncin de la cornea, cncer de esfago, reseccin traqueal, y problemas cardiacos. Ms
recientemente se ha desarrollado un tejido tridimensional compuesto por las clulas y su matriz
extracelular depositada muy vascularizado obtenindose sistemas parecidos a rganos como el
corazn y el hgado (Yang, J. y cois. 2007 Biomaterials. 28, 5033-43).

Otro avance en este campo ha sido el cultivo conjunto de diferentes tipos de clulas sobre una
misma superficie. Por ejemplo superficies cubiertas con dos polmeros sensibles a la temperatura,
pero diferentes, con una temperatura de transicin y una secuencia de adhesin celular distinta,
permitiendo el control del sistema (Tsuda, Y. y cois. 2005 Biomaterials. 26, 1885-93).

Otras estrategias han consistido en la inmovilizacin de pptidos que promueven adhesin celular
como RGD (Ozturk, N. y cois. 2009. Biomaterials. 30, 5417-26), factores de crecimiento como la
insulina, factores de crecimiento epidrmicos o ELPs sensibles a temperatura con propiedades
adhesivas (Hatakeyama, H. y cois. 2006 Biomaterials. 27, 5069-78) para promover la unin celular
y la comunicacin de las clulas con el material sobre las superficies inteligentes (Ebara, M. y cois.
2008 Advanced Materials. 20, 3034- 3038; Mi, M. y cois. 2008 J Biomed Mater Res B Appl
Biomater. 86, 283-90). Esta aproximacin muestra el potencial de estos sistemas en el campo de la
ingeniera de tejidos, ya que no necesitan factores de crecimiento adicionales. Adems se podran
seleccionar y separar diferentes tipos de clulas mediante la utilizacin de dominios especficos de
adhesin celular, por ejemplo a clulas endoteliales mediante el dominio REDV (Girotti, A., y cois.
2004 J. Mater. Sci.: Mater. Med. 15, 479-484). De este modo, los polipptidos, ya sean naturales o
sintetizados mediante tcnicas de ingeniera gentica a travs de la tecnologa del ADN
recombinante disponible para sintetizar genes repetitivos (Rodrguez- Cabello J.C. y cois. 2010 J.
Mater. Sci.: Mater. Med. 15(4): 479-84, Macewan, S. R. y cois. 2010 Biopolymers 94(1 ): 60-77),
muestran un gran potencial en aplicaciones biomdicas debido a que pueden ser producidos con
altos niveles de especificidad, conteniendo grupos funcionales como dominios de adhesin celular,
dominios de entrecruzamiento para unin covalente a la superficie y/o dominios que pueden ser
reconocidos por proteasas ms o menos especficas que los convierten en biodegradables. As, un
mismo polmero puede contener diferentes dominios conservando al mismo tiempo la respuesta
inteligente a la temperatura. Los ELPs son uno de los mejores ejemplos de este tipo de polmeros.
Por ejemplo, Na y cois, han creado biochips basados en clulas aprovechando la ventaja que
proporciona la rpida respuesta de un material inteligente ante estmulos externos para crear
superficies mediante adsorcin de ELPs. La transicin inteligente de los ELPs hace que al unirlos a
una superficie de vidrio, dicha superficie cambie de un estado hidrofbico a uno hidroflico y
viceversa, en funcin de la temperatura, lo que hace que se pueda controlar la adhesin reversible
de clulas mediante la temperatura de incubacin (Na, K. y cois. 2008 Langmuir. 24, 4917-23;
Rodrguez-Cabello, J.C. y cois. 2010 Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 1 -35).

Por otro lado, se ha demostrado que es posible despegar clulas individuales o lminas celulares
utilizando membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) mediante un simple y pequeo
descenso en la temperatura y traspasarlas a una nueva superficie para la creacin de multicapas
celulares, lo que sugiere el gran potencial de esta aproximacin (Zhang, H. y cois. 2006 Tissue
Eng. 12, 391 -401 ).

Continuando con esta idea, Mi y cois, han desarrollado, mediante tcnicas genticas, una nueva
matriz extracelular que contiene dos ELPs con diferentes funcionalidades (cola de polihistidinas y
secuencia RGD) para recolectar una lmina de clulas desde la placa de cultivo con una reduccin
de la temperatura (Mi, M. y cois. 2008 J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 86, 283-90).

Por tanto, los ELPs son excelentes candidatos para llevar a cabo la recoleccin celular o "cell
harvesting" debido a su carcter inteligente frente a la temperatura, biocompatibilidad y capacidad
para incorporar dominios de adhesin celular, de entrecruzamiento o biodegradabilidad en su
secuencia; proporcionando un alto potencial en aplicaciones biomdicas. Adems, son sistemas
apropiados para la recoleccin celular no mecnica y sin tripsinizacin, evitando de esta manera
los inconvenientes que estos procedimientos conllevan como la necesidad de unas manos
expertas y el dao ocasionado en las protenas de la superficie celular y consecuente disminucin
de la viabilidad celular.

DESCRIPCIN DE LA INVENCIN

La presente invencin se refiere a unos biopolmeros, a las superficies termosensibles y bioactivas


que los comprenden y a su uso para recoleccin celular. La naturaleza termosensible de los
biopolmeros de la invencin permite una recoleccin celular rpida y eficaz por un simple cambio
de temperatura consiguiendo una viabilidad superior a la de los otros procedimientos descritos en
el estado de la tcnica. Por otro lado, debido a que es posible disear los biopolmeros con
secuencias especficas de unin celular a uno o a varios tipos celulares, es posible construir
sustratos selectivos para ingeniera de tejidos. Los sistemas descritos en el estado de la tcnica
presentan algunas carencias ya que, por ejemplo, parte del polmero depositado en la superficie se
va a introducir en las lminas o clulas recolectadas a modo de contaminante y se va a arrastrar en
las etapas sucesivas con los riesgos que esto conlleva y, por otro lado, todava no es posible
disponer o agrupar de forma eficaz diferentes tipos de clulas de manera ordenada o estructurada
en una lmina. En este sentido, el polmero de la invencin presenta una gran ventaja, ya que en
lugar de depositarse sobre la superficie de manera indiscriminada, es injertado mediante un enlace
covalente de forma controlada y de manera que el sistema sigue siendo termosensible y eficaz
para la recoleccin celular.

Los autores de la presente invencin han descrito un sistema para cultivos celulares en superficie
que permite la recoleccin celular de manera sencilla y eficaz. La superficie donde se cultivan las
clulas se encuentra modificada de manera que une covalentemente unos biopolmeros
termosensibles que a su vez unen selectivamente diferentes tipos celulares. Las clulas adheridas
pueden liberarse de la superficie mediante un simple cambio de temperatura, preservando las
protenas de la superficie celular y manteniendo una elevada viabilidad celular. Adems, la
superficie de cultivo puede unir las clulas en toda su extensin o de manera localizada.

Debido a que los biopolmeros termosensibles utilizados se injertan mediante enlace covalente en
la superficie, la liberacin del tejido generado se produce sin arrastrar restos del biopolmero. El
biopolmero de la presente invencin se basa en general en repeticiones de dominios presentes en
la elastina natural, que no son txicos y por tanto adecuados para la interaccin con las clulas.
Adems, presenta un dominio central bioactivo basado en una secuencia de unin celular, y un
dominio con grupos reactivos, como por ejemplo el grupo amino de la lisina, para la unin
covalente a la superficie de cultivo. El biopolmero de la presente invencin ha sido producido
mediante la tecnologa del ADN recombinante.

Asimismo, la presente invencin se refiere a cualquiera de los cidos nucleicos que codifican para
la secuencia aminoacdica de los biopolmeros de la invencin, a sus usos y a un mtodo de
sntesis del mismo.

En la presente invencin se producen superficies bioactivadas con polmeros injertados mediante


qumica "c//c/ ". Dichas superficies que inducen adhesin celular selectiva, proliferacin celular y
desarrollo de tejidos sobre ellas responden a la temperatura como sistema para conmutar y
controlar su bioactividad. De esta forma, una vez cultivadas las clulas, o formado el tejido o capas
celulares, estas se desadhieren de la superficie sin daarse ni contaminarse, demostrando que el
sistema de recoleccin celular es rpido, sencillo de manejar y eficaz. Por otro lado, es posible
predefinir un patrn sobre la superficie para que las clulas tengan mayor afinidad por diferentes
zonas de la superficie e incluso se estructuren en la monocapa siguiendo ese mismo patrn.

Por tanto, esta invencin se fundamenta en tres pilares. El primero de ellos consiste en la
posibilidad de anular la capacidad de adhesin celular del soporte debido a la termosensibilidad del
biopolmero. El segundo consiste en la posibilidad de disear biopolmeros con diferentes
bioactividades o secuencias de unin celular especficas. Y el tercero consiste en la capacidad de
injertar los polmeros permanentemente y de manera controlada y eficaz sobre la superficie sin que
pierdan sus anteriores cualidades. Los biopolmeros se han obtenido con un alto grado de
eficiencia, complejidad, control y robustez. Estas cualidades se deben a que se han considerado
las fuerzas hidrofbicas de los aminocidos. De este modo, se puede disponer de un control
preciso y cuantitativo del fenmeno de transicin inversa que se da en estos materiales, y por tanto
de la temperatura (Tt) a la que estos polmeros pasan de ser bioactivos a convertirse en no
bioactivos.

Los biopolmeros se han obtenido empleando la tecnologa de ADN recombinante, mediante la


clonacin de una secuencia nucleotdica que codifica para la secuencia aminoacdica del
biopolmero de la invencin en un vector capaz de expresar dicha secuencia. Mediante esta
tecnologa se aprovecha la maquinaria de replicacin, transcripcin y traduccin de los organismos
capaces de producir los biopolmeros. Los biopolmeros de la invencin contienen dominios
laterales tipo elastina para dotarlos de la necesaria respuesta trmica. Adems, contienen un
dominio central bioactivo con una secuencia de unin celular (RGD, REDV, etc.). Por ltimo,
contienen un dominio reactivo qumicamente en su extremo, como son por ejemplo los grupos
amino de la lisina (Figura 1 ).

El injerto del polmero sobre la superficie consiste en la activacin de la superficie, y su


biofuncionalizacin mediante enlace covalente por reaccin qumica de ciclacin tipo "c//c/ ". Una
vez biofuncionalizada la superficie, se procede al sembrado y cultivo de las clulas hasta conseguir
el desarrollo tisular. En este momento se disminuye la temperatura a valores inferiores a la
temperatura de transicin del polmero bioactivo y, de esta manera, se consigue la modificacin en
la conformacin de dicho polmero, que da lugar a un sustrato no adherente del que la capa celular
se separa espontneamente. La explicacin a nivel molecular del fenmeno adhesin-desadhesin
se fundamenta en un fenmeno de auto-organizacin de las cadenas moleculares en la
nanoescala que se produce como consecuencia de los cambios de temperatura del sistema. En
este proceso, a la temperatura del cultivo y en presencia de agua las cadenas se encuentran en
una conformacin plegada en que los dominios de unin celular polares tienden a estar expuestos
hacia el exterior. Al disminuir la temperatura, las cadenas se despliegan dejando los dominios de
unin celular inaccesibles a las clulas, convirtindose en una superficie no adherente de la que se
despegan las clulas (Figura 2).

Por tanto, un primer aspecto de la presente invencin se refiere a un biopolmero que comprende
los pptidos A, B y D, con la estructura [(D-Bn-Am- Bs)], donde

A tiene la estructura (Fti-G-Ft2), donde

F tiene la estructura X1-X2-X3-X4-X5, donde X1 y X4 pueden ser cualquier aminocido excepto los
aminocidos prolina, lisina, serina y cistena, X2 es el aminocido prolina, X3 puede ser el
aminocido glicina o el aminocido alanina y X5 es el aminocido glicina,

G es una secuencia de unin celular, t1 y t2 tienen valores de entre 8 y 12,


B tiene la estructura Y1-Y2-Y3-Y4-Y5, donde Y1 e Y4 pueden ser cualquier aminocido excepto los
aminocidos prolina, lisina, serina y cistena, Y2 es el aminocido prolina, Y3 puede ser el
aminocido glicina o el aminocido alanina y Y5 es el aminocido glicina,

D comprende un pptido de 2 a 10 aminocidos iguales o diferentes que se seleccionan de la lista


que comprende: lisina, cistena, serina, asparragina, glutamina, cido asprtico y cido glutmico,
n tiene un valor de entre 10 y 18, m tiene un valor de entre 1 y 3, y

s tiene un valor de entre 10 y 18.

El pptido A es la secuencia aminoacdica bioactiva que comprende la secuencia de unin celular.


El pptido B es un dominio de tipo elastina, al igual que el pptido F. El pptido D es el dominio
reactivo, pues contiene los aminocidos polares que van a permitir el injerto del biopolmero en la
superficie de manera covalente mediante los grupos reactivos de sus cadenas laterales.

Las secuencias aminoacdicas (se puede usar el trmino "pptidos" indistintamente para referirse a
las secuencias aminoacdicas) A, B, D, F y G de

acuerdo con las estructuras descritas que dan lugar a los biopolmeros de la invencin, pueden
estar unidos por enlace covalente o cualquier otro tipo de enlace que de lugar a una estructura que
mantenga las propiedades de los biopolmeros de la presente invencin. El enlace se selecciona,
aunque sin limitarse, de la lista que comprende puentes de hidrgeno, apareamiento inico,
asociacin hidrofbica o formacin de complejos de inclusin.

En una realizacin preferida del biopolmero del primer aspecto de la presente invencin, G es una
secuencia aminoacdica que comprende un pptido que se selecciona de la lista que comprende
RGD, LDT, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19, o un dominio de
unin a heparina o un dominio de unin a azcares derivado de lectina y aglutinina..
Preferiblemente, G comprende el dominio RGD. Ms preferiblemente, G es SEQ ID NO: 1 .

El dominio RGD es bien conocido y consiste, como su nombre indica, en los aminocidos arginina,
glicina y cido asprtico. Este dominio es reconocido por protenas de la superficie celular de
diversos tipos celulares y funciona como un dominio de adhesin celular. SEQ ID NO: 16 es el
dominio REDV, tambin bien conocido, y que consiste, como su nombre indica, en los aminocidos
arginina, cido glutmico, cido asprtico y valina; tambin funciona como un dominio de adhesin
celular y es reconocido por clulas endoteliales. Un dominio de unin a heparina funciona como
dominio de unin celular puesto que es un dominio de unin a glicosaminoglicanos de la superficie
celular. Igualmente, un dominio de unin a azcares permite la unin a las clulas a travs de los
azcares que presentan las glicoprotenas de membrana. La lectina y la aglutinina tienen dominios
bien conocidos de unin a azcares. SEQ ID NO: 18 est presente en la laminina y es reconocida
por diversos tipos celulares, SEQ ID NO: 19 es reconocida por neuritas, es decir, cualquier
expansin del soma de una neurona, ya sea una dendrita o un axn. Estas secuencias, que forman
parte del biopolmero de la invencin, son reconocidas por sus respectivos tipos celulares y
propician su unin. Los biopolmeros que contengan SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 19 se pueden
emplear en la generacin de tejidos vasculares o tejidos nerviosos, respectivamente.

El dominio G ha de presentar una secuencia eficaz de unin celular para que el biopolmero de la
invencin funcione adecuadamente en un sistema de recoleccin celular, como muestran los
ejemplos de la presente invencin. En una realizacin preferida del biopolmero del primer aspecto
de la presente invencin, Xi es el aminocido valina, leucina o isoleucina. Preferiblemente, F es
SEQ ID NO: 2.

En una realizacin preferida del biopolmero del primer aspecto de la presente invencin, Yi es el
aminocido valina, leucina o isoleucina. Preferiblemente, B es SEQ ID NO: 3.

En una realizacin preferida del biopolmero del primer aspecto de la presente invencin, D
comprende un pptido de 3 a 5 aminocidos iguales o diferentes que se seleccionan de la lista que
comprende: lisina, cistena, serina, asparragina, glutamina, cido asprtico y cido glutmico. En
una realizacin preferida del biopolmero del primer aspecto de la presente invencin, los
aminocidos iguales o diferentes del pptido que comprende D se seleccionan de la lista que
comprende: lisina, cistena, serina, asparragina y glutamina.. Preferiblemente, los aminocidos del
pptido que comprende D son iguales y son el aminocido lisina.

El dominio D ha de comprender al menos dos aminocidos cuya cadena lateral presente un grupo
reactivo, necesario para la reaccin que permitir injertar la molcula de biopolmero por uno de
sus extremos a la superficie de cultivo, mediante enlaces covalentes. Por tanto, D comprende entre
2 y 10 aminocidos polares con un grupo reactivo en su cadena lateral (como lisina, cistena,
serina, asparragina, glutamina, cido asprtico y cido glutmico), preferiblemente entre 3 y 5 de
estos aminocidos. Los aminocidos lisina, cistena, serina, asparragina y glutamina son preferidos
para llevar a cabo la unin covalente entre el biopolmero y la superficie mediante una modificacin
a azida de los grupos amina de las cadenas laterales de estos aminocidos. Cuando se emplean
estos aminocidos en el dominio D, este se sita en el extremo N-terminal del biopolmero. La
lisina es el aminocido preferido para formar los enlaces covalentes entre el dominio D del
biopolmero y la superficie de cultivo debido a la facilidad que presenta el grupo amino de su
cadena lateral para dar la reaccin de sustitucin nuclefila con la azida reactiva, como se muestra
en los ejemplos de la presente invencin.

Los aminocidos con un grupo carboxilo en su cadena lateral, como cido asprtico y cido
glutmico, tambin pueden ser empleados para unir covalentemente el biopolmero por su extremo
a la superficie, aunque mediante otras reacciones bien conocidas por el experto en la materia.
Cuando se emplean estos aminocidos en el dominio D, este se sita en el extremo C- terminal del
biopolmero, ya que el grupo carboxilo terminal del propio biopolmero podr participar tambin en
la formacin del enlace covalente con al superficie.

La lisina es el aminocido preferido para formar los enlaces covalentes entre el dominio D del
biopolmero y la superficie de cultivo debido a la facilidad que presenta el grupo amino de su
cadena lateral para dar la reaccin de sustitucin nuclefila con la azida reactiva, como se muestra
en los ejemplos de la presente invencin. En una realizacin preferida del biopolmero del primer
aspecto de la presente invencin, t1 y t2 tienen valores de entre 9 y 1 1 .

En una realizacin preferida del biopolmero del primer aspecto de la presente invencin, n tiene un
valor de entre 12 y 16.

En una realizacin preferida del biopolmero del primer aspecto de la presente invencin, m tiene
un valor de entre 1 y 2.

En una realizacin preferida del biopolmero del primer aspecto de la presente invencin, s tiene un
valor de entre 12 y 16.

En una realizacin preferida del biopolmero del primer aspecto de la presente invencin, D es el
pptido SEQ ID NO: 4, B es el pptido SEQ ID NO: 3, n y s tienen el valor de 14, F es el pptido
SEQ ID NO: 2, t1 y t2 tienen el valor de 10, G es el pptido SEQ ID NO: 1 y m tiene el valor de 2.

Un segundo aspecto de la presente invencin se refiere a un cido nucleico que comprende una
secuencia nucleotdica que codifica para la secuencia aminoacdica del biopolmero del primer
aspecto de la invencin. Preferiblemente, dicho cido nucleico es un vector de expresin. El
trmino "vector de expresin" (en adelante, vector de la invencin o vector de la presente
invencin) se refiere a un fragmento de ADN que tiene la capacidad de replicarse en un
determinado husped y, como el trmino indica, puede servir de vehculo para multiplicar otro
fragmento de ADN que haya sido fusionado al mismo (inserto). Inserto se refiere a un fragmento de
ADN que se fusiona al vector; en el caso de la presente invencin, el vector puede comprender
cualquiera de las secuencias nucleotdicas que codifican para cualquiera de los biopolmeros de la
invencin, fusionadas al mismo, que puede replicarse en el husped adecuado. Los vectores
pueden ser plsmidos, csmidos, bacterifagos o vectores virales, sin excluir otro tipo de vectores
que se correspondan con la definicin realizada de vector.

Un tercer aspecto de la presente invencin se refiere a una clula aislada transfectada con el cido
nucleico del segundo aspecto de la invencin.

El trmino "clula" tal como se entiende en la presente invencin hace referencia a una clula
procaritica o eucaritica. La clula puede ser una bacteria capaz de replicar un ADN ajeno
transformado como por ejemplo cualquiera de las cepas de la especie Escherichia coli o una
bacteria capaz de transferir el ADN de inters al interior de una planta como por ejemplo
Agrobacterium tumefaciens. Preferiblemente, la clula hace referencia a una clula eucaritica
vegetal y dentro de este grupo, ms preferiblemente, a aquellas clulas pertenecientes al reino
Plantae. As pues, en el caso de que la clula sea vegetal, el trmino clula comprende, al menos,
una clula del parnquima, clula meristemtica o de cualquier tipo, diferenciada o indiferenciada.
Asimismo, tambin se incluye en esta definicin un protoplasto (clula de una planta que carece de
pared celular).

El trmino "transfeccin" hace referencia a la introduccin de material gentico externo en clulas


mediante plsmidos, vectores vricos (en este caso tambin se habla de transduccion) u otras
herramientas para la transferencia. El trmino transfeccin para mtodos no-virales es usado en
referencia a clulas eucariticas de mamfero, mientras que el trmino transformacin se prefiere
para describir las transferencias no-virales de material gentico en bacterias y clulas eucariotas
no animales como hongos, algas o plantas. Un cuarto aspecto de la presente invencin se refiere
al uso del biopolmero del primer aspecto de la invencin, del cido nucleico del segundo aspecto
de la invencin, o de la clula del tercer aspecto de la invencin, para la preparacin de un soporte
de recoleccin celular. El trmino "soporte" para la recoleccin celular, es una superficie de
cualquier tipo sobre la cual pueden adherirse clulas. Se conocen multitud de soportes para el
cultivo celular, como placas, partculas, frascos, cubetas, superficies porosas, membranas, y
dems, que pueden estar compuestas por distintos materiales, plsticos preparados para cultivo
celular, vidrio, y otros, que a su vez pueden estar pretratados con distintas molculas que permiten
y favorecen dicho cultivo celular, como fibronectina, colgeno, laminina, polilisina, poliornitina, etc.
El soporte se refiere nicamente a la superficie sobre la cual se siembran las clulas, y no incluye
otros accesorios como tapones, tapas, etc. Un quinto aspecto de la presente invencin se refiere a
un soporte de recoleccin celular que comprende el biopolmero del primer aspecto de la
invencin. Preferiblemente, la unin entre el biopolmero y el soporte se lleva a cabo mediante al
menos dos enlaces covalentes por molcula de biopolmero, ms preferiblemente, por tres enlaces
covalentes por molcula de biopolmero. Preferiblemente, en los enlaces covalentes reaccionan los
grupos amino o los grupos carboxilo de las cadenas laterales de al menos dos de los aminocidos
del pptido D. Preferiblemente, la superficie del soporte es lisa o curva. Ms preferiblemente, el
soporte consiste en micropartculas. Preferiblemente, las micropartculas son esfricas o
pseudoesfricas. En el caso de biorreactores, el cultivo celular puede ser ms interesante realizarlo
sobre micropartculas que sobre una superficie lisa o una superficie mayor. Un sexto aspecto de la
presente invencin se refiere al uso del soporte del quinto aspecto de la invencin para la
recoleccin celular.

Un sptimo aspecto de la presente invencin se refiere a un dispositivo de cultivo y recoleccin


celular que comprende el soporte del quinto aspecto de la invencin.

El trmino "dispositivo" para la recoleccin celular se refiere al equipo necesario para dicho cultivo
celular, y puede ser una placa, que incluye el soporte y la tapa, o una cmara de cultivo dentro de
la cual se localiza el soporte que comprende el biopolmero de la invencin, y que permite regular
las condiciones de temperatura y de presin de CO2 y O2, por ejemplo.

Un octavo aspecto de la presente invencin se refiere al uso del dispositivo de recoleccin celular
del sptimo aspecto de la invencin para el cultivo y la recoleccin celular. Preferiblemente, se usa
para el cultivo celular en un biorreactor.

Un noveno aspecto de la presente invencin se refiere a un mtodo para la recoleccin celular que
comprende las siguientes etapas:

(a) funcionalizar un soporte de cultivo celular,

(b) unir covalentemente el soporte funcionalizado en la etapa (a) a al menos dos de los
aminocidos del pptido D del biopolmero del primer aspecto de la invencin,

(c) poner en contacto una suspensin celular con el soporte obtenido en (b), y

(d) recolectar las clulas adheridas a dicho soporte. El trmino "funcionalizar" se refiere a la adicin
de grupos funcionales.

En una realizacin preferida del mtodo del noveno aspecto de la presente invencin, la
funcionalizacin del soporte se lleva a cabo con grupos alquinilo, con grupos alqueno, con grupos
nitrilo, con grupos carbonilo o con grupos mina. Preferiblemente, la funcionalizacin del soporte se
lleva a cabo con grupos alquinilo.

En una realizacin preferida del mtodo del noveno aspecto de la presente invencin, la
recoleccin de las clulas adheridas al soporte se lleva a cabo mediante una disminucin de la
temperatura del cultivo celular de 10 a 37 C.

En una realizacin preferida del mtodo del noveno aspecto de la presente invencin, entre las
etapas (c) y (d) se lleva a cabo la siguiente etapa:

(c') cultivar las clulas de (c) hasta que proliferen y formen una monocapa.

Las clulas en cultivo pueden dividirse, de forma que cuando se siembran, no cubren toda la
superficie de cultivo y, a medida que se van dividiendo, van formando una capa de una sola clula
de grosor que cubre toda la superficie de cultivo. Esto se llama formar una monocapa y alcanzar la
confluencia.

En una realizacin preferida del mtodo del noveno aspecto de la presente invencin, antes de la
etapa (b) se transforman los grupos reactivos de las cadenas laterales de al menos dos de los
aminocidos del pptido D del biopolmero del primer aspecto de la invencin, en grupos azida.
En una realizacin preferida del mtodo del noveno aspecto de la presente invencin, la unin
covalente de la etapa (b) se realiza mediante cicloadicin.

La cicloadicin mediante la cual se une el biopolmero de la invencin al soporte de recoleccin


celular se basa en una estrategia sinttica denominada "click-chemistry". Esta estrategia est
basada en reacciones que permiten el acoplamiento de bloques modulares de una manera
selectiva y eficiente tanto en aplicaciones a pequea escala como en procesos a gran escala. Las
reacciones que pueden considerarse dentro de esta estrategia "click" deben cumplir una serie de
requisitos bien definidos, como son los siguientes: debe ser modular, aplicable en un rango amplio
de situaciones, de elevado rendimiento, generar como subproductos sustancias no txicas y debe
ser estereoespecfica (no necesariamente enantioselectiva). Adems, estas reacciones se deben
poder llevar a cabo en condiciones suaves, a partir de productos de partida fcilmente disponibles
y en ausencia de disolventes orgnicos o en pequeas cantidades de los mismos y los productos
finales deben ser fciles de aislar.

Existen varios tipos de transformaciones que podran incluirse dentro de la categora de "click
chemistry", pero sin duda la reaccin de cicloadicin de Hisgen 1 ,3-dipolar de alquinos y azidas
catalizada por Cu(l), para dar lugar a 1 ,2,3 triazoles es el ejemplo ms caracterstico y utilizado de
todas ellas. Ello se debe a la facilidad de sntesis de derivados alquino y azida, junto a su
estabilidad cintica y su tolerancia a una gran variedad de grupos funcionales y condiciones de
reaccin. Esta reaccin se puede llevar a cabo en presencia de grupos funcionales y en
rendimientos prcticamente cuantitativos.

Un dcimo aspecto de la presente invencin se refiere a un mtodo para la obtencin del


biopolmero del primer aspecto de la invencin que comprende las siguientes etapas:

(a) cultivar la clula del tercer aspecto de la invencin en las condiciones adecuadas para la
expresin del cido nucleico del segundo aspecto de la invencin.

(b) purificar el biopolmero codificado por dicho cido nucleico.

El grado de complejidad composicional impuesto por las necesidades del diseo multifuncional no
puede ser alcanzado por tcnicas estndar de sntesis macromolecular. El biopolmero se obtiene
como protena recombinante, mediante tcnicas adaptadas de biologa molecular y biotecnolgica,
en microorganismos o plantas modificados genticamente. La secuencia nucleotdica que codifica
para la secuencia aminoacdica del biopolmero de la presente invencin, se inserta en un vector
de expresin definido anteriormente.

La transfeccin de una clula, definida en un prrafo anterior, se lleva a cabo con tcnicas
conocidas en el estado de la tcnica, por ejemplo pero sin limitarse, con electroporacin, con
biolstica, Agrobacterium tumefaciens o cualquier otra tcnica que permita la integracin de
cualquiera de los cidos nucleicos de la invencin en el ADN de la clula husped, ya sea
genmico, cloroplstico o mitocondrial.

La expresin del cido nucleico en la clula de la invencin da lugar a un biopolmero que puede
ser purificado mediante tcnicas conocidas en el estado de la tcnica. A lo largo de la descripcin y
las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras
caractersticas tcnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros
objetos, ventajas y caractersticas de la invencin se desprendern en parte de la descripcin y en
parte de la prctica de la invencin. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de
ilustracin, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencin.

DESCRIPCIN DE LAS FIGURAS Figura 1. Esquema del biopolmero de la invencin anclado a la


superficie de cultivo. Los puntos negros representan los dominios reactivos para la unin covalente
al sustrato y los puntos estrellados en medio de la molcula del biopolmero representan el dominio
de reconocimiento celular.

Figura 2. Esquema del cultivo celular sobre el biopolmero y de cmo las clulas se separan
cuando la temperatura baja de 37 C a 4 C, al no quedar accesible el dominio de reconocimiento
celular.

Figura 3. Electroforesis en gel de acrilamida del biopolmero 1 con el marcador de peso molecular
en el carril de la izquierda y el biopolmero 1 en el carril de la derecha. Los pesos moleculares se
indican en kilodaltons (kDa).

Figura 4. Anlisis de espectroscopia de masas (MALDI-ToF, del ingles "Matrix- assisted lser
desorption/ionization- time of fligh ) del biopolmero 1 en el cual se muestra el valor de su Masa
Molecular experimental de 31 .246 Da, siendo el terico 31 .371 Da y la diferencia entre ambos
atribuible al error de medida. Tambin se observa el carcter monodisperso de la molcula,
apareciendo solo un estrecho pico.

Figura 5. Anlisis de espectroscopia de infrarrojos (FTIR-ATR, del ingls "Fourier Transform


Infrared - Attenuated Total Reflectance") del biopolmerol en el cual se muestran las seales
caractersticas de los grupos amida (-1700 cm"1) presentes en los polmeros proteicos diseados.

Figura 6. Anlisis de calorimetra diferencial de barrido, (DSC, del ingls "Differential scanning
calorimetry") del biopolmero 1 en el que se muestra su temperatura de Transicin Inversa
(24.2C).

Figura 7. Reaccin de funcionalizacin de los polmeros con grupos azida. En primer lugar (1 ) se
genera "in situ" la azida trflica TfN3, a partir de la correspondiente azida de sodio menos reactiva.
En una segunda etapa (2) la azida trflica acta como reactivo nuclefilo dando una reaccin de
sustitucin sobre el grupo amino. Figura 8. Anlisis de espectroscopia de masas (MALDI-ToF) del
biopolmero 1 ' donde se muestra el aumento en 46 unidades de su peso molecular, respecto al
biopolmero 1 precursor, debido a la introduccin de los grupos azida de 24 unidades de masa
mayor que los grupos amino.

Figura 9. Anlisis de espectroscopia de infrarrojos FTIR-ATR del biopolmerol ' que muestra la
presencia de las seales de absorcin caractersticas de los grupos amida de los polmeros
proteicos (-1700 cm"1 ) junto con la seal caracterstica del nuevo grupo azida a 2100 cm"1.

Figura 10. Anlisis de DSC del biopolmero 1 ' muestra la disminucin en 1 ,3 C de la temperatura
de transicin inversa de este biopolmero (22,8 C), respecto a su precursor (24,2 C), debido a la
introduccin de grupos menos polares como los grupos azida en la estructura.

Figura 11 . Esquema de las etapas de funcionalizacin de las superficies. En la primera etapa se


activa la superficie con grupos hidroxilo por medio de un reactivo como la piraa. En la etapa
posterior se genera la superficie funcionalizada por grupos amino por enlace covalente entre el
silanol generado "in situ" y los grupos hidroxilo. En la tercera etapa se modifican los grupos amino
por reaccin de amidacin para dar la superficie activada por los grupos alquinilos presentes en el
extremo de la molcula de reactivo utilizada.

Figura 12. Esquema de la reaccin tipo "click" de biofuncionalizacin de la superficie con polmeros
tipo elastina. La reaccin de cicloadicin 1 ,3-dipolar entre un grupo azida y un grupo alquinilo
genera el correspondiente 1 ,2,3- triazol-1 ,4-disustituido en una reaccin en medio acuoso
catalizada por el in Cu(l) generado "in situ" por reduccin del in Cu(ll) en presencia de in
ascorbato. Figura 13. Anlisis comparativo de espectrometra de fotoelectrones de Rayos X (XPS)
para el vidrio y para las superficies funcionalizadas con grupos amino, grupos alquinilo y polmero
1 '. Se deduce un mayor recubrimiento en la superficie que posee el polmero unido
covalentemente debido a que se observa una menor proporcin de silicio que en las otras tres
muestras restantes. Adems, se observa que aumenta la proporcin en nitrgeno para las
superficies tratadas respecto a la original de vidrio. Esto es razonable debido al contenido en
nitrgeno en los grupos amino y amidas de las muestras funcionalizadas tanto con grupos amino,
alquino como en las biofuncionalizadas.

Figura 14. Espectroscopia de masas de iones secundarios (ToF-SIMS, del ingls "Time-of-Flight
Secondary Ion Mass Spectrometry") de la superficie funcionalizada con el polmero 1 '. Se
observan los iones de masa 68 (C4H6N+) y 72 (C4Hi0N+), tpicos de la presencia de un
recubrimiento de aminocidos valina; aparece un in de masa 70 (C H 8N+), tpico de la presencia
de un recubrimiento de aminocido prolina y la aparicin de un in de masa 86 (C5Hi 2N+) muestra
la presencia de un recubrimiento de aminocido isoleucina.
Figura 15. Imgenes fotogrficas de microscopa ptica por contraste de fases (objetivo x10) del
mismo campo a los tiempos 24h, 25h, 26h y 27h para las 8 superficies diferentes: A) vidrio, B)
polmero 1 ', C) Polmero 2', D) Polmero 3', E) Polmeros 3'+ 4, F) Polmero 4', G) Polmero 5', H)
Polmero 6'. La barra de escala corresponde a 100 mieras.

Figura 16. Evaluacin del porcentaje de clulas adheridas frente al total a lo largo del tiempo en 9
campos aleatorios de tres muestras replicadas en 4 experimentos independientes para las
diferentes superficies.

Figura 17. Evaluacin del nmero total de clulas adheridas y no adheridas a lo largo del tiempo en
9 campos aleatorios de tres muestras replicadas en 4 experimentos independientes para las
diferentes superficies.

Figura 18. Evaluacin de la viabilidad celular de las clulas despegadas de las superficies
biofuncionalizadas (polmero 1 ') y de clulas recin tripsinizadas (control) a diferentes tiempos de
incubacin de las clulas sobre poliestireno mediante la tcnica colorimtrica "Alamar Blue"
(p<0,05).

EJEMPLOS

A continuacin se ilustrar la invencin mediante ensayos realizados por los inventores que
describen la sntesis del biopolmero de la presente invencin as como sus caractersticas. Los
ejemplos se proporcionan para poder comprender la descripcin, y no se pretende que sean
limitativos de la presente invencin.

EJEMPLO 1. Obtencin de polmeros proteicos recombinantes tipo elastina. El diseo y la


obtencin de las secuencias nucleotdicas sintticas que codifican para las secuencias
aminoacdicas de los distintos biopolmeros empleados, incluyendo el biopolmero de la invencin
se realizaron como est descrito en WO/2010/092224. Igualmente, la expresin, purificacin y
caracterizacin de los biopolmeros se llev a cabo como est descrito en WO/2010/092224.

Se disearon los siguientes biopolmeros o polmeros:

Biopolmero 1 (371 aminocidos)

Estructura: D - BM - A2-Bi4.

Secuencia aminoacdica SEQ ID NO: 7:

MGKKKP-(VPGVG)i4-((VPGIG)inAVTGRGDSPASS(VPGIG)in VPGVG)i4- V

Codificado por la secuencia nucleotdica SEQ ID NO: 8.


La composicin de aminocidos terica y la obtenida mediante HPLC (del ingls "High-
performance liquid chromatography") con deteccin UV (luz ultravioleta) se presentan en la Tabla 1
. Tabla 1 . Anlisis de la composicin de aminocidos del biopolmero 1 . n.d.: no detectado.

El rendimiento de la produccin fue de 75 mg/L.

El Peso Molecular terico para el polmero 1 es de 31 .371 Da y se estim experimentalmente por


electroforesis en gel de poliacrilamida (Figura 3) y por MALDI-TOF en un espectrmetro modelo Q-
Star resultando ser 31 .250 Da (Figura 4). La figura 5 representa a modo de ejemplo un espectro
de infrarrojos (IR) obtenido para el biopolmero 1 . La Temperatura de transicin obtenida mediante
DSC en tampn fosfato salino (PBS) fue de 24,2 C (Figura 6).

El biopolmero 1 es un polmero tipo elastina con secuencia de adhesin celular y con capacidad
de funcionar como sistema de recoleccin celular. Debido a su carcter inteligente, al superar su
temperatura de transicin inversa cambia drsticamente su conformacin de manera que se anula
su capacidad de adhesin celular, producindose el despegue de las clulas de la superficie, una
vez conseguido un cultivo eficaz de dichas clulas.

La secuencia aminoacdica A incluye una secuencia bioactiva RGD no especfica, que induce la
adhesin celular a la superficie bioactiva a temperaturas superiores a la de la transicin inversa y
coincidentes con la del cultivo celular.

La secuencia aminoacdica B se incluye como portadora de las propiedades inteligentes del


polmero, produciendo una diferente conformacin del polmero en funcin de la temperatura del
entorno, y la que impide la adhesin celular por debajo de la temperatura de transicin inversa
anulando el efecto de la secuencia A de adhesin celular.

La secuencia aminoacdica D incluye tres aminocidos lisina portadores de los grupos amino
necesarios para unir el polmero a la superficie mediante enlace qumico covalente, es decir, para
obtener las superficies biofuncionalizadas.

Biopolmero 2 de 371 aminocidos


Estructura: D - BM - C2-BH

Secuencia aminoacdica SEQ ID NO: 9:

MGKKKP-(VPGVG)i4-((VPGIG)inAVTGRDGSPASS(VPGIG)in)?-(VPGVG)i4- V

Codificado por la secuencia nucleotdica SEQ ID NO: 10.

La composicin de aminocidos terica y la obtenida mediante HPLC con deteccin UV se


presentan en la Tabla 2.

Tabla 2. Anlisis de la composicin de aminocidos del biopolmero 2.

El rendimiento de la produccin fue de 70 mg/L.

El Peso Molecular terico para el polmero 2 es de 31 .371 Da y se estim experimentalmente por


electroforesis en gel de poliacrilamida y por MALDI-TOF en un espectrmetro modelo Q-Star
resultando ser 31 .265 Da. La Temperatura de transicin obtenida mediante DSC en PBS fue de
23,5 C. El polmero 2 puede tener capacidad de funcionar como sistema de recoleccin celular.
Debido a su carcter inteligente, al superar su temperatura de transicin inversa, su conformacin
cambia drsticamente y la adhesin celular disminuye, producindose el despegue de las clulas
de la superficie, una vez conseguido un cultivo eficaz de las clulas.

El polmero 2 posee las secuencias aminoacdicas B y D como las del polmero 1 . La secuencia
aminoacdica C incluye una secuencia no bioactiva polar RDG.

Biopolmero 3 de 427 aminocidos:

Estructura: D - B84

Secuencia aminoacdica SEQ ID NO: 1 1 :

MGKKKP-(VPGVG)8 -V
Codificado por la secuencia nucleotdica SEQ ID NO: 12.

La composicin de aminocidos terica y la obtenida mediante HPLC con deteccin UV se


presentan en la Tabla 3. Tabla 3. Anlisis de la composicin de aminocidos del biopolmero 3.

El rendimiento de la produccin fue de 35 mg/L.

El Peso Molecular terico para el polmero 3 es de 35.191 Da y se estim experimentalmente por


electroforesis en gel de poliacrilamida y por MALDI-TOF en un espectrmetro modelo Q-Star
resultando ser 35.152 Da. La Temperatura de transicin obtenida mediante DSC en PBS fue de
29,4 C.

El polmero tipo elastina llamado polmero 3 tiene capacidad de funcionar como sistema de
recoleccin celular debido a su carcter inteligente, si bien el nmero de clulas adheridas es
inferior debido a la ausencia de una secuencia bioactiva de adhesin celular. Las secuencias
aminoacdicas B y D son como las de los polmeros 1 y 2. Biopolmero 4 de 371 aminocidos

Estructura: B14- A2 - B1

Secuencia aminoacdica SEQ ID NO: 13:

MESLLP-(VPGVG)i4-((VPGIG)inAVTGRGDSPASS(VPGIG)in VPGVG)i 4-V Codificado por la


secuencia nucleotdica SEQ ID NO: 14.

La composicin de aminocidos terica y la obtenida mediante HPLC con deteccin UV se


presentan en la Tabla 4. Tabla 4. Anlisis de la composicin de aminocidos del biopolmero 4.

El rendimiento de la produccin fue de 42 mg/L.


El Peso Molecular terico para el polmero 4 es de 31 .371 Da y se estim experimentalmente por
electroforesis en gel de poliacrilamida y por MALDI-TOF en un espectrmetro modelo Q-Star
resultando ser 31 .388 Da. La Temperatura de transicin obtenida mediante DSC en PBS fue de
23,8 C.

El polmero 4 se utiliza en un sistema compuesto por dos biopolmeros, el primero de ellos con
capacidad de injertarse en la superficie, polmero 3, y el segundo, polmero 4, con capacidad de
inducir adhesin celular de manera que el sistema resulta eficaz como sistema de recoleccin
celular por la sinergia del efecto de los polmeros.

En otra experiencia realizada, el polmero 4 se utiliza injertado en la superficie una vez modificado
su grupo amino terminal en grupo azida y sin contener la secuencia D rica en lisinas en el extremo
amino terminal. Las secuencias aminoacdicas A y B son como las del polmero 1 .

Biopolmero 5 de 699 aminocidos

Estructura: H-l6

Secuencia aminoacdica SEQ ID NO: 15:

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH-MESLLP-{[(VPGIG)2(VPGKG)(VPGIG)2]2 A GRGDSPASS [(VPG I


G)2(VPGKG)(VPG IG)2]2]}6-V

Codificado por la nucleotdica SEQ ID NO: 20.

La composicin de aminocidos terica y la obtenida mediante HPLC con deteccin UV se


presentan en la Tabla 5.

Tabla 5. Anlisis de la composicin de aminocidos del biopolmero 5.

El rendimiento de la produccin fue de 51 mg/L.


El Peso Molecular terico para el polmero 5 es de 60.661 Da y se estim experimentalmente por
electroforesis en gel de poliacrilamida y por MALDI-TOF en un espectrmetro modelo Q-Star
resultando ser 60.556 Da. La Temperatura de transicin obtenida mediante DSC en PBS fue de
32,2 C.

La secuencia aminoacdica I es similar a la secuencia A, portadora de la secuencia de adhesin


celular RGD, pero con la particularidad de que un aminocido isoleucina del pentapptido en
posicin 3 y del pentapptido en posicin 8 de la serie de 10 pentapptidos que flanquean a la
secuencia de adhesin RGD, ha sido cambiado por otro de lisina, portador de grupos amino
capaces de ser transformados en grupos azida. De esta manera, cuando se injerta en la superficie,
lo har a travs de mltiples enlaces covalentes, repartidos a lo largo de la cadena del biopolmero
5, impidiendo que cambie sustancialmente su conformacin con la temperatura, y por tanto no
resultando un sistema eficaz de recoleccin celular.

Biopolmero 6 de 343aminocidos

Estructura: D-A3

Secuencia aminoacdica SEQ ID NO: 21 :

MGKKKP-((VPGIG)inAVTGRGDSPASS(VPGIG)in^-V

Codificado por la secuencia nucleotdica SEQ ID NO: 22.

La composicin de aminocidos terica y la obtenida mediante HPLC con deteccin UV se


presentan en la Tabla 6. Tabla 6. Anlisis de la composicin de aminocidos del biopolmero 6.

El rendimiento de la produccin fue de 83 mg/L.

El Peso Molecular terico para el polmero 6 es de 29461 Da y se estim experimentalmente por


electroforesis en gel de poliacrilamida y por MALDI-TOF en un espectrmetro modelo Q-Star
resultando ser 29.269 Da. La Temperatura de transicin obtenida mediante DSC en PBS fue de
23,0 C.
El polmero tipo elastina llamado polmero 6 posee la secuencia aminoacdica A, portadora de la
secuencia de adhesin celular RGD repetida tres veces a lo largo de la cadena polipeptdica y
posee la secuencia D como la de los polmeros 1 -3, lo que le permite unirse al soporte mediante
enlace covalente. EJEMPLO 2. Modificacin de polmeros 1 -6.

Modificacin del pie-polmero 1 para obtener el pie-polmero 1 '. La obtencin del biopolmero 1 ' se
lleva a cabo por transformacin de la secuencia del pptido D, que porta aminocidos lisina que
poseen grupos amino en la posicin gamma. Estos grupos amino se transforman para
posteriormente llevar a cabo la reaccin de ciclacin tipo "c//c/ ". El pptido D transformado se
denomina pptido E.

En el pptido E se han transformado los grupos amino de las lisinas en grupos azida, por reaccin
de sustitucin utilizando azida trflica generada "in sit" como reactivo nuclefilo (Figura 7),
obtenindose un rendimiento de la reaccin del 89%. De esta manera, obtenemos un polmero
inteligente, que presenta una secuencia de adhesin celular bioactiva y que puede ser injertado por
va qumica a la superficie.

Para caracterizar el biopolmero 1 ' se realiz una espectrometra MALDI-TOF y de dicho anlisis
se dedujo que el peso molecular del polmero es de 31 .296 Da (masa molar terica 31 .475 Da,
figura 8), observndose un lgico aumento de 46 g/mol al sustituir los grupos amino pertenecientes
a sus lisinas por grupos azida.

El biopolmero V obtenido muestra un espectro de infrarrojo (FTIR-ATR) que presenta la seal


caracterstica de los grupos azida a frecuencias de 2.100 cm"1 (Figura 9), mientras que en el
espectro de IR del biopolmero precursor 1 (Figura 5) se observa la ausencia de dicha seal.

Se corrobora el xito y alcance de la reaccin de modificacin del polmero 1 examinando el


ensayo de anlisis de aminocidos realizado al biopolmero 1 ', donde se observa una importante
disminucin del nmero de aminocidos de lisina mientras que el resto de los aminocidos
permanecen inalterados. De esta manera, deducimos que se han modificado los grupos amino de
dichas lisinas, transformndose en grupos azida, estimando que se han transformado un 46% de
las lisinas (Tabla 7).

'
Tabla 7.- Anlisis de la composicin de aminocidos del biopolmero 1
La respuesta inteligente del biopolmero 1 ' ocurre a una temperatura de 22,8 C e inferior a la del
biopolmero 1 de 24,2C en 1 ,3 C. Este comportamiento es debido a la introduccin de un grupo
fuertemente apolar, como es el grupo azida, frente al grupo amino de partida (Figura 6).

Modificacin de los biopolmero 2-6 para obtener los biopolmero 2'-6'.

Los biopolmeros 2-6 han sido modificados como se ha descrito para el biopolmero 1 , dando lugar
a los biopolmeros 2'-6', respectivamente.

Los polmeros modificados han sido caracterizados de manera similar al V. Se ha realizado su


anlisis de aminocidos, se han determinado sus pesos moleculares por MALDI-TOF, su
temperatura de la transicin inversa por DSC, y se ha realizado el anlisis de su espectro de
infrarrojo (FTIR-ATR) llegndose a conclusiones semejantes a las anteriores. Todos estos datos se
detallan a continuacin.

Biopolmero 2' modificado

Tabla 8. Anlisis de la composicin de aminocidos del biopolmero 2 '.

Rendimiento de la reaccin: 94%

Masa molar terica: 31 .475 Da

Masa molar media experimental (MALDI-TOF): 31 .291 Da


Temperatura de transicin (DSC) en PBS: 21 ,8 o C

Tasa de transformacin de lisinas: 46 %

Biopolmero 3' modificado

Tabla 9. Anlisis de la composicin de aminocidos del biopolmero 3 '.

Rendimiento de la reaccin: 80 %

Masa molar terica: 35.295 Da

Masa molar media experimental (MALDI-TOF): 35.185 Da

Temperatura de transicin (DSC) en PBS: 27,7 C

Tasa de transformacin de lisinas: 50%

Biopolmero 4' modificado

Tabla 10. Anlisis de la composicin de aminocidos del biopolmero 4 '.

Asp Ser Glu Gly Arg Thr

Terico 2 7 1 140 2 2

Anlisis

aminocidos Experimental 2,35 6,83 1 ,25 145,53 2,64 2,1 1

Ala Pro Val Met Lys Me Leu

Terico 4 71 99 1 0 40 2

Anlisis

aminocidos Experimental 4,22 70, 15 97,78 n.d. 0,00 39,40 2, 14 Rendimiento de la reaccin: 90
%
Masa molar terica: 31398 Da

Masa molar media experimental (MALDI-TOF): 31 .327 Da

Temperatura de transicin (DSC) en PBS: 24,2 C

Biopolmero 5' modificado

Tabla 1 1 . Anlisis de la composicin de aminocidos del biopolmero 5 '.

Rendimiento de la reaccin: 85 %

Masa molar terica: 61 .285 Da

Masa molar media experimental (MALDI-TOF): 60.900 Da

Temperatura de transicin (DSC) en PBS: 22,2 C

Tasa de transformacin de lisinas: 54%

Biopolmero 6' modificado

Tabla 12. Anlisis de la composicin de aminocidos del biopolmero 6 '

Rendimiento de la reaccin: 50 %
Masa molar terica: 29.565 Da

Masa molar media experimental (MALDI-TOF): 29.302 Da Temperatura de transicin (DSC) en


PBS: 21 ,5 C

Tasa de transformacin de lisinas: 83%

EJEMPLO 3. Obtencin de superficies biofuncionalizadas con los polmeros.

Una vez modificados los biopolmeros con grupos azida, la obtencin de las superficies
biofuncionalizadas se lleva a cabo en dos etapas: la primera consiste en la activacin de la
superficie de vidrio con grupos alquinilo y la segunda en el injerto de los polmeros en las mismas a
travs de un enlace qumico covalente.

Activacin de la superficie

En primer lugar se lleva a cabo el activado de la superficie con "piraa", mezcla 7:3 en volumen de
cido sulfrico (H2SO4) y perxido de hidrgeno (H2O2) capaz de eliminar la capa de xido de
silicio presente en la superficie del vidrio dejando grupos hidroxilo libres (-OH) expuestos en la
superficie. En la figura 1 1 se representa el proceso de activacin llevado a cabo en la superficie
del vidrio. El seguimiento de las reacciones en la superficie se efecta, entre otras tcnicas,
mediante la medida del ngulo de contacto de una gota de agua sobre la superficie obtenida en
cada uno de los pasos. El cambio en su hidrofobicidad se manifiesta en la variacin de su ngulo
de contacto, pasando de 48,1 para la superficie no activada a 27,3 para la superficie activada, al
aumentar su hidrofilia

por la presencia de los grupos hidroxilo expuestos en la superficie.

Cada etapa de modificacin de la superficie se caracteriza tambin mediante el anlisis por


espectrometra de fotoelectrones de Rayos X (XPS), que nos permite obtener la concentracin
atmica de los elementos presentes en la superficie con una profundidad de anlisis de
aproximadamente 5 nm. La presente tcnica tambin es capaz de darnos informacin relativa al
estado qumico de los elementos presentes. En las superficies de vidrio se observa una elevada
proporcin de Si y O junto con una pequea proporcin de C y de otros elementos que se
encuentran como contaminantes. La proporcin de Si disminuye ligeramente y la de O aumenta
para la superficie activada, junto con una pequea disminucin del C ambiental (Tabla 13). Tabla
13. Resultado de la XPS de las superficies de vidrio, vidrio activado con disolucin "piraa" y
superficies amino y alquino silanizadas.
La siguiente etapa consiste en la obtencin de una superficie funcionalizada con grupos amino, por
reaccin de los grupos hidroxilo libres expuestos en la superficie recin activada con 3-
aminopropilsilanol, generado "in situ" a partir de 3-aminopropiltrimetoxisiloxano (APTS) (Figura 1 1
). La tcnica de rutina para determinar la modificacin de la superficie es la medida del ngulo de
contacto de una gota sobre la superficie, observndose un razonable aumento de la hidrofobicidad
(ngulo de contacto que vara desde 27,3 para la superficie activada con grupos hidroxilo libres
hasta un ngulo de 78,1 para la superficie funcionalizada con grupos aminopropilsiloxano). La
superficie tambin se caracteriza mediante el anlisis por XPS. En dicho anlisis se confirma la
presencia del grupo aminopropil, ya que se registra la presencia de un pico de N 1 s a 397 eV
(Tabla 13) que no est presente en la superficie de vidrio de partida, ni en la superficie activada por
la disolucin de piraa, y un aumento en la proporcin de C que supera la posible contaminacin
ambiental.

Por ltimo, la formacin de la superficie funcionalizada con grupos alquinilo se efecta por reaccin
de amidacin, catalizada por una base como la trietilamina, de los grupos amino presentes en la
superficie con anhdrido pentinoico, portador de grupos alquinilo terminales (Figura 1 1 ).

En la figura 1 1 , donde se representan las etapas de reaccin realizadas, puede verse tambin
que se realizaron medidas del ngulo de contacto de una gota de agua sobre las superficies
obtenidas en cada una de las etapas. Dichas medidas nos permitieron estudiar los cambios de
hidrofobicidad de las superficies y por tanto sirvieron como primer mtodo de control o seguimiento
de cada etapa de reaccin. As, la superficie funcionalizada con grupos alquinilo presenta una
pequea disminucin en su hidrofobicidad respecto a la superficie aminofuncionalizada, lo cual se
corrobora con su medida de su ngulo de contacto que disminuye a 64,5.

La superficie alquinilo funcionalizada presenta un mayor recubrimiento que la superficie amino


funcionalizada, lo cual queda reflejado en su anlisis de XPS por la disminucin de la proporcin
de Si 2p. Asimismo, se observa una disminucin en la proporcin de O y una mayor proporcin
relativa de C y de N, lo que permite confirmar la adicin del grupo alquinilo (Tabla 13). Se obtiene
informacin adicional sobre la estructura molecular del injerto a partir de la comparacin de los
espectros de alta resolucin de las distintas regiones de inters. Es posible identificar los diferentes
estados de oxidacin de los elementos a estudiar, mediante la deconvolucin de sus
correspondientes espectros. En el espectro de alta resolucin de la regin N 1 s de la superficie
aminosilanizada se aprecia un solo pico a 399,5 eV correspondiente al grupo amino. En el espectro
de la superficie aquinilosilanizada se muestra la aparicin de un segundo pico de nitrgeno a 401
,7 eV correspondiente al nitrgeno de mayor estado de oxidacin de la amida, lo cual prueba la
formacin de un enlace covalente tipo amida. La proporcin observada de los dos picos de N de
diferente estado de oxidacin nos permite deducir por deconvolucin que se ha formado un 30%
de acoplamiento de grupos alquinilo, proporcin suficiente sin ser excesiva para la posterior
funcionalizacin de la superficie con polmeros proteicos.

Los anlisis de espectroscopia ToF-SIMS para las superficies amino y alquinilo funcionalizadas
muestran un espectro similar entre ellas que difiere del observado para la superficie sin
funcionalizar fundamentalmente en los iones de masa 23 (Na +), 30 (CH4N+) y 45 (CH3NO+) (Tabla
14). La menor intensidad del in Na + permite deducir nuevamente un mayor recubrimiento en las
superficies amino y alquinilo funcionalizadas. Por otro lado, en las superficies funcionalizadas se
observan dos nuevos iones ausentes en las superficies no funcionalizadas, como son: el in de
masa 30 (CH4N+), que aparece con mayor intensidad para la muestra alquinilo que para la muestra
amino y el in de masa 45 (CH3NO+), con intensidad similar en ambas superficies, lo que permite
deducir una composicin orgnica en el recubrimiento.

Tabla 14. ToF-SIMS de las superficies de vidrio y de las superficies amino y alquinilosilanizadas.
Inten. es intensidad.
Biofuncionalizacin de las superficies mediante cicloadicin tipo "c// 'c/ ". Los biopolmeros
modificado 1 '-6' se han enlazado covalentemente a la superficie funcionalizada con grupos
alquinilo por reaccin de cicloadicin tipo "c//c/ ", entre los grupos azida contenidos en los
polmeros y los grupos alquinilo expuestos en la superficie (Figura 12).

La formacin de un 1 ,2,3-triazol-1 ,4-disustituido se produce por cicloadicin 1 ,3- dipolar tipo


Hisgen en medio acuoso, catalizada por el in Cu(l) generado "in situ" por reduccin del in Cu(ll)
en presencia de ascorbato. Este tipo de reaccin transcurre en condiciones suaves de reaccin,
presenta una gran tolerancia al agua, al oxgeno y a otros grupos funcionales presentes y se puede
llevar a cabo en una gran variedad de disolventes, tanto prticos como aprticos proporcionando
elevados rendimientos (Figura 12).

Las superficies con los biopolmeros injertados 1 '-6' se han caracterizado por XPS. En el caso de
la superficie funcionalizada con el biopolmero 1 ' se ha apreciado un mayor espesor de capa y un
mayor recubrimiento que en las superficies obtenidas previamente con funciones amino y alquinilo,
debido a una menor proporcin de Si 2p presente (4,21 %) y una mayor proporcin de C 1 s (59,15
% de concentracin atmica) (Tabla 15), en comparacin con las superficies amino y
alquinilosilanizadas, lo cual indica que la reaccin ha sido eficaz y hay una presencia importante
del biopolmero 1 'injertado, ya que la proporcin 59:23:1 1 est de acuerdo con la proporcin
porcentual de estos elementos en dicho polmero. Este comportamiento es similar para el resto de
las superficies biofuncionalizadas con los polmeros 2 '-6'analizadas como se observa en la tabla 14.
A modo de ejemplo en la figura 13 se muestra el anlisis de XPS de las distintas etapas de
funcionalizacin de la superficie hasta la obtencin de la superficie funcionalizada con el
biopolmero 1 '.

Tabla 15.- XPS de las superficies funcionalizadas con polmero 1 ', polmero 2', polmero 3',
polmero 4 adsorbido sobre polmero 3' injertado (3 '+ 4), polmero 4', polmero 5' y polmero 6'. POL
r POL 2' POL 3'

Conc. (eV) Conc. Conc.

Atom. Atom. Atom.

Pico (eV) (%) (%) (eV) (%)

C 1 s 284 59,15 284 69,99 284 64,24

01 s 529 23,19 529 15,29 529 18,18

N1 s 398 1 1 ,16 398 8,65 398 9,1


Si 2p 101 4,21 101 5,18 101 6,59

Los anlisis de espectroscopia ToF-SIMS para las superficies injertadas con los polmeros
modificados 1 '-6' muestran un espectro que difiere del observado para las superficies amino y
alquinilo funcionalizadas y que permite deducir que existe un recubrimiento de tipo proteico debido
a la aparicin de los iones tpicos a los que dan lugar los aminocidos valina, prolina, isoleucina y
glicina. A modo de ejemplo, en la figura 14 se muestra el anlisis de ToF-SIMS de la superficie
funcionalizada con el polmero 1 '. En ella se observan los iones de masa 68 (C 4H6N+) y 72 (C
H10N+), tpicos de la presencia de un recubrimiento de aminocidos valina; aparece un in de masa
70 (C4H8N+), tpico de la presencia de un recubrimiento de aminocido prolina y la aparicin de un
in de masa 86 (CsH^N"1") muestra la presencia de un recubrimiento de aminocido isoleucina.
Todos estos picos no estn presentes en la superficie funcionalizada con grupos alquinilo, lo que
permite corroborar un recubrimiento de tipo proteico en las nuevas superficies injertadas con el
polmero 1 '. Este comportamiento es similar en todas las superficies estudiadas a excepcin de la
superficie biofuncionalizada con el polmero 3 ', para el cual la ausencia de aminocidos isoleucinas
se manifiesta en una menor proporcin del in de masa molecular 86 (Tabla 16). Hay que destacar
que la presencia del in de masa 86 en el sistema 3'+4 demuestra la eficaz adsorcin del polmero
4 sobre la superficie injertada con el polmero 3'. Tabla 16. of-SIMS de las de las superficies
funcionalizadas con polmero 1 ', 2',

3', 4, 3'+ 4, 4', 5'y 6'. I es intensidad.


El anlisis de la superficie con el biopolmero injertado 4 ' por XPS (Tabla 15) y ToF-SIMS (Tabla
16) indica que la reaccin no es eficaz con un nico grupo amino terminal y que la superficie no
muestra un recubrimiento adecuado del biopolmero 4'injertado, como se deduce de los resultados
obtenidos por estas tcnicas, los cuales muestran una proporcin elevada de Si 2p presente (16,17
%) en la superficie, junto con una menor proporcin de C 1 s (50,75 %). El anlisis de la superficie
con los biopolmeros injertados 5' y 6' por XPS (Tabla 15) y ToF-SIMS (Tabla 16) indica que la
reaccin ha sido eficaz, que hay una presencia importante de biopolmero en la superficie y que el
recubrimiento ha sido adecuado tanto con el biopolmero 5' como con el 6'. Para comprobar si el
comportamiento inteligente de los biopolmeros se mantiene cuando stos se han injertado en las
superficies, y por tanto que estos sistemas son viables como sistemas de recoleccin celular, se
han llevado a cabo medidas de ngulos de contacto en muestras tratadas trmicamente. Se
hicieron medidas por encima (a 37 C) y por debajo de la temperatura de transicin (a 10 C)
obtenindose los valores a las dos temperaturas escogidas que se muestran en la tabla 17.

Para la superficie funcionalizada con el biopolmero 1 ' se observan valores diferentes del ngulo
de contacto a 10C y 37C de 76.81 .2 y 65.20.8, respectivamente, como consecuencia del
diferente plegamiento en la estructura del biopolmero 1 '. Se observa cmo la hidrofobicidad de la
superficie es mayor al superar la temperatura de transicin del biopolmero. Esto es debido a que
el polmero pasa de un estado hidratado a uno no hidratado cuando supera su temperatura de
transicin (Tt), es decir que disminuye su carcter hidroflico con la temperatura. Los resultados se
muestran en la tabla 17.

Tabla 17. ngulos de contacto de las superficies funcionalizadas con polmeros 1 '-6' a diferentes
temperaturas.

SUPERFICIE NGULO a 10C NGULO a 37 C

Polmero 1 ' 65,2 0,8 76,8 1 ,2 1 1 ,6

Polmero 2' 65,9 1 ,0 74,9 0,7 9,0

Polmero 3' 59,7 2,1 64,8 1 ,1 5,1

Polmero 3'+4 49,0 1 ,9 53,2 4,2 4,2

Polmero 4' 60,3 0,5 64,1 1 ,5 3,8

Polmero 5' 67,5 0,7 65,3 0,6 2,4

Polmero 6' 43,5 1 ,2 49,1 2,0 5,6 El escaso recubrimiento de la superficie con el polmero 4'
se observa de nuevo en la pequea disminucin que presenta el ngulo de contacto de la
superficie funcionalizada con dicho polmero 4', el cual slo vara 3,8 para la superficie a 10 C
(60,3 0,5) y 37 C (64,1 1 ,5), respectivamente. Puesto que la estructura del polmero 4 ' es
totalmente anloga a la del polmero 1 ', la pequea variacin observada denota la escasa
presencia de polmero en la superficie, por lo cual se observan valores similares a los encontrados
en la superficie no injertada recubierta de grupos alquinilo (64,5, figura 1 1 ). Las medidas de
ngulos de contacto llevadas a cabo en la superficie biofuncionalizada con el biopolmero 5' (Tabla
17) nos muestran que la hidrofobicidad de la superficie vara apreciablemente con la temperatura,
observndose valores de 65,3 0,6 a 37 C y de 67,5 0,7 a 10 C. Estos valores muestran cmo
el polmero 5', al estar unido covalentemente a la superficie por varios puntos a lo largo de su
cadena, no presenta la libertad de movimiento necesaria para cambiar su conformacin con la
temperatura y, por tanto, puede perder su capacidad como sistema de recoleccin celular.

Si bien se mantiene el comportamiento inteligente del biopolmero 6 ' en la superficie como se


deduce de las medidas de ngulos de contacto llevadas a cabo en la superficie (Tabla 17),
observndose de nuevo una disminucin en la hidrofobicidad de la superficie al bajar la
temperatura por debajo de la de transicin, de 49,1 1 ,2 a 37 C a 43,5 2,0 a 10 C, los valores
observados corroboran la mayor hidrofilia del polmero injertado 4' por la presencia de las tres
secuencias polares de adhesin celular RGD.

Biofuncionalizacin de las superficies mediante cicloadicin tipo "c// 'c/ " del polmero 3' y posterior
adsorcin del polmero 4.

Se utiliz tambin un sistema compuesto por dos biopolmeros, el primero de ellos con capacidad
de injertarse en la superficie (polmero 3 ') y el segundo (polmero 4), con capacidad de inducir
adhesin celular de manera que el sistema resulta eficaz como sistema de recoleccin celular por
la sinergia del efecto de ambos polmeros.

En el polmero 4, la secuencia bioactiva RGD induce la adhesin celular a la superficie bioactiva a


temperaturas superiores a la de la transicin inversa y coincidentes con la del cultivo celular.

En el polmero 4, el pptido B se incluye como portador de las propiedades inteligentes del


polmero, que impide la adhesin celular por debajo de la temperatura de transicin inversa,
anulando el efecto de las zonas ms polares y que favorecen la adhesin celular.

El biopolmero modificado 3' se ha enlazado covalentemente por reaccin qumica mediante


reaccin de cicloadicin tipo "c//c/ ", entre los grupos azida contenidos en el polmero y los grupos
alquinilo presentes en la superficie. El procedimiento ha sido el mismo que el descrito para los
polmeros 1 ' y 2'.

Una vez obtenidas las superficies biofuncionalizadas con el polmero 3 ' injertado va qumica se
produce la adsorcin del polmero 4, por medio de la inmersin de las superficies previamente
preparadas en una disolucin acuosa del biopolmero 4. La superficie con el sistema de
biopolmeros 3' y 4 se ha caracterizado por XPS y se ha apreciado un mayor espesor de capa y un
mayor recubrimiento que en las superficies funcionalizadas con grupos amino y/o alquinilo, lo que
se deduce de la menor proporcin de Si 2p y de la mayor proporcin de C 1 s (Tabla 15) presente
en las superficies biofuncionalizadas con polmero 4, en comparacin con las superficies amino y
alquinilosilanizadas; lo cual indica una presencia importante de biopolmeros sobre la superficie.
EJEMPLO 4. Ensayos de adhesin celular.

Estudio del proceso de recoleccin celular mediante las superficies bioactivas. El estudio del
proceso de recoleccin celular mediante este tipo de superficies se dividi en dos partes. Primero,
la recoleccin de clulas individuales y segundo, la recoleccin de una lmina celular mediante
membranas de PVDF (fluoruro de polivinilideno).

Recoleccin de clulas individuales.


Las superficies biofuncionalizadas con el biopolmero tipo elastina son esterilizadas mediante luz
UV durante 30 minutos por cada lado. Por otra parte, los pocilios de las placas multipocillos de
poliestireno de 24 pocilios son tratados con albmina de suero bovino (BSA) al 0,1 % en PBS y
mantenidas toda la noche a 4o C para evitar que posteriormente las clulas se unan de manera
inespecfica. A continuacin son lavados tres veces con PBS y las superficies biofuncionalizadas
estriles son colocadas en los pocilios correspondientes. Por otro lado, se procede al sembrado
celular con fibroblastos humanos (lnea celular HFF-1 ). Los fibroblastos son cultivados en frascos
de 250 mi con medio DMEM ("Dulbecco's Modified Eagle Mdium") suplementado con 15% suero
fetal bovino (FBS) y penicilina-estreptomicina al 1 % a 37 C bajo una concentracin del 5 % de
CO2 en aire. Cuando las clulas llegan a confluencia son recolectadas mediante el tratamiento con
0,25% Tripsina y 0,02% EDTA (cido etilendiaminotetraactico) en PBS. Tras la centrifugacin de
la suspensin celular resultante se resuspenden en DMEM suplementado con penicilina-
estreptomicina al 1 %. La suspensin celular es diluida hasta tener 2x10 4 clulas/pocilio y alcuotas
de 500 son distribuidas en cada pocilio sobre cada una de las superficies biofuncionalizadas e
incubadas a 37 C bajo una concentracin del 5% de CO 2 en el aire. La morfologa de las clulas
es evaluada y fotografiada a los 30 minutos, 4, 8 y 24 horas (h) (Figura 15), a partir de la siembra,
por contraste de fases mediante un microscopio ptico equipado con un sistema de cmara digital.
El experimento es repetido cuatro veces, bajo las mismas condiciones, evaluando tres rplicas en
cada uno de ellos y analizando las clulas de las fotos generadas en 9 campos elegidos al azar en
cada superficie. A las 24 h de cultivo las placas multipocillos que contienen las superficies con las
clulas adheridas son transferidas a 4 o C. Despus de 1 h (25 h desde el inicio del experimento), 2
h (26 h desde el inicio del experimento) y 3 h (27 h desde el inicio del experimento) de incubacin,
la morfologa celular es observada y fotografiada como se indic anteriormente, considerando las
clulas redondeadas como no adheridas y las clulas extendidas como adheridas (Figura 16 y 17).

El porcentaje de clulas adheridas y el nmero total de clulas adheridas es representado como el


valor medio (n=4) con su desviacin estndar. Superficies de vidrio no biofuncionalizadas, sin
ningn tipo de recubrimiento son usadas como controles de adhesin y de recoleccin.

En la figura 15B la superficie funcionalizada con el biopolmero modificado 1 ', el cual contiene la
secuencia peptdica bioactiva RGD, muestra una muy buena adhesin a los 30 minutos, semejante
a la del vidrio (Figuras 16 y 17). A las 24h esta adhesin tanto en porcentaje como en nmero de
clulas sigue siendo comparable a la de la superficie de vidrio como se puede comprobar en las
imgenes tanto en su extensin como en la morfologa celular (Figura 15B).

Sin embargo, se observa que cuando disminuimos la temperatura, por debajo de la Tt del polmero,
con clara diferencia respecto a las superficies de vidrio sin recubrimiento, las clulas comienzan a
despegarse, apareciendo grandes huecos entre ellas, y comienzan a adquirir una morfologa ms
redondeada (Figura 15B).
As, a partir de las 24 h el nmero de clulas adheridas disminuye mientras que se produce un
gran aumento en el nmero de clulas no adheridas, que corresponden a las clulas de morfologa
ms redondeada, que no interaccionan con la superficie pero mantienen las interacciones entre
ellas y con su matriz extracelular. Las clulas muestran por tanto una alta capacidad de adhesin y
una respuesta al cambio de temperatura que hace que se despeguen. En consecuencia, para la
constitucin de un sistema de recoleccin celular efectivo, es tan importante la presencia de una
secuencia bioactiva de adhesin celular por la cual las clulas se adhieren eficazmente, como la
capacidad que muestra este polmero injertado en la superficie para cambiar de conformacin en
funcin de la temperatura y pasar a comportarse como no adherente.

La Figura 15C muestra la superficie funcionalizada con el biopolmero modificado 2', el cual
contiene la secuencia peptdica RDG, que es la versin desordenada ("scrambled") del RGD, y
donde la capacidad de adhesin del pptido RGD queda anulada. El nmero de clulas que
consiguen adherirse en esta superficie es significativamente menor con respecto a la superficie de
vidrio y a la superficie del polmero V (Figura 15A, B). Adems, esta adhesin es claramente ms
dbil.

La morfologa de las clulas a las 24 h de incubacin nos demuestra que pocas clulas consiguen
unirse de forma efectiva a la superficie injertada con el biopolmero modificado 2'. Esto provoca un
rpido despegue en cuanto se produce el cambio de temperatura (Figura 17) como puede
observarse en la fotografa correspondiente a las 25 h de incubacin (Figura 15C). Esta superficie
por tanto muestra baja capacidad de adhesin pero mantienen la respuesta inteligente al cambio
de temperatura propia de los polmeros tipo elastina siendo insuficiente para constituir un sistema
efectivo de recoleccin celular (Figura 16).

La superficie de la figura 15D corresponde a una superficie funcionalizada con el biopolmero


modificado 3', el cual no contiene ninguna secuencia peptdica bioactiva. El nmero de clulas que
consiguen adherirse es significativamente menor con respecto a la superficie de vidrio y a
superficie injertada con el biopolmero modificado V. Adems, la adhesin celular a la superficie
funcionalizada con el biopolmero modificado 3' es lbil. La morfologa de las clulas a las 24 h de
incubacin nos indica que el nmero de clulas que consiguen unirse de forma efectiva a la
superficie es pequeo (Figura 16). Esta baja e ineficaz adhesin provoca un rpido despegue de
las clulas sobre la superficie en cuanto se produce el cambio de temperatura, como puede
observarse en la fotografa correspondiente a las 25 h de incubacin de la figura 15D y en la figura
17. Por tanto muestra baja capacidad de adhesin celular, lo que hace que no sea un sistema
efectivo para llevar a cabo la recoleccin celular, a pesar de que mantiene la respuesta inteligente
al cambio de temperatura propia de los polmeros tipo elastina.

En la figura 15E se muestran las superficies funcionalizadas con el biopolmero modificado 3' sobre
el que se adsorbe el biopolmero 4, el cual contiene la secuencia peptdica bioactiva RGD. Este
sistema de dos polmeros muestra muy buena adhesin celular a los 30 minutos, aunque dicha
adhesin es inferior a la del vidrio y a la de la superficie funcionalizada con el polmero 1 ', como
muestran las figuras 16 y 17. La adhesin celular a la superficie funcionalizada con el biopolmero
modificado 3' sobre el que se adsorbe el biopolmero 4 sigue siendo significativamente menor a las
24 h, aunque las clulas conservan una morfologa similar (Figuras 15E y 17). Cuando disminuimos
la temperatura por debajo de la Tt del polmero, observamos con clara diferencia respecto a la
superficie de vidrio, que las clulas comienzan a despegarse adquiriendo una morfologa ms
redondeada. As, a partir de las 24 h, las clulas adheridas disminuyen mientras que se produce un
gran aumento en el nmero de clulas no adheridas, de morfologa redondeada. Las clulas
permanecen interactuando entre ellas y con su matriz extracelular, pero no con la superficie. Las
clulas muestran por tanto, a la vista de las imgenes y de las grficas, una alta capacidad de
adhesin y una respuesta al cambio de temperatura que hace que se despeguen. Este podra ser
un sistema efectivo para llevar a cabo la recoleccin celular, aunque no tanto como el constituido
por el polmero 1 ', que adems de ser ms eficaz tanto en la adhesin como en la desadhesin
mediante tratamiento trmico (Figuras 15B y 16) solo requiere la presencia de un nico polmero
injertado en la superficie. Adems, hay que considerar que la recoleccin de las clulas
provenientes de esta superficie arrastrara consigo restos del polmero 4, a diferencia del ejemplo
con el polmero 1 ', en el cual no se arrastran restos debido a la unin covalente del biopolmero a
la superficie. Otra desventaja del sistema formado por el biopolmero 3' injertado y el biopolmero 4
adsorbido es el hecho de que el polmero 4 est tan solo adsorbido, lo cual puede provocar su
liberacin inespecfica al medio durante el cultivo celular.

En la figura 15F la superficie funcionalizada con el biopolmero modificado 4', el cual contiene la
secuencia peptdica bioactiva RGD y no presenta residuos de lisinas en el extremo. Dicho polmero
4' posee capacidad de injertarse en la superficie una vez modificado su grupo amino terminal, si
bien se observa que la modificacin nicamente del grupo amino terminal del biopolmero no es
suficiente para conseguir un recubrimiento completo de la superficie tratada. Esta superficie
muestra una escasa adhesin celular a los 30 minutos debido a que el insuficiente recubrimiento
de la superficie de vidrio hace que las clulas se tengan que adherir a las partes expuestas del
vidrio funcionalizado con grupos alquinilo, donde la adhesin no es efectiva. As, la posterior
desadhesin de las clulas por el tratamiento trmico no resulta efectiva y estas permanecen
adheridas a la superficie (Figuras 16 y 17). La poca eficiencia de la reaccin de acoplamiento del
biopolmero 4'a la superficie hace inviable el uso de este biopolmero para la obtencin de un
sistema de recoleccin celular.

Este resultado demuestra que la unin entre el biopolmero y el soporte se debe llevar a cabo
mediante al menos dos enlaces covalentes por molcula de biopolmero, ms preferiblemente, por
tres enlaces covalentes por molcula de biopolmero. Por lo tanto, estos resultados corroboran los
obtenidos anteriormente para esta superficie con la medida de los ngulos de contacto (Tabla 17),
que indicaban un recubrimiento menor de la superficie cuando se empleaba el biopolmero 4',
puesto que no se observaba un cambio importante con la temperatura.
En la figura 15G la superficie funcionalizada con el biopolmero modificado 5', el cual contiene 24
residuos de lisina y seis repeticiones de la secuencia peptdica bioactiva RGD repartidas a lo largo
de toda la cadena aminoacdica, muestra una adhesin celular muy buena a los 30 minutos,
semejante a la del vidrio y a la del biopolmero V. A las 24 h esta adhesin sigue siendo
comparable a la de la superficie de vidrio, como se puede comprobar en las imgenes, tanto en el
nivel de recubrimiento de la superficie como en la morfologa celular (Figura 15G).

Sin embargo, se observa que cuando disminuimos la temperatura, por debajo de la Tt del
biopolmero 5', las clulas no se despegan de la superficie del sustrato. Esto implica que la unin
del biopolmero a travs de residuos situados a lo largo de toda la molcula no permite el cambio
conformacional con la bajada de temperatura como se corrobor en la invariabilidad del ngulo de
contacto sobre dicha superficie (Tabla 17). El biopolmero 5 ' no es por tanto til para la constitucin
de un sistema de recoleccin celular efectivo, volvindose a demostrar que es tan importante la
presencia de una secuencia bioactiva de adhesin celular por la cual las clulas se adhieren
eficazmente, como la capacidad que debe conservar el biopolmero injertado en la superficie para
cambiar su conformacin en funcin de la temperatura. La unin por varios puntos del esqueleto
peptdico del biopolmero 5' a la superficie no permite el cambio de conformacin necesario en el
biopolmero para que las clulas puedan desadherirse. En conclusin, el biopolmero 5' tampoco
sera til para la obtencin de un sistema de recoleccin celular.

En la figura 15H la superficie funcionalizada con el biopolmero modificado 6', el cual contiene la
secuencia peptdica bioactiva RGD repetida tres veces a lo largo de la cadena aminoacdica y
tambin tres residuos de lisina en su extremo amino terminal, muestra una adhesin semejante a la
del vidrio a los 30 minutos de incubacin. A las 24 h esta adhesin sigue siendo comparable tanto
en el rea recubierta como en la morfologa celular (Figuras 15H y 17). Sin embargo, se observa
que cuando disminuimos la temperatura por debajo de la Tt del biopolmero, las clulas no se
despegan de la superficie del sustrato (Figura 17). Esto implica que la presencia de varias
secuencias bioactivas RGD a lo largo de la cadena peptdica no permite el cambio de
conformacin adecuado en la molcula capaz de provocar el despegue masivo de las clulas,
quedando probablemente en la nueva conformacin algn resto de la secuencia RGD expuesto,
suficiente para que las clulas permanezcan adheridas a l. Este resultado concuerda con la
escasa variacin con la temperatura de los ngulos de contacto de esta superficie (Tabla 17). El
biopolmero 6' no es por tanto til para la recoleccin celular ni para la constitucin de un sistema
de recoleccin celular efectivo. Se vuelve a demostrar por tanto que es tan importante la presencia
de una secuencia bioactiva de adhesin celular por la cual las clulas se adhieren eficazmente,
como la capacidad del biopolmero injertado en la superficie para cambiar su conformacin en la
manera adecuada, exponiendo o no la secuencia bioactiva a las clulas, en funcin de la
temperatura. Pasadas las 3 horas a 4o C (27 h desde el inicio del experimento) evaluamos la
viabilidad de las clulas presentes sobre las superficies mediante la tcnica fluorescente de "Live-
Dead cell staining kit" (Abcam). Las clulas vivas o de coloracin verde y las clulas muertas o
teidas de rojo fueron contadas a partir de 9 fotografas correspondientes a diferentes campos
aleatorios de cada superficie. El porcentaje de clulas vivas es calculado con su desviacin
estndar correspondiente (n=4). En este experimento se comprob que las clulas presentes en
las superficies biofuncionalizadas con los polmeros modificados 1 ', 2', 3', 3'+4, 5 'y 6' despus del
tratamiento trmico muestran unos porcentajes de viabilidad superiores al 90 % (Tabla 18) en
todos los casos, con lo que se demuestra que ni el cultivo sobre los biopolmeros ni el tratamiento
trmico provocan un efecto adverso sobre la viabilidad de las clulas.

Tabla 18. Viabilidad celular evaluada a travs de la tcnica fluorescente de "Live-Dead cell staining
ki .

Se evala tambin la vitalidad de los fibroblastos despegados tras las 27 h de cultivo sobre las
superficies funcionalizadas con el polmero modificado 1 '. As, los fibroblastos despegados son
analizados mediante su cultivo en placas de poliestireno TC durante 1 , 3, 10 y 14 das a 37 C
bajo una concentracin del 5% de CO2 en el aire usando la tcnica colorimtrica "Alamar Blue".
Como control se utiliz el mismo nmero de fibroblastos obtenidos mediante la tcnica de
tripsinizacin cultivados en las mismas placas de poliestireno TC durante 1 , 3, 10 y 14 das a 37
C bajo una concentracin del 5% de CO2. El experimento es repetido cuatro veces, bajo las
mismas condiciones, evaluando tres rplicas en cada uno de ellos.

El resultado obtenido es un aumento constante en la actividad metablica a lo largo del tiempo sin
encontrar diferencias significativas con los controles (P<0,05), por lo que las clulas son viables y
capaces de proliferar (Figura18) alcanzando a los fibroblastos tripsinizados a lo largo del tiempo.
As, se pone de manifiesto que el uso del biopolmero 1 ' es un mtodo ms eficaz para la
recoleccin celular que no afecta a las protenas de la membrana celular y por tanto mantiene
intactas las interacciones entre clula-clula y clula-matriz extracelular. Adems, esta prueba nos
demuestra nuevamente que el tratamiento trmico no tiene ningn efecto adverso sobre la
viabilidad celular.

Recoleccin de una lmina celular mediante membranas de PVDF.

Las superficies de vidrio funcionalizadas e injertadas con el biopolmero V son esterilizadas


mediante luz UV durante 30 minutos por cada lado. Al mismo tiempo los pocilios de las placas
multipocillos de poliestireno de 24 pocilios son tratados con BSA al 0,1 % en PBS y mantenidas
toda la noche a 4o C para evitar que posteriormente las clulas se unan de manera inespecfica. A
continuacin, los pocilios son lavados tres veces con PBS y las superficies de vidrio
funcionalizadas e injertadas con el biopolmero V ya estriles son colocadas en los pocilios
correspondientes.

Posteriormente se procede al sembrado celular. Fibroblastos HFF-1 son usados durante todo el
experimento. Los fibroblastos son cultivados en frascos de 250 mi con DMEM suplementado con
10% FBS y penicilina-estreptomicina al 1 % a 37 C bajo una concentracin del 5 % CO2 en el
aire. Cuando las clulas llegan a confluencia son recolectadas mediante el tratamiento con 0,25%
Tripsina y 0,02% EDTA en PBS. Esta digestin enzimtica es suspendida mediante la adicin de
DMEM suplementado con penicilina- estreptomicina al 1 %. La suspensin celular es ajustada a
2x104 clulas/pocilio. Alcuotas de 500 son distribuidas en cada pocilio sobre las superficies de
vidrio funcionalizadas e injertadas con el biopolmero V e incubadas a 37 C bajo una
concentracin de 5% CO2 en el aire hasta que las clulas alcanzan la confluencia. Una vez
alcanzada la confluencia del cultivo, se disminuye la temperatura del cultivo a 4 C. Despus de 1
hora a 4 C, la membrana de PVDF es colocada dentro de los pocilios. El medio de cultivo es
aspirado de forma que la membrana de PVDF se adhiere a la lmina de clulas. Las placas son
incubadas durante 0,5 h de nuevo a 4 C. Transcurrido este tiempo y con ayuda de unas pinzas, la
membrana de PVDF adherida a la lmina de clulas es transferida a una nueva placa de
poliestireno. Al aadir medio de cultivo fro, la membrana de PVDF flota y es recogida mediante
unas pinzas, quedando nicamente la lmina celular en el pocilio. Se confirm una buena
viabilidad de las clulas que forman la lmina estudiando su proliferacin de forma cualitativa una
vez transferida a una nueva placa de cultivo.

CLAIMS (OCR text may contain errors)

REIVIN DICACION ES
1 . Un biopolmero que comprende los pptidos A, B y D, con la estructura [(D- Bn-Am-Bs)], donde

A tiene la estructura (Fti-G-Ft2), donde

F tiene la estructura X1 -X2-X3-X4-X5, donde X1 y X4 pueden ser cualquier aminocido excepto los
aminocidos prolina, lisina, serina y cistena, X2 es el aminocido prolina, X3 puede ser el
aminocido glicina o el aminocido alanina y X5 es el aminocido glicina,
G es una secuencia de unin celular, t1 y t2 tienen valores de entre 8 y 12,

B tiene la estructura Y1 -Y2-Y3-Y4-Y5, donde Y1 e Y pueden ser cualquier aminocido excepto los
aminocidos prolina, lisina, serina y cistena, Y2 es el aminocido prolina, Y3 puede ser el
aminocido glicina o el aminocido alanina y Y5 es el aminocido glicina,

D comprende un pptido de 2 a 10 aminocidos iguales o diferentes que se seleccionan de la lista


que comprende: lisina, cistena, serina, asparragina, glutamina, cido asprtico y cido glutmico,
n tiene un valor de entre 10 y 18,

m tiene un valor de entre 1 y 3, y

s tiene un valor de entre 10 y 18.

2. El biopolmero segn la reivindicacin anterior donde G es una secuencia aminoacdica que


comprende un pptido que se selecciona de la lista que comprende RGD, LDT, SEQ ID NO: 16,
SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19, o un dominio de unin a heparina o un dominio
de unin a azcares derivado de lectina y aglutinina.

3. El biopolmero segn cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores donde G comprende el


dominio RGD.

4. El biopolmero segn cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores donde G es SEQ ID NO:
1.

5. El biopolmero segn cualquiera de las cuatro reivindicaciones anteriores donde Xi es el


aminocido valina, leucina o isoleucina.

6. El biopolmero segn cualquiera de las cinco reivindicaciones anteriores donde F es SEQ ID NO:
2.

7. El biopolmero segn cualquiera de las seis reivindicaciones anteriores donde Yi es el


aminocido valina, leucina o isoleucina.

8. El biopolmero segn cualquiera de las siete reivindicaciones anteriores donde B es SEQ ID NO:
3.

9. El biopolmero segn cualquiera de las ocho reivindicaciones anteriores donde D comprende un


pptido de 3 a 5 aminocidos iguales o diferentes que se seleccionan de la lista que comprende:
lisina, cistena, serina, asparragina, glutamina, cido asprtico y cido glutmico.

10. El biopolmero segn cualquiera de las nueve reivindicaciones anteriores donde los
aminocidos iguales o diferentes del pptido que comprende D se seleccionan de la lista que
comprende: lisina, cistena, serina, asparragina y glutamina.

1 1 . El biopolmero segn la reivindicacin anterior donde los aminocidos del pptido que
comprende D son iguales y son el aminocido lisina.
12. El biopolmero segn cualquiera de las once reivindicaciones anteriores donde t1 y t2 tienen
valores de entre 9 y 1 1 .

13. El biopolmero segn cualquiera de las doce reivindicaciones anteriores donde n tiene un valor
de entre 12 y 16.

14. El biopolmero segn cualquiera de las trece reivindicaciones anteriores donde m tiene un valor
de entre 1 y 2.

15. El biopolmero segn cualquiera de las catorce reivindicaciones anteriores donde s tiene un
valor de entre 12 y 16.

16. El biopolmero segn cualquiera de las quince reivindicaciones anteriores donde D es el


pptido SEQ ID NO: 4, B es el pptido SEQ ID NO: 3, n y s tienen el valor de 14, F es el pptido
SEQ ID NO: 2, t1 y t2 tienen el valor de 10, G es el pptido SEQ ID NO: 1 y m tiene el valor de 2.

17. cido nucleico que comprende una secuencia nucleotdica que codifica para la secuencia
aminoacdica del biopolmero segn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

18. El cido nucleico segn la reivindicacin anterior donde dicho cido nucleico es un vector de
expresin.

19. Clula aislada transfectada con el cido nucleico segn cualquiera de las reivindicaciones 17 o
18.

20. Uso del biopolmero segn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, del cido nucleico segn
cualquiera de las reivindicaciones 17 o 18, o de la clula segn la reivindicacin 19, para la
preparacin de un soporte de recoleccin celular.

21 . Soporte de recoleccin celular que comprende el biopolmero segn cualquiera de las


reivindicaciones 1 a 16.

22. El soporte de recoleccin celular segn la reivindicacin anterior donde la unin entre el
biopolmero y el soporte se lleva a cabo mediante al menos dos enlaces covalentes por molcula
de biopolmero, preferiblemente por tres enlaces covalentes por molcula de biopolmero.

23. El soporte de recoleccin celular segn la reivindicacin anterior donde en los enlaces
covalentes reaccionan los grupos amino o los grupos carboxilo de las cadenas laterales de al
menos dos de los aminocidos del pptido D.

24. El soporte de recoleccin celular segn cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores
caracterizado porque su superficie es lisa o curva.

25. El soporte de recoleccin celular segn la reivindicacin anterior caracterizado porque consiste
en micropartculas.
26. El soporte de recoleccin celular segn la reivindicacin donde las micropartculas son
esfricas o pseudoesfricas.

27. Uso del soporte segn cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores para la recoleccin
celular.

28. Dispositivo de cultivo y recoleccin celular que comprende el soporte segn cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 26.

29. Uso del dispositivo de recoleccin celular segn la reivindicacin 25 para el cultivo y la
recoleccin celular.

30. Uso del dispositivo de recoleccin celular segn la reivindicacin anterior para el cultivo celular
en un biorreactor.

31 . Mtodo para la recoleccin celular que comprende las siguientes etapas:

(a) funcionalizar un soporte de cultivo celular,

(b) unir covalentemente el soporte funcionalizado en la etapa (a) a al menos dos de los
aminocidos del pptido D del biopolmero segn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16,

(c) poner en contacto una suspensin celular con el soporte obtenido en (b), y

(d) recolectar las clulas adheridas a dicho soporte.

32. El mtodo para la recoleccin celular segn la reivindicacin anterior donde la funcionalizacin
del soporte se lleva a cabo con grupos alquinilo, con grupos alqueno, con grupos nitrilo, con grupos
carbonilo o con grupos mina.

33. El mtodo para la recoleccin celular segn cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores
donde la funcionalizacin del soporte se lleva a cabo con grupos alquinilo.

34. El mtodo para la recoleccin celular segn cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores
donde la recoleccin de las clulas adheridas al soporte se lleva a cabo mediante una disminucin
de la temperatura del cultivo celular de 10 y 37 C.

35. El mtodo para la recoleccin celular segn cualquiera de las cuatro reivindicaciones anteriores
caracterizado porque entre las etapas (c) y (d) se lleva a cabo la siguiente etapa:

(c') cultivar las clulas de (c) hasta que proliferen y formen una monocapa.

36. Mtodo para la recoleccin celular segn cualquiera de las cinco reivindicaciones anteriores
donde antes de la etapa (b) se transforman los grupos reactivos de las cadenas laterales al menos
dos de los aminocidos del pptido D del biopolmero segn cualquiera de las reivindicaciones 1 a
16, en grupos azida.
37. Mtodo para la recoleccin celular segn cualquiera de las seis reivindicaciones anteriores
donde la unin covalente de la etapa (b) se realiza mediante cicloadicin.

38. Mtodo para la obtencin del biopolmero segn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 que
comprende las siguientes etapas:

(a) cultivar la clula segn la reivindicacin 19 en las condiciones adecuadas para la expresin del
cido nucleico segn cualquiera de las reivindicaciones 17 o 18,

(b) purificar el biopolmero codificado por dicho cido nucleico.