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A Dispersão Genética E De Pequenas Moléculas Do Eixo Aid / Rad51 Protege Igualmente Os Ratos Não

Diabéticos Não Obesos Do Diabetes Tipo 1 Através Da Expansão De Linfócitos B Regulamentares.
Introdução

Os linfócitos B desempenham um papel fundamental no desenvolvimento da diabetes tipo 1 (T1D) servindo
como um subconjunto de APCs preferencialmente de células T patogénicas autorreativas. Como resultado de
sua importância patogênica, as terapias direcionadas aos linfócitos B Receberam considerável interesse como
possíveis intervenções T1D. Infelizmente, as intervenções T1D dirigidas a linfócitos B Até à data não conseguiu
parar a morte da célula b. Os autoanticorpos IgG que marcam os seres humanos em risco futuro para T1D
indicam que os linfócitos B produzidos sofreram os processos de maturação de afinidade de recombinação de
interruptor de classe e, possivelmente, hipermutação somática. Este estudo descobriu que a ablação mediada
por CRISPR / Cas9 do gene da citidina desaminase induzida pela ativação da recombinação de interruptor de
classe / indução de hipermutação somática inibe o desenvolvimento de T1D no modelo de rato NOD. A ativação
induzida de Citidina desaminase induz rupturas de DNA do genoma de largura que, se não forem reparadas
através de células homólogas mediadas por recombinação de RAD51, resultam na morte de linfócitos B.
Tratamento com o inibidor de RAD51 4,49-diisotiocianatostilbeno-2, 29-dissulfónico Ácido também inibiu
fortemente o desenvolvimento de T1 em ratos NOD. As abordagens de genética e de pequenas moléculas
Linfócitos B CD73 + que exercem atividade reguladora suprimindo respostas de células T diabetogénicas. Assim,
um primeiro CRISPR / Cas9- Mediada por modificação genética identificou o eixo AID / RAD51 como um alvo
para um potencial clinicamente traduzível Farmacológica que pode bloquear o desenvolvimento de T1D
convertendo os linfócitos B em uma doença CD73 + inibitória regulatória Estado.
Embora a destruição auto-imune de células b pancreáticas produtoras de insulina subjacentes ao
desenvolvimento de diabetes tipo 1 (T1D) seja finalmente mediada pela atividade combinada de células T CD4
+ e CD8 +, é evidente no modelo de rato NOD e, provavelmente, em seres humanos, que Os linfócitos B
desempenham um papel patogénico chave adicional (1-9). Estudos em ratinhos NOD indicam que os linfócitos
B contribuem para T1D por ser o subconjunto de APCs que mais eficientemente suporta a expansão de
respostas de células T patogénicas (10-12). Isto é devido à presença de linfócitos B que expressam moléculas
de Ig ligadas à membrana plasmática capazes de capturar e internalizar eficientemente auto-antigénios de
células b para subsequente processamento e apresentação a células T diabetogénicas. Populações semelhantes
de linfócitos B patogénicos também provavelmente contribuem para o desenvolvimento de T1D em seres
humanos, A presença de autoanticorpos específicos de Ag em células B circulantes que são biomarcadores
críticos para identificar indivíduos com alto risco de doença futura.
A maioria dos autoanticorpos em seres humanos com ou em risco para T1D é de um isotipo IgG, indicando que
os linfócitos B que os produziram foram submetidos a maturação por afinidade. A maturação é o processo que
ocorre nos centros germinativos (GCs) pelos quais os linfócitos B sofrem diversificação de Ig e Clonal. A
diversificação de Ig ocorre através da hipermutação somática (SHM) e da recombinação de switch de classe
(CSR), enquanto que a seleção clonal resulta da interação competitiva com o auxiliar folicular T (Tfh). As
pressões seletivas dentro dos GCs resultam na expansão preferencial dos linfócitos B com maior afinidade para
o seu Ag cognato. Em doenças auto-imunes, tais como T1D, os processos aberrantes de seleção levam à
expansão dos linfócitos B auto-reativos, que podem se tornar células secretoras de autoanticorpos ou reter sua
Ig de superfície para servir como APCs potencialmente mais eficazes. Embora achados anteriores sugerem que
a maturação por afinidade é importante para a patogênese da T1D (16), a importância dos processos CSR / SHM
para a progressão da doença ainda não foi elucidada. Além disso, não está claro se os linfócitos B devem
submeter-se à CSR / SHM para se tornarem APCs autoreativas eficazes que suportam a patogénese da T1D.
Devido ao seu papel no suporte de respostas de células T patogénicas, tem havido um interesse considerável
em determinar se as abordagens dirigidas a linfócitos B poderiam proporcionar uma intervenção T1D eficaz.
Um ensaio clínico descobriu que o tratamento transitório com o rituximab Ab específico para CD20, que esgota
os linfócitos B, permitiu a preservação precoce (1 y), mas não a longo prazo (2 y), da produção de peptídeo C
em pacientes com T1D de início recente. A falta de proteção a longo prazo pode ser atribuída, pelo menos em
parte, à recuperação dos linfócitos B após tratamento com rituximab transitório. No entanto, em murganhos
NOD, os linfócitos B infiltrantes de ilhéus pancreáticos perdem a expressão da superfície celular de CD20 e,
assim, são rendidos resistentes à pletição por um anticorpo anti-CD20 murino semelhante ao rituximab (18).
Estes resultados indicam a necessidade de identificar estratégias alternativas que possam proporcionar uma
abordagem de intervenção T1D mais eficaz dirigida a linfócitos B.
No presente estudo, avaliamos a contribuição da CSR / SHM para o desenvolvimento de T1D e se o
direcionamento específico dos linfócitos B submetidos a esses processos poderia proporcionar uma intervenção

terapêutica eficaz. Como primeira etapa, utilizamos a tecnologia CRISPR-Cas9 para retiragem direta, em
camundongos NOD, do gene de citidina-desaminase induzido pela ativação (Aicda) necessário para iniciar
processos CSR / SHM (19-21). A retiragem de Aicda inibiu significativamente o desenvolvimento de T1D.

A proteína de citidina desaminase induzida por activação (AID) codificada por Aicda inicia SHM e CSR induzindo
mutações pontuais e rupturas de dsDNA em sequências de genes Ig. Adicionalmente, a AID gera DSBs em outras
partes ao longo do genoma (22, 23) que são normalmente reparadas pela recombinação homóloga mediada
pelo complexo RAD51 (HR). Na ausência de FC, os linfócitos B nos quais o SHM / CSR foi iniciado sofrem morte
celular (23). A pequena molécula 4,49 diisotiocianatostilbeno-2, 29-ácido dissulfónico (DIDS) inibe RAD51-
mediada HR (23). A DIDS tem sido utilizada como agente modelo em estudos anteriores, indicando que o
bloqueio de RAD51 poderia ser considerado uma intervenção para a eliminação de linfomas de células B AID +
(23). ). Neste estudo, usamos o tratamento DIDS para determinar se o direcionamento do eixo AID / RAD51
poderia fornecer uma intervenção dirigida a linfócitos B para T1D. Interessantemente, a disrupção genética e
mediada por DIDS do eixo AID / RAD51 aumentou o número de linfócitos B CD73 + que exerceram processos
reguladores que suprimem activamente a T1D. Juntos, estes estudos indicam que as terapias capazes de
expandir os linfócitos B reguladores, potencialmente incluindo aqueles que visam processos de maturação de
afinidade, podem finalmente representar estratégias de intervenção T1 clinicamente traduzíveis.

Materiais e métodos

Ratos

Os ratinhos NOD e C57BL / 6J (B6) são mantidos no Laboratório Jackson em condições livres de agentes
patogénicos. Utilizou-se a tecnologia CRISPR-Cas9 para gerar directamente ratinhos NOD. Aicda2 / 2 por
microinjecção citoplasmática de zigotos NOD / ShiLtDvs com 100 ng / ml de ARNm de Cas9 e 50 ng / ml dos
seguintes ARN de guia único (sgRNAs), com as letras maiúsculas Sendo o complemento para a sequência
genómica alvo: 59gaaattaatacgactcactataggAGTCACGCTGGAGACCGATAgttttagagctagaaatagc-39 ou 59-
gaaattaatacgactcactataggACTTCTTTTGCTTCATCAGAgttttagagctagaaatagc39. Tendo como alvo o exão 1 ou 2,
respectivamente, de Aicda. ( Figura 1). Os sgRNAs do Éxon 1 e 2 foram microinjetados em 47 e 39 zigotos,
respectivamente. Estes zigotos microinjectados foram então transplantados para três e duas fêmeas
receptoras, respectivamente. O DNA da cauda da progénie sobrevivente foi sequenciado e identificou 100 e
14,3% de eficiência de direcionamento para o éxon 1 (14/14) e éxon 2 (2/14). Os ratinhos fundadores de
mosaico identificados como portadores de uma mutação na região alvo de Aicda foram retrocruzados para
ratinhos NOD / ShiLtDvs. A progénie N1 resultante foi pesquisada quanto a mutações transmitidas pela linha
germinal por amplificação por PCR do éxon 1 com os iniciadores 59-TCACACAACAGCACTGAAGC-39 e 59-
ACCCAAAAGACCTGAGCAGA-39 ou éxo 2 com os iniciadores: 59 CGCTCAGCTACCTTGCCTAT-39 e 59-
CGAAGTCCAGTGAGCAGGA-39. Os produtos de PCR foram purificados e analisados por sequenciação num
analisador de DNA ABI 3730 (Applied Biosystems) utilizando o iniciador direto ou inverso. As sequências
mutantes foram separadas do tipo selvagem (WT) utilizando o pacote Poly Peak Parser para R. Uma deleção de
2 pb juntamente com uma inserção de 309 pb foi selecionado para uma linha que alveja o éxon 1 e uma deleção
de 13 pb foi selecionado para uma linha direcionando o éxon 2. Os mutantes N1 foram cruzados para fixar as
mutações à homozigose, após o que as linhas foram mantidas por acasalamentos irmão-irmã. Os murganhos
mutantes foram genotipados por polimorfismos de comprimento de amplificação utilizando os mesmos
iniciadores utilizados para sequenciação. ( Figura 1). Os ratos foram comparados por idade e sexo para
experimentação, mas não foi realizado um método de randomização específico para formar grupos
experimentais. O Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal do Laboratório Jackson aprovou todos os
protocolos envolvendo ratos.

RT-PCR e análise de expressão genética

Os linfócitos B foram purificados a partir de ratinhos fêmea NOD ou B6 de 8 semanas de idade. O ARN total foi
extraído utilizando um RNeasy Micro Kit (QIAGEN). Os iniciadores para Aicda RT-PCR (26) são 59-
CAGGGACGGCATGAGACCT-39 e 59-TCAGCCTTGCGGTCTTCACA-39 e iniciadores para Gapdh são 59-GAGAA-
ACCTGCCAAGTATGATGAC-39 e 59-TGATGGTATTCAAGAGAGTAGGGAG-39 (27). Utilizou-se RNA para sintetizar
ADNc com um kit MessageSensor RT (Thermo Fisher) e Random Decamers (Invitrogen). Utilizou-se o poder
SYBR Green (Applied Biosystems) para determinar a expressão de Aicda e Gapdh. A PCR quantitativa (qPCR) foi
executada utilizando um Applied Biosystems ViiA7, e os dados foram analisados utilizando o software A & B
RUO.

A troca de classe para o isotipo IgG1 foi quantificada por análise citométrica de fluxo após 96 horas totais em cultura. como descrito anteriormente (29). . as culturas foram reestimuladas como descrito acima. antes da liberta�o singuleto / vivo. e TCRb (H57-597) (todos da BioLegend). CXCR5 (L138- D7).5 mM (BP176-100. IgM (II / 41). E 4. Se não foram encontradas ilhotas contendo células b em três secções. Sigma-Aldrich) a 37° C (5% CO2) durante 48 h. CD8a (53-6.1 (A20). TER-119 (TER119) e estreptavidina (todas da BD Biosciences). 2A.5). CD80 (16-10A1).L2 (TY25). B220 -6B2). GL-7 (GL7). Para experi�cias baseadas em DIDS. sem lesões visíveis. de acordo com o protocolo do fabricante. 2-ME 71. as culturas foram diluídas com o meio de volta para 112 106 células por mililitro. Isolamento leucocitário associado a ilhéus Os leucócitos infiltrados associados a ilhotas foram isolados para citometria de fluxo. Avaliação histológica da insulite Os escores de insulite média quantitativa foram determinados pelo método de cálculo descrito anteriormente (28). 2B. CD4 (GK1. CD69 (H1. CD73 (TY / 11. As lâminas foram coradas com al-diehido fucsina e H & E. CD45. CD23 (B3B4). 2. Os subgrupos de linfócitos B esplênicos foram caracterizados por citometria de fluxo. as suspensões de células únicas de esplenócitos foram lisadas com tampão de Gey para remover RBCs. como descrito anteriormente (18).8).25% (corresponde a glicemia de 300 mg / dl). A pontuação final de insulite incorpora a proporção de ilhotas em ratinhos analisados que sofreram cada nível de destruição. Resumidamente. CD19 (1D3) e CD16 / CD32 (2. Citometria de fluxo Os leucócitos entre as amostras indicadas foram fenotipados por citometria de fluxo utilizando a instrumentação LSRII SORP (BD Biosciences) ou Attune Cytometer (Thermo Fisher Scientific).1 (A20) . Para experiências Aicda2 / 2. CD45. CD21 (7G6). CD8a (53-6. CD19 (1D3). CD43 (S7). E IgG1 (1070-09) (SouthernBiotech). CD4 (GK1. Fisher Scientific). 3. E CD44 (IM7) (todos da eBioscience). BD Biosciences) ou LPS (25 mg / ml. utilizou-se iodeto de propídio ou DAPI para discriminação viva / morta. Às 72 h.. 25% de destruição de ilhéus. 100 mg / ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich) e 10% (v / v) de FBS inactivado pelo calor (Atlanta Biologicals) sob estimulação com IL-4 recombinante de murganho (25 ng / Ml. Para todas as experiências.7). PeproTech) e anti-CD40 (1 mg / ml. IgD (11-26c. conforme descrito anteriormente (30). GL-7 (GL7). 25-75% destruição de ilhéus.Monitoramento do desenvolvimento de T1D O desenvolvimento de T1D foi avaliado por monitorização semanal de glicosúria com Ames Diastix (Bayer). o rato analisado recebeu uma pontuação de insulite de 4. CD19 (1D3). CD62 (MEL-14). Os seguintes anticorpos conjugados com fluorocromo (clones) foram utilizados para estes estudos: CD95 (J02). aglutinados leucocíticos não invasivos peri-insulares. Gating estratégias são mostradas na Fig.2a).7). o pâncreas fixo de Bouin foi seccionado em três níveis não-sobrepostos. Às 48 h.2F3). Os linfócitos B purificados foram cultivados a uma concentração de 13 106 células por mililitro em RPMI 1640 (Life Technologies) suplementado com L-glutamina 2 mM (Life Technologies). PD. as c�ulas TER-119 + foram exclu�as (Figura 2C suplementar) atrav� de estrat�ias de bloqueio em vez dos procedimentos de lise. CD21 (7G6). 1. com início da doença definido por duas leituras consecutivas 0.1 (A20).4G2) (todos da Tonbo Biosciences). 100 U (Sigma-Aldrich). CD45. Todas as análises foram feitas em células singletes (vivas) fechadas. Ensaio de CSR in vitro Os linfócitos B esplénicos foram purificados utilizando MicroBeads anti-CD43 (Miltenyi Biotec). A pontuação final foi determinada dividindo a pontuação cumulativa para cada pâncreas pelo número de ilhotas totais ($ 20 por rato) examinadas. CD23 (B3B4).5). CD39 (Duha59). PD-1 (RMP1-30). As ilhotas foram marcadas por um observador cego da seguinte forma: 0. e os dados foram analisados utilizando o software FlowJo (TreeStar). B220 (RA3- 6B2). 75-100% de destruição de ilhéus.

Os padrões de Ab incluíam IgG1 e IgG2b (SouthernBiotech) e IgG3 e IgM (Sigma-Aldrich). TER-119 +. Santa Cruz Biotechnology) durante os períodos de tempo indicados.03 105 células por mililitro em meio X-VIVO 20 com 0 ou 10 mg / ml de LPS (Sigma-Aldrich) durante 3 dias. B220 +.1 M. Transferências adoptivas Os linfócitos B esplênicos e as células T foram purificados por depleção negativa das populações CD11b +. em alguns experimentos. Com os linfócitos B e / ou células T indicados e foram monitorizados para o desenvolvimento de T1D. . A concentração de IL- 10 em sobrenadantes de cultura foi determinada utilizando um kit ILISA ELISA MAX de rato (BioLegend). 100 mg / ml de estreptomicina (Ambos da Sigma-Aldrich) e aminoácidos não essenciais (Lonza) a 37 ° C durante 4 dias. todos da BD Biosciences) na presença de AMP 10 mM e 0 ou 100 mM a. TER-119 + E células B220 + (para purificação de células T). os ratos NOD fêmeas foram injectados i. e os dados foram analisados utilizando o software FlowJo. CD73 + (para a purificação dos linfócitos B) ou CD11b +. CD11c +. Utilizaram-se os seguintes Abs específicos biotinilados: CD11b (M1 / 70). O CD73 (TY / 11.p. Medição ELISA da produção de IL-10 Os linfócitos B CD73 + ou CD732 foram classificados como descrito acima e cultivados a 5. TER-119 (TER119) e B220 (RA3-6B2) (todos da BD Biosciences). Os linfócitos B CD73 + e CD732 dos reservatórios purificados foram então classificados directamente em HyClone FBS (GE Healthcare Life Sciences) inactivado por calor utilizando um classificador SORP FACSAria II (BD Biosciences) equipado com um bocal de 85 mm. IgG3 e IgM (SouthernBiotech). CD11c +. CD8 + e CD73 + Estreptavidina MicroBeads (Miltenyi Biotec) e o Abs. TER-119 + e CD3ε + e. Os Abs de Revestimento foram os seguintes: IgG1. Os linfócitos B ordenados e as células T marcadas foram lavados três vezes com meio X-VIVO 20 isento de soro (Lonza) para remover o soro residual e foram cocultivados sob estimulação com anti-CD40 solúvel (1 mg / ml). Semanalmente com 0. Ensaio de supressão de células T mediado por linfócitos B CD73 + Os linfócitos B de ratinhos NOD. IgG2b.Aicda2 / 2 ou NOD de 6 a 8 semanas de idade foram purificados a partir de baços agrupados e de nódulos linfáticos pancreáticos (PLN) por depleção negativa de células CD11b +. 8 ou 10 semanas de idade. CD3ε + e TER-119 + Biotin Binder Dynabeads (Invitrogen). CD11c +.v.Isótipo Ig do soro ELISA A quantificação dos isótipos de Ig sérica foi realizada conforme descrito (31). A supressão percentual foi calculada relativamente ao índice de proliferação médio de células T na presença de linfócitos B CD732 com AMP 0 mM e APCP 0 mM. todos da Sigma. O Ab de detecção era anti-ratinho de cabra acoplado a fosfatase alcalina (South-ernBiotech). utilizando Abs conjugado com biotina e MicroBeads de estreptavidina (Miltenyi Biotec). piruvato de sódio 1 mM (Life Technologies).0 (Tecan). CD11c +. O veículo era bicarbonato de potássio 0. Tratamentos DIDS A partir das 6. 2-ME 71. CD3ε (145-2C11). As placas foram analisadas usando um Infinite M200 Pro executando o software Magellan 7. Status de autoanticorpos de insulina Os autoanticorpos de insulina sérica (IAAs) foram detectados como descrito como parte do Workshop Internacional sobre Lições de Modelos Animais para Diabetes de Tipo 1 Humano (32). As células T CD4 + CD732 purificadas foram marcadas com 5 mM Cell Proliferation Dye eFluor 670 (eBioscience). 10 ou 50 mg / kg de DIDS (CAS 67483-13-0. 100 U / ml de penicilina.8) foi obtido da BioLegend. A proliferação de células T foi avaliada por citometria de fluxo. anti-CD3 (5 mg / ml) e anti-CD28 solúvel (2 mg / ml. CD11c (HL3). b-metilenadenosina 59-difosfato (APCP).5 mM (Fisher Scientific).Aldrich) em meio X-VIVO 20 isento de soro suplementado com HEPES 10 mM (Lonza). As células T CD4 + CD732 foram purificadas a partir de baços de ratinhos NOD com 6-8 semanas de idade por depleção negativa de células CD11b +. Os receptores de NOD-scid foram injectados i.

as sequências de Ig de comprimento completo foram então mapeadas para as sequências da linha germinativa de .com/milaboratory/mitools).Aicda2 / 2 como controlos.Comprimento para cada MIG. Em seguida. As células purificadas foram lavadas com PBS. mIGM_r2 : 59- ATTGGGCAGCCCTGATTGGGGGAAGACATTTGG-39. como se segue. utilizando apenas as primeiras leituras. RNaseOUT 40U (Invitrogen) e 200 U SMARTScribe Reverse Transcriptase. Igualmente. utilizando o Bioanalyzer RNA 6000 Pico Kit (Agilent). E adaptador de interruptor de molde 1 mM 59- AAGCAGUGGTAUCAACGCAGAGUNNNNUNNNNUNNNNUCTTrGrGrGrG-39. Primeiro foi efectuada PCR utilizando cDNA equivalentes a 2. mIGG12_r2: 59-ATTGGGCAGCCCTGATTAGTGGATAGACHGATG-39. em que XXXXXX representa um código de barras de 6 nt específico de amostra. após o que os linfócitos B de PLN (CD45. com os iniciadores M1S: 59. mIGG3_r2: 59- ATTGGGCAGCCCTGATTAAGGGATAGACAGATG-39.Preparação da biblioteca de repertório de Ig A preparação bibliográfica e a análise de dados para o seqüenciamento do repertório de Ig foram realizadas conforme descrito anteriormente (33). As reacções de transcrição reversa foram estabelecidas como se segue: 5 ml de ARN e 2 ml de iniciadores específicos de isotipo IgH (10 mM cada) foram aquecidos a 72 ° C durante 3 min e depois incubados a 42 ° C durante 3 min para recozir Primers. 59.5%. O ADNc foi em seguida tratada com 5 U de ADN-glicosilase de uracilo (New England Biolabs) para degradar adaptador interruptor placa tempe. O número total de ARN determinado.1 + CD19 + B220 +) foram purificados separadamente utilizando um FACSAria II. usando platina superfi ADN polimerase para introduzir sample. Juntou-se uma quantidade igual de cada biblioteca e administrou-se num gel de agarose a 1. Os dados de sequenciação foram processados usando MIGEC (34). Os segundos produtos de PCR foram purificados utilizando um kit NucleoSpin Gel e PCR Purification.códigos de barras duplo-finais específicos. DTT 2 mM. adicionaram-se os seguintes componentes a cada reacção para uma concentração final de 13 tampão de primeira cadeia. divididas em grupos de identificadores moleculares (MIGs) consistindo em leituras compartilhando a mesma UMI. em seguida.residual e. Utilizando MiXCR (35). em seguida. MIGs consistindo de menos de cinco leituras foram descartados. Resumidamente. os ratinhos NOD / ShiLtDvs fêmeas receberam semanalmente DIDS (50 mg / kg) ou tratamento de veículo de 8 a 16 semanas de idade.39 e Z: 59. as sequências de consenso foram determinadas independentemente para leituras de 59 e 39 leituras dentro de cada MIG. as leituras em bruto foram demultiplexadas com base nos dois códigos de barras de 6 nt de cada amostra e.e 39-end read consenso seqüências foram então mescladas usando o MiTools Merge Utility (https://github. para gerar full. e mIGD_r2: 59- ATTGGGCAGCCCTGATTCTCTGAGAGGAGGAAC-39. ressuspensas em Tampão RLT e congeladas por pressão. O ARN total foi transcrita inversamente utilizando a transcritase reversa SMARTScribe (Takara) com iniciadores específicos do isotipo IgH (1 mM cada) IgHG1 / 2 : 59- CAGGGATCCAKAGTTC-39.5 ng de ARN e platina superfi ADN Polimerase (Invitrogen) com os seguintes iniciadores: M1SS: 59-AAGCAGTGGTATCAACGCA-39. Seqüenciamento de repertório de Ig e análise de dados As bibliotecas de sequenciação foram cravadas com um controlo PhiX Control v3 a 30% e carregadas a uma concentração de 10 pM para sequenciação emparelhada de 400 + 225 pb assimétrica executada utilizando um sequenciador MiSeq executando um Kit Reagente MiSeq v3 (todos da Illumina). IgHM: 59-GATGACTTCAGTGTTGT-39 e IgHD: 59-AGTGGCTGACTTCCAA-39. bibliotecas reunidas. Primeiro. e extraiu-se uma banda de 600-800 pb e extraiu-se utilizando um Kit NucleoSpin Gel e PCR Purification. Em seguida. com a mínima seqüência semelhança definida para 70% para leituras com sobreposição partes. para todas as amostras foi de 10. extraiu-gel foram então qualidade controlada usando um Kit de Bioanalyzer alta sensibilidade (Agilent) e quantificados por qPCR utilizando um Kit ção Biblioteca de quantificação / Illumina GA / ABI Prism com o controlo interno Illumina (ambos a partir de Kapa Biosystems).(N) 4-6 (XXXXXX) CA- GTGGTATCAACGCAGAG. adaptador de interruptor de 59 modelos 1 mM e 1 mM cada dNTP (Invitrogen). O RNA total foi purificado utilizando um RNeasy Micro Kit (QIAGEN). IgHG3: 59-CAGGGCTCCATAGTTC-39. U. desoxiuridina) para introduzir uma sequência identificadora molecular única (UMI) para a extremidade 39 de cada molécula de cDNA.(N) 4-6 (XXXXXX) ATTGGGCAGCCCTGATT-39. em seguida. purificaram-se linfócitos B residentes de PLN a partir de ratinhos NOD não manipulados com 8 semanas de idade e ratinhos NOD. purificado utilizando um Kit de NucleoSpin gel e purificação de PCR (Takara). A primeira PCR dutos foram purificados utilizando um kit de purificação de PCR e NucleoSpin gel e. 300 ng de produto purificado segunda PCR foi utilizado para a preparação da biblioteca de sequenciação individual utilizando um Kit NEBNext Ultra II da biblioteca de ADN Prep com NEBNext singleplex Oligos para Illumina (New England Biolabs). As concentrações para cada biblioteca foram determinadas utilizando um kit de ensaio Qubit dsDNA BR (Life Technologies). com pequenas alterações. amplificado. Para cada amostra.

apesar da presença continuada de leucócitos infiltrando ilhéus em ratinhos NOD. a natureza diabetogénica destas células foi alterada por ablação genética de AID. Em seguida. os linfócitos B das linhagens 1 e 26 NOD.Aicda2 / 2 ratos restantes livre de T1D aberto no final do estudo de incidência ainda eram caracterizados por níveis significativos de insulite (Fig. A observação de CSR reduzida similarmente em progênies F1 para cada linha demonstra que este fenótipo é o resultado de nossa nova interrupção direta em NOD de Aicda (Fig. cada NOD. desconhece-se se a CSR e a SHM são contribuintes naturalmente importantes para a actividade diabetogénica dos linfócitos B em ratinhos NOD e. As linhas de Aicda2 / 2 exibiram taxas significativamente reduzidas semelhantes de T1D (Fig. 2. Os linfócitos B em camundongos NOD podem sofrer CSR / SHM. Para fazer isso. 1F). Aicda2 / 2 (Fig. Em seguida. 1C). 1D). As análises de teste de Mann-Whitney. tm1Hon / HonRbrc estabelecido. aumentando sua capacidade de processar e apresentar epitopos autoantigênicos para células T diabetogênicas. 1G). Estes dados suportam a presença de um nível de linha de base significativamente mais elevado de linfócitos B que expressam Aicda activado por auto-antigénio em ratinhos NOD do que em controlos B6 e são consistentes com observações anteriores de que os GCs são expandidos em estirpes auto-imunes (37). Os ratinhos NOD. Na montagem de clonótipos. 1F. Em seguida.Aicda2 / 2 mostraram diminuição significativa da CSR (Fig. Wilcoxon e t foram todas duas colunas. Contudo.Cg-Aicda. A progressão da insulite não foi retardada na Linha 1 NOD.Aicda2 / 2.Aicda2 / 2 linfócitos B totais são numericamente aumentados. Uma descoberta inicial que suporta esta possibilidade foi que os níveis basais de expressão de Aicda necessários para induzir CSR / SHM foram mais elevados nos linfócitos B de NOD do que naqueles de ratinhos B6 não auto-imunes (Fig.referência de ratinho.Aicda2 / 2B para se submeterem à RSE não era o resultado de mutações fora do alvo causadas por CRISPR-Cas9. 1E. As estratégias de bloqueio para estudos de citometria de fluxo subsequentemente descritos estão ilustradas na Fig.Aicda com a de controles WT NOD. testou- se se a expressão de Aicda pelos linfócitos NOD B era crítica para a sua actividade diabetogénica. Utilizou-se a tecnologia CRISPR-Cas9 para direccionar directamente o exão 1 ou 2 (contendo um potencial local de partida alternativo) de Aicda em zygotes NOD (Fig. Aicda2 / 2. e os alinhamentos resultantes foram utilizados para reunir clonótipos. Ambos NOD. 11 e 18 semanas de idade. 1A-D suplementar).Aicda + / 2 heterozigóticos desenvolveram T1D a uma taxa intermédia (dados não apresentados). foi utilizada uma probabilidade de mutação específica de 1024 para a correção baseada em frequência de PCR ou erros de seqüenciamento. em seres humanos susceptíveis a doenças. indicando que isso não poderia explicar a sua resistência à T1D. Os murganhos da linha 1 foram utilizados para todos os estudos subsequentes devido a uma melhor . 1E). As estimativas de diversidade clonotípica foram calculadas com base na sequência de nucleótidos de CDR3 e utilização de segmentos V e J. Foram também efectuadas análises para confirmar que a capacidade reduzida dos linfócitos NOD. Curiosamente. Análise estatística Todos os gráficos e estatísticas foram gerados usando Prism 6 (GraphPad) ou Excel (Microsoft). comparámos-os com os controlos de WT para a presença de várias populações de linfócitos B imaturos e maduros dentro de baços e PLNs. as linhagens 1 e 26 NOD. 1A). A linha Aicda2 / 2 foi cruzada com o material B6. comparamos a cinética da progressão da insulite em camundongos NOD e NOD.Aicda2 / 2 fêmeas aos 7. estes dados indicam que. e os linfócitos B purificados dos híbridos F1 resultantes foram testados quanto à capacidade de RSE. As análises estatísticas específicas estão listadas nas respectivas legendas. 1B. Os clonetipos montados foram então exportados para análise de diversidade usando VDJtools (36). Semelhante ao caso relatado para um material de fundo B6 (22). e os subgrupos GC e semelhantes à memória são proporcionalmente expandidos Inicialmente investigar a base para a resistência T1D de NOD. Em seguida. por extensão. NOD. Juntos. Isto permitiu a subsequente geração de bases de fundo de NOD puro contendo o alelo Aicda alvo do exão 1 (Linha 1) ou exão 2 (Linha 26) num estado homozigótico (Figura 1A-D suplementar). comparamos a taxa feminina de desenvolvimento T1D para cada linha NOD. avaliamos a capacidade dos linfócitos B purificados das linhagens 1 ou 26 para se submeter à CSR ao isotipo IgG1 após a estimulação de anti-CD40 e IL-4 in vitro. Resultados Os linfócitos NOD B apresentam maior expressão de Aicda e sua ablação retarda significativamente o desenvolvimento de T1D.

. Uma alteração na proporção de células T1 / T2 pode reflectir o aumento da separação tolerogénica de linfócitos B autorreativos em ratinhos NOD. estes dados indicam que a ablação genética de AID em ratinhos NOD conduz a uma expansão das células T periféricas e Tfh subconjunto e a protecção da doença observada não é devida a uma diminuição do seu potencial diabetogênico. 2F). Embora expandido numericamente. Aicda2 / 2 (Figura 2E).Aicda2 / 2 não diferiram na sua capacidade de transferir T1D para receptores NOD-scid deficientes em linfócitos (Fig. o rendimento total dos linfócitos B esplênico e PLN B foi maior nos camundongos NOD.Aicda2 / 2 (Fig. Os processos de seleção para podar os linfócitos B auto-reativos operam no estádio imaturo de transição-1 (T1) no baço (38). Apesar da distribuição diferente dos subconjuntos T1 e T2. nós testamos se as células T em T1D-resistente NOD. respectivamente.1 +) foram semelhantes em ratinhos NOD e NOD. mas não afeta diretamente sua atividade diabetogênica As células T são os últimos mediadores da destruição de células B em T1D. o perfil de isótopos do soro dominado por IgM dos camundongos NOD. De acordo com os relatórios de ablação de AID em outras estirpes (41). As células T NOD purificadas ou NOD. 3D). 2G). Alternativamente.Aicda2 / 2 estava diminuída. os linfócitos Fas + GL7 + GC B foram expandidos nos baços e PLN dos ratinhos NOD. Portanto. 2B).Aicda2 / 2 (Fig. As proporções de linfócitos B infiltrando-ilhotas em camundongos NOD. Além disso.Aicda2 / 2 (39). 3B. enquanto que as células subsequentes de transição-2 (T2) no estádio de desenvolvimento são diminuídas (Fig. os rendimentos das células T CD4 + e CD8 + esplénicas foram aumentados em ratinhos NOD. Correspondente com aumento dos linfócitos GC B. 3A). 2C. as percentagens de linfócitos B entre leucócitos infiltrantes de ilhéus (CD45. A frequência dos linfócitos T1 B esplénicos é aumentada em ratinhos NOD. Os ratinhos Aicda2 / 2 foram quantitativa e / ou qualitativamente distintos daqueles em controlos NOD. esta alteração pode ser o resultado da diminuição da susceptibilidade dos linfócitos Aicda2 / 2B à apoptose no estádio T1 (40). Além disso. as células CXCR5 + PD-1 + Tfh totalmente activadas também foram expandidas em baços e PLN de ratinhos NOD. A ablação de AID em camundongos NOD expande populações de células T.Aicda2 / 2 expressando a ativação de CD69 e marcadores de memória semelhantes a CD80 ou PD-L2 (42) foram semelhantes e maiores. bem como aqueles observados em pacientes com deficiência de AID (43).Aicda2 / 2 (Fig. Juntos. 2A). estes dados indicam que a ablação genética de AID em ratinhos NOD aumenta o número de linfócitos B periféricos apresentando um GC mais predominante e fenótipo semelhante a memória.proclividade de reprodução e à facilidade de genotipagem em comparação com os murganhos Line 26 igualmente resistentes a T1D. procurou-se determinar se a actividade diabetogénica intrínseca de células T em ratinhos NOD. 2D). Juntos. as proporções de linfócitos B esplênicos de tipo memória CD80 + e PD-L2 + (42) foram aumentadas em NOD. Finalmente. Isto está correlacionado com os grandes tamanhos de GC observados em baços de ratinhos Aicda2 / 2 (dados não apresentados).Aicda2 / 2. Surpreendentemente.Aicda2 / 2 é paralelo ao de outras cepas Aicda2 / 2 (Fig. 3C). do que aqueles em controles de NOD (Figura 2H).Aicda2 / 2 do que nos controles WT (Fig.Aicda2 / 2 (Fig.

(D) Incidência de T1D feminino em controlos de NOD em comparação com ratos NOD.Aicda2 / 2 purificados para receptores NOD-scid.0001) e NOD. CD39 e CD73 são ectoenzimas que catalisam a conversão de ATP extracelular em AMP e depois em adenosina. respectivamente. As células T NOD induziram T1D muito menos eficientemente em receptores NOD-scid quando cotransferred com linfócitos Aicda2 / 2 B do que quando cotransferred com linfócitos WT B (Fig. (A) Os linfócitos B purificados de baços individuais de ratinhos fêmeas NOD (n = 3) e B6 (n = 3) de 8 semanas de idade foram testados quanto à expressão de Aicda através de qPCR.FIGURA 1.Aicda2 / 2 induziram eficientemente o desenvolvimento de T1D em receptores de NOD-scid. (F) Insulite para fêmea NOD e NOD. Aicda2 / 2 ratinhos não resulta de um efeito intrínseco das células T. As células T NOD transferem T1D de forma adoptiva de forma menos eficiente na presença de linfócitos B deficientes em Aicda caracterizados por um subconjunto CD73 + expandido Tal como descrito acima. avaliamos como os linfócitos B deficientes em AID podem influenciar tais efectores patogênicos. Linha 1 = 5. (G) Ilhéu representativo para cada nível de pontuação de insulite. foram transferidos números iguais de células T esplénicas NOD purificadas e linfócitos B esplénicos NOD ou NOD.Aicda2 / 2 Linhas 1 e 26 camundongos remanescentes livres de T1D evidente no final do estudo de incidência de doença . 0.001). 4A). As setas apontam para a infiltração linfocítica de ilhotas. Os dados são representativos de três experiências independentes. Aicda2 / 2 Linhas 1 e 26 ratinhos estimulados em cultura com anti-CD40 (1 mg / ml) e IL-4 murina (25 ng / ml) durante 96 h. (B) Gráficos de citometria de fluxo representativos que mostram a mudança de classe para IgG1 de linfócitos B purificados de NOD e NOD. O teste t de Student foi utilizado para determinar o valor de p mostrado para a expressão de gene. Barra de escala. Linha 26 = 5) são resumidos em (C). Assim. Os linfócitos NOD B expressam espontaneamente níveis elevados de Aicda e a ablação deste gene inibe o desenvolvimento de T1D. Isto indicou que a resistência T1D em NOD. Os dados quantitativos reunidos a partir de três experimentos (NOD = 7. e o teste de MannWhitney foi utilizado para a mudança de classe. 11 e 18 semanas de idade. Há evidências de que alterações na via metabólica purinérgica CD39 / CD73 desempenham um papel importante em várias doenças autoimunes (44). Todos os gráficos de barras e gráficos de dispersão mostram uma média de 6 SEM. (E) Escores de insulite em uma escala de 0 (sem lesão visível) a 4 (75-100% de destruição de ilhotas) para fêmeas NOD. quando transferido na ausência de linfócitos B. Os valores de p para a incidência de T1D foram determinados utilizando os testes de log- rank de MantelCox. Para testar inicialmente isto.Aicda2 / 2 Line 1 (p. 200 mm.Aicda2 / 2 Line 26 (p = 0. as células T purificadas de doadores NOD. A sinalização da adenosina através do receptor A2a .Aicda2 / 2 Linha 1 ratos com 7. Estes resultados indicaram que os linfócitos Aicda2 / 2B podem suprimir activamente as respostas de células T diabetogênicas.

Todos os gráficos de barras mostram média 6 SEM. (G) Análise de células B220 + infiltrando-ilhotas entre leucócitos CD45. zona marginal (MZ. (C) Gráficos de contorno de citometria de fluxo representativos mostrando eventos de células monocelulares vivas com linfócitos B para análise de linfócitos B esplénicos e PLN GC (Fas + GL7 +) em camundongos NOD e NOD.Aicda2 / 2 ratinhos (n = 16 para CD69 e CD80. que contêm um subconjunto CD73 + expandido que foi anteriormente referido como exercendo actividade reguladora (46) FIGURA 2.Aicda2 / 2 fêmeas de 7 semanas de idade. de isótipos de Ig de soro em camundongos NOD macho de 6 a 7 semanas de idade (n = 7) e ratinhos NOD. T2 (B220 + CD19 + CD21hi CD23 +).Aicda2 / 2 (n = 10) de 10 semanas de uma experiência. CD80 + ou PD-L2 + em ratinhos NOD fêmeas com 10-12 semanas de idade (n = 18 para CD69 e CD80. n = 14 para PD-L2) reunidos a partir de cinco experiências. Os dados quantitativos (n = 7 por grupo) de uma experiência são resumidos em (D). 4C). Observamos maiores proporções de linfócitos B CD73 + que coexpressaram ou não o CD39 nos baços. um representante de três experimentos). Juntos.da adenosina (A2aR) pode inibir a sinalização TCR e prevenir a ativação celular (45). (F) Quantificação. Aicda2 / 2 em comparação com os controles NOD. mas não encontraram diferenças na fração CD39 + CD732 (Fig.Aicda2 / 2 (n = 16) reunidos a partir de cinco experiências.Aicda2 / 2 (n = 10) reunidos a partir de duas experiências.Aicda2 / 2 de 7- 10 semanas de idade (n = 21) comparados com os controlos de NOD (n = 19) Quatro experimentos individuais.1 + em ratinhos NOD fêmeas com 10-12 semanas de idade (n = 18) e ratinhos NOD.Aicda2 / 2 em comparação com os controles NOD (Fig. . Os níveis de linfócitos CD73 + B foram maiores nos baços. comparámos a extensão em que os linfócitos B de murganhos NOD intactos e com deficiência de Aicda expressam CD39 e / ou CD73. Os linfócitos NOD. por ELISA. (B) A enumeração de linfócitos B totais (CD45. Assim. (A) Análises de citometria de fluxo comparando os subgrupos de linfócitos T (B220 + CD19 + CD212 CD232). Todos os valores de p foram calculados utilizando análises de MannWhitney.1 + B220 + CD19 +) no baço e PLN de ratinhos NOD. 4B. estes dados indicam que a capacidade das células T de NOD para induzir o desenvolvimento de T1D é reduzida na presença de linfócitos NOD. PLNs e ilhotas de camundongos NOD. a expressão de CD73 assinala um subconjunto de linfócitos B com a capacidade de suprimir as respostas das células T através da produção de adenosina (46). (H) Proporções de linfócitos B infiltrando ilhéus com um fenótipo CD69 +. n = 13 para PD-L2) ou NOD. B220 + CD19 + CD21hi CD232) e subgrupos de linfócitos B foliculares (FO. (E) Porcentagem de células CD80 + ou PD-L2 + entre linfócitos B esplénicos ou PLN em ratinhos fêmeas NOD (n = 8) e NOD. 4D-F). B220 + CD19 + CD21 + CD23 +) em 8 -wk-old fêmea NOD e NOD.Aicda2 / 2 B.Aicda2 / 2 ratos (n = 8 por grupo. PLNs e ilhotas de NOD.Aicda2 / 2 B são numericamente aumentados e apresentam um fenótipo de GC mais predominante do que os dos controlos de NOD. Num modelo de colite murina.

Aicda2 / 2 foram cultivados com células T CD4 + WT CD732 CD4 + anti-CD40 estimuladas com CD3. estes resultados indicam que o desenvolvimento diminuído de T1D em ratinhos NOD.Aicda2 / 2 exercem actividade reguladora suprimindo respostas de células T diabetogénicas Conforme mencionado acima. Os linfócitos B CD73 + e CD732 ordenados de ratinhos NOD ou NOD. Em seguida. com ou sem o inibidor CD73 APCP. a uma expansão de linfócitos B CD73 + com a capacidade de suprimir respostas de células T patogénicas. FIGURA 3. que exibem a capacidade de suprimir respostas de células T diabetogénicas.Aicda2 / 2 é devido. Juntos. Os linfócitos B Aicda2 / 2 enxertados em receptores NOD-scid retêm a expressão aumentada de CD73 (Fig. avaliamos se os linfócitos B CD73 + expandidos em ratinhos NOD. Numa base por célula. com dados quantitativos (n = 7 Por grupo) resumido em (C). a expressão de CD73 pode marcar uma população de linfócitos B supressores.Aicda2 / 2. Esses resultados coletivos também indicam que a ablação genética de AID inibe o desenvolvimento de T1D em camundongos NOD aumentando quantitativamente. De modo semelhante. Figura 3A suplementar). 5A). pelo menos em parte.1 + TCRb + CD8 +) esplénicas ou PLN-residentes em 7DWW-old female NOD (n = 19) e NOD Aicda2 / 2 (n = 21) ratinhos agrupados a partir de quatro experiências. Assim. segregam níveis significativamente mais elevados de IL-10 sob estimulação LPS do que as suas contrapartes CD732 (Figura 5D) . em vez de mudar qualitativamente. realizou-se estudos in vitro para determinar se os linfócitos NOD B deficientes em Aicda exercem efeitos supressores sobre tais efectores patogénicos através da actividade reguladora mediada pelo subconjunto CD73 + expandido. (D) desenvolvimento de T1D em receptores NODscid . Os números de células CD4 + nT de fenótipo total periférico e GC são aumentados em ratinhos NOD Aicda2 / 2. (B) Gráficos de contorno de citometria de fluxo representativos mostrando eventos fechados de células T CD4 vivas unicelulares para análise de células Tfh esplénicas e PLN cheias (CXCR5 + PD-1 +) em camundongos fêmeas com 7 semanas de idade.Os linfócitos B CD73 + em ratinhos NOD.Aicda2 / 2 exercem efeitos supressores de T1D em experiências de transferência adoptiva.Tem sido relatado anteriormente que os linfócitos B com uma capacidade de suprimir o desenvolvimento de T1D em ratinhos NOD principalmente fazê- lo através da secreção de IL-10 (47). 5C.1 + TCRb + CD4 +) e CD8 (CD45. (A) Os rendimentos das células T CD4 (CD45. os linfócitos CD73 + B de murganhos NOD intactos e deficientes em AID suprimiram a proliferação de células T igualmente e numa extensão significativamente maior do que o subconjunto CD732 na presença de AMP. A adição de APCP diminuiu este efeito (Fig. Os linfócitos CD73 + B suprimem as respostas das células T através da geração de adenosina por esta ectoenzima e potencialmente pela sua capacidade de secretar IL-10 após a estimulação. a população de linfócitos B CD73 + expandida em ratinhos NOD. As células T NOD purificadas transferiram T1D para receptores NOD-scid com uma eficiência significativamente maior quando misturados com linfócitos Aicda2 / 2 B que tinham sido esgotados do subconjunto CD73 + (Figura 5B). um representante de três experimentos. e AMP. os linfócitos B CD73 + imuno-reguladores.

os linfócitos B tratados com Aicda2 / 2 e DIDS apresentaram diminuição da diversidade.(4. nós hipotetizamos que o direcionamento da via AID / RAD51 pelo tratamento com DIDS pode proporcionar uma intervenção eficaz de T1D dirigida a linfócitos B. Todos os gráficos de barras mostram média 6 SEM. Semelhante ao caso dos murganhos de controlo B6.Aicda2 / 2 ou NOD fêmeas de 7-8 semanas de idade. respectivamente (Fig. Portanto. Raciocinou-se que a incapacidade dos linfócitos NOD. utilizando protocolos estabelecidos (33). Para minimizar as sobreavaliações da diversidade. Adicionalmente. Para garantir que o viés de amostragem resultante de variáveis na profundidade de seqüenciamento não foi responsável pelas diferenças observadas na diversidade. As análises de rarefação e estimativa da diversidade de Chao extrapolada (48) revelaram diminuição da diversidade de IgH entre os linfócitos B dos camundongos NOD tratados com NOD. O valor de p da incidência de T1D foi calculado utilizando a análise de MantelCox. Todos os valores de p em gráficos de barras foram calculados utilizando a análise de MannWhitney. foram recuperados menos linfócitos B estimulados com anti-CD40 / IL-4 a partir de culturas contendo (E) -5-acetamido-2. também hipotetizamos que a perturbação mediada por DIDS do eixo AID / RAD51 recapitularia tais diminuições na diversidade de repertório de Ig. Aicda2 / 2. Juntos. . Para testar inicialmente essa possibilidade. 6D. Inibindo a reparação de RAD51 mediada por RAD51 de AID iniciado off-alvo DSBs. bem como a partir de ratinhos NOD tratados com veículo ou 50 mg / kg DIDS de 8 a 16 semanas de idade. 6B. Figura 4 suplementar). eo tratamento com esta pequena molécula diminui a diversidade do repertório IgH de uma forma semelhante à ablação Aicda. utilizou-se sequenciação de alto rendimento para caracterizar ARNm de IgH de comprimento total a partir de linfócitos B purificados residentes de PLN de NOD e NOD individuais de 8 semanas de idade.Aicda2 / 2 e DIDS em comparação com os controlos NOD não tratados e tratados com veículo.5 3 106 células T purificadas de ratinhos fêmeas NOD. foram recuperados menos linfócitos NOD B de culturas contendo DIDS (Figura 6A). determinou-se se o tratamento com DIDS afectou o repertório Ig de ratinhos NOD de uma maneira semelhante à ablação genética de AID. outro inibidor RAD51 de pequena molécula Que é 1500 vezes mais potente do que DIDS (Figura 6A. o protocolo utiliza a transcrição reversa de comutação de molde para incorporar uma IHM de 12 pb na extremidade 39 de cada molécula de cDNA. em comparação com seus respectivos controles (Fig. Por extensão. 6C).Aicda2 / 2 B de iniciar os processos CSR / SHM resultaria numa diminuição do gene de Ig que codifica a diversidade do repertório em relação aos controlos WT. 6E). estimulamos linfócitos NOD B purificados com anti-CD40 e IL-4 na presença de veículo ou 150 mM de DIDS in vitro. Por conseguinte. Após 500 iterações de reamostragem. Isto permite a correcção dos erros de sequenciação e de PCR agrupando múltiplas leituras provenientes de moléculas de cDNA simples para formar leituras de consenso. após 4 d de estimulação. o tratamento com a pequena molécula DIDS induz a morte de linfócitos B em que SHM e CSR processos foram iniciados (23).(3-isopropiltioureido) -2-sulfonatostriilo) benzenossulfonato. conforme medido pela estimativa da diversidade observada e da diversidade total do limite inferior (Efron-Thisted) (49). O tratamento com DIDS diminui a diversidade de repertório de Ig de linfócitos NOD B Os resultados dos nossos estudos genéticos mostram que os processos dependentes da AID desempenham um papel importante nas contribuições dos linfócitos B para o desenvolvimento de T1D em ratinhos NOD. cada amostra foi amostrada abaixo de 500 leituras de consenso. os dados in vitro e in vivo indicam que os linfócitos NOD B são tão susceptíveis à DIDS como anteriormente relatado para os da estirpe B6 (23). Em seguida.injectados com 2.

PLN e islote em 7 Ratinhos NOD de 12 semanas de idade (baço / PLN: n = 15. Todos os valores de gráfico de barras p foram calculados utilizando a análise de Mann-Whitney. ilhotas: n = 16).5 3 106 células T purificadas de doadores de NOD fêmeas de 7-8 semanas de idade misturadas com 2. e todos os gráficos de barras mostram uma média de 6 SEM. (A) Níveis de enxerto esplênico de linfócitos CD73 + B de NOD (n = 9) ou NOD Os doadores de Aicda2 / 2 (n = 8) foram misturados com células T de NOD (2. ilhotas: n = 18) e ratinhos NOD. Quantificação da percentagem de células CD39 + CD73 +. (C) Quantificação da percentagem de células CD73 + entre os linfócitos B do baço. As células T NOD transferem T1D adoptivamente de forma menos eficiente na presença de linfócitos B deficientes em Aicda caracterizados por uma expansão do subconjunto CD73 +. ilhotas: n = 8) reunidos a partir de duas experiências individuais. PLN (E) ou islote (F) B220 + CD19 + em ratinhos NOD fêmeas com 7-12 semanas de idade (baço / PLN : N = 15. Os linfócitos B CD73 + deficientes em AID expandidos exercem actividade de tipo regulador suprimindo respostas de células T diabetogénicas. (A) Desenvolvimento de T1D em receptores de NOD-scid injectados com 2. O valor de p da incidência de T1D foi calculado utilizando a análise de MantelCox.5 3 106 de cada tipo de célula) 4 semanas após o transferem para receptores de NOD-scid. FIGURA 5.Aicda2 / 2 (baço / PLN: n = 17. Resultados de um experimento. (B) Desenvolvimento . Os dados dos ilhéus são reunidos a partir de cinco experiências. Os dados do baço e PLN são reunidos a partir de três experiências. ilhotas: n = 7) e ratinhos NOD.5 3 106 linfócitos B de ratinhos NOD de 7-8 semanas de idade (n = 10 ) Ou NOD Aicda2 / 2 ratinhos (n = 9). CD39 + CD732 e CD392 CD73 + entre os linfócitos B (B).Aicda2 / 2 (baço / PLN: n = 17.FIGURA 4.

Além disso.Aicda2 / 2 fenocópicos aumentaram as proporções de linfócitos CD73 + B. os ratos NOD. e anti-CD28 solúvel (2 mg / ml). e os níveis de IL-10 do sobrenadante de cultura foram medidos por ELISA. Todos os gráficos de barras mostram média 6 SEM. IAA2: veículo 6/7. Além disso. É importante notar que o tratamento com DIDS impediu a progressão para a T1D aberta quando iniciado em ratinhos IAA + NOD (IAA +: veículo 2/3. Injecções de veículo ou DIDS a 10 mg / kg (dose baixa) ou 50 mg / kg (dose elevada. PLN e residentes de ilhotas com potencial capacidade imunossupressora pelo tratamento com DIDS (Fig. 8B). A inibição molecular do eixo AID / RAD51 inibe o desenvolvimento de T1D Em seguida. Finalmente. em relação aos controlos tratados com veículo. os ratinhos NOD tratados com DIDS de 8 a 16 semanas de idade foram avaliados quanto a alterações fenotípicas nas populações de linfócitos B. A partir das 6. 8D). DIDS 0/11) (Figura 7D). Adicionalmente. o tratamento com DIDS conduziu à expansão dos compartimentos de linfócitos B esplénicos e PLN GC (Fig.0 3 105 células T CD4 + purificadas com depleção de CD73 a partir de ratinhos NOD macho 7-10 semanas de idade foram marcadas com Proliferação de Células tintura eFluor 670 e co-cultivadas durante 4 d com 1. com 0 (linha de base) ou a AMP 10 mM.(C) Um total de 1. 7A-C). altura em que a incidência da doença em controlos atingiu 90% (Fig. 8 ou 10 semanas de idade.cionalmente. 7A e retrospectivamente digitado para IAAs. imediatamente antes do início do tratamento. (D) Um total de 5 3 104 NOD (n = 5 repetições biológicas) purificadas ou NOD. DIDS 0/9.5 3 106 células T purificadas de ratinhos NOD fêmeas de 7- 8 semanas de idade misturados com 2. Fig. semelhante ao caso provocado pela ablação genética da AID. Quantificação da supressão percentual da linha de base. o tratamento com DIDS exerceu fortes efeitos protetores T1D até 24 semanas de idade. 7E). Adi. 8A). A supressão in vitro mediada por CD73 e os dados de produção de IL-10 apresentados são combinados a partir de três e duas experiências individuais.0 3 105 CD73 + ou CD732 linfócitos B a partir de baços de NOD macho reunidas 7-10 semanas de idade (n = 6 réplicas biológicas) ou NOD Aicda2 / 2 (n = 10 replicados biológicos) os ratos sob condições de estimulação que consistem em solúvel anti CD40 (1 mg / ml). o aumento provocado por DIDS nos linfócitos CD73 + B das ilhotas ocorreu nas subpopulações CD73 + CD39 + e CD73 + CD392 (Fig. mas aumentaram a expressão de CD80 e PD-L2 (Fig.p.Aicda2 / 2. Independentemente do tempo de início ou da dose. 8F). Os efeitos do tratamento DIDS nos linfócitos B indirectamente suprimem as respostas das células T diabetogénicas . Isto também foi semelhante à expansão de linfócitos B com um fenótipo similar à memória dentro das ilhotas de camundongos NOD. mesmo quando iniciado em ratinhos NOD que já tinham desenvolvido elevados níveis contínuos de autoimunidade de células B marcados pela presença de IAAs. Os linfócitos B também foram proporcionalmente aumentados entre os linfócitos infiltrantes de ilhéus (Fig. o soro foi recolhido a partir de ratinhos representados na Fig.5 3 106 linfócitos B totais ou CD73-esgotados purificados a partir de 7-8 semanas de fêmeas NOD Aicda2 / 2 doadores.de T1D em receptores de NOD-scid injectados com 2. o tratamento com DIDS conduziu a uma diminuição proporcional da Hardy F) linfócitos B (Fig. A análise de MannWhitney foi realizada para a produção de IL-10. O valor de p do estudo de incidência de T1D foi calculado usando a análise de MantelCox.2F Suplementar). 8C). os ratinhos NOD tratados com DIDS a partir de 8 semanas de idade tinham níveis diminuídos de insulite em comparação com os controlos (Fig. as análises de citometria de fluxo de linfócitos B residentes em medula óssea revelaram que. Estes dados colectivos indicam que o tratamento com DIDS inibe a progressão para T1D evidente. Apesar desta expansão observada de linfócitos B semelhantes a memórias infiltração de ilhéus em ratinhos tratados com DIDS. 8E). testámos se o tratamento in vivo com DIDS exercia efeitos protectores de T1D em ratinhos NOD. os ratinhos NOD fêmeas receberam i. esplênicos.A presença de IAAs é um critério importante que é usado para identificar humanos em alto risco futuro de T1D para inclusão em possíveis ensaios de intervenção de doença (13). 8G. os linfócitos B infiltrantes de ilhéus apresentaram níveis semelhantes de CD69.Aicda2 / 2 (n = 10 repetições biológicas) CD73 + ou linfócitos B CD732 foram cultivadas durante 3 d com 0 ou 10 mg / ml LPS. na presença ou ausência de APCP 100 mM. respectivamente. O teste de Wilcoxon foi realizado para o ensaio de supressão. 6 e 8 semanas apenas para iniciar). placa-ligado anti-CD3ε (5 mg / ml). Conforme observado após ablação genética de AID. O tratamento com DIDS altera os perfis de linfócitos B de uma forma semelhante àquela provocada pela ablação de Aicda Para investigar inicialmente como o reagente pode desencadear a protecção T1D. Assim. os ratinhos NOD tratados com DMS de 50 mg / kg de 8 a 16 semanas de idade foram caracterizados por um aumento do número total de linfócitos esplénicos e PLN B (Fig.

O tratamento com DIDS não alterou significativamente a expressão CD69 das células T CD8 + das ilhotas. 9A). 9G). tornaram- se então doadores de células T esplénicas purificadas que foram transferidas para receptores NOD-scid que foram subsequentemente monitorizados para desenvolvimento T1D. mas não nos baços. As células T CD4 + apresentaram maior expressão de CD69 após tratamento com DIDS (Fig. 9C) após tratamento com DIDS. Para distinguir entre as possibilidades acima. Em vez disso. Conforme observado na ablação genética de AID. Nós imaginamos duas explicações possíveis para este resultado: os linfócitos B nos doadores tratados com DIDS expandem as populações de células T autorreativas menos eficientemente do que nos ratinhos tratados com veículo e os DIDS podem actuar directamente para suprimir a actividade das células T diabetogénicas. os receptores de NOD-scid iniciaram semanalmente 50 mg / kg de DIDS ou tratamento com veículo e foram monitorizados para desenvolvimento de T1D. os receptores NOD-scid tratados com DIDS ou veículo desenvolveram T1D a uma taxa equivalente (Fig. tratados uma vez por semana com veículo ou DIDS de 50 mg / kg de 8 a 16 semanas de idade. As células T CD4 + e CD8 + totais aumentaram numericamente nos PLNs. 9F).O tratamento com DIDS e a ablação genética de Aicda provocam alterações fenóticas semelhantes em linfócitos NOD B. testámos se o tratamento com DIDS tinha efeitos duradouros sobre a actividade diabetogénica das células T. mas aumentou ligeiramente os níveis de IL-7Ra (Fig. Assim. a capacidade reduzida de células T de ratinhos NOD tratados com DIDS para transferir T1D de forma adotiva não pode ser atribuída a uma redução directa na sua patogenicidade. 9E). As células T de ratinhos tratados com DIDS transferiram T1D para receptores de NOD-scid com eficiência significativamente menor em comparação com os de dadores de controle (Fig. A partir de 3 d póstransfer. houve uma diminuição na proporção do subconjunto CD8 + entre as células T infiltrativas de ilhéus (Fig. 9D). 9B). as proporções de células Tfh aumentaram nos baços e PLNs de ratinhos NOD tratados com DIDS (Fig. enquanto que as células T CD8 + tinham um efector diminuído e um fenotipo de memória central aumentado (Fig. as células T CD4 + infiltrantes de ilhéus tinham um fenótipo de memória central naive diminuído e aumentado. Finalmente. Após o enxerto com células T NOD. Juntos. é provavelmente devido à DIDS limitar a capacidade dos linfócitos B para suportar a expansão de efectores patogénicos. em comparação com os controlos tratados com veículo. Os ratos NOD fêmeas. Estes resultados indicam que o tratamento com DIDS não afecta directamente a actividade diabetogénica das células T NOD. em ratinhos tratados com DIDS. estes dados indicam que o tratamento com DIDS reduz as células T CD8 + efetoras e dirige a acumulação de células T CD4 + e CD8 + de memória central dentro das ilhotas de ratinhos NOD. de ratinhos tratados com DIDS (Fig. testou-se o efeito directo de DIDS sobre a função diabetogénica de células T de NOD na ausência de linfócitos B. A proporção de células T totais diminuiu entre leucócitos infiltrantes de ilhéus (Fig. 9E). consideramos importante determinar se o tratamento com DIDS afecta directamente a capacidade diabetogénica das células T de NOD. Em seguida. Adicionalmente. . 9H). Embora não tenha sido provocada pela ablação de Aicda. As células T esplénicas purificadas de ratinhos NOD fêmeas de 5 a 6 semanas de idade foram transferidas para recipientes de NOD-scid.

semelhante ao caso com a ablação genética de AID. de 8 a 16 semanas de idade. As linhas sólidas e tracejadas são regiões interpoladas e extrapoladas. também transferimos células T de controlos tratados com veículo com linfócitos B desprovidos de CD73 de ratinhos tratados com DIDS. Assim. Em seguida. semelhante ao caso dos ratinhos NOD. Os dados são representativos de uma das três experiências. Os linfócitos B CD73 + expandidos pelo tratamento com DIDS suprimem as respostas das células T diabetogénicas Nós testamos se coinfusion de linfócitos B de controle ou tratados com DIDS NOD ratos afetados diferencialmente a capacidade de diabetogenic T células para transferir doença para NOD-scid receptores. 10A). respectivamente. A área sombreada representa o intervalo de confiança de 95%. As células T esplénicas purificadas dos ratinhos tratados com veículo foram então cotransferidas em recipientes de NOD-scid com números iguais de linfócitos B purificados totais de dadores tratados com veículo ou DIDS. Por conseguinte. (C) Índice de estimativa da diversidade do caos.FIGURA 6. o tratamento com DIDS expande as populações de linfócitos B CD73 +. a depleção do subconjunto CD73 + aumentou significativamente a capacidade dos linfócitos B de dadores tratados com DIDS para suportar o desenvolvimento de T1D em receptores de NOD-scid coinfused com células T patogénicas (Fig. 10A). 10A). Tal como anteriormente referido. No entanto.Aicda2 / 2. DIDS diminui a expansão in vitro e a diversidade de utilização de Ig de linfócitos NOD B. As sequências com codões de paragem precoce ou mutações de mudança de quadro foram filtradas para exibir apenas clones "funcionais". (A) Rendimentos celulares de linfócitos B purificados a partir de ratinhos B6 ou NOD (n = 3 repetições biológicas por grupo) cultivados durante 96 h (13 106 células por mililitro) com anti-CD40 (1 mg / ml) e IL-4 murina (25 ng / ml) na presença do veículo.(3-isopropiltioureido) -2- sulfonatostyryl) benzenossulfonato. testámos se a população CD73 + expandida pelo tratamento com DIDS pode suprimir directamente as respostas das células T. NOD fêmeas foram injectadas uma vez por semana. O desenvolvimento de T1D foi significativamente diminuído em receptores de NOD-scid de células T patogénicas coinfused com linfócitos B totais de dadores tratados com DIDS em comparação com dadores tratados com veículo (Fig.(4. Diversidade observada (D) e estimativa de Efron-Thisted (E) após 500 iterações de downsampling para 500 leituras. o tratamento DIDS de ratinhos NOD induz um aumento quantitativo em linfócitos B CD73 + com uma capacidade para suprimir activamente o desenvolvimento de T1D (Fig. Numa base . Os valores de p foram calculados utilizando o teste t de Student. Os dados são apresentados num gráfico de rarefação mostrando a diversidade clonal como uma função de moléculas de cDNA únicas sequenciadas. com veículo ou 50 mg / kg DIDS. As parcelas de dispersão mostram 6 SEM médias. (B) Um total de 136 000-400 000 linfócitos B PLN purificados dos grupos experimentais NOD indicados foi sequenciado para a diversidade de utilização do gene de IgH (n = 3 ratinhos por grupo) numa experiência. 150 mM de DIDS ou 100 nM de (E) -5-acetamido-2. com pontos que indicam o tamanho exato da amostra e a diversidade observada.

10B). A partir de 6 (A). 3B suplementar). Finalmente. IAA2 DIDS: n = 11. embora os processos de CSR e de SHM sejam processos linfócitos intrínsecos B importantes na patogênese de T1D. Os dados mostram média 6 SEM. Discussão Demonstrou-se que a interrupção do eixo AID / RAD51. (D) O soro foi colhido a partir da coorte de ratinhos em (A) no início do tratamento e tipificado retrospectivamente para IAAs. Este efeito supressor foi diminuído após a adição de APCP (Fig. que. FIGURA 7. Fig. por meios genéticos ou farmacológicos. Embora as células T purificadas de ratinhos NOD. O tratamento com DIDS inibe o desenvolvimento de T1D. camundongos NOD fêmeas foram tratados com veículo ou DIDS (10 ou 50 mg / kg) numa base semanal e monitorizados para desenvolvimento T1D. IAA2 Veículo: n = 7) . os linfócitos B CD73 + de ratinhos tratados com veículo e DIDS suprimiram igualmente a proliferação de células T em resposta à estimulação anti-CD3 e anti-CD28 numa extensão significativamente maior do que o subconjunto CD732 na presença de AMP (Fig. Os valores de p foram calculados utilizando o teste exato de Fisher. a nosso conhecimento. os linfócitos B CD73 + de murganhos tratados com DIDS produziram menos IL-10 após a estimulação com LPS do que os dos controlos tratados com veículo (Fig. a sua ausência não diminui o desenvolvimento de células T autorreativas. incluindo um aumento quantitativo de linfócitos B reguladores CD73 + (Bregs). pelo menos em parte. 10C). O gráfico representa a percentagem de ratinhos IAA + ou IAA2 em cada grupo de tratamento que avançou ou não para T1D (IAA + DIDS: n = 9. Estes resultados indicam que o direccionamento farmacológico da actividade de RAD51 inibe o desenvolvimento de T1D em ratinhos NOD de uma maneira semelhante àquela provocada pela ablação de Aicda. a inibição de . Os valores de p foram calculados utilizando a análise de Mantel- Cox. inibe fortemente o desenvolvimento de T1D em camundongos NOD. Os valores de p foram calculados utilizando a análise de Mann-Whitney.Aicda2 / 2 sejam eficazes na transferência adoptiva de T1D para receptores NOD-scid. (E) Escores de insulina para ratinhos fêmeas NOD tratados semanalmente a partir das 8 semanas de idade com veículo (n = 10) ou DIDS numa dose de 10 mg / kg (n = 8) ou 50 mg / kg (n = 14). Adicionalmente. 10B. nós fornecemos a primeira evidência. IAA + Veículo: n = 3. Surpreendentemente.percelular. à expansão de populações específicas de linfócitos B CD73 + com capacidade de regular Respostas de células T patogénicas. examinamos a produção de IL-10 por linfócitos B CD73 + e CD732 classificados de ratinhos tratados com veículo e DIDS. 8 (B) ou 10 (C) sem de idade. e esta proteção é devida.

fracção E (B220 + CD432 IgM + IgD2) e fracção F (B220 + CD432 IgM + IgD +) na medula óssea (uma experiência). (F) Percentagem de células CD69 +. CD80 + e PD-L2 + entre as células B220 + de ilhotas (veículo n = 13. O tratamento com DIDS altera os perfis de linfócitos B de uma forma semelhante àquela provocada pela ablação de Aicda. Deste modo. combinadas a partir de duas experiências). n = 14 DIDS. CD732 CD39 + e CD73 + CD392 entre linfócitos de ilhotas B220 + (veículo n = 13. (A) Rendimento dos linfócitos esplénicos totais e PLN CD19 + B220 + (n = 7 veículos. Os dados são média 6 SEM. NOD fêmeas camundongos foram tratados com veículo ou 50 mg / kg DIDS de 8 a 16 semanas de idade. combinados a partir de duas experiências). n = 14 DIDS Islet. n = 8 DIDS Spleen / PLN. (B) Percentagem de linfócitos B esplénicos e PLN GC (Fas + GL7 +) (n = 7 veículo. n = 8 DIDS. (C) Percentagem de leucócitos B220 + entre células CD45. n = 8 DIDS. (E) Percentagem de células CD73 + CD39 +. FIGURA 8. (G) Proporções dos subconjuntos de linfócitos B Hardy D (B220 + CD432 IgM2 IgD2). a ruptura do eixo AID / RAD51 pode representar um meio previamente não realizado de expansão in vivo de Breg. A análise de MannWhitney foi realizada para todos os gráficos de gráficos de barra e dispersão.processos CSR e SHM conduz a uma expansão de Bregs que controlam estes efectores. n = 14 DIDS combinadas a partir de duas experiências). n = 13 Veículo Islet. combinados a partir de duas experiências). (D) Percentagem de linfócitos B CD73 + entre os linfócitos B220 + CD19 + B (n = 7 Veículo Bazo / PLN. Esses achados revelam uma ligação inesperada entre o bloqueio de processos de maturação por afinidade dependente de AID / RAD51 e o desenvolvimento de Breg.1 + de ilhotas (combinadas a partir de duas experiências). .

combinadas a partir de duas experiências). Os efeitos de DIDS sobre linfócitos B indirectamente suprimem respostas de células T diabetogénicas. combinadas a partir de duas experiências). (E) Percentagem de células CD69 + e IL-7Ra + entre as células T CD4 + e CD8 + das ilhotas (veículo n = 13. Estudos .ou tratados com veículo (veículo n = 13. A análise de Mann-Whitney foi realizada para todos os gráficos de barras.1 + dentro das ilhotas. n = 8 DIDS. Combinado a partir de dois experimentos). pelo menos em parte através da produção de adenosina (Figuras 5C. combinados a partir de duas experiências). n = 14 DIDS. (H) Um total de 2. (B) Quantificação da percentagem de células Tfh completas entre células CD4 + TCRb + no baço e PLN (n = 7 Veículos. n = 14 DIDS. efetora (CD44 + CD62L2) e memória central (CD44 + CD62L +) nos ilhéus de camundongos DIDS. combinadas a partir de duas experiências). (A) Percentagem de células T CD4 + e CD8 + entre os leucócitos vivos TER-1192 ou PLN (não-RBCs) (n = 7 Veículos. (C) Percentagem de leucócitos TCRb + entre células CD45. 10B). n = 8 DIDS. Dados mostram média 6 SEM. (D) Percentagem de células CD4 + ou CD8 + entre células T de ilhotas (veículo n = 13. (F) Percentagem de células T CD4 + e CD8 + naive (CD442 CD62L +). As células T esplénicas foram então purificadas a partir de cada grupo de tratamento e transferidas (3 3 106) para receptores de NOD scid (n = 16 por grupo) que foram subsequentemente monitorizados para desenvolvimento de T1D. NOD fêmeas camundongos foram tratados semanalmente com 50 mg / kg DIDS ou veículo de 8 a 16 semanas de idade. n = 14 DIDS.FIGURA 9. (G) Ratinhos NOD fêmeas foram injectados com veículo ou 50 mg / kg DIDS de 8 a 16 semanas de idade.5 3 106 linfócitos T purificados de ratinhos NOD fêmeas com 6 semanas de idade foi transferido para ratos NOD-scid que subsequentemente iniciaram tratamento semanal com DIDS de 0 ou 50 mg / kg (n = 10 por grupo) e Foram monitorados para T1D. A ablação de AID e DIDS direccionada para RAD51 resulta na acumulação de linfócitos B CD73 + capazes de suprimir as células T. Os valores de p do estudo de incidência foram calculados utilizando a análise de Mantel-Cox.

Portanto. Outros estudos forneceram evidências de que a expansão de Breg tem potencial para conferir efeitos inibidores de T1D fortes. Isto poderia incluir o tratamento de DIDS suportando a expansão de Bregs de CD732 capazes de suprimir células T através de mecanismos independentes de adenosina. possivelmente. A futura criação de linfócitos B CD732 / 2 NOD camundongos irá ajudar a desacoplar as contribuições reguladoras individuais fornecidos pela geração de adenosina e secreção de IL-10.A secreção de IL-10 tem sido reconhecida como um meio principal de supressão imune mediada por Breg (51). os possíveis efeitos da focalização do eixo AID / RAD51 na capacidade de eliminar agentes patogénicos terão de ser objecto de investigação de outros investigadores. à regulação descendente da expressão de CD20 na superfície celular por isfilificação de linfócitos B (18). 9F). 10B). discernir a contribuição da AID para estes processos em ratinhos NOD é complicada por defeitos específicos da estirpe na tolerância central dos linfócitos B (55). Por conseguinte. suporta a conclusão de que tais efeitos protectores da doença são em grande parte O resultado da produção de adenosina mediada por CD73. não podemos infectar ratos com micróbios no The Jackson Labo. Esta observação é consistente com um relatório sugerindo que a produção de adenosina mediada por Breg pode desempenhar um papel mais importante na imunossupressão do que a secreção de IL-10 (46). Contudo. a manipulação da AID afeta os linfócitos B associados ao intestino e altera a microflora intestinal (56). o tratamento com DIDS diminui a capacidade de outras populações de linfócitos B em murganhos NOD para suportar a actividade das células T diabetogénicas. para além da expansão de CD73 + Bregs. a população de linfócitos B CD73 + expandidos em ratinhos NOD deficientes em AID ou tratados com DIDS parece inibir em grande parte respostas de células T diabetogénicas através de um mecanismo que é dependente de Atividade desta ectoenzima. a AID tem sido implicada na tolerância central dos linfócitos B em cepas de fundo C57BL / 6 e BALB / c (53). A capacidade dos linfócitos B de murganhos NOD tratados com DIDS para inibir as respostas de células T diabetogénicas (Fig. a via da AID demonstrou desempenhar um papel importante nos linfócitos B fora do ambiente do GC esplénico ou dos gânglios linfáticos. embora os linfócitos B com depleção de CD73 de ratinhos tratados com DIDS pudessem suportar a capacidade de células T patogénicas coinfundidas para transferir T1D para receptores de NOD-scid. Desconhece-se por que os linfócitos B CD73 + de murganhos tratados com DIDS produzem menos IL-10 induzida por LPS do que os dos controlos. Além disso. o mecanismo pelo qual esses Breg de CD732 medeiam a supressão é provavelmente independente da IL-10. Isto poderia indicar que. impedindo a diferenciação de células T de memória para efectores (50). devem ser investigados agentes que possam aumentar especificamente o CD73 + Bregs sem afetar o eixo AID / RAD51. Adicionalmente. porque esta população produz pouco da citocina em resposta à estimulação. No entanto. deve notar-se que os linfócitos B IL-102/2 têm expressão CD73 reduzida. as células T diabetogénicas são suprimidas através de um mecanismo mediado pela adenosina. A produção de IL-10 pelos linfócitos B requer estimulação forte.anteriores demonstraram que a sinalização de adenosina através de A2aR inibe a regulação descendente de células T CD8 + de IL-7Ra. emparelhado com uma expressão aumentada de IL-7Ra (Figura 9E). também há relatos de Bregs capazes de suprimir o lúpus eritematoso sistêmico eo desenvolvimento experimental de encefalomielite auto-imune através de mecanismos independentes da IL-52 (52). o fizeram com menos eficiência do que os linfócitos B totais do controlo tratado com veículo Doadores. apesar de não excluir a possibilidade de outras vias de supressão independentes de adenosina que não se sobrepõem. suporta ainda a conclusão Que. . pelo menos em parte. Se este for o caso.ratory. enquanto a geração de adenosina pelos linfócitos B CD73 + é constitutiva. a alteração nas populações de células T CD8 + infiltrando ilhéus em ratinhos NOD tratados com DIDS de um efetor para um fenótipo de memória central (Fig. desde que seu substrato esteja presente (46). a ruptura do eixo AID / RAD51 poderia. Adicionalmente. o tratamento com DIDS de ratinhos feitos geneticamente deficientes na expressão de IL-10 ou tratados com um Ab bloqueando esta citocina não discriminaria as contribuições reguladoras da produção de adenosina mediada por CD73 e a acção directa por IL-10. Assim. Além disso. Por conseguinte. resultar numa diminuição da capacidade para eliminar a infecção. Por conseguinte. Um ensaio clínico de linfócitos pan-B mediado por rituximab anterior não travou permanentemente a morte celular (17). 10C). Devido à política institucional. Alterações da microflora do intestino podem afetar drasticamente o desenvolvimento de T1D (57). Por exemplo. Contudo. apesar da produção reduzida de IL-10 (Fig. Deve também notar-se que. 10A. sugerindo que esta citoquina provavelmente regula directamente a expressão de CD73 pelos linfócitos B (46). Este estudo centrou-se no papel do eixo AID / RAD51 nos processos de afinidade-maturação GC contribuindo para T1D. Outro estudo demonstrou um papel da AID na tolerância central e periférica dos linfócitos B humanos (54). Isto proporciona uma explicação provável para a razão pela qual a imunoterapia anti-CD20 apenas protege ratinhos NOD de T1D se iniciada antes do desenvolvimento de IAA. Estudos em ratinhos NOD indicam que isto pode dever-se. neste sistema. o efeito do direcionamento de AID / RAD51 sobre a tolerância central de linfócitos B em NOD não é claro e merece uma investigação adicional. é justificado examinar o impacto da interrupção do eixo AID / RAD51 na homeostase GALT. Por conseguinte.

esta área da via AID tem outros alvos potenciais que podem ser explorados. O teste de Wilcoxon foi realizado para ensaio de supressão. Os receptores de NOD scid foram então monitorizados para desenvolvimento de T1D durante 8 semanas.e os regimes de depleção de linfócitos pan-B podem esgotar essas populações protetoras (58). (C) Um total de 1 3 105 linfócitos B CD73 + ou CD732 purificados de camundongos NOD tratados com veículo ou DIDS (n = 6 repetições biológicas por grupo) foram cultivados durante 3 d com LPS a 10 mg / ml e o sobrenadante de cultura IL -10 foram medidos por ELISA. FIGURA 10. direcionados ao eixo AID / RAD51. estes estudos mostram que o bloqueio genético ou farmacológico de processos de afinidade de linfócitos B em ratinhos NOD conduz a desvio para um fenótipo regulador de CD73 + capaz de inibir o desenvolvimento autoimune de T1D.0 3 105 células NOD T foi marcado com Cell Proliferation Dye eFluor 670 e co-cultivado durante 4 d com 1. pode finalmente representar uma abordagem de intervenção de doença clinicamente traduzível. A supressão in vitro mediada por CD73 e os dados de produção de IL- 10 apresentados são combinados a partir de duas experiências individuais.03 105 CD73 + ou CD732 B linfócitos de pool de bovinos tratados com veículo (n = 6 repetições biológicas) ou DIDS (N = 6 repetições biológicas) sob condições de estimulação consistindo em anti-CD40 solúvel (5 mg / ml) e anti-CD28 solúvel (2 mg / ml) com anti-CD40 solúvel (1 mg / ml) 0 (linha de base) ou AMP 10 mM na presença ou ausência de APCP 100 mM. Além disso. o direccionamento farmacológico do RAD51 para bloquear a actividade dos linfócitos B diabetogénicos. também representa uma melhoria significativa em relação a estratégias anteriores de intervenção de doença alvo de linfócitos B. O valor de p do estudo de incidência foi calculado utilizando a análise de Mantel-Cox. Os linfócitos B CD73 + em ratinhos tratados com DIDS são supressores de T1D. quer através do aumento da produção de adenosina quer através da administração de agonistas A2aR. NOD fêmeas camundongos foram tratados semanalmente com 50 mg / kg DIDS ou veículo de 8 a 16 semanas de idade. de que futuros agentes farmacêuticos clinicamente aplicáveis. (B) Um total de 1. linfócitos B esgotados CD73 de ratinhos tratados com DIDS (CD732 DB) ou linfócitos B totais de ratinhos tratados com DIDS ). esta via também poderia representar um alvo imunomodulador potencial clinicamente relevante para o tratamento de várias outras doenças auto-imunes. Estes estudos também indicam que é necessária mais investigação sobre o papel da via imunorreguladora purinérgica na patogénese T1D. esses estudos iniciais revelam que o direcionamento . A análise de Mann-Whitney foi realizada para a produção de IL-10. Nossos resultados fornecem a primeira indicação. Por conseguinte. Como RAD51 é um complexo multiproteico. poderiam converter alguns linfócitos B em um fenótipo regulador CD73 + protetor de T1D. Em resumo. mesmo quando iniciada num estádio de desenvolvimento T1D autoanticorpo tardio tardio. (A) NOD scid receptores foram infundidos com 2 3 106 células T esplênicas purificadas de dadores tratados com veículo misturadas com um número igual de linfócitos B esplénicos purificados do veículo (Total VB). Além disso. A identificação e uso de agentes farmacológicos que bloqueiam potencialmente a atividade da AID como uma nova abordagem de intervenção T1D também devem ser explorados. Todos os gráficos de barras mostram média 6 SEM. ao nosso conhecimento. directamente ou convertendo-os num estado imunorregulador. Juntos. uma vez que esta terapia imunomoduladora mantém a sua eficácia. Quantificação da percentagem de supressão da linha de base.

Divulgações K. do serviço de Citometria de Fluxo e da Research Animal Facility. . Inc.D. Agradecimentos Agradecemos ao pessoal do grupo de Genome Technologies do Laboratório Jackson. K...terapêutico do eixo AID / RAD51 nos linfócitos B é uma área de pesquisa não realizada anteriormente para o desenvolvimento da terapia T1D. US20130184342 A1: "Métodos e composições para tratamento de cancro e doença autoimune".M. Londres. pelo apoio técnico.D. Contêm a Patente dos Estados Unidos No. Também agradecemos Susanne Sattler (Imperial College.M.G. do grupo de Tecnologias de Engenharia Genética. Reino Unido) para revisão crítica do manuscrito. é um fundador e accionista em Cyteir Therapeutics.M.L.H. e C. Os outros autores não têm conflitos de interesses financeiros. M.