You are on page 1of 106

DESARROLLO DE UNA FERMENTACION ALCOHOLICA A PH REGULADO Y TEMPERATURA DE 25°C EN EL BIORREACTOR BIOFLO 3000 M1227 Y ESTUDIO INICIAL DE FERMENTACIONES EN SISTEMA CONTINUO

GABRIEL MAURICIO RAMIREZ NIETO JULIAN FELIPE PEDROZA FLOREZ

Proyecto de grado para optar por el título de Ingeniero de Producción Agroindustrial

Director BERNADETTE KLOTZ Bióloga

ROSA ERLIDE PRIETO Química

UNIVERSIDAD DE LA SABANA

FACULTAD DE INGENIERIA DE PRODUCCION AGROINDUSTRIAL

BOGOTA, D.C.

2001

Nota de aceptación

________________________________

________________________________

________________________________

________________________________ Presidente del Jurado

________________________________

Jurado

________________________________

Jurado

Bogotá D.C, 16 de Julio del 2001

A mis Padres por su paciencia y colaboración durante estos dos años. Julián Pedroza

A mis Padres, mi hermana y mi esposa Vilma y mis hijos. Mauricio Ramírez

AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan sus agradecimientos a:

La Doctora Bernadette Klotz y la Doctora Erlide Prieto, directoras del presente proyecto,

por

su

valiosa

colaboración

y

orientación

para

el

desarrollo

del

mismo.

CONTENIDO

Pág

RESUMEN ---------------------------------------------------------------------------- XIV INTRODUCCION --------------------------------------------------------------------- XV

  • 1. OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------- 16

    • 1.1 GENERAL -------------------------------------------------------------------------- 16

    • 1.2 ESPECÍFICOS--------------------------------------------------------------------- 16

      • 2. REVISION BIBLIOGRAFICA---------------------------------------------------- 17

        • 2.1 CONDICIONES DE LA FERMENTACION ALCOHOLICA

EN

EL

CRECIMIENTO

DE

LA

LEVADURA

SACCHAROMYCES

CEREVISIAE --------------------------------------------------------------------------- 17

  • 2.1.1 Biología de las fermentaciones ------------------------------------------------------------ 17

    • 2.1.1.1 Glucólisis -------------------------------------------------------------------------------------- 17

    • 2.1.1.2 Ciclo de crecimiento de microorganismos-------------------------------------------- 21

      • 2.1.2 Requerimientos nutricionales de la levadura------------------------------------------- 22

        • 2.1.2.1 Substratos utilizados como fuente de carbono-------------------------------------- 23

        • 2.1.2.2 Substratos utilizados como fuente de nitrógeno------------------------------------ 23

          • 2.1.3 Condiciones de la fermentación ----------------------------------------------------------- 24

            • 2.2 VARIABLES QUE AFECTAN LA FERMENTACION ALCOHOLICA 25

              • 2.2.1 Temperatura ------------------------------------------------------------------------------------ 25

              • 2.2.2 pH-------------------------------------------------------------------------------------------------- 26

                • 2.2.2.1 Ajuste del pH --------------------------------------------------------------------------------- 27

                • 2.2.2.2 Buffers ----------------------------------------------------------------------------------------- 27

Contenido

VI

  • 2.2.3 Aireación ----------------------------------------------------------------------------------------- 28

    • 2.3 BIORREACTORES ------------------------------------------------------------------------- 28

      • 2.3.1 Monitoreo y control de biorreactores ----------------------------------------------------- 28

      • 2.3.2 Monitoreo de la fermentación -------------------------------------------------------------- 29

      • 2.3.3 Retroalimentación ----------------------------------------------------------------------------- 30

        • 2.4 CULTIVOS CONTINUOS ---------------------------------------------------------------- 30

          • 2.4.1 Diferencias entre cultivo continuo y discontinuo --------------------------------------- 32

          • 2.4.2 Cinética del cultivo continuo----------------------------------------------------------------- 32

            • 3. MATERIALES Y METODOS ------------------------------------------------------------- 35

              • 3.1 PROCEDIMIENTO -------------------------------------------------------------------------- 35

              • 3.2 DISEÑO EXPERIMENTAL -------------------------------------------------------------- 36

                • 3.2.1 Diagramas de flujo ---------------------------------------------------------------------------- 36

                  • 3.2.1.1 Pruebas preliminares ---------------------------------------------------------------------- 36

                  • 3.2.1.2 Pruebas en el Bioflo ------------------------------------------------------------------------ 36

                    • 3.2.2 Preparación de los medios de cultivo para pruebas preliminares ---------------- 37

                    • 3.2.3 Esterilización de los erlenmeyer y adecuación de los medios de cultivo ------- 38

                    • 3.2.4 Activación e inoculación de la levadura ------------------------------------------------- 38

                    • 3.2.5 Variables a medir durante la fermentación preliminar ------------------------------- 39

                      • 3.2.5.1 pH ----------------------------------------------------------------------------------------------- 39

                      • 3.2.5.2 Número de microorganismos ------------------------------------------------------------ 39

                      • 3.2.5.3 Sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa--------------------------------- 39

                        • 3.2.6 Análisis de los datos obtenidos en las pruebas preliminares---------------------- 39

                        • 3.2.7 Pruebas preliminares en el Bioflo --------------------------------------------------------- 39

                        • 3.2.8 Fermentación alcohólica en el Bioflo----------------------------------------------------- 40

                        • 3.2.9 Fermentación alcohólica sin regulación de pH ---------------------------------------- 40

                          • 3.2.10 Diagrama de flujo de puesta en marcha de una fermentación en el Bioflo--- 40

                          • 3.2.11 Reproducibilidad de la fermentación alcohólica en el Bioflo --------------------- 41

                            • 3.2.11.1 Variables a medir durante la fermentación ----------------------------------------- 41

                            • 3.2.11.2 Técnicas utilizadas------------------------------------------------------------------------ 42

Contenido

VII

3.2.12 Pruebas preliminares para trabajo de cultivos continuo--------------------------- 42

  • 3.3 MATERIALES Y METODOS------------------------------------------------------------ 42

    • 3.3.1 Método Kjeldahl para la determinación de nitrógeno total-------------------------- 42

      • 3.3.1.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 42

      • 3.3.1.2 Reacciones que se presentan ----------------------------------------------------------- 43

      • 3.3.1.3 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 43

      • 3.3.1.4 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 43

      • 3.3.1.5 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 44

      • 3.3.1.6 Cálculo y expresión de los resultados------------------------------------------------- 45

        • 3.3.2 Método para la determinación de azúcares reductores por titulación

de Lane y Enyon --------------------------------------------------------------------------------------- 45

  • 3.3.2.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 45

  • 3.3.2.2 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 46

  • 3.3.2.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 46

  • 3.3.2.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 47

  • 3.3.2.5 Cálculo y expresión de los resultados------------------------------------------------- 48

    • 3.3.3 Determinación del número de microorganismos por recuento en cámara

de conteo Neubauer Improved --------------------------------------------------------------------- 48

  • 3.3.3.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 48

  • 3.3.3.2 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 49

  • 3.3.3.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 49

  • 3.3.3.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 49

  • 3.3.3.5 Cálculo y expresión de los resultados------------------------------------------------- 49

    • 3.3.4 Método para la determinación del contenido alcohólico de etanol por

el método de destilación simple ------------------------------------------------------------------- 50

  • 3.3.4.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 50

  • 3.3.4.2 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 50

  • 3.3.4.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 50

  • 3.3.4.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 50

    • 3.3.5 Determinación de sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa ------------ 51

      • 3.3.5.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 51

Contenido

VIII

  • 3.3.5.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 51

  • 3.3.5.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 51

    • 4. PRESENTACIÓN DE RESULTADOS ---------------------------------------- 53

      • 4.1 GUIA DE MANEJO DEL SISTEMA DE BOMBAS

PERISTÁLTICAS ---------------------------------------------------------------------- 53

  • 4.1.1 Configuración de sistema de bombas peristálticas para control de pH -------- 55

    • 4.2 RESULTADOS DE FERMENTACIONES PRELIMINARES ------------- 56

      • 4.2.1 Porcentajes de variación de pH para los medios semisintético y natural ------ 57

        • 4.3 RESULTADOS DE PRUEBAS PRELIMINARES EN EL BIOFLO ---- 57

          • 4.3.1 Determinación de velocidad de agitación para una fermentación alcohólica-- 57

          • 4.3.2 Determinación de la concentración de ácido y base--------------------------------- 58

          • 4.3.3 Fermentación preliminar en el Bioflo ----------------------------------------------------- 58

            • 4.4 ESTANDARIZACION DE METODOLOGIAS ----------------------------------- 58

              • 4.4.1 Calibración de método de determinación de nitrógeno total----------------------- 59

                • 4.4.1.1 Curva de calibración del método Kjeldahl con urea ------------------------------- 59

                • 4.4.1.2 Curva de calibración para etapa de destilación y titulación---------------------- 60

                  • 4.4.2 Calibración del método de determinación de azúcares reductores

por titulación de Lane y Enyon --------------------------------------------------------------------- 62

  • 4.5 RESULTADOS DE LAS FERMENTACIONES ALCOHOLICAS

EN EL BIOFLO -------------------------------------------------------------------------------------- 63

  • 4.5.1 Datos de crecimiento de microorganismos --------------------------------------------- 63

  • 4.5.2 Datos de contenido de nitrógeno total en la biomasa-------------------------------- 65

  • 4.5.3 Datos de sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa----------------------- 66

  • 4.5.4 Datos de azúcares reductores residuales y contenido de etanol----------------- 66

  • 4.5.5 Volúmenes consumidos de ácido y base por el sistema de regulación

de pH------------------------------------------------------------------------------------------------------ 67

  • 4.5.6 Variación de pH en las fermentaciones sin control de pH -------------------------- 68

    • 5. DISCUSION DE RESULTADOS ------------------------------------------------------- 69

Contenido

IX

  • 5.1 SELECCION DE MEDIO DE CULTIVO CON MAYOR

RANGO DE FLUCTUACION DE PH ----------------------------------------------------- 69

  • 5.2 ANALISIS DE LAS PRUEBAS PRELIMINARES EN EL BIOFLO ---- 70

  • 5.3 ANALISIS DE METODOLOGIAS ESTANDARIZADAS -------------------- 70

    • 5.3.1 Análisis de la estandarización del método de determinación de

nitrógeno total------------------------------------------------------------------------------------------- 70

  • 5.3.2 Análisis de la estandarización del método de determinación de

azúcares reductores residuales-------------------------------------------------------------------- 71

  • 5.4 ANALISIS DE FERMENTACION CON REGULACION DE PH

RESPECTO A UNA FERMENTACION SIN REGULACION DE PH------- 72

  • 5.4.1 Crecimiento de microorganismos --------------------------------------------------------- 72

  • 5.4.2 Contenido de nitrógeno en la biomasa ------------------------------------------- 73

  • 5.4.3 Sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa ----------------------------------- 76

  • 5.4.4 Azúcares reductores residuales y contenido de etanol ----------------------------- 76

5.4.4.1 Balance de masa de azúcar consumido en las fermentaciones---------------- 77

  • 5.4.5 Comportamiento del pH en fermentaciones sin regulación de pH --------------- 82

    • 5.5 ANALISIS DE LA EVALUACION DE BOMBAS PERISTALTICAS

DEL BIOFLO Y SEGUIMIENTO DE UNA FERMENTACION EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO-------------------------------------------------------------- 82

CONCLUSIONES-------------------------------------------------------------------------------------- 85

RECOMENDACIONES------------------------------------------------------------------------------- 87

ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------- 88

BIBLIOGRAFÍA --------------------------------------------------------------------------------------- 105

LISTA DE TABLAS

Pág Tabla 2.1 Requerimientos de nutrientes ---------------------------------------------------------23 Tabla 2.2 Composición del extracto de levadura producido mediante autólisis------- 24 Tabla 2.3 Parámetros medidos o controlados en biorreactores -------------------------- 29 Tabla 3.1 Normas y métodos utilizados--------------------------------------------------------- 35 Tabla 3.2 Medio de cultivo semisintéticos------------------------------------------------------ 37 Tabla 3.3 Medio de cultivo naturales------------------------------------------------------------- 38 Tabla 4.1 Ciclo de funcionamiento de bombas peristálticas------------------------------- 54 Tabla 4.2 Caudales de bombas peristálticas para flujos de entrada y salida empleando tubo de silicona de 1/8”--------------------------------------------------------------- 55 Tabla 4.3 Resultados para medio semisintético ----------------------------------------------- 56 Tabla 4.4 Resultados para medio natural ------------------------------------------------------ 56 Tabla 4.5 Porcentajes de variación de pH------------------------------------------------------ 57 Tabla 4.6 Resultados de volúmenes consumidos de ácido y base, y tiempo de operación a diferentes velocidades de agitación-------------------------------- 57 Tabla 4.7 Resultados de volúmenes consumidos de ácido y base, y tiempo de operación a diferentes concentraciones ------------------------------------------- 58 Tabla 4.8 Resultados de calibración para método total de Kjeldahl--------------------- 59 Tabla 4.9 Resultados para etapa de destilación y titulación del método Kjeldahl --------------------------------------------------------------------------------------------------- 61 Tabla 4.10 Resultados de calibración para método de determinación de azúcares reductores----------------------------------------------------------------------------------- 62 Tabla 4.11 Resultados de crecimiento de microorganismos ------------------------------ 64 Tabla 4.12 Resultados de contenido de nitrógenos celular por mililitro ---------------- 65 Tabla 4.13 Resultados de toma de °Brix a 20 °C--------------------------------------------- 66 Tabla 4.14 Resultados de determinación de azúcares reductores residuales-------- 67

Lista de Tablas

XI

Tabla 4.15 Resultados de contenido de etanol ----------------------------------------------- 67 Tabla 4.16 Variación de pH en una fermentación sin control de pH -------------------- 68 Tabla 5.1 Porcentajes de error del método de determinación de nitrógeno total en diferentes estandarizaciones realizadas---------------------------------------------------- 71 Tabla 5.2 Mayor crecimiento de microorganismos en fermentaciones en el Bioflo ----------------------------------------------------------------------------------------------- 72 Tabla 5.3 Mayor contenido de nitrógeno en fermentaciones en el Bioflo -------------- 73 Tabla 5.4 Rangos de contenido de nitrógeno por célula ----------------------------------- 74 Tabla 5.5 Rangos de porcentaje peso a peso de nitrógeno por célula ----------------- 75 Tabla 5.6 Balance de azúcares en fermentaciones en el Bioflo para 10 litros de medio ------------------------------------------------------------------------------- 79 Tabla 5.7 Porcentajes de consumo de azúcares en diferentes fermentaciones en el Bioflo ------------------------------------------------------------------------- 80 Tabla 5.8 Valores de s e y x e a diferentes valores de tasa de dilución y µmax para una fermentación en sistema continuo. ---------------------------------------- 84

LISTA DE FIGURAS

Pág Figura 2.1 Secuencia de la glucólisis ------------------------------------------------------------ 19

Figura 2.2 Vía anaerobia de la glucólisis ------------------------------------------------------- 20

Figura 2.3 Vía aeróbica de la glucólisis --------------------------------------------------------- 20

Figura 2.4 Relación de concentración de substrato y velocidad

específica de crecimiento de un microorganismo --------------------------------------------- 21

Figura 2.5 Curva de crecimiento típica de una población celular ------------------------ 22

Figura 2.6 Componentes del retroalimentador ------------------------------------------------ 30

Figura 2.7 Efectos de la tasa de dilución y concentración de substrato

en un quimiostato -------------------------------------------------------------------------------------- 31

LISTA DE ANEXOS

Pág Anexo A Datos de fermentaciones preliminares----------------------------------------------- 88

Anexo B Datos de fermentaciones en el Bioflo ------------------------------------------------ 90

Anexo C Datos del seguimiento de una fermentación con flujos de

entrada y de salida ------------------------------------------------------------------------------------ 94

Anexo D Sistema de bombas peristálticas del Bioflo 3000 M1227--------------------- 100

RESUMEN

En la línea de investigación de fermentación, se continuó con el conocimiento en el manejo y funcionamiento del biorreactor; este trabajo presentó un aporte complementario enfocado a la evaluación del sistema de regulación de pH y su incidencia en el desarrollo de una fermentación alcohólica. Para establecer la influencia de la variable pH se determinó parámetros como crecimiento de microorganismos, contenido de nitrógeno, consumo de sólidos solubles totales, contenido de sacarosa, contenido de etanol y contenido de azúcares residuales, comparando una fermentación con regulación de pH contra una sin regulación, presentando mejor rendimiento al controlar el pH. Para el estudio inicial de fermentaciones en sistema continuo, el biorreactor presentó inconsistencias en los flujos que no permitieron desarrollar dicho proceso.

Abstract: The purpose of this project was to establish the effect of a regulated pH on an ethanolic fermentation at 25°C. Also, through this study it was want to complete instruction manual of the biorreactor Bioflo. Following parameters were determined during the growth of Saccharomyces cerevisiae in a system with controlled and non controlled pH: total nitrogen content, growth of microorganism, consumption of total soluble solids, sucrose content, ethanol content and residual sugars content. In addition, initial steps for the establishment of a continuos culture realized.

INTRODUCCION

La facultad de Ingeniería de la Universidad de La Sabana adquirió un biorreactor para investigación en el área de fermentaciones y como apoyo en la formación académica. Los trabajos anteriormente realizados en el Bioflo se centraron en establecer una guía de manejo y funcionamiento de éste, determinando la precisión y la reproducibilidad de fermentaciones alcohólicas a temperatura constante de 30 °C y 25 °C. El presente trabajo es un complemento al manejo del biorreactor, en el cual se evalúa el sistema de regulación de pH y los sistemas continuos de cultivo, brindando un aporte al protocolo de operación del equipo.

El monitoreo y control de una fermentación es un área activa de investigación que busca mejorar la eficacia de los bioprocesos, alcanzando uniformidad y confiabilidad en el proceso de fermentación. La variable pH es de gran importancia ya que afecta al proceso fermentativo de diversas maneras, produciendo reacciones no deseadas, inhibiendo la actividad enzimática de las levaduras y formando productos no esperados en el proceso de fermentación. Es por esto que el trabajo está orientado al manejo y funcionamiento del biorreactor en el desarrollo de una fermentación alcohólica a pH regulado y temperatura óptima de 25 °C para el crecimiento de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Con el fin de medir la reproducibilidad de esta fermentación se realiza el seguimiento de parámetros tales como crecimiento de microorganismos, contenido de nitrógeno en la biomasa, consumo de sacarosa, variación de sólidos solubles, contenido de azúcares reductores residuales y contenido de etanol.

Adicionalmente se continuó con la estandarización de los métodos analíticos aceptados internacionalmente a las condiciones del laboratorio de investigación de la Facultad. Se han realizado nuevas adquisiciones de equipos, que ofrecen mejor exactitud y precisión en los análisis, como lo es la determinación de contenido de nitrógeno total en una muestra. A la vez se empleo el método de titulación de Lane y Enyon, alternativo para determinación de azúcares reductores residuales diferente al método colorimétrico empleado en las anteriores investigaciones.

Como parte principal de la guía complementaria de manejo y funcionamiento del Bioflo, se encuentra la configuración de los sistemas de bombas peristálticas, necesarias para

controlar variables

como

pH

en

una fermentación

alcohólica

y

dar

pie

al

uso

del

biorreactor en sistema continuo, lo cual se evaluó de manera preliminar en el presente

trabajo y servirá para el que desee profundizar las investigaciones realizadas por la

facultad de Ingeniería

en

la

línea de fermentación.

CAPITULO 1

OBJETIVOS

  • 1.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar una fermentación alcohólica a pH regulado y temperatura constante en el Bioflo y realizar un estudio preliminar de fermentaciones en sistema continuo.

  • 1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

Determinar mediante fermentaciones alcohólicas preliminares, qué medio de cultivo, semisintético o natural, presenta un mayor rango de variación de pH.

Determinar la concentración necesaria de ácido y base a ser utilizada en la regulación de pH y configurar de manera preliminar los sistemas de bombas peristálticas del Bioflo.

Determinar la reproducibilidad de una fermentación alcohólica en el biorreactor a pH constante y temperatura de 25 °C. Establecer una guía de manejo y funcionamiento del sistema de bombas peristálticas del biorreactor en una fermentación alcohólica utilizando el sistema de regulación de pH. Realizar pruebas iniciales para el manejo del Bioflo en cultivos continuos

CAPITULO 2

REVISION BIBLIOGRAFICA

En éste capítulo se presenta el marco teórico para el desarrollo del siguiente trabajo. Básicamente se hace una revisión sobre la fermentación alcohólica, variables que afectan la fermentación, el funcionamiento de un Biorreactor y la teoría básica sobre fermentaciones en sistema continuo.

2.1 CONDICIONES DE LA FERMENTACION ALCOHOLICA EN EL CRECIMIENTO DE LA LEVADURA SACCHAROMYCES CEREVISIAE.

La fermentación en gran escala puede llevarse a cabo mediante el uso de hongos, levaduras o bacterias, pero las levaduras son las más utilizadas por su papel en la fabricación de bebidas alcohólicas. Son los microorganismos que más se usan en la bioindustria, se pueden cultivar por las células mismas y por los productos finales que se producen durante la fermentación alcohólica.

La producción de alcohol por levadura se realiza por una fermentación alcohólica anaeróbica, del cual resulta un rendimiento menor de células, pero cantidades satisfactorias de alcohol y CO 2 .

Durante los primeros días del proceso de fermentación, las células de levadura crecen por respiración consumiendo oxigeno y creando un medio anaerobio. Tan pronto como él oxigeno desaparece se inicia la fermentación, produciendo alcohol. La levadura pasa de metabolismo aerobio al anaerobio.

La tolerancia al alcohol depende, además de las características genéticas de la cepa, de diversos factores ambientales como la concentración de azúcares en el medio desde el inicio de la fermentación y en fases posteriores, temperatura, pH y de manera importante la concentración del etanol en las diferentes etapas de la fermentación.

2.1.1 Biología de las fermentaciones.

Aproximadamente el 96% de la producción del etanol mediante fermentación a nivel industrial se lleva a cabo mediante cepas de Saccharomyces cerevisiae. El etanol se produce en la ruta de glucólisis, específicamente en la vía anaeróbica, en la que el piruvato producido se convierte en acetaldehído y etanol. La reacción global es la siguiente:

Glucosa + 2 ADP + 2 Pi

Aproximadamente el 96% de la producción del etanol mediante fermentación a nivel industrial se lleva a

2 Etanol + 2 CO 2 +ATP + Energía

El rendimiento teórico de 1 gramo de glucosa es de 0.51 gramos de etanol y 0.49 gramos de CO 2 . Aproximadamente el 10% de la glucosa se transforma en biomasa y el rendimiento en etanol y CO 2 alcanzan el 90% del valor teórico. El ATP formado se utiliza para las necesidades energéticas de la célula (Owen, 1991, 134).

En cuanto a la estructura celular de la levadura, la envoltura de la célula de levadura incluye una membrana plasmática, un espacio periplásmico y una pared celular constituida principalmente por polisacáridos y una pequeña cantidad de péptidos. La pared tiene una estructura semirrígida permeable al soluto que proporciona a las levaduras una considerable fuerza compresional y tensil.

2.1.1.1 Glucólisis

La glucólisis ejemplifica de que manera los procesos bioquímicos de una célula se desarrollan en pequeños pasos secuenciales, los cuales son catalizados cada uno por una enzima específica. Los primeros pasos de la glucólisis requieren de un ingreso de energía, que es suministrada por el acoplamiento de estos pasos al sistema ATP/ADP. La secuencia completa comienza con una molécula de glucosa. Se invierte energía en los pasos 1 y 3 por transferencia, en cada paso, de un grupo fosfato desde una molécula de ATP a la molécula de azúcar. La molécula de 6 carbonos, proveniente de la glucosa presenta la lisis en el paso 4 y a partir de este paso en adelante la secuencia produce energía. Cabe anotar que en este paso se producen 2 moléculas de gliceraldehído fosfato que en el paso final producirá las dos moléculas de ácido pirúvico. En los pasos 6 y 9 las moléculas de ADP toman energía del sistema, fosforilándose a ATP. De esta forma la molécula de glucosa se ha convertido en dos moléculas de ácido pirúvico. La ganancia neta de energía son dos moléculas de ATP y dos moléculas de NADH por molécula de glucosa.

El ácido pirúvico obtenido en la glucólisis puede seguir dos vías. Una vía es aeróbica (respiración) y la otra es anaeróbica (fermentación). La vía aeróbica es la vía principal del metabolismo energético de las levaduras en presencia de oxígeno y la vía anaeróbica es la vía fermentativa que funciona en ausencia de un aceptor externo de electrones. En ausencia del oxígeno el ácido pirúvico se convierte en etanol.

La siguiente gráfica muestra las dos etapas de la glucólisis; La primera etapa usa ATP y la segunda produce ATP y NADH.

Figura 2.1 Secuencia de la glucólisis

Figura 2.1 Secuencia de la glucólisis Fuente: CURTIS, Helena. Biología. • Vía anaeróbica o fermentación: Los

Fuente: CURTIS, Helena. Biología.

Vía anaeróbica o fermentación: Los pasos por los cuales el ácido pirúvico, formado por la glucólisis, se convierte anaerobiamente en etanol. En el primer paso se desprende CO 2 . En el segundo, se oxida el NADH y se reduce el acetaldehído. La mayoría de la energía potencial de la glucosa permanece en

el alcohol, que es el producto final de la secuencia. Se producen 2 moléculas de etanol más 2 moléculas de CO 2 a partir una molécula de glucosa.

Glucosa Figura 2.2 Vía anaerobia de la glucólisis

el alcohol, que es el producto final de la secuencia. Se producen 2 moléculas de etanol

2 Etanol + 2 CO 2

el alcohol, que es el producto final de la secuencia. Se producen 2 moléculas de etanol

Fuente: CURTIS, Helena. Biología.

Vía aeróbico o respiración: En presencia de oxígeno, la siguiente etapa de la degradación de la glucosa implica la oxidación progresiva del ácido pirúvico a CO 2 y agua, proceso conocido como respiración. El paso previo es la oxidación del ácido pirúvico a un grupo acetilo de dos carbonos que se combina con la coenzima A para formar el acetilCoA. El acetilCoA entra en el ciclo de Krebs que es el siguiente paso de la respiración, en el cual los carbonos donados por el grupo acetilo se oxidan a CO 2 y los átomos de hidrógeno pasan a los transportadores de electrones. Lo mismo que en la glucólisis, en cada paso interviene una enzima específica.

Figura 2.3 Vía aeróbica de la glucólisis

el alcohol, que es el producto final de la secuencia. Se producen 2 moléculas de etanol

Fuente: CURTIS, Helena. Biología

La secuencia respiratoria completa es:

Glucosa + 6 O 2

6 CO 2 + 6 H 2 O + Energía

La secuencia respiratoria completa es: Glucosa + 6 O 6 CO + 6 H O +
  • 2.1.1.2 Ciclo de crecimiento de microorganismos

Una población de microorganismos presenta generalmente un patrón de crecimiento característico cuando se inocula en un medio de cultivo fresco.

Fase de retraso: En esta fase las células se ajustan a las nuevas condiciones. Si un cultivo que crece exponencialmente es inoculado al mismo medio bajo las mismas condiciones de crecimiento, no se observa fase de retraso y el crecimiento exponencial continua a la misma velocidad.

Fase exponencial: Es la etapa en la cual la velocidad de crecimiento de las células aumenta progresivamente. Transcurrido un periodo de tiempo, las células crecen a una velocidad máxima constante y no dependen de la concentración de substrato. La siguiente gráfica ilustra este comportamiento.

Figura 2.4 Relación de concentración de substrato y velocidad específica de crecimiento de un microorganismo

La secuencia respiratoria completa es: Glucosa + 6 O 6 CO + 6 H O +

Fuente: TREVAN, M. Biotecnología: principios biológicos.

La zona B a C equivale a la fase exponencial del cultivo, con substrato en exceso y un crecimiento a una velocidad máxima constante. La zona A a B corresponde a la desaceleración de la velocidad de crecimiento, desde el final de la fase exponencial hasta el inicio de fase estacionaria.

En la fase exponencial, el comportamiento del crecimiento de un microorganismo en un cultivo puede describirse mediante la siguiente ecuación:

donde:

N t = N 0 x 2 n

N t es número de células en un tiempo t N 0 es el número de células inoculadas n es el número de generaciones al tiempo t

Fase estacionaria: Lo que limita el crecimiento en esta fase es que alguno de los nutrientes indispensables se agota o algún producto de desecho fabricado en el medio llega a un nivel en el que es inhibidor y cesa el crecimiento exponencial. En la fase estacionaria no hay incremento ni decremento en la cantidad de células, pero muchas de las funciones celulares pueden continuar, incluyendo el metabolismo energético y la producción de metabolitos secundarios.

Fase de muerte: Después de alcanzar la fase estacionaria y continuar con la incubación de las células, estas pueden seguir vivas y continuar metabolizando, pero lo más probable es que mueran. En algunos casos, la muerte se acompaña por lisis celular, dando a lugar a disminución en el conteo microscópico directo junto con la disminución del conteo de viabilidad.

Gráficamente, en escala semilogarítmica se observa el comportamiento típico del crecimiento de una población de microorganismos. Figura 2.5 Curva de crecimiento típica de una población celular

• Fase estacionaria: Lo que limita el crecimiento en esta fase es que alguno de los

Fuente: BROCK, T. Microbiología.

  • 2.1.2 Requerimientos nutricionales de la levadura

Los

microorganismos se

cultivan

en

agua,

a

la

que

se

le

han añadido los

nutrientes apropiados. La solución acuosa que contiene los nutrientes necesarios

se denomina medio de cultivo. Lo nutrientes existentes en el medio de cultivo dan a la célula microbiana todos los ingredientes requeridos para que produzca más células semejantes a ella misma. Además de las fuentes de energía, que pueden ser substancias orgánicas o inorgánicas, o luz, el medio de cultivo debe de tener fuentes de carbono, de nitrógeno y macro y micro nutrientes respectivos.

Un medio de cultivo óptimamente equilibrado es obligatorio para considerar la máxima producción. La composición de los medios de cultivo debe ser constantemente adaptada a los procesos de fermentación. En general los requerimientos básicos de nutrientes para los microorganismos y las formas comunes de satisfacerlos en los cultivos se enuncian en la siguiente tabla.

Tabla 2.1 Requerimientos de nutrientes

NUTRIENTE

FORMA QUIMICA SUMINISTRADA AL MEDIO DE CULTIVO

CARBONO

GLUCOSA, ACETATO, PIRUVATO, MEDIOS COMPLEJOS COMO EXTRACTO DE LEVADURA, PEPTONA

NITROGENO

ORGANICOS: AMINOACIDOS Y BASES NITRGENADAS, INORGANICOS: KNO 3 , (NH 4 ) 2 SO 4 ,

FOSFORO

Na 2 HPO 4 , KH 2 PO 4

AZUFRE

Na 2 SO 4 , H 2 S

POTASIO

KCL, K 2 HPO 4

MAGNESIO

MGSO 4 , MgCL 2

SODIO

NaCl

HIERRO

QUELATOS DE HIERRO, FeCl 3

MICRONUTRIENTES

MnSO 4 , CuCl 2 , ZnCl 2 , CoCl 2 , NiCl 2 , Na 2 MoO 4 , Na 2 Se 4

Fuente: BROCK, T. Microbiología

  • 2.1.2.1 Substratos utilizados como fuente de carbono

Los carbohidratos son tradicionalmente las fuentes de energía en la industria de la fermentación. Por razones económicas la glucosa o la sacarosa puras rara vez son utilizadas como única fuente de carbono, excepto en los procesos que exigen el control exacto de la fermentación. La melaza, el extracto de malta, el almidón, las dextrinas, la celulosa y los aceites vegetales son utilizados comúnmente como fuentes de carbono en diversos procesos fermentativos.

2.1.2.2

Substratos utilizados como fuente de nitrógeno

Muchos procesos a gran escala utilizan amonio, sales, urea o amonio gaseoso como fuente de nitrógeno. Una fuente de nitrógeno que es metabolizada eficientemente es el líquido de maceración del maíz, que se forma durante la formación de almidón a partir de maíz. Los extractos de levadura son excelentes substratos para muchos microorganismos. El extracto de levadura contiene aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en agua y carbohidratos. Las peptonas pueden ser utilizadas por muchos microorganismos pero son relativamente caras para la aplicación industrial. Las fuentes de peptonas incluyen la carne, la caseina, la gelatina, la queratina, las semillas de maní, la harina de soya, las semillas de algodón y las semillas de girasol.

El extracto de levadura es medio complejo

y su composición se presenta a

continuación. Tabla 2.2 Composición del extracto de levadura producido mediante autólisis

 

COMPOSICIÓN (%)

MATERIA SECA

70

NITROGENO TOTAL

8.8

PROTEINA (N * 6.25)

55

AMINOACIDOS

38.4

CONTENIDO EN VITAMINAS (ppm)

TIAMINA

20-30

RIVOFLAVINA

50-70

PIRIDOXINA

25-35

ACIDO PANTOTENICO

200

NIACINAMINDA

600

Fuente: CRUEGER, W. Biotecnología: Manual de microbiología industrial.

El extracto de levadura al ser un medio complejo, provee de la mayoría de los factores potenciales de crecimiento, factores que consisten en vitaminas, aminoácidos, purinas y pirimidinas, los cuales no pueden ser sintetizados por algunos microorganismos.

Se establece que los medios de cultivo para llevar a cabo una fermentación alcohólica a nivel laboratorio, que muestran mayor rendimiento son los que utilizan extracto de levadura, acompañado de un complejo vitamínico (Alba y Sierra, 1999,

123)

2.1.3 Condiciones de la fermentación.

En la fermentación alcohólica las levaduras utilizan los azúcares sacarosa, fructosa, maltosa y maltotriosa en este orden. La sacarosa es hidrolizada primeramente por la invertasa localizada en el espacio periplásmico extracelular.

Aunque las fermentaciones alcohólicas son en gran medida anaerobias, las levaduras necesitan algo de oxígeno para sintetizar algunos esteroles y ácidos grasos insaturados.

Muchas cepas de Saccharomyces cerevisiae pueden producir concentraciones de etanol de hasta el 12 % al 14%. Existen cepas seleccionadas capaces de producir hasta un 18% a 20% de alcohol, aunque la velocidad de fermentación se ve fuertemente reducida cuando la concentración de etanol aumenta (Owen, 1991,

136).

En las levaduras, los valores de pH comprendidos entre 3 y 6 son la mayoría de las veces favorables al crecimiento y actividad fermentaria. La velocidad de fermentación aumenta generalmente con la temperatura entre los 15°C y los 35 °C y los niveles de glicerol, acetona, acetaldehído y piruvato se elevan en los medios de fermentación. La formación de niveles elevados de alcohol también depende de la temperatura (Owen, 1991, 136).

En la producción de bebidas alcohólicas deben controlarse las fermentaciones de forma que, por un lado se asimilen los carbohidratos y otros nutrientes y se conviertan en alcohol y en compuestos con aromas característicos y deseables, y por otro lado, se minimice la formación de aromas y sabores indeseables. Entre los componentes del aroma y sabor se encuentran otros alcoholes diferentes del etanol, ésteres, compuestos carbonílicos, ácidos orgánicos, compuestos azufrados, aminas y fenoles.

A medida que la riqueza alcohólica aumenta, la población de otras levaduras que se encuentran en el medio a fermentar decrece y va siendo sustituida como población dominante por la Saccharomyces cerevisiae. Este patrón de sucesión está fuertemente influenciado por las condiciones de fermentación como son la temperatura y el pH; por ejemplo, a una temperatura de 25°C y pH de 3.0 a 3.5, las cepas de Saccharomyces cerevisiae dominan la fermentación y las otras especies mueren. Como también la adición de SO 2 reduce la población de levaduras silvestres en el medio y de esta manera favorece la preponderancia de Saccharomyces cerevisiae, ya que esta especie es más resistente a este biocida (García, 1993, 295).

  • 2.2 VARIABLES

ALCOHOLICA

QUE

AFECTAN

LA

FERMENTACION

La fermentación es un proceso determinante en la composición final del producto fermentado. Son muchos los factores que influyen en el desarrollo de una fermentación: Temperatura, pH y aireación.

2.2.1 Temperatura

La temperatura es el factor de influencia decisiva para las actividades de las levaduras. La temperatura más adecuada para su reproducción y la fermentación

oscila entre 22 °C a 27 °C y se reproduce con mayor rapidez cuando la temperatura es de 25 °C. A temperaturas superiores a 30 °C, las levaduras pierden capacidad para desdoblar los azúcares y al aproximarse a 40 °C dejan de crecer y reproducirse (Alvarez, 1991, 112). En una fermentación alcohólica nunca se debe superar temperaturas de 32 °C durante el periodo fermentativo ya que se corren varios riesgos(Madrid, Marzo de 1991):

Inactivación de las levaduras responsables de la transformación de los azúcares en alcohol y CO 2 . Pérdida de alcohol por evaporación con merma de grado alcohólico. Iniciación de fermentaciones indeseables.

La influencia de la temperatura sobre el poder fermentativo, medida del porcentaje de etanol que una cepa de levadura es capaz de producir, es diferente. Cuando se fermenta a temperatura baja o moderada las fermentaciones son lentas, pero el grado alcohólico alcanzado es generalmente mayor que a temperaturas elevadas o superiores a los 30 °C ó 35 °C (Suárez, 1990, 211).

Además las fermentaciones alcohólicas efectuadas a 25 °C obtienen mejores resultados que las efectuadas a 30 °C ya que:

El crecimiento de microorganismos determinado, muestra que a 25 °C la levadura se desarrolla un 25.5% más que a 30 °C; El consumo de sólidos solubles, sacarosa y grado alcohólico a 25 °C es de 42.8 %, 71.0 % y 7.3 °GL respectivamente mientras que a 30 °C es de 36.4%, 63.8 % y 6.0 °GL(Merchan y Castillo, 1999, 120).

El buen desarrollo de la fermentación esta en parte ligado a la necesidad de evitar que las levaduras sean sometidas a temperaturas demasiado elevadas. La experiencia ha demostrado que son tanto más sensibles a la elevación de temperaturas cuanto más vieja sea la población, lo que constituye una causa de ralentización y a veces de parada de la marcha fermentativa, mientras quedan en el medio azúcares aun no transformados en alcohol.

A partir de 30 °C se puede considerar que las levaduras reducen progresivamente su actividad, hasta cesarla completamente cuando se aproxima a los 40 °C. El hecho de tratar de mantener la temperatura a un nivel razonablemente bajo no aspira solamente a la mayor regularidad de la fermentación y mayor grado alcohólico, si no que tiende a frenar la perdida por volatilización de una fracción importante de compuestos aromáticos (Suárez, 1990, 211).

2.2.2 pH

El crecimiento de la levadura y la velocidad de fermentación no se ve afectado por la variación de pH entre 3.5 y 6.0 en el medio, pero a valores de pH entre 3.05 hasta 3.50 en el medio, se logra alcanzar un máximo de rendimiento de acuerdo a la formación de producto y crecimiento de la levadura (Aleixandre, Noviembre de

1998).

En una fermentación alcohólica, el pH varía normalmente entre un mínimo de 2.8 y un máximo de 3.8, rango que depende básicamente de la composición del medio

a ser fermentado (De Rosa, 1998, 194). Se establece que el pH en valores menores que 3.0 en un proceso fermentativo, se presenta el fenómeno de inhibición por pH, el cual se debe al efecto que esta variable tiene sobre los centro activos de las enzimas. Estos centros presentan actividad en un determinado estado de ionización y este estado varía en función del pH el medio. Por lo tanto, la actividad enzimática es función del número de centros activos y estos, dependen del pH del medio. Por otra parte, este fenómeno puede interpretarse por el importante efecto que el pH del medio tiene sobre la estructura y la permeabilidad de la membrana celular (Revista Alimentación, equipos y tecnología, Junio de 1993).

La marcha fermentativa depende además del pH del medio y los productos que resultan son mejores en cuanto a rendimiento a valores de pH bajos. También el conjunto de las floculaciones coloidales están reguladas por el pH del medio, así como algunas de sus características organolépticas tales como color y sabor.

En la levadura Saccharomyces cerevisiae el crecimiento se da más rápido que en las bacterias a bajos valores de pH, ofreciendo la ventaja de operar una fermentación alcohólica evitando contaminación. Si se utiliza sacarosa como fuente de carbono el sistema es más sensible al pH que al utilizar glucosa, ya que la inversión de la sacarosa se acelera a pH bajos.

El producto final de una fermentación alcohólica esta constituido esencialmente por una solución hidroalcohólica de ácidos orgánicos salificados en distintas proporciones, especialmente de potasio, magnesio y calcio. Esta solución contiene diferentes sustancias, que pueden permanecer en estado de solución verdadera, de solución coloidal o de simple suspensión. Las proporciones de estos constituyentes pueden ser sensiblemente variables entre ellos y esto en función de diversos factores tales como pH. El pH es una característica de primaria importancia, y esto por diferentes motivos. Ante todo organolépticamente el pH influye fuertemente sobre la sensación de acidez, dado que ésta depende más de la concentración hidrogeniónica (fuerza ácida) que de la cantidad de ácidos contenidos. Sobre la formación del fosfato férrico y consiguiente quiebra fosfática tiene fuerte influencia el pH, y se ha podido demostrar que el pH óptimo para el pleno desarrollo de éste fenómeno se sitúa sobre el valor de 3.3. A valores sensiblemente inferiores o superiores el enturbiamiento no aparece. Se puede comprender como las desviaciones de pH pueden hacer aparecer riesgos que no se tenían, hecho que se produce, por ejemplo, a continuación del tratamiento de un vino con un desacidificante o también por la adición directa de un ácido (De Rosa, 1998, 239).

2.2.2.1 Ajuste del pH

Adición de ácido tartárico o de ácido cítrico: Los dos únicos ácidos que se pueden usar tanto tecnológicamente como legalmente, son el ácido tartárico y el cítrico.

Desacidificación:

Los desacidificantes utilizables técnicamente en las

fermentaciones son: el carbonato de calcio, el bicarbonato de potasio y el

tartrato neutro de potasio.

2.2.2.2 Buffers

En los medios de cultivo es deseable mantener un pH constante (rango 3.0 –3.5) durante el proceso fermentativo y esto se logra mediante el empleo de amortiguadores o buffers. También sucede que el pH en un medio de cultivo se ajusta adicionando un compuesto alcalino, por ejemplo hidróxido de sodio si el pH es demasiado ácido; o un compuesto ácido, por ejemplo el ácido clorhídrico, si el pH es demasiado alcalino. Como los microorganismos suelen provocar cambios en el pH de sus ambientes al desarrollarse, lo mejor es adicionar al medio de cultivo un amortiguador de pH, actuando dentro de los límites máximos de pH; por lo tanto, se deben seleccionar amortiguadores para diferentes regiones de pH. Para límites próximos a la neutralidad (pH 6.0 a 7.5) el fosfato constituye un amortiguador apropiado (Brock, 1993, 349). Generalmente los sistemas proteicos de un medio de cultivo permiten un efecto buffer en el mismo.

2.2.3 Aireación

La velocidad de fermentación al inicio del proceso fermentativo, depende estrechamente de las condiciones de aireación, desarrollándose dicha fermentación más rápidamente cuando las levaduras están mejor aireadas. Por lo tanto, es conveniente airear el medio hasta el máximo, máximo que coincidirá con él limite de solubilidad de un gas (oxígeno) en un liquido y que es muy bajo. Por mucho que se airee al principio, se tenderá a alcanzar muy pronto la saturación del mosto en oxígeno.

La utilización del oxígeno por levaduras sólo tiene lugar al comienzo de la fermentación. Una vez arrancada ésta, no necesita oxigenación o de lo contrario se desviaría el proceso alcohólico, y comenzaría entonces la metabolización de los azúcares por vía respiratoria, produciendo mayor cantidad de células.

La fermentación con agitación es ligeramente más rápida que la fermentación sin agitación. A pesar de ello, los niveles finales de etanol y azúcar obtenidos son similares en ambas condiciones de operación, observándose un ligero aumento en el grado alcohólico y el azúcar residual en la fermentación sin agitación (López, Marzo de 1995, 55).

2.3

BIORREACTORES

Son dispositivos para el cultivo de microorganismos que permiten el control tanto de la densidad de la población, como de la velocidad de crecimiento. Su aplicación incluye la preparación de bebidas alcohólicas, como una amplia gama en la industria biotecnológica. Se pueden adaptar para realizar cultivos

discontinuos o continuos. En cultivos discontinuos, el microorganismo crece a partir de una limitada cantidad de medio hasta que se agota un nutriente esencial o se acumulan subproductos tóxicos hasta niveles que inhiben el crecimiento. En cambio en el tipo continuo se emplean dos elementos en su control, la velocidad de flujo y la concentración de un nutriente limitante.

2.3.1 Monitoreo y control de biorreactores

En el ambiente dentro de un biorreactor se debe asignar la óptima actividad catalítica para las levaduras mediante parámetros como temperatura, pH, oxígeno disuelto, velocidad de flujo, velocidad de agitación, que tienen un significativo efecto en el desarrollo de la fermentación y las reacciones enzimáticas. Para proveer el ambiente deseado, las propiedades del sistema deben ser monitoreadas y se deben tomar acciones de control para rectificar cualquier desviación de los valores deseados. El monitoreo y control de las fermentaciones es un área activa de investigación destinada a mejorar la productividad de los bioprocesos y alcanzar una confiable y uniforme operación de fermentación.

Varios niveles de procesos de control existen en la industria de la fermentación. El control manual es el más simple, requiere de operación humana para manipular dispositivos tales como bombas, motores y válvulas. La retroalimentación es usada para mantener parámetros a valores específicos. Con la creciente aplicación de los sistemas de computadoras en la industria de la fermentación, también se quiere apuntar a la implementación de controles avanzados y estrategias de optimización basado en modelos de fermentación.

  • 2.3.2 Monitoreo de la fermentación

Para entender el control del estado de una fermentación se debe conocer las variables críticas que afectan a un bioproceso. Estas variables pueden ser agrupadas en tres categorías: físicas, químicas y biológicas. Muchas de las medidas físicas están establecidas en la industria; otras están actualmente siendo desarrolladas o son foco de investigación para obtener nuevos instrumentos. Idealmente las medidas deben realizarse in situ y en línea. Actualmente el monitoreo en línea tiene aplicación en los siguientes grupos:

Producción de biomasa.

Producción de enzimas microbianas.

Producción de metábolitos microbianos: etanol, ácido cítrico, acetona, butanol, polisacaridos, vitaminas.

Procesos de transformación: glucosa a etanol, etanol a vinagre, producción de antibióticos.

Las medidas que son realizadas en línea generalmente son: temperatura, presión, pH, oxígeno disuelto, velocidad de flujo, velocidad de agitación, consumo de energía, nivel de espuma.

Tabla 2.3 Parámetros medidos o controlados en biorreactores

         

FISICOS

 

QUIMICOS

 

BIOLOGICOS

         

TEMPERATURA, PRESION, NIVEL DE LIQUIDO, NIVEL DE ESPUMA, VELOCIDAD DE AGITACION, CONSUMO DE ENERGIA, VELOCIDAD DE FLUJO DE GAS, VELOCIDAD DE FLUJO DE MEDIO, VISCOSIDAD DEL CULTIVO

 

PH, OXIGENO Y CO 2 DISUELTO, POTENCIAL REDOX, COMPOSICION DE GAS DE SALIDA, CONDUCTIVIDAD, COMPOSICION DEL MEDIO

 

CONCENTRACION DE BIOMASA, CONCENTRACION DE ENZIMAS, COMPOSICION DE BIOMASA(ADN, ARN, PROTEINA, ATP/ADP/AMP/NAD), MORFOLOGIA.

FUENTE: DORAN, Pauline. Bioprocess Engineering principies.

2.3.3 Retroalimentación

Cuando se necesita mantener el valor de una variable constante durante el proceso, por ejemplo el pH a un valor dado, se tienen diferentes sistemas controladores. Uno de los controladores más simples es el de retroalimentación, el cual consta de un aparato de medición (potenciómetro) que envía el valor de la medición al controlador. En el controlador el valor medido es comparado con el valor establecido o fijo y se registra la diferencia. La desviación con respecto al valor real se llama error, el cual es usado por el controlador para determinar que acción debe seguir para corregir el proceso. El controlador produce una señal la cual es transmitida al ejecutar encendiéndolo o apagándolo; Para el caso del pH, si la medida baja del punto determinado, una bomba adiciona álcali a la fermentación hasta retornar el valor de pH requerido.

Figura 2.6 Componentes del retroalimentador

Tabla 2.3 Parámetros medidos o controlados en biorreactores FISICOS QUIMICOS BIOLOGICOS TEMPERATURA, PRESION, NIVEL DE LIQUIDO,

FUENTE: DORAN, Pauline. Bioprocess Engineering principles.

  • 2.4 CULTIVOS CONTINUOS

Si se prepara un cultivo de tal forma que el cese del crecimiento se deba al agotamiento del medio, es decir, limitación del substrato, en lugar de la acumulación de metabolitos tóxicos, entonces la fase exponencial del crecimiento puede prolongarse mediante la adición de nuevo medio al recipiente. Esta operación puede repetirse hasta que el recipiente se llene, No obstante, si se instala un sistema de flujo continuo en un fermentador de tal forma que el cultivo fresco desplace, en un volumen igual, al cultivo agotado, entonces se puede conseguir una producción de células de forma continua. Un fermentador continuo de tanque agitado contiene dispositivos para la alimentación y descarga en continuo. El contenido del recipiente se encuentra en estado estacionario, es decir, no varia con el tiempo; esto se aplica a la retención de microorganismos y a la concentración de los componentes del medio en el fermentador. Las condiciones de estado estacionario pueden alcanzarse operando sobre principios quimiostáticos, que implican ajustar el caudal del alimento al fermentador a un valor apropiado y constante, permitiendo a las concentraciones de microorganismos, substrato y producto bioquímico alcanzar sus niveles naturales.

En el quimiostato, el crecimiento de las células se controla ajustando la concentración de un substrato mediante la fijación de una tasa de dilución que fijará la tasa de crecimiento en el sistema. Cualquier substrato que se requiera puede ser utilizado como substrato limitante. Generalmente los substratos limitantes que más incidencia tienen en el crecimiento de la Saccharomyces cerevisiae son el ion amonio, glucosa y fosfato (Crueger, 1991, 79).

Los efectos de diferentes tasas de dilución y concentración del substrato limitante para la proliferación de los microorganismos se explican así: Cuando las tasas de dilución son altas, el organismo no puede crecer lo suficientemente rápido para ir de acuerdo con su dilución y el cultivo es lavado del quimiostato. En el otro extremo, con tasas de dilución muy lentas una fracción importante de las células pueden morir de inanición, puesto que el nutriente limitante no llega con la suficiente rapidez para mantener el metabolismo celular. La concentración de microorganismos en el quimiostato se controla por la cantidad de nutriente limitante. Si la concentración de éste (nutriente en el medio que llega) se elevara dejando constante la tasa de dilución, la concentración de microorganismos aumentaría aunque la tasa de crecimiento seguiría siendo la misma y la concentración de substrato en el quimiostato seguiría siendo virtualmente cero. De esta manera, ajustando la tasa de dilución y la concentración de substrato, experimentalmente se puede obtener a voluntad una variedad de concentración de microorganismos y tasas de crecimiento. La figura 2.7 explica el comportamiento del efecto de diferentes tasas de dilución respecto a la concentración de microorganismos y las tasas de crecimiento.

Figura 2.7

Efectos de la tasa de dilución y concentración de substrato en un

quimiostato

Figura 2.7 Efectos de la tasa de dilución y concentración de substrato en un quimiostato Fuente:

Fuente: BROCK, T. Microbiología

De acuerdo a la gráfica anterior, se nota que a altas tasas de dilución, el crecimiento no puede equilibrar la dilución, la población se extingue y la concentración del substrato alcanza un máximo. Sin embargo, en el mayor rango de tasas de dilución, la concentración de microorganismos permanece constante y la concentración de substrato conserva un valor muy bajo. Aunque la concentración de microorganismos permanece constante, la tasa de crecimiento y el tiempo de duplicación varía en un intervalo amplio.

En conclusión, los dispositivos para cultivo continuo (quimiostatos) son un medio para mantener la población en crecimiento exponencial durante largos periodos. Lo principal de un dispositivo para cultivo continuo es reabastecer lentamente el recipiente del cultivo con medio fresco, en tanto se elimina el medio ya usado y las células a la misma velocidad. La velocidad a la que se realiza esta dilución rige la velocidad de crecimiento de la población celular en el recipiente del cultivo.

  • 2.4.1 Diferencias entre cultivo continuo y discontinuo

El cultivo continuo opera bajo condiciones de un estado de equilibrio, es decir,

las concentraciones de todos los componentes del cultivo son constantes. El cultivo continuo opera bajo condiciones limitantes de substrato mientras que el cultivo discontinuo, en la fase exponencial, funciona en presencia de exceso de substrato.

La velocidad de crecimiento

en

el cultivo

continuo está controlada por la

velocidad de dilución (y por ello

bajo

el

control del operario) y su

valor es

siempre menor que la velocidad máxima de crecimiento µmax. Por en contrario, la velocidad específica de crecimiento µ en la fase exponencial de un

cultivo discontinuo alcanzará la velocidad máxima de crecimiento µmax correspondiente a las condiciones que prevalezcan en el cultivo.

  • 2.4.2 Cinética del cultivo continuo

En un proceso continuo en condiciones de equilibrio la perdida de células debida

al

fluido

que

sale

debe

ser

balanceada

microorganismo(Trevan, 1990,86).

D=µ

por

el

crecimiento del

La velocidad de flujo D se define como la velocidad de flujo volumétrico que entra y sale a través del volumen del fermentador. D es definida como:

D=F/V

Donde D es la velocidad de dilución en h -1 , V es el volumen de fermentador en ml y F es el flujo en ml*h -1 .

La concentración de substrato en el quimiostato viene determinada por la velocidad de dilución. En efecto, esto se debe a que el crecimiento está consumiendo el substrato hasta una concentración que permite que la velocidad de crecimiento iguale a la velocidad de dilución.

Si el substrato se agota hasta un grado en que su concentración tenga un nivel inferior al que soporta la velocidad de crecimiento impuesta por la velocidad de dilución, se da la siguiente secuencia de sucesos (Trevan, 1990, 87):

La velocidad de crecimiento de las células será menor que la velocidad de dilución y saldrán del quimiostato a una velocidad superior a la que se está formando, por lo que decrece la producción.

La concentración de substrato en el quimiostato aumentará dado que existe un número menor de células para consumir el substrato.

La mayor concentración de substrato ocasionará que las células crezcan a una velocidad mayor que la velocidad de dilución, con lo que aumentará la concentración de biomasa.

La disminución de la velocidad de crecimiento y el cese del crecimiento debido al

agotamiento de substrato puede describirse por la

relación

entre

µ

y

la

concentración residual de substrato limitante esencial. El substrato limitante es aquel componente del medio que primero se agota y esto se explica de acuerdo a la relación de Monod. El efecto controlador de la velocidad de dilución está

regulado, esencialmente, por la relación entre µ y s(Trevan, 1990, 87):

µ = µmax x s / K s + s

donde s es la concentración residual del substrato limitante y K s es la constante de utilización o saturación para el substrato limitante y equivale a la concentración de substrato cuando el valor de µ es la mitad que el de µmax.

En un estado de equilibrio µ = D; por lo tanto:

D = µmax x s e / K s + s e Donde s e es la concentración del substrato residual en el estado de equilibrio. Despejando s e de la ecuación anterior resulta:

s e = K s x D / µmax – D Esta ecuación predice que la concentración de substrato en el quimiostato viene determinada por la velocidad de dilución. En efecto, esto se debe a que el crecimiento está consumiendo el substrato hasta una concentración que permite que la velocidad de crecimiento iguale a la velocidad de dilución. La concentración de células en el quimiostato en el estado de equilibrio viene definida por la ecuación:

x e = Y ( S R – ( K s x D / µmax – D ) )

donde:

Y es factor de rendimiento para el substrato limitante (g biomasa/ g substrato consumido).

S R es la concentración original del substrato en el medio.

La velocidad específica máxima de crecimiento en los procesos industriales se escoge de forma que se obtenga el rendimiento más alto en el volumen más pequeño del fermentador y en el tiempo más corto.

El modelo de Monod no es generalmente aplicable a la fermentación continua a velocidades muy bajas o muy altas de dilución. A velocidades medias de dilución la relación molar entre la biomasa producida y el CO 2 que se desprende es constante. A bajas velocidades de dilución la proporción de CO 2 se hace más grande. Esto se debe a que se utiliza más fuente de energía para el mantenimiento de la estructura celular, para la regulación osmótica o para la motilidad de la célula. Por otra parte, a velocidades altas de flujo una parte del carbono añadido es oxidado incompletamente (a productos como piruvato, acetato o ácidos tricarboxílicos) y de esta forma se reduce la productividad. A bajas velocidades de flujo, con nitrógeno como substrato limitante, se forman materiales de reserva, como polisacáridos, lo que resulta en un aumento en el tamaño de la célula y por tanto de la biomas

CAPITULO 3 MATERIALES Y METODOS

En este capítulo se describen las metodologías que fueron utilizadas para la realización de este trabajo. Las metodologías internacionalmente aceptadas, fueron adaptadas a las infraestructuras de los laboratorios con los que cuenta la Facultad de Ingeniería.

3.1

PROCEDIMIENTO

Para la implementación de las normas se realizaron los siguientes pasos:

Tabla 3.1 Normas y métodos utilizados

DETERMINACION

NORMA/METODOS

 

Nitrógeno

Norma AOAC 960.52

Etanol

Manual de métodos analíticos para el control de calidad de bebidas alcohólicas (NTC) y norma AOAC

969.12

Azúcares reductores

Norma AOAC 923.09

Sólidos solubles totales y % Sacarosa

Refractómetro y Sacarómetro

Conteo de microorganismos

Método cámara de conteo

FUENTE: Autores

Elaboración de curvas de calibración para los métodos de determinación de nitrógeno y azúcares reductores, utilizando muestras de concentración conocida, para los métodos empleados.

Cálculo del porcentaje de error de exactitud al comparar el valor teórico de las

muestras de experimentales.

concentración

conocida

  • 3.2 DISEÑO EXPERIMENTAL

    • 3.2.1 Diagramas de flujo

3.2.1.1 Pruebas preliminares

Preparación de medios de cultivo s1, s2, s3, n1, n2, n3 (s= medio semisintético, n= medio natural)

Activación de levadura a 35°C en solución 5% de azúcar

Activación de levadura a 35°C en solución 5% de azúcar

Activación de levadura a 35°C en solución 5% de azúcar

Desarrollo de las fermentaciones a temperatura de 25 °C hasta estabilización de sólidos solubles totales

Determinación de parámetros en función del tiempo: número de microorganismos, sólidos solubles totales, %sacarosa, pH

Determinación de parámetros en función del tiempo: número de microorganismos, sólidos solubles totales, %sacarosa, pH

Determinación de parámetros en función del tiempo: número de microorganismos, sólidos solubles totales, %sacarosa, pH

Evaluación de las fermentaciones:

selección del medio de mayor fluctuación de pH

  • 3.2.1.2 Pruebas en el Bioflo

Configuración del funcionamiento del bioflo: velocidad de agitación, concentración de ácido y base para regulación de pH y bombas de alimentación

− Cálculo del porcentaje de error de exactitud al comparar el valor teórico de las muestras

con

el

valor

de

 

las muestras

 
Cada medio se prepara por

Cada

medio se

prepara por

triplicado en

erlenmeyer de

500

l

d

bid

t

 
Inocular la levadura activada a d di d

Inocular la levadura activada a d

di

d

 
 

Se toma una muestra diaria de

15 ml cada medio (s1, s2, s3, n1, n2, n3). Se determina media aritmética desviación

15 ml cada medio (s1, s2, s3, n1, n2, n3). Se determina media aritmética desviación

 
 

Se

determina mediante

regresión lineal la pendiente

regresión lineal la pendiente

para

cada medio de cultivo y

el porcentaje de variación de

 
 

Para la velocidad de agitación

se

observan los tiempos de

operación a velocidades de

operación

a

velocidades

de

50,

75

y

100

r.p.m.

Para la

concentración

de

ácido

y

base,

 

se

emplea

concentraciones de 1 N y 5 N

Fermentación alcohólica en el biorreactor, preparación de medio de cultivo a 10 litros bajo condiciones constantes de temperatura 25 °C y pH de 4.5, paralelo a una fermentación sin funcionamiento del sistema de regulación de pH a 25°C.

Determinación de parámetros en función del tiempo: número de microorganismos, sólidos solubles totales y %sacarosa, nitrógeno total.

Determinación de parámetros finales: contenido de etanol y azúcares residuales Elaborar guía de manejo y funcionamiento

Determinación de parámetros finales:

contenido de etanol y azúcares residuales

Determinación de parámetros finales: contenido de etanol y azúcares residuales Elaborar guía de manejo y funcionamiento

Elaborar guía de manejo y funcionamiento del bioflo bajo trabajo de regulación de pH

Elaborar guía de manejo y funcionamiento del bioflo bajo trabajo de regulación de pH

Trabajo preliminar para manejo del bioflo en cultivos continuos: concentración de substrato limitante y tasa de dilución.

 

El número de réplicas de cada

fermentación es de dos (2) empleando el medio s2.

fermentación es de dos (2) empleando el medio s2.

 
 

Se

realiza

por

triplicado

tomando una muestra diaria

tomando una muestra diaria

de

30

ml

a

excepción

de

porcentaje de sacarosa que se

toma

al

final

de

la

fermentación

Se determina la

 
Se realiza al final de cada

Se

realiza al final de cada

fermentación por triplicado determinando media aritmética desviación estándar

 
 

Se emplea el medio s2 a un volumen de 10 litros, tomando

muestra diaria para determinar

muestra diaria para determinar

crecimiento

 

de

microorganismos, contenido

3.2.2 Preparación de los medios de cultivo para pruebas preliminares

El medio de cultivo utilizado para este estudio se presenta en la tabla 3.2 y 3.3 Tabla 3.2 Medios de cultivo semisintéticos

       

CONTENIDO

MEDIO S1

MEDIO S2

MEDIO S3

       

Extracto de levadura (g/l)

 
  • 8.00 8.00

8.00

Sacarosa (g/l)

100.00

100.00

100.00

Metabisulfito de Sodio (g/l)

 
  • 0.05 0.05

0.05

Solución Madre de Complejo vitamínico (ml/l de medio)

 
  • 0.11 0.11

0.11

Sulfato de Amonio (NH 4 ) 2 SO 4 (g/l)
Sulfato de Amonio
(NH 4 ) 2 SO 4 (g/l)

Fosfato de Amonio (NH 4 ) 2 HPO 4 (g/l)

0.25

0.25

Fuente: Autores

Tabla 3.3 Medio de cultivo naturales

 
           

CONTENIDO

 

MEDIO N1

 

MEDIO N2

MEDIO N3

           

Piña (Ananas

 

1000.00

 

1000.00

1000.00

comosus) (g/l)

Metabisulfito de Sodio (g/l)

 

0.05

 

0.05

0.05

Solución Madre de Complejo vitamínico (ml/l de medio)

 

0.11

 

0.11

0.11

Sulfato de Amonio (NH 4 ) 2 SO 4 (g/l)

       

0.25

Fosfato de Amonio (NH 4 ) 2 HPO 4 (g/l)

     

0.25

 

Fuente : Autores

Cada medio se elaboró por triplicado. Posteriormente se debe llegar a 20°Brix con más adición de sacarosa.

  • 3.2.3 Esterilización de los erlenmeyer y adecuación de los medios de cultivo

Para la esterilización de los 18 erlenmeyer se utilizó una estufa WTB-BINDER, para ello se procedió a cerrarlos con papel aluminio, con el fin de que permanecieran estériles hasta el tiempo en el que fueran utilizados. La esterilización se llevó a cabo a 200 o C durante dos horas. Se procedió a la introducción del medio en los erlenmeyer, este proceso se realizó dentro de una cámara de flujo laminar CAE ET (30"x36"x6"), para evitar la contaminación de los medios de cultivo. Luego se aumentó la temperatura de los medios a 25 o C, al colocarlos en una estufa Binder adecuada a esta temperatura. En la preparación del medio de cultivo se agregó el metabisulfito de sodio con el fin de realizar una inhibición bacteriana química, y de esta forma, evitar el crecimiento de la flora bacteriana que podría contaminar el medio, formada principalmente por bacterias fermentativas tolerantes a medios ácidos.

3.2.4

Activación e inoculación de la levadura

La levadura Saccharomyces cerevisiae se activó previamente antes de ser inoculada en cada cultivo. Esta preparación es necesaria para 1 litro de medio.

Se pesó 5 gramos de sacarosa comercial y se depositaron en el balón aforado de 100 ml completando el volumen con agua destilada. Se colocó en el baño termostatizado hasta que llegó a una temperatura de 35 °C. Se pesó 0.6 gramos de levadura y se colocó en el vaso de precipitado de 100 ml. Se añadió 6 ml de la solución azucarada y se dejó en el baño termostatizado a 35 °C hasta que se notara la presencia de gas (CO 2 ). (Alba y Sierra, 1999, 76)

Se depositaron los 6 ml de la levadura activada para inocular el medio de cultivo el cual se fijo a 20 °Brix adicionando sacarosa.

La inoculación

de

la

levadura

se

realizó tomando en consideración los

procedimientos para el manejo estéril de cultivos. Para ello todas las inoculaciones se realizaron en la cámara de flujo laminar CAE ET, utilizando material previamente esterilizado (pipetas, erlenmeyer) y utilizando el mechero

para flamear todo el material que tuviera contacto con los medios.

  • 3.2.5 Variables a medir durante la fermentación preliminar

    • 3.2.5.1 pH

Para

medir el

pH,

se

tomó una muestra diaria

de cada medio durante la

fermentación, agitando previamente de manera suave durante 30 segundos el medio de cultivo. El pH fue medido mediante un potenciómetro debidamente calibrado.

  • 3.2.5.2 Número de microorganismos

El conteo se realizó diariamente por triplicado durante la fermentación, empleando la cámara de conteo Neubauer Improved en el microscopio.

  • 3.2.5.3 Sólidos solubles totales y %sacarosa

Los sólidos solubles totales se tomaron diariamente y por triplicado durante la fermentación, empleando el refractómetro y el porcentaje de sacarosa se tomó el día final de la fermentación utilizando el aerómetro-sacarómetro, según °Brix Tp 20 °C.

  • 3.2.6 Análisis de los datos obtenidos en las pruebas preliminares

Para la determinación de los parámetros se tomaron muestras diarias de manera estéril y por triplicado. El análisis se realizó mediante un manejo estadístico simple, determinando cual es el medio de cultivo que presenta mayor rango de

fluctuación de pH. Las metodologías que se siguieron para la determinación de los parámetros se presentan en la sección 3.3.

 

3.2.7

Pruebas preliminares en el Bioflo

Se realizaron ensayos preliminares con el medio que presentó mayor rango de fluctuación de pH, a un volumen de 6 litros; Estas pruebas permitieron configurar las siguientes condiciones para llevar a cabo la fermentación alcohólica:

Determinación de velocidad de agitación. De manera previa empleando agua y posteriormente con medio.

Concentración de ácido y base para regulación de pH empleando ácido cítrico y carbonato de calcio, solo con funcionamiento del sistema regulador del Bioflo. Se determinó mediante las necesidades volumétricas de ácido y base para regular el pH en el funcionamiento del mismo sistema regulador.

Configuración de bombas de alimentación peristálticas para salida y entrada de flujos del biorreactor.

3.2.8

Fermentación alcohólica en el Bioflo.

Se utilizó el medio de cultivo evaluado en ensayos preliminares. El número de réplicas de las fermentaciones son dos (2) con un volumen total de 10 litros.

Las fermentaciones en el biorreactor se llevaron a las siguientes condiciones constantes:

Temperatura de 25° C

pH de 4.5: pH que permite evaluar mejor el sistema de bombas peristálticas y observar el desarrollo continuo del sistema de regulación de pH, ya que difiere del pH normal del desarrollo de una fermentación (pH de 2.8 hasta 3.8).

3.2.9

Fermentación alcohólica sin regulación de pH.

Se utilizó el medio de cultivo evaluado en ensayos preliminares. El número de réplicas de las fermentaciones son dos (2) con un volumen total de 10 litros.

Las fermentaciones en el biorreactor se llevaron a las siguientes condiciones constantes:

Temperatura de 25° C

Se realizó la comparación de las dos fermentaciones mediante los datos de las variables medidas a lo largo de cada fermentación.

3.2.10 Diagrama de flujo de puesta en marcha de una fermentación en el Bioflo

Lavar y esterilizar el vaso del Bioflo en autoclave

fluctuación de pH. Las metodologías que se siguieron para la determinación de los parámetros se presentan

Preparar medio de cultivo en recipiente de 10 litros

Preparar medio de cultivo en recipiente de 10 litros Ajustar sólidos solubles totales a 20° Brix

Ajustar sólidos solubles totales a 20° Brix

Preparar medio de cultivo en recipiente de 10 litros Ajustar sólidos solubles totales a 20° Brix

Instalar el vaso en la cabina de control y agregar el medio de cultivo

Preparar medio de cultivo en recipiente de 10 litros Ajustar sólidos solubles totales a 20° Brix

Conectar mangueras del condensador y adaptar el motor al vaso

Preparar medio de cultivo en recipiente de 10 litros Ajustar sólidos solubles totales a 20° Brix

Insertar la termocupla y abrir la válvula de agua a una presión de 20 psi

Preparar medio de cultivo en recipiente de 10 litros Ajustar sólidos solubles totales a 20° Brix

Encender el Biorreactor y seleccionar modo 2 de fermentación.

Preparar medio de cultivo en recipiente de 10 litros Ajustar sólidos solubles totales a 20° Brix

Calibrar e instalar el potenciómetro

Preparar medio de cultivo en recipiente de 10 litros Ajustar sólidos solubles totales a 20° Brix

Fijar la temperatura y pH de trabajo: 25°C y 4.5 respectivamente

Preparar medio de cultivo en recipiente de 10 litros Ajustar sólidos solubles totales a 20° Brix

Inocular la levadura y fijar agitación al medio.

Preparar medio de cultivo en recipiente de 10 litros Ajustar sólidos solubles totales a 20° Brix

Medir a diario: Número de m.o, sólidos solubles totales, Contenido de nitrógeno, y pH en fermentación sin regulación.

Preparar medio de cultivo en recipiente de 10 litros Ajustar sólidos solubles totales a 20° Brix

Determinar al final de la fermentación: azúcares reductores, contenido alcohólico y % de sacarosa.

3.2.11 Reproducibilidad de la fermentación alcohólica en el Bioflo

La reproducibilidad de la fermentación alcohólica se determinó por medio de las variables a ser medidas durante el desarrollo de cada fermentación tanto para la fermentación con regulación de pH y sin regulación.

3.2.11.1 Variables a medir durante la fermentación

Número

de

microorganismos:

Se

tomó

una

muestra

diaria

durante

la

fermentación para conteo total mediante cámara Neubauer Improved.

Sólidos solubles totales y % sacarosa: Se tomó una muestra diaria, se realizó por refractómetro y sacarómetro respectivamente. El porcentaje de sacarosa se tomó solo al final de cada fermentación.

Nitrógeno total: Se tomó una muestra diaria, se realizó mediante método Kjeldahl.

Contenido de etanol: Al final de la fermentación se tomó una muestra, se realizó mediante destilación alcohólica, según Norma Icontec.

Azúcar residual: Al final de la fermentación, se realizó mediante método de AOAC 923.09.

pH: Se realizó la lectura en el monitor del Bioflo diariamente.

3.2.11.2

Técnicas utilizadas

Número de microorganismos: Cámara de conteo Neubauer Improved.

Sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa: Refractómetro y aerómetro (sacarómetro).

Nitrógeno total: Método Kjeldahl, según Norma AOAC 960.52.

Contenido de etanol: Método de destilación, según el Manual de Métodos analíticos para el control de calidad de bebidas alcohólicas (ICONTEC).

Azúcar residual: Norma AOAC 923.09.

3.2.11.3

Validación estadística de los datos

El análisis se realizó mediante un manejo estadístico simple, determinando media aritmética y desviación estándar en cada una de las variables medidas a lo largo del proceso de fermentación con un intervalo de confianza del 95%.

3.2.12 Pruebas preliminares para trabajo de cultivos continuos

Se trabajó de manera preliminar un cultivo continuo en el Bioflo, utilizando el medio semisintético con fosfato de amonio, que fue alimentado durante el proceso con el mismo. Se trabajó un cultivo con un volumen constante de 10 litros en el vaso del Biorreactor.

Se establecieron los siguientes parámetros:

Concentración de sustrato limitante.

Tasa de dilución, que determina la tasa de crecimiento. Los cultivos preliminares en sistema cerrado permiten establecer la tasa de crecimiento en la fase exponencial; en la fase exponencial se encuentra el máximo consumo de sustrato limitante y formación de producto. En el cultivo continuo, la salida de producto determina la entrada de sustrato limitante al sistema abierto.

3.3

MATERIALES Y METODOS

  • 3.3.1 Método Kjeldahl para la determinación de nitrógeno total

    • 3.3.1.1 Fundamento del método

En este método la muestra analizada se descompone con ácido sulfúrico concentrado en caliente, para convertir el nitrógeno en ion amonio. Cuando la descomposición se completa, la solución resultante se enfría, se diluye y se alcaliniza con hidróxido de sodio. El amonio liberado se separa por destilación y se recoge en una solución ácida y posteriormente se cuantifica por titulación.

El ácido sulfúrico que se utiliza para descomponer la muestra, oxida al carbono e hidrógeno a dióxido de carbono y agua, siendo esta etapa la más crítica en este método.

  • 3.3.1.2 Reacciones que se presentan

3.3 MATERIALES Y METODOS 3.3.1 Método Kjeldahl para la determinación de nitrógeno total 3.3.1.1 Fundamento del

muestra + H 2 SO 4 + H 2 O (NH 4 ) 2 SO 4 + 2 NaOH 2 NH 3 + 2H 3 BO 3

3.3 MATERIALES Y METODOS 3.3.1 Método Kjeldahl para la determinación de nitrógeno total 3.3.1.1 Fundamento del

(NH 4 ) 2 SO 4 + CO 2

Digestión

2NH 3 + Na 2 SO 4 + 2H 2 O Destilación

2H 2 BO 3 - + 2NH 4 + Destilado

3.3 MATERIALES Y METODOS 3.3.1 Método Kjeldahl para la determinación de nitrógeno total 3.3.1.1 Fundamento del

2H 2 BO 3 - + 2HCl 2H 3 BO 3 + 2Cl - Titulación Para calcular un volumen teórico de HCl con una normalidad dada se tiene de la

estequiometría de la reacción:

ml de HCl x Normalidad = Xg N [(132g (NH 4 ) 2 SO 4 x 34g

NH 3 x121g H 2 BO 3 x 73 g

HCl x 1 equiv. HCl x 1000ml) / (28g N x 132g (NH 4 ) 2 SO 4 x 34g x 36.5 g HCl)]

NH 3 x121g H 2 BO 3

Donde se obtiene:

ml de HCl x Normalidad HCl = Xg Nitrógeno x 71.43

  • 3.3.1.3 Materiales

Sistema de digestión de KJELDAHL BUCHI B-316

Tubos de vidrio para digestión BUCHI

Unidad de destilación BUCHI B-316

Centrífuga HERMLE Z320

Vaso de precipitado de 1000 ml (plásticos)

Bureta de 10 ml ( +

0.05 ml)

Pipetas de 5 y 10 ml (+ 0.045 - 0.05 ml) respectivamente

Erlenmeyer de 250 ml

Placa de calefacción y agitación

Tubos para centrífuga

Balanza analítica

3.3.1.4

Reactivos

 

Acido sulfúrico concentrado r.a

Pastillas catalizadoras de Kjeldahl sin selenio

Indicador de Taschiro

Acido bórico al 2%

Solución de hidróxido de sodio al 32%

Acido clorhídrico 1 N

Agua destilada

Carbonato de sodio

3.3.1.5

Procedimiento

 

!

Digestión

Tomar una muestra homogenizada de 20 ml del fermento y colocarla en un tubo de ensayo para centrifugarla a 4000 r.p.m. durante 20 minutos.

Una vez centrifugado eliminar el líquido sobrenadante con ayuda de una pipeta de 5 ml.

Adicionar al tubo de ensayo 20 ml agua destilada y agitar vigorosamente para que el sedimento se separe de la parte inferior del tubo.

Verter esta solución en un tubo de vidrio para digestión de Kjeldahl y enjuagar dos veces más el tubo de ensayo con agua destilada, vertiendo el agua de enjuague en el tubo de vidrio para digestión.

Adicionar 20 ml de ácido sulfúrico concentrado y una pastilla de catalizador de Kjeldahl sin selenio.

Encender el sistema de digestión BUCHI dejando el control de temperatura en 10 e instalar el tubo de vidrio con la muestra junto con el sistema de

evacuación de gases.

Se debe asegurar debidamente el sistema de

evacuación de gases para evitar fugas, observando que los gases circulen en

el sentido correcto.

Al iniciar la digestión se debe regular la temperatura del sistema de digestión, observando la formación de un anillo de gases en la parte media del tubo de vidrio de digestión.

Calentar hasta que se complete la reacción, esto se verifica cuando la solución resultante toma una coloración verde manzana traslúcida.

Dejar enfriar y permitir la completa evacuación de los gases de digestión. Desmontar el sistema y pasar a la unidad de destilación.

!

Destilación:

Verificar el correcto funcionamiento de la unidad de destilación BUCHI, observando los contenedores de ácido bórico, NaOH y agua destilada. A la vez, se debe abrir la llave de refrigerante.

Configurar la unidad de destilación en el panel de control, seleccionando el debido método de trabajo, que establece una destilación de 5 minutos.

Adaptar el tubo de vidrio de digestión en la unidad de destilación y a la vez colocar un erlenmeyer de 250 ml para recoger el destilado.

Iniciar la destilación oprimiendo la tecla “enter”, en este momento la unidad adiciona 80 ml de NaOH al 32% al tubo de digestión y 75 ml de ácido bórico al 2% al erlenmeyer.

Una vez terminado el tiempo de destilación se retira el tubo de digestión y el erlenmeyer que contiene el destilado.

Adicionar indicador taschiro y se procede a valorar la solución del erlenmeyer recolector de 250 ml con ácido clorhídrico 1 N debidamente valorado, con un viraje de color verde a azul oscuro.

3.3.1.6 Cálculo y expresión de los resultados

El contenido de nitrógeno de la muestra se calcula de la siguiente manera:

Nm= (V HCl * N HCl )/71.43 Donde:

Nm: contenido de nitrógeno de la muestra en gramos. V HCl : volumen de HCl gastados en la titulación en ml.

N HCl : Normalidad de HCl (equivalentes por litro). En éste caso 0.94656 N (Solución de HCl 1N debidamente valorada con NaOH 1 N valorado con biftalato de potasio)

71.43: constante de la estequiometría de las reacciones.

3.3.2 Método para la determinación de azúcares reductores por titulación de Lane y Enyon

  • 3.3.2.1 Fundamento del método

Los azúcares reductores están constituidos por aquellos azúcares que poseen acción reductora directa sobre una solución cupro-tartárico-alcalina.

Esta determinación comprende los siguientes pasos:

  • ! Clarificación

  • ! de azúcares reductores totales por titulación. (Método

Determinación

volumétrico).

El método volumétrico o la titulación de Lane y Eynon para la determinación de azúcares reductores consiste en la adición de la muestra a determinar azúcares reductores a una solución de reactivo de Felhing. La titulación termina cuando la solución que contiene los azúcares reductores reduce la solución de Felhing con la aparición de un precipitado de coloración roja debido al óxido cuproso.

3.3.2.2

Materiales

 

Balón aforado de 100 ml

(+ 0.1 ml)

Balón aforado de 1000 ml (+ 0.4 ml)

Balón aforado de 2000 ml (+ 0.6 ml)

Balón aforado de 250 ml

Balanza analítica METTLER TOLEDO (+ 0.1 mg)

Pipeta volumétrica de 10 ml (+ 0.05 ml)

Vaso de precipitado de 1000 ml

Vaso de precipitado plástico de 1000 ml

Vaso de precipitado de 250 ml

Erlenmeyer de 500 ml

Embudo de Buchner

Papel filtro diámetro de poro de 0.2 µm

Perlas de vidrio

Placa calefactora y de agitación

Bureta de 10 ml (+ 0.05 ml)

Bureta de 50 ml (+ 0.1 ml)

3.3.2.3

Reactivos

 

Solución de azúcar invertido al 1% (2 litros)

Sacarosa pura y seca = 23.75 granos

Acido benzoico = 4 gramos

Acido clorhídrico = 9 ml r.a.

Agua destilada = 2000 ml

Solución A (1 litro)

Sulfato cúprico puro 5H 2 O = 69.3 gramos

Agua destilada = 1000 ml

Solución B (1 litro)

Tartrato de sodio y potasio tetrahidratado = 354 gramos

Hidróxido de sodio puro = 100 gramos

Agua destilada = 1000 ml

Clarificación del fermento

Solución saturada de acetato neutro de plomo

Oxalato de potasio anhidro

Titulación

Azul de metileno

3.3.2.4 Procedimiento

Preparación de solución estándar de azúcar invertido

Disolver 23.75 gramos de sacarosa pura en cerca de 120 ml de agua en un matraz volumétrico de 250 ml. Añadir 9 ml de HCl concentrado y déjese en reposo durante 8 días a temperatura ambiente. Diluir hasta la marca con agua. Transferir 200 ml a un matraz volumétrico de 2 litros. Añadir cerca de 200 ml de agua agitando y 71.4 ml de una solución de NaOH 1 N y 4 gramos de ácido benzoico. Agregar 1 litro de agua, mezclar y verificar con papel indicador que la solución tenga aproximadamente un pH de 3. Ajustar si es necesario y diluir hasta la marca. Esto produce una solución estable al 1% (m/v) de azúcar invertido.

Clarificación del fermento Tomar 100 ml del fermento y colocarlo en un vaso de precipitado.

Neutralizar

exactamente

con

solución

de

NaOH

1N.

Para

soluciones

coloreadas

es

conveniente

utilizar

un

potenciómetro

para

controlar

la

neutralización. Agregar por pequeñas porciones, solución de acetato neutro de plomo, hasta

que no se observe la formación de más precipitado. Diluir con agua hasta la marca del matraz, mezclar y dejar en reposo.

Filtrar la parte sobrenadante, utilizar papel y embudos secos (filtrar a vacío).

Agregar por pequeñas porciones, oxalato de potasio anhidro, agitando después de cada adición hasta que no se observe la formación de más precipitado. Volver a filtrar.

El filtrado que se obtiene corresponde, volumen a volumen, con el fermento original.

Determinación de azúcares por titulación

 

Colocar en

un erlenmeyer de 500

ml,

15

ml de agua destilada,

5

ml de

la

solución B y 5 ml de la solución A.

 

Añadir algunas perlas de vidrio y colocar el erlenmeyer con la solución de Felhing en una placa calefactora.

Hervir la solución exactamente 2 minutos.

 

Agregar 4 gotas de azul de metileno 5 segundos antes de terminar el periodo de ebullición.

Añadir desde la bureta el fermento a la solución en ebullición hasta que desaparezca el color azul dejando la coloración roja debida a la aparición de óxido cuproso. Esta titulación no debe sobrepasar los 3 minutos.

  • 3.3.2.5 Cálculo y expresión de los resultados

La concentración de azúcares reductores en el fermento se determina de la siguiente manera:

[ ] Azúcares reductores =

g de azúcar invertido que reducen 10 ml de Felhing/ Volumen de titulación en ml.

Los gramos de azúcar invertido que reducen 10 ml de Felhing se obtienen a partir de una titulación con la solución patrón de azúcar invertido al 1%.

3.3.3 Determinación del número de microorganismos por recuento en cámara de conteo Neubauer Improved.

  • 3.3.3.1 Fundamento del método

Las cámaras de conteo se utilizan para determinar microscópicamente el número de microorganismos totales (vivos y muertos) en un determinado volumen de suspensión. Este método se emplea en muestras con concentraciones de microorganismos mayores o iguales 10 6 m.o/ ml y que no contengan partículas que impidan determinar de manera precisa el número de microorganismos.

En las cámaras de conteo hay una retícula grabada sobre la superficie de una placa de vidrio, con cuadros de un área pequeña y conocida. Sobre cada cuadro hay un volumen de magnitud conocida, muy pequeña, pero medida con mucha precisión. Se debe contar la cantidad de células por unidad de área de la retícula, empleando el microscopio de contraste, obteniendo una medida del número de células por el pequeño volumen de la cámara. De aquí se determina fácilmente el número de células por mililitro de suspensión, multiplicándolo por un factor de dilución basado en el volumen de la cámara donde se colocó la muestra.

La cámara de conteo Neubauer Improved es detallada a continuación. La profundidad de la cámara es de 0.1 mm. La cuadrícula de recuento muestra 9 cuadros grandes, cada uno de 1 mm 2 . Los 4 cuadros grandes de las esquinas están divididos en 16 cuadros con aristas de 0.25 mm. Se utilizan para recuento de leucocitos. El cuadrado grande central esta dividido en 25 cuadrados medianos con aristas de 0.2 mm y cada cuadrado mediano esta subdividido en 16 cuadrados pequeños con aristas de 0.05 mm y una superficie de 0.0025 mm 2 . Todos los cuadrados medianos tienen líneas de límite triple. La línea central es la frontera y decide si las células de esta zona se deben contar o no.

 

3.3.3.2

Materiales

Microscopio de contraste de fases

Cámara de conteo Neubauer Improved

Tubos de ensayo

Pipeta de 10 ml (+0.075 ml)

Pipeta de 1 ml (+0.01 ml)

Mechero de alcohol

Macropipeta

Goteros

3.3.3.3

Reactivos

Formaldehído

Agua destilada

3.3.3.4

Procedimiento

Tomar por triplicado muestras de fermento de manera homogénea de 1 ml y diluir a 1x10 -1 en un tubo de ensayo (9ml de agua destilada y 1 ml del medio fermentado).

Adicionar dos gotas de solución de formaldehído al 40%.

Agitar y tomar una o dos gotas de la suspensión homogénea, colocándola sobre la cámara Neubauer Improved. Cubrir con un cubreobjetos el área de las celdas.

Colocar la cámara de conteo en el microscopio y enfocar con el lente de 40X, ajustando el debido contraste.

Situarse en el cuadro grande central de los 9 cuadrados existentes cámara.

de la

Hacer el conteo de los cinco cuadrados que conforman el cuadrado grande central, preferiblemente en forma diagonal. Cada cuadrado tiene a su vez 16 cuadrados pequeños.

 

3.3.3.5

Cálculos y expresión de los resultados

Realizar los cálculos correspondientes según la siguiente fórmula estadística:

 

NMO = P / (SC x Pf x Fd)

NMO = Número de microorganismos por microlitro (µl). Si el resultado se requiere expresar por ml, se debe multiplicar por 1000 el resultado obtenido.

P = Número de partículas contadas. Corresponde al promedio de 5 cuadros.

SC = Superficie contada que corresponde a 0.04 mm 2 .

Pf = Profundidad de la cámara que corresponde a 0.1 mm.

Fd = Factor de dilución utilizado

3.3.4 Método para la determinación del contenido alcohólico de etanol por el método de destilación simple

 

3.3.4.1

Fundamento del método

La muestra se somete a destilación simple en condiciones específicas y en el destilado se determinan los grados alcoholimétricos (porcentaje de etanol en volumen), utilizando un alcoholímetro.

 

3.3.4.2

Materiales

Alcoholímetros Gay Lussac – Cartier a 15 °C(+ 0.1 °G.L)

Mechero de gas

Probeta de 250 ml

Aparato de destilación

Balón aforado de 250 ml

Perlas de vidrio

3.3.4.3

Reactivos

Agua destilada

3.3.4.4

Procedimiento

Destilación

En un balón aforado de 250 ml adicionar la muestra y llenar hasta la marca.

Instalar el aparato de destilación.

En el balón de destilación verter la muestra, a continuación lavar el balón que

contenía la muestra con agua destilada, llenándolo hasta las tras cuartas partes del mismo. Adicionar el agua de lavado al balón de destilación. Agregar perlas de vidrio para regular la ebullición. Comenzar la destilación con

un calentamiento regulado y continuo. Recoger el destilado en el mismo balón en que se midió la muestra, éste balón

debe estar sumergido en agua con hielo para evitar pérdidas debido a la alta volatilidad del etanol. La destilación termina cuando se han completado las ¾ partes del balón que

recibe el destilado, retirando el tubo ubicado en la parte inferior del refrigerante y lavándolo con agua por dentro y por fuera sobre el mismo balón. Completar a volumen con agua destilada hasta la marca.

Estimación del grado alcoholímetrico

Llenar la probeta del alcoholímetro e introducir el mismo en la probeta.

Dejar en reposo el alcoholímetro hasta que se estabilice realizando la lectura por el menisco inferior del alcoholímetro.

3.3.5 Determinación de sólidos solubles totales y % de sacarosa

 

3.3.5.1

Fundamento del método

La determinación de sólidos solubles

totales

se

basa

en

una

medición

refractométrica de la cual se obtiene el valor a una temperatura dada.

El porcentaje de sacarosa se realiza mediante el uso de un aerómetro, el cual se introduce en una solución y la lectura se realiza por el menisco que forma.

 

3.3.5.2

Materiales

Refractómetro

Sacarómetro

Termómetro (0-110 °C)

Probeta de 250 ml

3.3.5.3

Reactivos

Alcohol

3.3.5.4

Procedimiento

Sólidos solubles totales

Limpiar el prisma del refractómetro con alcohol y agua destilada, utilizando

algodón para evitar ralladuras. Verificar que la lectura sea cero colocando dos o tres gotas de agua destilada.

Llevar a 20 °C la muestra del fermento.

Hacer la respectiva medición con dos o tres gotas de fermento dejándolas caer

sobre el prisma. Observar la medición ajustando debidamente el refractómetro.

Porcentaje de sacarosa

Tomar una muestra de 250 ml de fermento, llevarla a 20 °C y colocarlo en una probeta

Introducir el sacarómetro en la probeta, esperar a que se estabilice cuidando de que no se pegue en las paredes. Realizar la lectura.

CAPITULO 4 PRESENTACION DE RESULTADOS

En este capítulo se presentan los resultados de las pruebas correspondientes al diseño experimental presentado. Además se presenta la guía de manejo y funcionamiento del sistema de bombas peristálticas del Biorreactor en una fermentación alcohólica aplicando el sistema de regulación de pH. Cabe anotar que en la metodología utilizada para determinar nitrógeno total y azúcares reductores fue necesario realizar una estandarización del equipo previo al desarrollo del método respectivo. En cuanto a las tablas de resultados, las celdas que se encuentran sombreadas corresponden a los días en que no se tomó la medida por ser fin de semana y el laboratorio no se encuentra disponible para su uso.

4.1

GUIA

DE

MANEJO

PERISTALTICAS

DEL

SISTEMA

DE

BOMBAS

El Biorreactor Bioflo 3000 M1227 consta de un sistema de cinco bombas peristálticas asignables dependiendo la variable a controlar. Cada bomba tiene un modo de funcionamiento y operación dependiendo del parámetro a controlar en una fermentación discontinua o continua. Los modos de funcionamiento son los siguientes:

Modo Off: En éste modo la bomba no tiene ningún funcionamiento ya que no responde al Feedback Control Loop. La bomba se encuentra apagada.

Modo Manual: Este modo funciona cumpliendo ciclos variables de las bombas. Se le asigna un valor especifico entre 0% y 100%, que determina un caudal para un porcentaje de velocidad.

Modo Base y Acido:

Cuando

el sistema

de

regulación de pH entra en

funcionamiento, el modo ácido y base en las bombas peristálticas son los que

realizan la acción de control de pH a un valor especifico.

Modo On: Este modo funciona cumpliendo una operación de velocidad fija en

la

bomba y su valor es de 125%, donde la bomba funciona de manera

continua.

Modos LVL1, LVL2, LVL3: Estos modos se utilizan cuando los sensores de control de niveles en el Bioflo están presentes en el sistema. Generalmente estos modos se utilizan para fermentaciones en continuo. Cada uno de los modos de nivel pueden a la vez seleccionarse para manejo del sistema continuo. Los modos de función del LVL1, 2 y 3 son Off, Add y Harvest. Esto indica que cada sensor de nivel puede ser utilizado para alimentar de medio de cultivo o para cosechar respectivamente, teniendo en cuento que cada sensor de nivel se le asigna una bomba.

En general, para el sistema de bombas peristálticas se emplean como entrada o salida de flujos del Biorreactor, las cuales deben instalarse apropiadamente para su correcto funcionamiento (Ver Anexo D). La configuración de las bombas depende de su uso y se instalan en el sistema así:

Para flujos de entrada al Biorreactor: se adapta el tubo de silicona de 1/8 de pulgada al puerto necesario. El tubo va desde el puerto hasta la parte baja de la bomba seleccionada y debe dar vuelta a la bomba, para esto se coloca la bomba en modo “ON”, hasta que se adapta totalmente el tubo. El tubo de silicona termina por acoplarse al recipiente contenedor. La bomba se configura en los modos mencionados.

Para flujos de salida del Biorreactor: se adapta el tubo de silicona de 1/8 de pulgada al puerto necesario. El tubo va desde el puerto designado hasta la parte alta de la bomba seleccionada y debe dar vuelta a la bomba para terminar acoplado en el recipiente contenedor.

Las bombas en su funcionamiento tienen unos ciclos variables de velocidad con los cuales determinan caudales de entrada y de salida del Biorreactor. Los ciclos variables se enuncian a continuación.

Tabla 4.1 Ciclos de funcionamiento de bombas peristálticas

 

D

A

T

O

S

D

E

C

IC

L

O

S

D

E

 

F

U

N

C

IO

N

A

M

IE

N

T

O

   

T

IE

M

P

O

 

C

IC

L

O

D

E

V

E

L

O

%

C

ID

A

D

M

UERTO

(s

e

g

)

 

T

R

(#

A

G

B A

IR

JO

O

)

 

5

 

1

5

.0

 

1

/8

 

1

0

 

1

3

.5

 

1

/4

 

1

5

 

1

3

.0

 

3

/8

 

2

0

 

1

2

.8

 

5

/8

 

3

0

 

1

1

.5

 

7

/8

 

4

0

 

1

0

.9

 

1

1

/8

 

5

0

 

8

.9

 

1

3

/8

 

6

0

 

7

.8

 

1

3

/4

 

7

0

 

6

.8

 

2

 

8

0

 

5

.5

 

2

1

/4

 

9

0

 

5

.2

 

2

1

/2

 

1

0

0

 

3

.0

 

2

3

/4

Fuente: Autores

A la vez se presenta los caudales determinados a diferentes porcentajes de velocidad para las bombas peristálticas, medidos para caudales de entrada y de salida, de acuerdo a las diferencias presentadas en el desarrollo posterior del sistema en continuo empleando los puertos designados para cosecha y alimentación del Bioflo ( Ver Anexo D). Se determinaron los caudales entre un rango de 5 % – 50 % de velocidad de la bomba debido a su frecuencia de uso para cultivos continuos.

Tabla 4.2 Caudales de bombas peristálticas para flujos de entrada y salida empleando tubo de silicona de 1/8 “

 

CAUDAL DE

CAUDAL DE

% DIFERENCIA ENTRE

%

VELOCIDAD

ALIMENTACION (ml/min)

COSECHA

(ml/min)

CAUDAL DE ALIMENTACION Y COSECHA

5

 
  • 0.175 0.200

12.50

15

 
  • 0.475 0.575

17.39

20

 
  • 0.630 0.780

19.23

25

 
  • 0.785 0.985

20.30

30

 
  • 0.940 1.190

21.01

35

 
  • 1.095 1.395

21.51

40

 
  • 1.250 1.600

21.88

50

 
  • 1.565 2.004

21.91

100

  • 3.125 4.031

 

22.48

Fuente: Autores

  • 4.1.1 Configuración de sistema de bombas peristálticas para control de pH

Para la utilización del sistema de regulación de pH,

en

el Bioflo

se deben

seleccionar dos

bombas peristálticas para la

adición de ácido

y

de

base de

acuerdo a la acción de control. Los pasos a seguir son:

Seleccionar el ácido y la base a utilizar para la regulación de pH. En éste caso se utilizó ácido cítrico e hidróxido de potasio respectivamente.

Adaptar dos tubos de silicona a las bombas seleccionadas. El tubo se instala de la siguiente manera: desde el puerto de adición que se encuentra en la tapa del vaso del Bioflo, hasta la parte de abajo de la bomba peristáltica, dándole la vuelta alrededor de ella hasta el recipiente donde se encuentra el ácido y la base respectivamente. Los recipientes a utilizar son erlenmeyer de 500 ml con tapón de caucho por donde se inserta el tubo de silicona. Cada bomba debe configurarse en el modo ácido o base correspondiente.

Después de adaptar los tubos de silicona de 1/8 de pulgada a las bombas se deben conectar a los puertos de adición de ácido y base que se encuentran en la tapa del Bioflo, según la figura incluida en el Anexo D.

Para seleccionar el modo de funcionamiento de la bomba, en la pantalla del Bioflo, se coloca el cursor en la columna “FEED1” y “FEED2” respectivamente, con la tecla “ALTER” se pasa al modo base y ácido respectivamente. La bomba se mueve en sentido horario, por lo cual el fluido se moverá en dicha

dirección. Verificar si el ácido o la base están siendo bombeados dentro del vaso de acuerdo al siguiente paso.

Escribir el valor del pH de trabajo, colocando el cursor en la columna de “pH1” y fila “SET” y oprimir “ENTER”.

En la pantalla “MASTER” del Bioflo, llevar el cursor a la columna “pH1” y fila “CONTROL”, donde inicialmente aparece el letrero “OFF”. Oprimir la tecla “ALTER” hasta que aparezca el titulo “P.I.D” para luego oprimir “ENTER”.

En el Anexo D se presentan las figuras de guía para la instalación y configuración de sistema de bombas peristálticas y la configuración de los puertos de entrada y salida de flujos del Bioflo.

  • 4.2 RESULTADOS DE FERMENTACIONES PRELIMINARES

Se presenta las siguientes tablas de resultados para las fermentaciones en erlenmeyer empleando medio semisintetico y natural.

Tabla 4.3 Resultados para medio semisintético

   

S1

 

S2

 

S3

DIA

 

pH

   

°Brix

 

N° m.o/ml

 

pH

 

°Brix

N° m.o/ml

 

pH

 

°Brix

 

N° m.o/ml

Rango +

 

Rango +

 

Rango + Rango -

Rango +

Rango +

Rango + Rango -

 

Rango +

   

Rango +

 

Rango + Rango -

Rango -

Rango -

Rango -

Rango -

Rango -

Rango -

0

6.35

6.32

   
  • 20.0 0.0E+00

  • 20.0 0.0E+00

0.0E+00

6.76

6.72

20.0

20.0

 

0.0E+00

6.36

6.34

20.0

20.0

0.0E+00

0.0E+00

1

4.69

4.62

   
  • 20.1 3.4E+07

  • 19.5 4.4E+07

2.8E+07

4.82

4.76

20.1

19.7

 

3.1E+07

4.60

4.58

20.1

19.3

3.7E+07

2.6E+07

4

3.93

3.65

 

8.9

  • 9.3 6.1E+07

5.8E+07

3.77

3.60

9.4

8.2

6.6E+07

4.4E+07

3.73

3.67

 

8.5

8.1

8.8E+07

4.4E+07

5

3.94

3.66

 

7.8

  • 8.7 1.1E+08

8.6E+07

3.78

3.62

8.3

7.3

9.6E+07

6.4E+07

3.75

3.70

 

7.8

6.8

1.5E+08

8.2E+07

6

3.94

3.65

 

7.1

  • 8.2 1.5E+08

1.1E+08

3.80

3.64

7.5

6.6

1.1E+08

6.6E+07

3.77

3.72

 

6.9

6.2

1.1E+08

9.2E+07

8

3.98

3.68

 

6.0

  • 6.5 7.5E+07

5.6E+07

3.83

3.67

6.8

6.2

6.9E+07

5.4E+07

3.80

3.76

 

6.6

6.0

7.9E+07

6.6E+07

11

3.96

3.72

 

5.8

  • 6.1 6.3E+07

4.0E+07

3.86

3.71

6.5

6.0

5.7E+07

4.0E+07

3.84

3.80

 

6.3

5.5

6.5E+07

6.0E+07

Fuente: Autores Tabla 4.4 Resultados para medio natural

 
   

N1

 

N2

 

N3

 

DI A

 

pH

   

°Brix

   

N° m .o/ml

pH

°Brix

N° m .o/ml

 

pH

   

°Brix

 

N° m .o/ml

 

Rango +

 

Rango +

 

Rango + Rango -

Rango +

Rango +

Rango + Rango -

 

Rango +

   

Rango +

 

Rango + Rango -

Rango -

Rango -

Rango -

Rango -

Rango -

Rango -

0

 

3.56

     
  • 3.53 0.0E+00

    • 20.0 0.0E+00

      • 20.0 0.0E+00

 

3.61

3.58

20.0

 
  • 20.0 0.0E+00

0.0E+00

3.54

3.52

  • 20.0 20.0

   

0.0E+00

1

 

3.68

     
  • 3.66 2.3E+07

    • 17.3 2.7E+07

      • 12.0 3.1E+07

 

3.71

3.69

19.9

 
  • 17.5 2.5E+07

2.6E+07

3.67

3.66

 
  • 19.5 17.5

 

2.4E+07

4

 

3.82

     
  • 6.7 3.0E+07

    • 6.6 4.5E+07

  • 3.80 7.0

 

3.72

3.70

   
  • 6.9 4.8E+07

4.0E+07

3.73

3.72

 

6.5

  • 6.6 5.1E+07

3.6E+07

5

 

3.94

     
  • 6.6 8.1E+07

    • 6.4 1.1E+08

  • 3.90 6.6

 

3.90

3.86

   
  • 6.4 1.0E+08

6.5E+07

3.88

3.85

 

6.4

  • 6.6 1.2E+08

9.0E+07

6

 

3.95

     
  • 6.9 8.3E+07

    • 6.7 1.1E+08

  • 3.94 7.0

 

3.88

3.86

   
  • 6.9 9.8E+07

8.7E+07

3.87

3.85

 

6.7

  • 7.0 1.3E+08

9.2E+07

8

 

3.96

     
  • 6.7 9.2E+07

    • 6.2 1.0E+08

  • 3.95 6.9

 

3.89

3.88

   
  • 6.5 1.3E+08

8.1E+07

3.89

3.88

 

6.6

  • 6.8 9.4E+07

8.9E+07

11

 

3.98

     
  • 6.6 9.7E+07

    • 6.0 1.2E+08

  • 3.96 6.7

 

3.91

3.89

   
  • 6.3 1.5E+08

8.2E+07

3.89

3.88

 

6.5

  • 6.7 1.1E+08

7.5E+07

Fuente: Autores El porcentaje de

sacarosa medido para todos

los

medios

en

el

día