AISLAMIENTO, MICROCULTIVO Y MONTAJE DE

FITOPATGENOS EN PLANTAS

INTRODUCCION:
Las enfermedades causadas por hongos producen en sus hospederos una amplia variedad de
tipos diferentes de sntomas. Entre otros los hongos fitopatgenos pueden producir manchas
clorticas y necrticas, cribados, cancros, tiznes, podredumbres hmedas o secas, momias,
agallas, abolladuras, costras, ahogamientos, marchitamientos y pstulas.
Para controlar una enfermedad es indispensable conocer su agente causal de lo contrario
cualquier estrategia de control podra ser infructuosa o eventualmente agravar el estado sanitario
del cultivo, si no se conoce el fitopatgeno (causante de la enfermedad) podra estarce
utilizando un mecanismo inapropiado contra algo desconocido.
Un diagnstico preciso se inicia siempre con una muestra representativa y la observacin
apropiada del entorno de la planta. En el laboratorio la muestra es sometida a diferentes anlisis
en busca de evidencias, pistas o la identificacin definitiva del agente causal. Este diagnstico
se basa en exmenes, microscpicos, macroscpicos y aislamiento en cultivos puros. En muchos
casos los exmenes simples responden a la incgnita pero a veces se requiere realizar
procedimientos especficos (aislamiento de microorganismos) para obtener el resultado preciso
como los que se muestran en el presente informe.
Una vez que se tiene el resultado de las diferentes tcnicas de aislamiento como lo es la
obtencin de la cepa pura, el siguiente paso para cumplir a cabalidad con el segundo postulado
de Koch es la identificacin del agente causal y una herramienta ms para cumplir con este
objetivo, en caso que este agente causal sea un hongo como en la mayora de las enfermedades
que limitan la produccin agrcola: es la tcnica de microcultivo; con sta se obtienen las
distintas fases del ciclo de vida de los hongos, que va de germinacin de la espora, formacin
del tubo germinativo, hifas, micelio, diferenciacin de las estructuras reproductivas asexuales y
sexuales. Se debe dar un manejo de tiempos en el desarrollo de los hongos para poder observar
las estructuras desde el inicio de su formacin.

OBJETIVOS:
A. Conocer la importancia del estudio de estos hongos para determinar medidas de
control.
B. Desarrollar y comprender las principales tcnicas que se utilizan para aislar hongos
fitopatgenos.
C. Realizar los procedimientos preliminares de identificacin del agente causal de la
enfermedad vegetal.
D. Conocer la tcnica de microcultivo y montaje para la caracterizacin de estructuras
somticas y reproductivas para identificar morfolgicamente a los hongos
fitopatgenos.

MATERIALES
 A. OBSERVACIN DIRECTA DEL AGENTE CAUSAL

- Muestras de hojas de rosal, yuca y mango

- Cinta adhesiva
- Lmina portaobjeto

B. AISLAMIENTO

- Muestras de tallo de Esprrago

- Muestras de tallo de Caa de azcar
- Muestras de fruto de Alcachofa
- Medios de cultivo APD.
- Agua destilada estril.
- Leja 1%
- Asa bacteriolgica
- Navaja

C. MICROCULTIVO
- Agua estril.
- Pinzas de diseccin.
- Bistur.
- Caja de Petri con lminas portaobjetos estriles.
- Placa Petri con la muestra del hongo.
- Laminas cubreobjeto (estril).

D. MONTAJE

- Lminas portaobjetos
- Laminas cubreobjetos
- Esmalte de uas (transparente)
- Pinza
- Microscopio ptico
PROCEDIMIENTO:
A. OBSERVACIN DIRECTA DEL AGENTE CAUSAL (MTODO DE GRAHAM):

- Se utiliza una cinta adhesiva transparente.

- La parte adhesiva se coloca sobre la hoja de rosal, yuca y mango.
- La cinta adhesiva se coloca sobre un portaobjetos con la cara engomada hacia el
cristal.
- Se observa en microscopio ptico.

B. AISLAMIENTO DE HONGOS: Todos los aislamientos deben hacerse en un medio

estril, es decir, a la flama del mechero, para evitar contaminaciones.

A.1. AISLAMIENTO DIRECTO: Si se observan las fructificaciones o el micelio en el

ejemplar enfermo.

1. Se toma una muestra de este material con un asa bacteriolgica.

2. Se coloca en directo sobre el medio de cultivo Agar Papa.
3. Se incuba a 24 C y se observan resultados despus de 4 a 5 das.
 B.1. AISLAMIENTO DEL AGENTE CAUSAL A PARTIR DE TEJIDO ENFERMO:

1. Haga cortes de los tejidos enfermos de aproximadamente 5 mm de largo, de tal

manera que abarquen tanto tejido enfermo como tejido sano.
2. Sumrjalos durante 3 minutos en la solucin de hipoclorito de sodio al 0.5%.
3. Enjuagar con agua destilada estril (3 veces).
4. Mediante las pinzas esterilizadas a la llama, transfiera 5 trozos en cada placa de
Petri formando un cuadrado con un trozo de tejido en el centro.
5. Coloque las placas en una incubadora graduada entre 25-28C.
6. Una vez que aparezcan las colonias transfiera aspticamente trozos pequeos del
margen de ellos a tubos de ensayo conteniendo APD.

C. MICROCULTIVO

1. Con un bistur estril se cuadricula el medio de cultivo de la placa Petri en cuadros

de aproximadamente 0.5cm por 0.5cm.
2. Con la ayuda de un bistur estril, uno de los cuadros del medio de cultivo se
transfiere al portaobjetos que est en la cmara de microcultivo; este portaobjetos
debe de estar sobre dos rectngulos de vidrio.
3. Con un asa bacteriolgica estril se lleva el inculo de la muestra al centro
superiores del cuadrado de 0.5 cm por lado del Agar Papa Dextrosa. Se coloca el
cubre objetos sobre el cuadrado de APD, procurando que quede bien centrado.
4. Se agregan 2 mL de agua estril, en el fondo de la cmara de microcultivo para
mantener la humedad, sin mojar el rea de crecimiento del hongo.
5. Incubar las placas por 5 das y observar crecimiento.

D. MONTAJE A PARTIR DE MICROCULTIVO

1. Con la pinza estril sacar la lmina portaobjeto del microcultivo.

2. Con la ayuda de la pinza separar la lmina cubreobjetos de la portaobjetos.
3. Con una navaja, realizar cortes descontinuos en los alrededores del cuadrado de
agar con el hongo en crecimiento.
4. Retirar el cuadrado de APD con la pinza esteril.
5. Colocar 1 a 2 gotas de azul de lactofenol sobre la lmina.
6. Cubrir suavemente con un cubreobjetos con la ayuda de la pinza procurando que
no queden burbujas de aire.
7. Remover el exceso de colorante con papel higinico.
8. Sellar los bordes con esmalte transparente y dejar secar.
9. Observar en microscopio ptico e identificar el gnero.

DISCUSIN

- La observacin directa mediante la tcnica de Graham modificada para observacin de

fitoatgenos es muy til, ya que permite la observacin y diagnstico rpido del agente
causal, si este presentase el crecimiento del micelio.
- El Oidium por ejemplo es un gnero conocido tambin como cenicilla, causado por el
hongo Uncinula nector, es otra fungosis importante en los cultivos. Ataca todos los
 tejidos verdes y penetra slo las clulas epidermales, pero afecta tambin las clulas
vecinas, dando una apariencia polvosa de color gris blanquecino a los rganos atacados.
El haz y el envs son igualmente susceptibles a la infeccin en cualquier edad de la
hoja, las que se deforman y detienen su crecimiento. Los peciolos y el raquis del racimo
son susceptibles a la infeccin durante todo el ciclo de crecimiento tornndose
quebradizos. (Gonzles L, 1985). Mediante esta tcnica, se permiti la observacin de
este gnero en s, tanto en hojas de rosal, yuca y mango. Sin embargo como se muestra
en las figuras 01, 02 y 03, corresponden a diferentes especies, segn la morfologa que
presentaron sobre todo los conidios tanto en formas ovaladas y alargadas aprecindose
as las diferencias entre ellas.

- Cuando una enfermedad causada por hongos no puede ser identificada fcilmente a
travs de la consulta bibliogrfica, la produccin de signo en cmara hmeda o la
identificacin mediante la tcnica de Graham con cinta adhesiva, es necesario proceder
al aislamiento. El aislamiento de hongos a menudo requiere que se coloquen porciones
de tejido vegetal infectado en diversos medios de cultivo (Shurtleff, M. & Averre.
1997). Sin embargo, estos se someten a un tratamiento con hipoclorito de sodio (leja) al
1%, concentracin que asegura la destruccin de organismos saprfitos que pueden
ubicarse dentro del tejido infectado, y solo permitir el crecimiento del fitopatgeno en
particular. Este hipoclorito de sodio al 1% se retir de los cortes a los 3 min. Y se
enjuagaron los cortes en SSF para impedir que evite el crecimiento del hongo.

- Para la identificacin de agentes causales de enfermedades en plantas, es necesario

realizar la siembra de los cortes en un medio de APD, en un promedio de 5 cortes por
medio de cultivo, esto se debe realizar para asegurar el crecimiento del hongo y para la
identificacin correcta del mismo para evitar as falsos diagnsticos.

- La tcnica del microcultivo permite la observacin e identificacin de las estructuras

microscpicas de hongos filamentosos que se distinguen con facilidad sin distorsin,
alteracin o rompimiento de las mismas. Esto pasa cuando el hongo se desarrolla
directamente bajo el portaobjetos, y forma parte as de las pruebas o mtodos para
identificar el gnero y especie de hongos, y permiten hacer el seguimiento del
desarrollo de los mismos.
Adems, nos proporciona 2 muestras que pueden ser utilizadas para su posterior
montaje y observacin, al quedar las hifas adheridas a la laminilla y otra gran porcin
sobre la lmina portaobjetos.

Esta tcnica resulta sumamente til para aquellos hongos en los que es difcil observar
la formacin de los condios sobre los conidiforos y la forma y estructura de estos;
porque, al efectuar el preparado correspondiente, se desprenden o se rompen. Mediante
este mtodo se puede observar bajo el microscopio, su crecimiento y esporulacin en
todos sus detalles y as tener elementos morfolgicos de estructuras somticas y
reproductivas completas para as poder hacer la identificacin con mayor confiabilidad
y conocer a los hongos como agentes causales de enfermedades en los cultivos de
importancia agrcola (Dhingra, and Sinclair, 1985; Trigiano, Windham,. and Windham,
2004).

- Respecto a la tcnica de montaje usada, la tincin con azul de lactofenol fue la indicada,
esta es una tincin simple (es decir, un slo colorante) y como tal est basada en la
afinidad del colorante por componentes de las clulas, en este caso por las estructuras
fngicas.
 - El colorante azul de lactofenol tiene tres caractersticas que lo hacen especial para
observar dichas estructuras en los hongos del tipo moho obtenidos en los cultivos por
aislamiento: el fenol, el cual destruye la flora acompaante (en los cultivos, pueden
crecer colonias de bacterias). El cido lctico, que conserva las estructuras fngicas al
crear, por decirlo de algn modo, una pelcula que las protege provocado por un
cambio de gradiente osmtico entre el interior y el exterior de dicha estructura y el azul
de algodn, que tiene la capacidad de adherirse a las hifas y conidios de los hongos
microscpicos, permitiendo una adecuada visualizacin.

- En relacin a los hongos fitopatgenos aislados en cultivos de esprrago en la fig. 01 se

observa que en tallo se aisl a Cladosporium sp. Este hongo es considerado saprfito,
que presenta conidios no esfricos, septados y ramificados.

CONCLUSIONES
- El microcultivo es el procedimiento idneo para la identificacin de estructuras
fngicas, pues te permite visualizar al microscopio el micelio en su conjunto no solo
una parte del mismo.
- Es de suma utilidad para la observacin de fitopatgenos, la observacin directa
mediante la tcnica de Graham modificada.
- La tcnica del microcultivo es til para aquellos hongos que es difcil observar la
formacin de los conidios sobre los conidiforos.
- Las caractersticas que posee el azul de lactofenol son las indicadas para que tenga la
capacidad de adherirse a las hifas y conidios de los hongos y permitan as una adecuada
visualizacin.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
- Agrios, G.N. 1995. Fitopatologa. 2a.ed. Mxico, Uthea. 838p.
- Kimati, H.; Bergamin Filho, A.; Amorim, L. 1995. Manual deFitopatologa. Principios e
conceitos.V.1. 3a ed. Sao Paulo. Ceres. 919 p
- Dhingra, O. D. and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC Press. 355
pp SB 732.5 D45.
- Shurtleff, M. C. and C. W. Averre. 1997. The plant disease clinic and field diagnosis of
abiotic diseases. American Phytopathological Society, St. Paul, MN.
- Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Plant pathology, Concepts
and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washinton, D.C., 413 pp.
C.B. SB732.56 P53.
- Bazn, C. Enfermedades de cultivos frutcolas y hortcolas. Edit. Jurdica. Lima. Per.
1975.
- Gonzles, L. Introduccin a la fitopatologa. IICA. San Jos, Costa Rica. 1985.