INVESTIGACION UNIDAD 5.

ESTABLECIMIENTO DEL
CULTIVO DE TEJIDOS

Equipo
Jose Rafael Ramirez Magaa
Jose Domingo Chi Moo
Ruben Israel Ek May

PROFESOR: VICTORIANO VELASQUEZ KU

 ndice
5. ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO DE TEJIDOS.............................................3
5.1 Etapas del cultivo de tejidos............................................................................3
5.1.1. Establecimiento asptico.............................................................................3
5.1.2. Multiplicacin.................................................................................................3
5.1.3. Enraizamiento................................................................................................4
5.1.4 Adaptacin......................................................................................................4
5.2. Seleccin de la planta madre..........................................................................5
5.2.1. Genotipo.........................................................................................................6
5.2.2. Fitosanidad.....................................................................................................6
5.2.3. Edad de la planta...........................................................................................8
5.2.4. Condiciones de crecimiento de la planta....................................................9
5.2.5. Edad del rgano o tejido vegetal.................................................................9
5.3 Explante............................................................................................................10
5.3.1. Tipo de explante...........................................................................................11
5.3.2. Posicin del explante..................................................................................11
5.3.3. Tamao del explante....................................................................................11
5.4 Siembra del explante.......................................................................................11
5.4.1. Desinfeccin del explante..........................................................................12
5.4.2. Diseccin del explante................................................................................12
5.4.3. Siembra en diferentes medios: slidos y lquidos..................................13
5.5. Condiciones de incubacin...........................................................................14
5.5.1. Fotoperiodo..................................................................................................14
5.5.2. Intensidad lumnica.....................................................................................15
5.5.3. Temperatura.................................................................................................15
5.5.4. Humedad relativa.........................................................................................15

1
 5. ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO DE TEJIDOS.

La biotecnologa vegetal hace posible que los proyectos agropecuarios tengan

ms realce y despunte a la hora de ejecutarlos, ahora vamos a entender sobre el
establecimiento del cultivo de tejidos vegetales in vitro.
El termino cultivo de tejidos es muy amplio y tiene numerosos objetivos,
dependiendo de la orientacin que se quiera dar al laboratorio. La tcnica de
cultivo de tejidos in vitro es muy heterognea mediante las cuales un explante, que
no es ms que la parte separada de un vegetal, por ejemplo un trozo de hoja,
tejido, etc., se cultiva aspticamente en un medio de composicin qumica
definida, para luego incubarla en a condiciones ambientales controladas.

La separacin del explante y las operaciones relacionadas con su incubacin in

vitro, depender en gran medida del tipo de explante y del sistema de cultivo in
vitro que se emplee, basndose desde luego en los objetivos que se persigan.
Para el establecimiento de cultivo de tejidos, se deben analizar aspectos
importantes tales como: el explante, la sepsia, los medios de cultivo y las
condiciones ambientales de incubacin.

5.1 Etapas del cultivo de tejidos.

5.1.1. Establecimiento asptico.

El cultivo de tejidos comienza a partir de trozos extrados de la planta madre.

Estos pequeos rganos o trozos de tejido se llaman explantes. Las plantas que
crecen en el medio natural estn contaminadas por microorganismos (bacterias y
hongos). Los explantes antes de ser introducidos en el medio de cultivo han de ser
esterilizados. Posteriormente se introducirn en el medio a su vez estril y se
mantendrn all en condiciones aspticas.

5.1.2. Multiplicacin.

Una vez que la primera fase se ha completado con xito, comienza la

multiplicacin de los explantes. El explante encuentra en el medio de cultivo todo
aquello que necesita para su crecimiento y desarrollo (agua, elementos minerales,
azcares, hormonas, etc.). Tras un perodo de crecimiento (4-8 semanas) es
necesario el subcultivo y paso a un nuevo medio. Es en este paso donde se
produce la multiplicacin de las plantas.

5.1.3. Enraizamiento.

Antes de llevar las nuevas plantas al exterior es necesario proporcionarles una

raz con la que sean capaces de realizar
2 sus actividades vitales una vez que se
encuentren de nuevo en el medio natural. La induccin de estas races se produce
modificando ligeramente las caractersticas del medio de cultivo adecundolas
para la generacin de races.

5.1.4 Adaptacin.

Esta fase consiste en el paso de las plantas del cultivo al medio natural. Este es
un paso extremadamente importante, ya que si no se realiza cuidadosamente se
pueden perder gran nmero de plantas. Las plantas en condiciones de cultivo
estn en una atmsfera con alta humedad y baja intensidad luminosa, por tanto el
tejido epitelial se caracterizar por tener menos ceras que protejan a las plantas
contra la deshidratacin. El acondicionamiento de nuevo al medio exterior se
efectuar por tanto cuidadosamente, utilizando para ello invernaderos.

Esquema 1. Resumen de cinco etapas del cultivo de tejidos, segn Montoya en

1991.

Etapas del cultivo de

tejidos

5.2. Seleccin de la planta madre.

3
La correcta eleccin y preparacin del explanto incide directamente sobre la
calidad del mismo y su respuesta frente a los dos principales problemas que
afectan al establecimiento del cultivo, que son la contaminacin con
microorganismos y la oxidacin del explanto. Los factores que influyen sobre la
calidad del explanto son: el tipo de rgano que sirve como explanto, la edad
ontognica y fisiolgica del mismo, la estacin en la cual se colecta el material
vegetal, el tamao y el estado sanitario general de la planta donante.

La planta donante debe elegirse en base a una seleccin masal positiva para las
caractersticas agronmicas deseables. Una vez seleccionados los individuos, es
preciso definir el tipo de explanto a establecer en condiciones in vitro. En general,
los rganos jvenes o bien rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el
establecimiento que los obtenidos a partir de materiales adultos. El empleo de
explantos que se encuentran expuestos a bajos niveles de patgenos puede
resolver el problema de la contaminacin por hongos y bacterias durante el
establecimiento del cultivo in vitro. Se recomienda colectar explantos primarios a
campo durante la estacin primaveral y estival, cuando existe una brotacin activa
de las yemas, ya que el empleo de yemas en estado de dormicin ocasiona serios
problemas de contaminacin. A fin de lograr explantos de ptima calidad es
conveniente hacer crecer las plantas donantes por un tiempo mnimo en
condiciones de invernculo. De esta forma es posible incidir directamente sobre el
estado sanitario y la calidad de los explantos mediante el control de la intensidad
lumnica, temperatura y reguladores de crecimiento. Para especies ornamentales
tropicales y subtropicales se recomienda mantener las plantas donantes en
condiciones de alta temperatura (25C) y baja humedad relativa (75%) a fin de
reducir la proliferacin de patgenos.

5.2.1. Genotipo

En general se asume que la frecuencia de cambios depender de variaciones

preexistentes en el genotipo y de las interacciones que surgen entre el genotipo y
el proceso de cultivo. En arroz, ciertas variedades estables muestran niveles de
variacin que oscilan entre el 0 y el 1%, mientras que en otras, consideradas
inestables, oscilan entre el 10 y el 27%. En Kalanchoe, especie ornamental, la
variacin somaclonal es genotipo dependiente y se la utiliza como una
herramienta para la obtencin de variedades.

5.2.2. Fitosanidad.

La propagacin natural se producen en poca cantidad y son fuertemente daadas

por parsitos y depredadores, razn por la cual es un factor limitante para la
obtencin de material para futuras plantaciones. Las tcnicas biotecnolgicas
pueden jugar un rol importante, para el suministro
4 adecuado de vitroplantas como
material de plantacin. La germinacin in vitro posibilita dicho proceso en
condiciones aspticas y controladas en cualquier poca del ao, permitiendo
disminuir el proceso de germinacin as como obtener plntulas en condiciones
fitosanitarias apropiadas para trabajos de cultivo in vitro. Sin embargo, para el
establecimiento exitoso de estas especies, se hace necesario prevenir y controlar
la contaminacin microbiana y oxidacin fenlica, ya que constituye uno de los
problemas ms graves en la micropropagacion.

El cultivo in vitro de tejidos vegetales resulta una herramienta potente, bsica y

necesaria, en la propagacin de plantas que presentan dificultad para multiplicarse
vegetativamente, abarcando una serie de tcnicas para su manipulacin y control.
Bsicamente consiste en el cultivo sobre un medio nutritivo artificial en
condiciones aspticas. As, las plantas completas o partes de ellas (explantes),
como: semillas, embriones, rganos, tejidos, clulas y protoplastos, pertenecientes
a diversas especies vegetales, son cultivadas in vitro. Dichas tcnicas permiten
controlar los procesos fisiolgicos de crecimiento y desarrollo de la planta, como
son: divisin celular, germinacin, brotacin, enraizamiento, floracin y
fructificacin (8), adems de que pueden desempear un papel importante en el
suministro adecuado de vitroplantas como material de plantacin.

La contaminacin microbiana es uno de los problemas ms graves en la

micropropagacin de especies vegetales a nivel mundial, produce cuantiosas
prdidas de material, tanto en los trabajos de investigacin como en la
micropropagacin comercial. Puede tener dos orgenes: a) microorganismos que
colonizan la superficie o el interior del explante (endfitos) y b) microorganismos
introducidos durante la manipulacin en el laboratorio. Los contaminantes ms
frecuentes en condiciones in vitro son los hongos, las bacterias y levaduras,
denominados "vitropatgenos", aunque tambin existen otros menos frecuentes
como los virus, viroides y microartrpodos (caros y trips). El trmino
vitropatgeno ha sido usado para aquellos organismos que no son
necesariamente patgenos para las plantas en el campo, pero s son perjudiciales
para clulas, tejidos u rganos cultivados in vitro, mientras que el trmino
patgeno ha sido confinado para describir a un organismo que causa enfermedad
a las plantas cultivadas en el campo. Se ha sugerido que los vitropatgenos
pueden ser dainos para el cultivo de tejidos vegetales, ya que compiten con el
explante por los nutrientes del medio y les producen daos directos e indirectos
por la colonizacin de sus tejidos o liberacin al medio de metabolitos txicos,
aunque en la actualidad no se encuentran muchos trabajos en la literatura
cientfica que expliquen el mecanismo de accin de los contaminantes, que los
hacen perjudiciales para las plantas in vitro.

Algunos encontraron que la inoculacin de plantas in vitro de Hemerocallis con la

bacteria no patgena Lactobacillus platarum, un contaminante frecuente del cultivo
de tejidos, causaba una disminucin del coeficiente de multiplicacin, seguido de
un rpido deterioro de los cultivos. Ellos refirieron, adems, que esto coincidi con
el incremento del nmero de bacterias y la concentracin de cido lctico en el
medio de cultivo. Ellos demostraron que 5 el efecto perjudicial de Lactobacillus
plantarum era un resultado directo de la produccin de cido lctico, ms que del
efecto general de la disminucin del pH. Los coeficientes de multiplicacin de
plantas infectadas con contaminantes bacterianos latentes pueden mantenerse
inalterables, pero reiteradamente se ha referido que decrecen. No obstante, en el
cultivo de clulas y tejidos vegetales, el efecto de la presencia de microorganismos
no ha sido ampliamente examinado.

Las bacterias son los contaminantes in vitro ms comunes y ocasionan serios

problemas, porque pueden ser sistmicas as como difciles de detectar y eliminar.
Estos microorganismos escapan a los efectos de los esterilizantes superficiales y
pueden ser inter o intracelulares. Entre los ltimos, se encuentran los virus,
viroides y muchos gneros bacterianos como: Agrobacterium, Bacillus,
Corynebacterium, Lactobacillus, Erwinia, Enterobacter y Pseudomonas. Su
distribucin puede ser localizada o sistmica por xilema o floema. Estos
contaminantes no se manifiestan en los primeros subcultivos, ya que la alta
presin osmtica, el pH y ciertas hormonas de los medios de cultivo pueden inhibir
su crecimiento. Debido a este efecto inhibitorio, muchos microorganismos
requieren un perodo de adaptacin a las nuevas condiciones antes de manifestar
su presencia; esto ocurre por lo general en la fase de multiplicacin.

Entre las principales fuentes de contaminacin bacteriana se citan los explantes, el

ambiente de los locales de trabajo, los operadores y las tcnicas deficientes de
esterilizacin. Adems, los microorganismos pueden diseminarse por caros, trips
y hormigas. El ambiente de los locales de trabajo es una fuente de contaminacin,
ya sea directa o indirectamente. Se plantea que a travs de las corrientes de aire,
las partculas del suelo cargadas de esporas y clulas de microorganismos son
arrastradas y penetran por los acondicionadores de aire, son transportadas e
introducidas por el hombre y permanecen en el ambiente por condiciones
higinicas inadecuadas. Del mismo modo, el tipo de cultivo (anual o perenne), la
forma de propagacin (sexual o asexual) y las condiciones climticas influyen en
la gravedad de las contaminaciones. Las condiciones climticas en zonas
tropicales favorecen el desarrollo y la multiplicacin de los microorganismos, que
tienen un efecto negativo sobre los explantes. El xito de los sistemas de
propagacin de plantas por biotecnologa depende en gran medida del control y la
prevencin de la contaminacin microbiana. Existen varias estrategias para
controlar y manejar la contaminacin, que incluyen la prevencin mediante la
seleccin y el tratamiento de la planta madre, la desinfeccin superficial del
explante y la identificacin de los microorganismos contaminantes, el control de la
contaminacin a travs del uso de sustancias antimicrobianas y el cultivo de
meristemos.

5.2.3. Edad de la planta.

6
La edad es un factor importante ya que los tejidos juveniles poseen un alto grado
de actividad meristematica y tienden a tener mas plasticidad in vitro que los
adultos, como es el caso de la respuesta de cotiledones, hipoctilos y hojas
aisladas de material juvenil que son usadas para micropropagacion. Los tejidos
juveniles presentan una mayor capacidad morfogenetica, la cual se manifiesta en
respuesta de crecimiento, proliferacin y enraizamiento, a diferencia de un tejido
maduro el cual es mas difcil de desdiferenciar e inducir a la produccin de races
y brotes.

Es mucho ms difcil propagar material adulto que juvenil ya que los primeros son
recalcitrantes, es decir, difciles de regenerar. Sin embargo, an en estos casos es
posible extraer explantos de mayor capacidad regenerativa mediante dos formas:

1) seleccionando los tejidos ms juveniles dentro de un rbol.

2) induciendo el rejuvenecimiento del rbol donante antes de aislar los explantos

Para seleccionar el material ms juvenil en una planta adulta hay que considerar el
fenmeno de topfisis. Este es un proceso por el cual el tipo de crecimiento de un
nuevo individuo est determinado por la posicin que ocupaba en la planta adulta.
Esto es ocasionado por efecto del envejecimiento fisiolgico e implica que los
explantos ms reactivos in vitro se encuentran en las yemas de las reas basales
del tronco y races.

5.2.4. Condiciones de crecimiento de la planta.

Los cultivos de tejidos vegetales deben mantenerse en condiciones ambientales

semejantes a las naturales ms favorables. La luz, la temperatura y la humedad
relativa son los principales factores del ambiente que inciden sobre los cultivos. El
comportamiento de muchos cultivos depende de la calidad, intensidad y
fotoperodo de la luz que reciben, dado que varias enzimas involucradas en el
desarrollo y en el metabolismo secundario son influenciadas por la luz. La mayora
de los cultivos desarrollan a una intensidad luminosa entre 5 a 25 W/m 2 (1000 a
5000 lux). Si bien la calidad de la luz puede determinar diferentes respuestas
morfognicas, en general se utiliza luz blanca, pobre en longitudes de onda larga.

El fotoperodo habitualmente utilizado es de 16 horas de luz y 8 horas de

oscuridad, aunque algunos cultivos requieren oscuridad. La temperatura de las
cmaras de cultivo se regula en general entre 22 y 28C, permitiendo as el
desarrollo tanto de especies de climas templados como de plantas tropicales. Es
de destacar que durante el perodo iluminado, la temperatura en el interior de los
frascos de cultivo es 1-2C superior a la de la cmara, debido al efecto
invernadero; se crea as un termoperodo suave. La velocidad de sntesis y de
degradacin de distintos compuestos y por ende el nivel de produccin y
acumulacin de metabolitos tambin es influenciado por la temperatura. En cuanto
a la humedad relativa, sta se mantiene en alrededor del 70 % en las condiciones
en las que se realizan habitualmente los 7cultivos, aunque vara con la temperatura
de la cmara y el tipo y cierre de los recipientes. El porcentaje de humedad
relativa no es reportado en la mayora de los trabajos sobre cultivo in vitro de
vegetales.

5.2.5. Edad del rgano o tejido vegetal.

Gran parte del cultivo de tejidos, esta en la edad del explante que va ser utilizado
para los trabajos. La edad de la planta y el grado de diferenciacin del tejido
muchas veces etas interrelacionados y pueden producir efectos interactivos se
cultivan in vitro. Por ejemplo, segn los experimentos realizados por Toivonenn y
Kartha en 1988, quienes trabajaron con Pinus glauca, descubrieron que las
plntulas a las que se les extirpo los cotiledones 7 a 8 das luego de ser plantadas,
formaban las primeras yemas adventicias antes que plntulas cuyas yemas fueron
extirpadas luego de los 8 dias. Asi tambin de yemas adventicias en explantes de
hojas de Cucumis melo, mostraron mayor produccin en los explantes que tenan
un tamao entre 0.3 y 0.5 mm los cuales tenan 14 das de plantados. Esta
propiedad no tenia aquellos explantes que tenan ms de 21 das. La edad del
explante puede clasificarse en cuatro clases:

1.-Edad del rgano o de la planta que ha sido extraida: es al edad biolgica de la

planta, es el tiempo que transcurri desde que la planta comenz como retoo o
como embrin.
2.-Edad fisiolgica o ontogenetica o fase de crecimiento: incluye los conceptos de
juvenilidad y adulto.
3.-El grado de diferenciacin: con este concepto, las partes ms jvenes de la
planta son clulas meristematicas no diferenciadas. Tericamente se dice que
algunas plantas poseen las clulas meristematicas siempre en estado juvenil y
que podran vivir para siempre.
4.-Periodo de cultivo: es el tiempo desde que recin se instala el cultivo.

5.3 Explante.

El concepto de explante se refiere a cualquier parte vegetal que ha sido separada

de la planta, que puede ser un tejido (fragmentos de hojas, tallos, races, ptalos,
etc.), un rgano (semillas, anteras, ovarios, botones florales, hojas y races
completas, etc.), estructuras como las anteras y los ovarios, o bien clulas
individuales (como en el caso de los protoplastos). Con excepcin de los vulos y
el polen, los explantes estn constituidos por tejidos y/o clulas somticos. El
nombre explante es una versin castellanizada del vocablo ingls explant;
acuado especialmente para identificar a los tejidos vegetales cultivados in vitro y
sin otro significado. La seleccin del explante es un aspecto clave para tener xito
en el cultivo de tejidos, ya que dependiendo de su ubicacin en la planta, del tipo
de tejido que contiene, de su edad cronolgica y fisiolgica, de su contenido
endgeno de hormonas, entre otros, se comportar
8 de una manera o de otra.
La variacin tambin puede ser una consecuencia de quimerismo en el explanto
original. Las quimeras son mosaicos genticos. Esto significa que dentro de una
misma planta existen clulas con diferente constitucin gentica, lo cual se debe a
una serie de cambios producidos durante el desarrollo en el ADN nuclear de
ciertos tipos celulares. Si estos tejidos se utilizan como explantos y sus clulas son
inducidas a dividirse y rediferenciarse, las diferentes lneas celulares podran
entonces dar origen a plantas genticamente diferentes. Por lo tanto, la utilizacin
de explantos con tejidos quimricos preexistentes puede resultar en una fuente
extra de variacin. Sin embargo, la recuperacin de quimeras a partir de explantos
no quimricos es un fenmeno frecuente que puede ocurrir a partir de procesos
organognicos. La utilizacin de explantos con tejidos organizados como esquejes
radicales o caulinares sera una buena opcin si es necesario mantener
estabilidad gentica durante el cultivo in vitro. Sin embargo, diferentes genotipos
reaccionan de manera distinta, an con explantos seguros. Parecera que el
cultivo de meristemas aislados sera la mejor opcin para minimizar el riesgo de
variacin somaclonal. Sin embargo, esto no debera tomarse como regla.
Utilizando tcnicas moleculares fue posible detectar la ocurrencia de variacin en
plantas de frutilla y paraso obtenidas a partir de meristemas. El cultivo de
protoplastos parecera inducir, en ocasiones, inestabilidad gentica, como fue
observado en papa y Nicotiana. Esto, en ocasiones, ha sido asociado a los
mayores tiempos en cultivo involucrados en la regeneracin de plantas a partir de
explantos tan pequeos.

5.3.1. Tipo de explante.

El material vegetal con el que se inicia un cultivo in vitro puede ser cualquier
clula, tejido u rgano de la planta (explante). Comnmente se seleccionan
aquellas partes de la planta que se encuentran en divisin activa, como las
regiones meristemtica:

Tejidos somticos: de tallo, raz, hoja, meristemos

Tejidos reproductores: anteras, polen, microesporas, vulos, semillas

Si se elimina la pared celular de las celulas se obtiene un cultivo de protoplastos.

5.3.2. Posicin del explante.

El mejor explante que podemos utilizar en la planta es aquel que se encuentra

en posicin del tercio de en medio de la planta, es decir la planta la dividimos en
tres partes, escogemos los explantes de la parte de en medio todos los que esten
ubicados en esa zona, estos son potencialmente buenos para usarlos de explante
en cultivos in vitro.

9
 5.3.3. Tamao del explante.

El tamao del explante es un factor que tambien puede determinar la respuesta in

vitro. Explantes muy pequeos requieren el empleo de medios de cultivo mucho
mas complejos y la vitalidad y la capacidad regenerativa tiende a ser bajas.
Explantes grandes son mas difciles de desinfectar pero generalmente poseen un
mayor potencial regenerador considerablemente mayor. En varios trabajos se han
demostrado las ventajas que ocasiona el pretratamiento de las plantas donantes
con reguladores del crecimiento para reactivar el desarrollo de las plantas
donantes.

5.4 Siembra del explante.

Una vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado
para evitar la proliferacin de contaminantes biolgicos (bacterias, hongos y
levaduras principalmente) en el medio, los cuales afectan el crecimiento y
desarrollo del explante (Fontrbel 2001) y compiten con el mismo deteriorndolo y
hacindolo inservible para cultivo (Kyte & Kleyn 1996). Los explantes
desinfectados son trasladados a una cmara de flujo laminar (con aire filtrado,
libre de microorganismos) donde se realizar la transferencia a un medio de
cultivo apropiado (Kyte & Kleyn 1996) al tipo de especie y las necesidades del
cultivo. Una vez que el explante est en el medio, se sella el rasco de cultivo y se
traslada a una cmara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y
fotoperiodo controladas para su desarrollo. Una vez que los explantes luego de
algunas semanas en la cmara de crecimiento han desarrollado algunas races y
hojas, es el momento de realizar el traspaso al invernadero. Este es uno de los
pasos ms difciles de la tcnica, ya que los explantes in vitro se encuentran en
condiciones ambientales muy diferentes y se alimentan de manera heterotrfica
(del medio de cultivo) y el estrs de adaptacin a las condiciones de vivero es muy
fuerte (Kyte & Kleyn 1996, Fossard 1999). Un porcentaje de las plntulas
clonadas in vitro no sobrevive al invernadero, pero la parte que si sobrevive crece
ya en condiciones normales y al cabo de unas semanas est lista para ser
trasladada al campo de cultivo.

5.4.1. Desinfeccin del explante.

Realizar una adecuada preparacin de la planta dadora de explantes,

cultivndola preferentemente en invernaderos tratadas con productos qumicos
que eliminen patgenos y eventuales microorganismos endfitos.
Los explantos deben ser esterilizados antes de ser establecidos en condiciones de
cultivo. Protocolo del tipo de esterilizacin superficial de material vegetal son:

Lavado con agua corriente durante 20-30min

Etanol 70%, entre 5 y 10 seg.
10
 Solucin de hipoclorito de sodio (NaCIO) de 5 a 20%, entre 5 y 30 min. Este
paso puede ser reemplazado por el uso de soluciones diludas de bicloruro
de mercurio (HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%.
Enjuagues con abundante H2O estril (4 5 veces).
En el caso del HgCl2 , el material se debe enjuagar sucesivas veces pues
es difcil de eliminar.

5.4.2. Diseccin del explante.

Cultivar los explantes en una cmara de transferencia con aire estril (gabinete
de flujo laminar), localizada en un ambiente limpio y no expuesta a corrientes de
aire. De no disponer este equipamiento, se pueden sustituir con cuartos
esterilizados previamente con luz ultravioleta (nunca exponerse a la luz UV en
forma directa). La mesada de trabajo y las paredes del gabinete deben ser
desinfectadas previamente con etanol al 70%. De la misma manera deben ser
desinfectados exteriormente todos los recipientes (conteniendo medios de cultivo,
agua, etc.) que ingresen en el rea del aire estril. Los operarios constituyen
frecuentemente una importante fuente primaria de contaminacin, porque es
recomendable que, antes de comenzar a trabajar laven sus manos y antebrazos
con abundante agua y jabn y se des infecten con etanol al 70 %. La utilizacin
de guardapolvos, guantes y mscaras protectoras de la boca y de la nariz, as
como los gorros protectores de los cabellos, ayudan a reducir sensiblemente los
niveles de contaminacin. Los instrumentos de trabajo (pinzas, pipetas, tijeras,
agujas, cpsulas de Petri) deben ser esterilizados antes de su uso. Muchos de
estos instrumentos pueden ser colocados en etanol al 95% y, antes de ser
usados, se deben flamear cuidadosamente en la llama de un mechero.

Tambin es necesario flamear la boca de los recipientes que contienen los

medios de cultivo antes y despus de cultivar el explante. Incubar los cultivos en
cmaras o cuartos de cultivo, cerrados, libres de corrientes de aire y bien
higienizados. En lo posible se debe restringir la circulacin de personas, y los
recipientes con cultivos contaminados deben ser rpidamente eliminados de este
sector. Es conveniente que antes del lavado, estos cultivos sean esterilizados.

5.4.3. Siembra en diferentes medios: slidos y lquidos.

Consistencia del medio.

El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las
caractersticas del medio de cultivo (lquido o semi-slido). dependiendo de las
caractersticas del medio de cultivo (lquido o semi-slido). En el caso de un medio
slido, la concentracin y calidad del gar pueden tener importantes efectos en el
desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.). El cultivo en medio
lquido se utiliza cuando la propagacin in vitro es desarrollada a travs de las
11
siguientes vas. El cultivo en medio lquido se utiliza cuando la propagacin in vitro
es desarrollada a travs de las siguientes vas:

Induccin de embriognesis
Cultivo de protoplastos
Cultivo de suspensiones celulares

Otro aspecto importante a tener en cuenta es la consistencia del medio de cultivo.

Puede emplearse como semislido o lquido. El agente gelificante ms empleado
en el cultivo in vitro es el agar extrado de diversas algas marinas. Las diferentes
calidades existentes en el mercado modifican la expresin morfognica debido a
que pueden contener sustancias inhibitorias o promotoras del crecimiento. Tal es
el caso del cultivo de hojas de Actinidia chinensis, cultivadas en una solucin de
MS con el agregado de 0,1 mg.L -1 de AIA + 1 mg.L -1 de BAP, donde se observ
una respuesta morfognica diversa segn el tipo de agar seleccionado. Por
ejemplo, cuando el gelificante empleado fue Chubut-agar, de produccin nacional,
se observ una gran diferenciacin de yemas adventicias, mientras que con el
agregado de agar SIGMA R slo se indujo la proliferacin de callo. En caso de
seleccionar medios de cultivo lquidos, la respuesta morfognica observada vara
de manera considerable. El cultivo lquido es imprescindible cuando se busca
promover la morfognesis indirecta a travs de suspensiones celulares. Para ello
es necesario cultivar los callos en medio lquido con agitacin para permitir que las
clulas se disgreguen y puedan diferenciar races, brotes o embriones somticos
en forma aislada. La seleccin del medio de cultivo lquido o slido depende,
adems, de la especie empleada.

En Cymbidium spp, por ejemplo, se ha observado que el empleo de medio de

cultivo lquido promueve una mayor diferenciacin de protocormos respecto del
mismo medio gelificado. A su vez, este proceso puede mantenerse durante varios
subcultivos mientras que en medio de cultivo gelificado se observ que los
protocormos tienden a formar tallos.

5.5. Condiciones de incubacin.

Factores relacionados con el ambiente de incubacin

Luz, obscuridad o fotoperiodo
Tipo de luz
Temperatura

Como se puede ver el numero de factores implicados en el proceso de

organognesis es muy grande, y el fenmeno
12 en si no se comprende lo suficiente
como para manipularlo a partir de una base solida de conocimientos. Los
conocimientos bsicos que se tienen hasta la fecha provienen en su inmensa
mayora de experimentos de ensayo y error. Debido a esto al trabajar por primera
vez con una especie debern montarse experimentos que nos permitan desarrollar
el mejor sistema para regenerar rganos a partir de ese material vegetal.

La incubacin de los cultivos se debe llevar a cabo en condiciones controladas.

Por lo menos en lo que se refiere a temperatura, calidad e intensidad de luz,
fotoperodo, humedad atmosfrica e higiene. Estas condiciones se logran con el
empleo de cmaras climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire
acondicionado (fro-calor) y una buena y uniforme circulacin de aire en el interior
y dotados de un buen sistema de alarma para cortar la iluminacin en caso de no
funcionar el aire acondicionado. En general, los cultivos son incubados a
temperatura constante de 25-28 C, con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La
luz es generalmente provista por lmparas fluorescentes del tipo luz da con
una irradiancia de entre 50 y 200mol m-2s-1. La humedad atmosfrica debe ser
elevada (80- 90%).

5.5.1. Fotoperiodo.

La alternancia de los ciclos de luz con los de oscuridad: EL FOTOPERODO.

Algunos fenmenos propios del desarrollo de las plantas (germinacin, La
alternancia de los ciclos de luz con los de oscuridad: EL FOTOPERODO. Algunos
fenmenos propios del desarrollo de las plantas (germinacin, floracin,
tuberizacin,...) pueden ser activados por el nmero de horas diarias de luz que
recibe la planta. De forma anloga, el nmero de horas de luz que recibe el
explanto cultivado in vitro puede afectar a su desarrollo. En general, el mejor
fotoperiodo in vivo ser tambin el mejor fotoperiodo in vitro. En general se utiliza
luz blanca y un fotoperiodo de 16hs de luz y 8 hs de oscuridad.

5.5.2. Intensidad lumnica.

La luz es uno de los factores principales que determinan el desarrollo de los

organismos auttrofos, en ello radica la importancia de controlar el factor luz en los
cultivos in vitro. Los aspectos aspectos relacionados con la luz que son
importantes en los cultivos in vitro son:

La cantidad de luz: LA IRRADIACIN . La irradiancia puede ser expresada

en funcin de la energa por unidad de superficie W/m2

La calidad de la luz: EL ESPECTRO () Los tubos fluorescentes son las

fuente de luz ms usada en las cmaras de cultivo.

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 5.5.3. Temperatura.

La temperatura de incubacin de los cultivos es un factor importante a tener en

cuenta. Si bien en las condiciones naturales de cultivo las plantas tienen
diferencias trmicas durante el da y la noche, las temperaturas in vitro se
mantienen casi estables. Es importante sealar que cuanto ms se asemejen las
condiciones in vitro a las ptimas de crecimiento de la especie estudiada, mayor
ser la respuesta esperada. En cultivos de hojas de Streptocarpus x hybridus
sometidos a diferentes temperaturas, se observ que la regeneracin mayor de
brotes se obtuvo a 12 C, mientras que por encima de los 30 C casi no hubo
diferenciacin.

5.5.4. Humedad relativa.

La humedad relativa (HR) como medida de la cantidad de vapor de agua

contenida en la atmsfera gaseosa, es otro de los parmetros fsicos a tener en
cuenta. La HR depender del sello o cobertura del envase empleado. Si este
cierre es hermtico, la humedad interior ser del 100 %. Si existe la posibilidad de
un intercambio gaseoso, la humedad interna puede descender a niveles cercanos
al 50 %. Este importante descenso del contenido de HR puede promover una
prdida veloz de agua del medio de cultivo, variando la concentracin de sus
compuestos hasta llegar a niveles txicos.

BIBLIOGRAFIA.

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