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PROCEDIMIENTO DE SIMBRA DE PLACAS PETRIFILM

Materiales:

- Pipetas
- Pipeteador
- Whirlpac

Equipos:

- Cmara de flujo laminar


- Balanza analtica
- Mufla

Procedimiento:

1. Preparar una dilucin de la muestra de alimento 1:10 o superior. Pesar o pipetear la


muestra en una bolsa Whirlpac, bolsa Stomacher, botella de dilucin o cualquier
otro recipiente estril apropiado.
2. Aadir una cantidad adecuada de alguno de los diluyentes de uso general indicados
en ISO 6887 o ISO 8261/IDF 122 tales como diluyente peptona-sal y agua de
peptona tamponada. Pueden usarse otros diluyentes, por ejemplo, fosfato hidrgeno
dipotsico, caldo letheen o agua destilada.
3. Mezclar u homogeneizar la muestra mediante los mtodos usuales.
4. Disponer la placa Petrifilm en una superficie plana. Levantar el film superior.
5. Pipetear 1 ml de muestra al centro aproximadamente del film inferior. Mantener la
pipeta en posicin vertical. No tocar el film inferior mientras se pipetea.
6. Bajar el film superior con cuidado, sin dejarlo caer, para evitar la formacin de
burbujas de aire.
7. Con la cara lisa hacia abajo, colocar el aplicador en el film superior sobre el
inculo.
8. Con cuidado, aplicar presin sobre el aplicador para distribuir el inculo por toda la
zona circular. No girar ni deslizar el aplicador.
9. Levantar el aplicador. Esperar 1 minuto para que se solidifique el gel.
10. Incubar las placas Petrifilm cara arriba en grupos de no ms de 20 placas a
temperatura de 30C+-1C o 35C+-1C o 37C+-1C durante 24+-2 horas.

PROCEDIMIENTO GENERAL PARA SIEMBRA CON AGAR EN PLACA


Muestras biolgicas del alimento obtenido de una produccin de planta

Materiales:

- Placas de Petri
- Pipetas
- Asas

Equipos:

- Estufa
- Mecheros de bunsen

PROCEDIMIENTO:

La muestra del alimento obtenida de una produccin en la planta, como es una


muestra especial se le dio un tratamiento previo:
1. En un frasco estril se agrega aproximadamente 5ml del alimento (previamente
entibiada) y se le completo con 45 ml de agua destilada estril.
2. Se homogenizo la muestra movindola de una manera rotatoria aproximadamente 10
minutos.
3. Luego se pas a sembrar en las placas respectivas usando el asa calibrada, se pasa el
asa por el mechero y se deja enfriar y se toma la muestra y se sobre la placa se hacen
zigzag con el asa inoculada.
4. Se lleva la placa a la estufa y se tiene 37C durante 48 h para el recuento de las
bacterias.

DETERMINACIN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES. MTODO DE


RECUENTO POR DILUCIN EN TUBO.
Materiales:

- Medios de cultivo: Caldo Brilla (presuntivo), agar MacConkey, agar Endo, EMB,
CB.
- Caldo EC
- Tubos de dilucin
- Pipetas
- Bombilla de aspiracin
- Placas de Petri
- Mechero Bunsen
- Bao Mara
- Estufa
- Gradillas
- Balanzas microbiolgicas calibradas

Procedimiento:

1. Preparamos diluciones hasta 10-3.


2. Sembramos dos, tres o cinco tubos por cada dilucin, segn sea el caso.
Los resultados se dan en por gr o mL

En el caso de agua se sigue de la otra forma:

1. Cuando se trate de aguas, los resultados se darn por 100 mL.


2. Luego, incubar a 35 C 1 por 24 h.
3. Realizar la 1ra lectura (determinar la presencia de gas). sta se observa en las
campanas.
4. Los tubos que no sean positivos se incuban por otras 24 h ms.

Mtodos para Coliformes fecales:

Para Coliformes fecales se utilizan dos mtodos:

En el Primer Mtodo

1. Se cogen los tubos positivos del caldo Lauril Sulfato Triptosa y se lleva una asada
al caldo EC utilizando un asa que tenga 3 mm de dimetro.
2. Luego, estos tubos se incuban a 45.5 C 0.2, en bao Mara con agitacin
constante por 24 h.
3. Si hay gas a las 24 o 48 h. es positivo para Coliformes fecales.

El Segundo Mtodo es la llamada prueba de Mackenzie.

En esta se usa el caldo Brila mas agua Peptonada.

Se parte del caldo MacConkey, los tubos positivos de la prueba de Coliformes totales se
siembran en este caldo, si aqu vuelve a salir positivo se le realizan las dos pruebas sgtes:

Slo se tomar esta prueba como positiva si los dos tubos (caldo Brilla y caldo Peptonado)
resultan positivos.

Al tubo con caldo peptonado se le agrega el reactivo de Kovacs para hacer la prueba de
Indol.

Para ver Coliformes termo resistentes, de los tubos que hayan salido positivos se siembra
una asada en agar MacConkey y se aslan las colonias caractersticas.

De los tubos positivos se los siembra en otros tubos en caldo EC con campana de Durham.
DETERMINACION DE BACTERIAS AEROBIAS TOTALES EN UNA MUESTRA
DE HELADO

Materiales:

- Placas con medio TSA


- Tubos con solucin salina conteniendo 4.5 ml
- Pipetas estriles

Procedimiento:

1. Tomar un frasco con la muestra del alimento cuyo nmero de bacterias se quiere
determinar y hacer diluciones decimales de la muestra. Las diluciones se realizan
tomando 0.5 ml de la muestra del alimento y pasndolo a un tubo que contenga 4.5
ml de solucin salina. De esta manera se ha conseguido disminuir el nmero de
bacterias 10 veces por lo que a esta dilucin se le denomina la 10.

2. De ella se toma 0.5 ml que se pasan a otro tubo con 4.5 ml obteniendo as la dilucin
10. Y as sucesivamente hasta llegar a una dilucin de la que se sospeche que va a
haber un nmero de clulas inferior a 100 por mililitro.
3. Una vez hechas las diluciones, se eligen tres de ellas, para realizar la siembra por
triplicado es decir se siembran tres placas de cada una de las diluciones elegidas con
0.1 ml. La siembra de realiza con esptula.

4. Una vez sembradas las placas se llevan a incubar a 37C durante 48 h para el
recuento de las bacterias
MARCHAS ANLISIS EN MATERIA PRIMA

Siembra de Coliformes totales

Materiales y equipo

- Gabacha
- Redecilla
- Mascarilla
- Papel toalla
- Alcohol 70%
- Algodn
- Beacker
- Bolsa whirl-pack
- Balanza electrnica
- Esptula
- Frasco de disolucin agua peptonada buferada
- Placa de Coliformes totales
- Incubadora
- Cmara de flujo laminar

Medios de cultivo y/o reactivos

- Agua peptonada buferada


- Alcohol70%
- Muestra de materia prima

Procedimiento de siembra de carne de res y cerdo

1. Colocarse la gabacha, redecilla, mascarilla y guantes al entrar al laboratorio de


microbiologa.
2. Colocar lo que se necesita para realizar el pesaje, lo cual consiste en: (1) Beacker de
250 ml, (2) bolsas whirl pack, esptula y muestra.
3. Desinfectar la esptula con alcohol al 70%, usando algodn.
4. Encender la balanza electrnica
5. Pesar el Beacker, luego tarar.
6. Retirar la tira de seguridad de la bolsa whirl pack
7. Colocar la bolsa whirl pack dentro del Beacker, habiendo ya retirado la tira de
seguridad.
8. Tarar la balanza
9. Cortar con un cuchillo pequeos trozos de carne de res, utilizando una esptula.
10. Pesar 10g de la muestra de carne de res utilizando una esptula
11. Retirar la bolsa whirl pack con el peso obtenido.
12. Tarar la balanza.
13. Pesar el Beacker y luego tarar.
14. Retirar la tira de seguridad de la bolsa whirl pack.
15. Colocar la bolsa whirl pack dentro del Beacker, habiendo ya retirado la tira de
seguridad.
16. Tarar la balanza
17. Cortar con un cuchillo pequeos trozos de carne de cerdo, utilizando una esptula.
18. Pesar 10g de la muestra de carne de cerdo utilizando una esptula.
19. Retirar la bolsa whirl pack con el peso obtenido.
20. Tarar la balanza.
21. Realizar las actividades dentro de la cmara de flujo laminar.
22. Colocar dentro de la cmara de flujo laminar lo que se necesita, lo cual consiste en
(2) jeringas, (2) Beacker, (1) bolsa whirl pack conteniendo la carne de res, (1) bolsa
whirl pack contiendo la carne de cerdo, (2) frascos de dilucin conteniendo 90 ml de
agua peptonada buferada y (2) placas petrifilm de Coliformes totales.
23. Rotular la placa petrifilm de Coliformes totales, cdigo y fecha
24. Colocar 90 ml de agua peptonada buferada dentro de la bolsa whirl pack, conteniendo
10g de carne de res
25. Homogenizar bien la muestra hasta que se disuelva en el agua peptonada buferada
26. Tomar 1ml de la muestra homogenizada usando una jeringa de 10ml
27. Proceder a realizar la siembra a una dilucin de 10-1 en la placa de Coliformes totales
28. Rotular la placa petrifilm de Coliformes totales, cdigo y fecha.
29. Colocar 90ml de agua peptonada buferada a la bolsa whirl pack conteniendo 10g de
carne de cerdo.
30. Homogenizar bien la muestra, hasta que se disuelva en el agua peptonada buferada.
31. Tomar 1ml de la muestra homogenizada usando una jeringa de 10ml
32. Proceder hacer la siembra una dilucin de 10-1 en la placa de Coliformes totales
33. Dejar las dos placas petrifilm de Coliformes totales en la cmara de flujo laminar
aproximadamente cinco minutos para que se solidifiquen.
34. Retirar de la cmara de flujo laminar la cristalera que se utiliz para realizar la
siembra.
35. Lavar y secar la cristalera utilizada
36. Colocar las placas en la incubadora a 35C

SIEMBRA DE AEROBIOS MESFILOS

Materiales y equipo

- Gabacha
- Redecilla
- Mascarilla
- Papel toalla
- Alcohol 70%
- Algodn
- Beacker
- Bolsa whirl-pack
- Balanza electrnica
- Esptula
- Frasco de disolucin agua peptonada buferada
- Placa de aerobios mesfilos
- Incubadora
- Cmara de flujo laminar

Medios de cultivo y/o reactivos

- Agua peptonada buferada


- Alcohol70%
- Muestra de materia prima

Procedimiento de siembra de carne de res y cerdo

1. Colocar lo que se necesita para realizar el pesaje, lo cual consiste en: (1) Beacker de 250
ml, (2) bolsas whirl pack, esptula y muestra.
2. Desinfectar la esptula con alcohol al 70%, usando algodn.
3. Pesar el Beacker, luego tarar.
4. Retirar la tira de seguridad de la bolsa whirl pack
5. Colocar la bolsa whirl pack dentro del Beacker
6. Tarar la balanza
7. Cortar con un cuchillo pequeos trozos de carne de res, utilizando una esptula.
8. Pesar 10g de la muestra de carne de res utilizando una esptula
9. Retirar la bolsa whirl pack con el peso obtenido.
10. Tarar la balanza.
11. Pesar el Beacker y luego tarar.
12. Retirar la tira de seguridad de la bolsa whirl pack.
13. Colocar la bolsa whirl pack dentro del Beacker
14. Tarar la balanza
15. Cortar con un cuchillo pequeos trozos de carne de cerdo, utilizando una esptula.
16. Pesar 10g de la muestra de carne de cerdo utilizando una esptula.
17. Retirar la bolsa whirl pack con el peso obtenido.
18. Tarar la balanza.
19. Realizar las actividades dentro de la cmara de flujo laminar.
20. Colocar dentro de la cmara de flujo laminar lo que se necesita, lo cual consiste en (1)
jeringas, (1) Beacker, (1) bolsa whirl pack conteniendo la carne de res, (1) bolsa whirl
pack contiendo la carne de cerdo, (1) frascos de dilucin conteniendo 90 ml de agua
peptonada buferada y (1) placas petrifilm de Aerobios mesofilos.
21. Rotular la placa petrifilm de Aerobios mesofilos, cdigo y fecha
22. Colocar 90 ml de agua peptonada buferada dentro de la bolsa whirl pack, conteniendo
10g de carne de res
23. Homogenizar bien la muestra hasta que se disuelva en el agua peptonada buferada
24. Tomar 1ml de la muestra homogenizada usando una jeringa de 10ml
25. Proceder a realizar la siembra a una dilucin de 10-1 en la placa de aerobios mesfilos.
26. Rotular la placa petrifilm de Coliformes totales, cdigo y fecha.
27. Colocar 90ml de agua peptonada buferada a la bolsa whirl pack conteniendo 10g de carne
de cerdo.
28. Homogenizar bien la muestra, hasta que se disuelva en el agua peptonada buferada.
29. Tomar 1ml de la muestra homogenizada usando una jeringa de 10ml
30. Proceder hacer la siembra una dilucin de 10-1 en la placa de Aerobios mesfilos.
31. Dejar las dos placas petrifilm de Aerobios mesfilos en la cmara de flujo laminar
aproximadamente cinco minutos para que se solidifiquen.
32. Retirar de la cmara de flujo laminar la cristalera que se utiliz para realizar la siembra.
33. Lavar y secar la cristalera utilizada
34. Colocar la placa en la incubadora a 35C

SIEMBRA DE E. COLI Y STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Materiales y equipo

- Papel toalla
- Alcohol 70%
- Algodn
- Beacker
- Bolsa whirl-pack
- Balanza electrnica
- Esptula
- Frasco de disolucin agua peptonada buferada
- Placa de E. coli
- Placa de Staphylococcus aureus
- Incubadora
- Cmara de flujo laminar

Medios de cultivo y/o reactivos

- Agua peptonada buferada


- Alcohol 70%
- Muestra de materia prima

Procedimiento de siembra de carne de res y cerdo

1. Colocar lo que se necesita para realizar el pesaje, lo cual consiste en: (1) Beacker de
250 ml, (2) bolsas whirl pack, esptula y muestra.
2. Desinfectar la esptula con alcohol al 70%, usando algodn.
3. Pesar el Beacker, luego tarar.
4. Retirar la tira de seguridad de la bolsa whirl pack
5. Colocar la bolsa whirl pack dentro del Beacker
6. Tarar la balanza
7. Cortar con un cuchillo pequeos trozos de carne de res, utilizando una esptula.
8. Pesar 10g de la muestra de carne de res utilizando una esptula
9. Retirar la bolsa whirl pack con el peso obtenido.
10. Tarar la balanza.
11. Pesar el Beacker y luego tarar.
12. Retirar la tira de seguridad de la bolsa whirl pack.
13. Colocar la bolsa whirl pack dentro del Beacker
14. Tarar la balanza
15. Cortar con un cuchillo pequeos trozos de carne de cerdo, utilizando una esptula.
16. Pesar 10g de la muestra de carne de cerdo utilizando una esptula.
17. Retirar la bolsa whirl pack con el peso obtenido.
18. Tarar la balanza.
19. Realizar las actividades dentro de la cmara de flujo laminar.
20. Colocar dentro de la cmara de flujo laminar lo que se necesita, lo cual consiste en (2)
jeringas, (2) Beacker, (1) bolsa whirl pack conteniendo la carne de res, (1) bolsa whirl
pack contiendo la carne de cerdo, (2) frascos de dilucin conteniendo 90 ml de agua
peptonada buferada, (1) placas petrifilm de E. coli y (1) placa petrifilm de
Staphylococcus aureus.
21. Rotular la placa petrifilm de E. coli, cdigo y fecha
22. Colocar 90 ml de agua peptonada buferada dentro de la bolsa whirl pack, conteniendo
10g de carne de res
23. Homogenizar bien la muestra hasta que se disuelva en el agua peptonada buferada
24. Tomar 1ml de la muestra homogenizada usando una jeringa de 10ml
25. Proceder a realizar la siembra a una dilucin de 10-1 en la placa de E. coli
26. Rotular la placa petrifilm de E. coli, cdigo y fecha.
27. Colocar 90ml de agua peptonada buferada a la bolsa whirl pack conteniendo 10g de
carne de cerdo.
28. Homogenizar bien la muestra, hasta que se disuelva en el agua peptonada buferada.
29. Tomar 1ml de la muestra homogenizada usando una jeringa de 10ml
30. Proceder hacer la siembra una dilucin de 10-1 en la placa de E. coli
31. Tomar 1ml de la muestra homogenizada usando una jeringa de 10ml
32. Proceder a hacer la siembra una dilucin de 10-1 en la placa de Staphylococcus aureus.
33. Dejar las dos placas petrifilm en la cmara de flujo laminar aproximadamente cinco
minutos para que se solidifiquen.
34. Retirar de la cmara de flujo laminar la cristalera que se utiliz para realizar la
siembra.
35. Lavar y secar la cristalera utilizada
36. Colocar las placas en la incubadora a 35C.
MOHOS Y LEVADURAS

Tcnica de Siembra directa y dilucin en placa.

El mtodo de siembra directa es eficiente para la deteccin de las distintas especies de


mohos, incluyendo la mayora de los productores de la toxina, pero es menos eficaz en la
deteccin de levaduras. Tambin se utiliza para determinar si la presencia del moho es
debido a la contaminacin externa o interna de la invasin.

Esta metodologa consiste en realizar diluciones de una muestra y sembrndolas


directamente en placas para obtener un conteo de la cantidad de mohos y levaduras que
posee la muestra

Materiales y equipo

- Bolsas estriles whirl pak.


- Cuchillos, tenedores, esptulas, pinzas, tijeras, cucharas estriles.
- Pipetas estriles graduadas de 1.0 y 10.0 ml.
- Placas petri estriles.
- Incubadora a 25 C (Temperatura ambiente).
- Balanza con capacidad de 2000 g de peso y sensibilidad de 0,1 g
- Stomacher.

Medios de cultivo

- Agar Dicloran glicerol 18% (DG18)


- Agar Papa dextrosa (PDA)
- Agua peptonada al 0,1% para dilucin (225 ml, 450 ml, 90ml). (AP 0,1%)

Procedimiento

1. Pese o mida 25 o 50 g/ml de la muestra de forma asptica.


2. Agregue aspticamente 225 ml o 450 ml de AP 0,1% (dilucin 10 -1).
3. Homogenice utilizando el stomacher durante 2 min.
4. Haga las diluciones que sean necesarias
5. Transfiera aspticamente 1.0 ml de dilucin de la muestra en placas de Petri y de
inmediato agregue 20-25 ml de agar Dicloran Glicerol DG18.
6. Mezcle las placas girando suavemente hacia la derecha, luego a la izquierda y por
ltimo en forma de 8, teniendo cuidado para evitar derrames.
7. Trabaje cada dilucin por triplicado.
8. Incube las placas en la oscuridad a 25C. Coloque las placas una sobre otra haciendo
columnas mximo de tres y no invertirlas.
9. Cuente las placas despus de 5 das de incubacin. Si no hay crecimiento en 5 das,
vuelva a incubar por otras 48 h. No cuente las colonias antes de que finalice el perodo
de incubacin debido a que la manipulacin de las placas puede resultar en el
crecimiento secundario de las esporas liberadas por movimientos en la manipulacin,
dando un conteo irreal de la cantidad presente en la muestra.
10. Cuente las placas que contienen de 10 a 150 colonias.
11. Informe de resultados en unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo o
mililitro, basado en el recuento del promedio de las tres placas y el resultado
presentarlo con dos cifras significativas. Si el tercer dgito es de 6 o superior, redondee
cifras anteriormente (por ejemplo, 456 = 460), si cuatro o menos, redondee a un dgito
a continuacin (por ejemplo, 454 = 450).
ESCHERICHIA COLI, BACTERIAS COLIFORMES Y ENTEROBACTERIAS

Materiales y equipo

- Cuchillos, esptulas, pinzas, tijeras, cucharas estriles.


- Bolsas estriles whirl pak.
- Pipetas estriles graduadas de 1,0 y 10,0 ml
- Placas petri estriles.
- Tubos con tapn de rosca y tubos de fermentacin.
- Asa metlica en aro y en punta.
- Balanza con capacidad de 2000 g de peso y sensibilidad de 0,1 g
- Stomacher.
- Bao de agua a 45,5 0,2 C.
- Incubadora de 35 1,0 C
- Lmpara de luz ultravioleta de onda larga.
- Cuenta colonias.

Reactivos y medios de cultivo

- Reactivo de Kovacs.
- Reactivo de Voges-Proskauer (VP).
- Reactivos de tincin de Gram.
- Indicador rojo de metilo.
- Buffer fosfato de 450 ml y 90 ml.
- Caldo Lauril triptosa (LST).
- Caldo verde brillante bilis lactosa (Brilliant green lactose bile broth 2%) BGLB al
2%

Procedimiento

Mtodo del nmero ms probable (NMP)

Fase presuntiva para coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli.

1. Pese 50 g de alimentos
2. Aada 450 ml Buffer fosfato y mezcle durante 2 minutos en el stomacher(Dilucin
10-1)
3. Si dispone de menos de 50 g de muestra, pese una porcin equivalente a la mitad de
la muestra y agregue el volumen suficiente de diluyente estril para realizar una
dilucin 1:10 (10-1) (25 g en 225 ml de diluyente).
4. Prepare diluciones decimales con diluyente estril. El nmero de diluciones que
prepare depende de la densidad de coliformes previsto.
5. Agite todas las suspensiones 25 veces en forma de arco. No utilice pipetas para
dispensar menos del 10% de su volumen total.
6. Transfiera 1 ml a 3 tubos de LST para cada dilucin de al menos 3 diluciones
consecutivas. Mantenga la pipeta en un ngulo de manera que el borde inferior se
apoye contra el tubo. No debe de transcurrir ms de 15 minutos desde que preparo la
muestra, hasta que todas las diluciones se inoculan en el medio adecuado.
7. Incube los tubos LST a 35C. Examine los tubos a las 24 2 h para ver las
reacciones y si hay presencia de gas, es decir, el desplazamiento del vial por medio
de la fermentacin o efervescencia al agitar suavemente. Incube durante otras 24 h si
las reacciones son negativas (tubos sin gas) y examine de nuevo a un total de 48 2
h.
Fase confirmativa para coliformes fecales y Escherichia coli

LST con gas


positivo

De cada tubo de LST con gas de la Caldo EC


fase presuntiva transferir una asada
llena de suspensin a cada uno de
los tubos con caldo EC

Incubar los tubos de EC a 45,5C por 24


2 horas y examinar la produccin de gas.
Si a las 24 2 horas da negativo,
reincubar y examinar de nuevo a las 48
2 h.

Utilizar los resultados de esta prueba para calcular el NMP de coliformes fecales. Para
coliformes fecales la temperatura de incubacin es de 45,5 0,2 C para todos los
alimentos, a excepcin de las pruebas de agua y en los mariscos y en el agua de cosecha
para cra de moluscos, se utiliza una temperatura de incubacin de 44,5 0,2 C.

Para la determinacin de E. coli se puede realizar la


siembra de LST a caldo EC-MUG (4-metil--
umbeliferil-D-glucurnido). Despus de la incubacin,
observar la fluorescencia azulada que presentan los
tubos bajo luz UV de onda larga y segn los que
presenten fluorescencia utilizar las tablas para obtener
el NMP de la E. coli.
Fase completa para la determinacin de E. coli. (Fase confirmativa)

Para las pruebas utilizar el inoculo que se encuentra en PCA inclinado

Inocular un tubo de caldo triptona e Adicionar de 0.2-0.3 ml de reactivo de


incubar 24 2 horas a 35C Kovacs. La aparicin de un color rojo
en la parte superior del caldo da
como positiva la presencia de
Escherichia coli.

A las 48 2 horas: aadir 0,6 ml de


Inocular caldo MR-VP e
solucin de -naftol y 0,2 ml de KOH
incubar 48 2 horas a
40%, y agitar. Aadir unos cristales
35C, para la prueba de
de creatina. Agitar y dejar reposar 2
VP.
h.

La Prueba es positiva si el color rosa


de la eosina se desarrolla.

Para E. coli es (-).


Aadir 5 gotas de solucin de rojo de
Inocular caldo MR-VP e metilo al tubo de MR-VP.
incubar 48 2 horas a
35C, para la prueba de La aparicin de un color rojo es
MR. reaccin positiva, pero un color
amarillo es reaccin negativa.

Para E. coli es (+).


Fase confirmativa para la determinacin de Escherichia coli
SALMONELLA SPP

Materiales y equipo

- Cucharas estriles.
- Bolsas de plstico estriles de 28 x 37 cm, con cinta de cierre.
- Placas de Petri estriles.
- Pipetas estriles de 1 ml (0,01 ml), 5 y 10 ml, con 0,1 ml de graduacin
- Papel pH con un rango entre 6 8
- Asa de inoculacin en aro y en punta.
- Vortex.
- Balanza con capacidad de 2000 g
- Incubadora a 35 2 C.
- Bao de agua con termostato a 43 0.2 C ; 42 0.2 C y 49 1C.

Reactivos y medios de cultivo

- Solucin de papana al 5%
- Solucin de Celulosa al 1%
- Solucin de cloro a 200 ppm que contiene 0,1% de sodio dodecil sulfato
- Solucin de hidrxido de potasio al 40%
- Solucin de hidrxido sdico 1N
- cido clorhdrico 1N
- Solucin colorante verde Brillante al 1%
- Agua destilada estril

Procedimiento

1. Pese aspticamente 25 g de muestra en bolsa estril, aada 225 ml de caldo lactosado


y mezcle 2 minutos. Cierre bien y Deje en reposo 60 5 minutos a temperatura
ambiente. Si la mezcla es polvo, el mezclado puede omitirse. Para muestras que no
requieran el mezclado, aada caldo lactosado y mezcle completamente; cierre bien y
deje en reposo por 60 5 minutos a temperatura ambiente.
2. Mezcle bien y determine el pH con papel prueba. Ajuste el pH si es necesario a 6.8
0.2. Aada arriba de 2,25 ml de tergitol aninico 7 calentando 15 minutos y mezcle
bien.
3. Alternativamente use tritn X-100 calentando 15 minutos. Limite el uso de estos
surfactantes para minimizar la cantidad requerida para iniciar la espuma.
4. La cantidad actual depende de la composicin del material de prueba.
5. Los surfactantes no se necesitan en anlisis de productos glandulares pulverizados
6. Deje un poco flojo el cierre de la bolsa e incube las muestras 24 2 horas a 35C.