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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUMICO BIOLGICAS

ACADEMIA DE BIOQUMICA
MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO DE

BIOQUMICA MDICA
Documento actualizado por:

M. en I. Edith Enrquez Gallosa

Vo.Bo.:

Dra. Laura Alejandra de la Rosa Carrillo

Coordinador de la Academia de Bioqumica

Autorizado por:

Ph.D. Alejandro Martnez Martnez

Jefe del Departamento de Ciencias Qumico Biolgicas

Cd. Jurez Chihuahaua

Mayo del 2012

Instituto de Ciencias Biomdicas

Universidad Autnoma de Ciudad Jurez

Semestre regular Enero Mayo 20XX

Semestre regular Agosto Noviembre 20XX

Curso de Verano Junio Julio 20XX


Contenido
PROLOGO ............................................................................................................. i
P R E S E N T A C I N ....................................................................................... ii
REGLAS PARA LOS ALUMNOS QUE ASISTEN A LOS LABORATORIOS DE
BIOQUIMICA. ....................................................................................................... v
INSTRUCCIONES PARA EL USO DE ESTE MANUAL ..................................... vii
PRCTICA No. 1 ................................................................................................... i
BIOSEGURIDAD ................................................................................................... i
PRCTICA No.2 .................................................................................................. iv
CARACTERIZACIN DEL ADN .......................................................................... iv
DETERMINACIN Y CUANTIFICACIN DE ADN POR LA TCNICA DE LA
DIFENILAMINA EN BASE A SU CONTENIDO EN DESOXIRRIBOSA. .............. iv
CUESTIONARIO ............................................................................................. vii
PRCTICA No. 3 ................................................................................................viii
CUANTIFICACIN DE CIDO RICO SRICO ................................................viii
CUESTIONARIO .............................................................................................. xi
PRCTICA No. 4 ................................................................................................xiii
EXTRACCION Y CUANTIFICACIN DE ADN DE LEUCOCITOS .....................xiii
CUESTIONARIO ............................................................................................. xv
PRACTICA No. 5 ............................................................................................... xvi
SEPARACION DE ADN POR ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA .... xvi
CUESTIONARIO ........................................................................................... xviii
PRCTICA No. 6 ................................................................................................ xx
EFECTO MUTAGENICO DE LA LUZ ULTRAVIOLETA. .................................... xx
CUESTIONARIO ............................................................................................xxii
PRCTICA No7 ................................................................................................xxiv
DIGESTIN DE CARBOHIDRATOS ................................................................xxiv
PRCTICA No.8 .............................................................................................. xxvii
DIGESTIN DE PROTENAS GSTRICAS. ................................................... xxvii
CUESTIONARIO ........................................................................................... xxx
PRACTICA No. 9 ............................................................................................ xxxiii
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LIPASA ....................................... xxxiii
(DIGESTION INTESTINAL DE GRASAS) ...................................................... xxxiii
CUESTIONARIO ......................................................................................... xxxvi
PRACTICA No 10 ......................................................................................... xxxviii
EXTRACCION Y SEPARACIN CROMATOGRAFICA DE FOSFOLIPIDOS
...................................................................................................................... xxxviii
INDUCCION Y REPRESION HORMONAL EN EL .............................................xlii
METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS. ..................................................xlii
CUESTIONARIO ............................................................................................xlvi
PRACTICA 12 ....................................................................................................xlix
DETERMINACION DE TRANSAMINASAS SERICAS.......................................xlix
CUESTIONARIO .............................................................................................. lii
CUANTIFICACION DE BILIRRUBINAS SERICAS ............................................. liv
CUESTIONARIO .............................................................................................lvii
PROLOGO

El siguiente manual ha sido actualizado para las carreras de Medicina y


Nutricin, por lo que se espera que el alumno aproveche en su totalidad la
informacin aqu presentada.
Los cursos de Bioqumica Mdica y Aplicada se imparten en el Instituto de
Ciencias Biomdicas como parte del programa integral del Departamento de
Ciencias Qumico Biolgicas y se requiere del curso de Bioqumica General
como materia antecedente.
En este curso se presenta una correlacin de aspectos del metabolismo integral
con las funciones especficas de los rganos y sistemas con un carcter muy
fundamental teniendo en cuenta que dichas funciones se tratarn con mayor
detalle en las nosologas y las clnicas respectivas.

2012
PRESENTAC I N

Uno de los aspectos fundamentales de la enseanza de materias


correspondientes al rea de las Ciencias Bsicas, es que el estudiante debe de
comprender los elementos tericos revisados. Con el fin de reafirmar dichos
conocimientos es necesario que los practique en el Laboratorio y como
consecuencia reciba los refuerzos apropiados y al final de dicho curso este
compenetrado con la materia analizada.
En la Academia de Bioqumica siempre ha existido el inters de que los
alumnos que cursen dichas materias tengan la capacidad de comprender los
fenmenos moleculares tanto a nivel celular como del organismo.
El individuo que se dedique a la investigacin y/o a la enseanza de la
Bioqumica, debe de estar convencido de que el ensayo de formas ms
eficientes de involucrar al alumno en el estudio de sta interesante rea, es la
nica manera de evolucionar positivamente en la investigacin y en la
excelencia acadmica.
Este manual de prcticas es el resultado del esfuerzo comn de la
Academia de Bioqumica, con el nico fin de fomentar la interrelacin de los
conocimientos tericos con la actividad practica, de una manera ms
organizada, en aras de un mayor aprovechamiento de la enseanza Bioqumica.
En base a este pensamiento, nos comprometimos a elaborar el "Manual de
Prcticas de Laboratorio de Bioqumica Medica" el cual esperamos sea til
durante los cursos de Bioqumica.
En este Manual se pretende dar al alumno una informacin bsica, que lo
motive a desarrollar un diseo experimental predeterminado y a deducir por
medio del anlisis objetivo de los resultados, las posibles implicaciones que se
tengan para demostrar un hecho que fue discutido previamente en la clase
terica.
Agradecemos la cooperacin y el apoyo recibido por parte de las
autoridades Universitarias para lograr la publicacin de este Manual.

Atentamente Comisin Elaboradora


Academia de Bioqumica

M.C. Hctor Reyes Leal Biol. Hctor Esparza Valencia


Q.F.B. Gilberto Reyes Leal Biol. Daniel Chvez Licn
Q.F.B. Graciela Manjarrez G. Q.B.P Jorge Bayln Monrrez
Q.B.P. J. Angel Araujo Dr. David Reyes Ruvalcaba.
Q.B.P. Oscar Barrozo

1997
NOMBRE DEL ALUMNO____________________________________

MATRICULA ____________________

HORARIO DE TEORIA ____________________

HORARIO DE LABORATORIO_______________

GRUPO DE LABORATORIO _________________

NUMERO Y/O NOMBRE DEL EQUIPO ______________________


REGLAS PARA LOS ALUMNOS QUE ASISTEN A LOS
LABORATORIOS DE BIOQUIMICA.

1. - Al inscribirse en la materia queda automticamente inscrito en un grupo de


Laboratorio. El maestro no est facultado para realizar cambios de grupo y/o
permutas.
2. - La asistencia a los laboratorios es obligatoria y debern presentarse con un
retardo no mayor de 10 min. de la hora de entrada.
3. - Para tener derecho a calificacin final del laboratorio se requiere un 80 % de
asistencias.
4. - Toda falta a la prctica equivale a cero en su reporte.
5. - Es obligatorio presentarse con bata blanca de manga larga a las sesiones
de laboratorio.
6. - Durante las sesiones de laboratorio queda estrictamente prohibido fumar e
ingerir alimentos.
7.- En caso de reprobar el laboratorio, automticamente queda reprobado en la
clase de teora.
8.- La calificacin final de laboratorio corresponde al promedio obtenido en las
prcticas, exmenes y trabajo en el laboratorio.
9.- Los reportes de la semana se entregarn obligatoriamente en el horario
establecido por el maestro. La aceptacin extempornea de reportes queda a
consideracin del docente. El Reporte es individual.
10.- Los reportes ya calificados, se devolvern a la semana siguiente.
11.- El material que sea daado por el alumno, deber reponerse antes de
finalizar el curso acompaado con la factura de compra. De no ser as no se
condicionar la calificacin del alumno.
12.- Si parte del material es daado o se pierde y se desconoce al
responsable, el material ser repuesto por el grupo asistente a la prctica.
13.- Se realizarn los exmenes de laboratorio pertinentes en las fechas
indicadas en la calendarizacin de la academia.
14.- Es obligacin del alumno entregar el material limpio cada vez que termine
su prctica.
15.- Se recomienda mantener limpia su mesa de trabajo y guardar el mayor
orden posible.
16.- El alumno se deber comprometer a regresar el material en las mismas
condiciones en que lo recibieron.
17.- Los reportes se calificarn en base a los acuerdos de la academia, teniendo
mayor peso los siguientes apartados:
A) Resultados
B) Discusin
C) Conclusiones
D) Cuestionario
E) Bibliografa
El maestro detallar la forma de reportar dentro del encuadre, el da de la
recepcin del grupo. Incluyendo el trabajo experimental y la discusin y
participacin en la prctica.
18.- Es obligacin del alumno investigar sobre el tema de la prctica previa
realizacin de sta, en caso de presentarse sin haber estudiado se considerar
como falta de inters, afectando la calificacin de la participacin de la misma.
19.- De igual manera, para aqul alumno que no se prepare para la discusin de
las prcticas, se ver afectado en la parte de su calificacin de correspondiente
a la misma.
INSTRUCCIONES PARA EL USO DE ESTE MANUAL

Con la idea de que el alumno pueda manejar de manera ms eficiente


este Manual se hacen las siguientes recomendaciones:
1.- Al principio del Manual se incluye un ndice de las prcticas a realizar, que
permite su rpida localizacin.
2.- La secuencia de prcticas, est en funcin de los programas de teora y cabe
aclarar que en la primera sesin se les indicar cuales prcticas se van a
realizar durante el semestre.
3.- Todas las prcticas estn subdivididas en dos partes:
a) Incluye la descripcin metodolgica de la prctica, que a su vez
se subdivide en:
- Ttulo de la prctica
- Objetivo de la prctica
- Prerrequisitos
- Introduccin
- Material y Mtodos
b) Contiene los elementos correspondientes al reporte de la
prctica y se subdivide en:
- Resultados
- Discusin
- Conclusiones
- Cuestionario
- Bibliografa consultada
4.- A continuacin se mencionan algunos aspectos significativos de cada uno de
estos elementos:
a) Ttulo de la prctica.- Indica el nombre de la prctica y la de
manera especfica de lo que se va a realizar durante la sesin.
b) Objetivo de la prctica.- Seala lo que se espera que el alumno
logre al trmino de esta.
c) Prerrequisitos.- Comprende una serie de puntos, que el alumno
debe de conocer su significado con anterioridad a la explicacin de
la prctica, para lo cual se recomienda consultar la bibliografa
recomendada al final de este Manual.
d) Introduccin.- Informacin bsica y muy breve, referente a la
prctica a realizar.
e) Mtodos y Materiales.- Es la descripcin del desarrollo de la
prctica, sealando el equipo, cristalera y soluciones a utilizar en
la prctica.
Es importante que el alumno entienda la secuencia del desarrollo
antes de iniciar el experimento, por lo cual es necesario que se lea
antes de la sesin de explicacin de la prctica, para que pueda
consultar sus dudas con el Docente.
f) Resultados.- En esta seccin se anotan los datos obtenidos
durante la sesin de la prctica, de acuerdo a las indicaciones
tanto del Manual como del Profesor.
h) Discusin.- Es una de las partes principales de todo
experimento, ya que consiste en realizar un anlisis comparativo
de los resultados esperados con respecto a los obtenidos, llevando
a cabo la argumentacin necesaria de dichos resultados.
i) Conclusiones.- En base a los resultados obtenidos y a la
discusin desarrollada, concluir cuales son los puntos principales y
que consecuencias a futuro plantean esta prctica.
j) Bibliografa consultada.- En este punto se deben incluir las
referencias bibliogrficas de los libros o artculos consultados, de
acuerdo a los siguientes lineamientos :
En el caso de revistas:
Nombre(s) del autor(es), (ao), Ttulo del artculo
Nombre de la Revista, Volumen, Pginas consultadas

En el caso de libros:
Nombre(s) del autores), (ao), Nombre del captulo.
Nombre del libro. Editorial. Edicin. Pas. Pginas
consultadas.
PRCTICA No. 1

BIOSEGURIDAD

OBJETIVO:
El alumno determinar la importancia de la aplicacin de la normatividad sobre
la seguridad, en niveles de riesgo en cualquier laboratorio para evitar accidentes.

PRERREQUISITOS:
1. Diferencias entre regla, reglamento, norma y ley.
2. Diferencia entre ley y costumbre.
3. Organismos que rigen las normatividades.
4. Normas involucradas en la seguridad en los laboratorios.

INTRODUCCIN:
Bioseguridad es una palabra compuesta por bio (del latn que significa vida) y
seguridad (del latn securitas que significa ausencia de riesgo).
El riesgo es la vulnerabilidad ante un dao para personas, cosas y/o el medio
ambiente. Existe una variedad de riesgos en los que se encuentran los riesgos
fsicos, qumicos, biolgicos, ambientales, laborales, financieros, polticos, etc
Sin embargo en el laboratorio el nivel de bioseguridad depende del grupo de
riesgo:
Grupo de Nivel de Tipo de Prcticas de Equipo de
riesgo bioseguridad laboratorio laboratorio seguridad
1 Bsico Enseanaza TMA Ninguno;
Nivel 1 bsica, trabajo en mesa
investigacin de laboratorio al
descubierto
2 Bsico Servicios de TMA y ropa Trabajo en
Nivel 2 atencin protectora; seal de mesa al
primaria; riesgo biolgico descubierto y
diagnstico, CSB para
investigacin posibles
aerosoles
3 Contencin Diagnstico Prcticas de nivel 2 CSB adems
Nivel 3 especial, ms ropa especial, de otros medios
investigacin acceso controlado de contencin
y flujo direccional primaria para
del aire todas las
actividades
4 Contencin Unidades Prcticas de nivel 3 CSB de clase iii
mxima patgenos ms cmara de o trajes
Nivel 4 peligrosos entrada con cierre presurizados
hermtico, salida junto con CSB
con ducha y de clase ii,
eliminacin autoclave de
especial de doble puerta (a
residuos travs de la
pared), aire
filtrado
Tabla 1 TMA: tcnicas microbiolgicas apropiadas. CSB: cmara de seguridad
biolgica. OMS(2005)

En los laboratorios aparte del equipo, existen soluciones reactivas las cuales
tambin se manejan y deben llevar un requerimiento para su uso. Cada
sustancia que se maneje en los laboratorios debe estar etiquetada y siempre
deber haber a la mano la Hoja de Datos de Uso Seguro (MSDS por sus siglas
en ingles), misma que refiere los cuidados que se debe tener para el manejo de
las sustancias.
El Sistema de Comunicacin de Riesgos (Right To Know) muy utilizado en los
E.U.A. nos refiere de manera explcita de los riesgos y daos a los cuales
estamos expuestos por el manejo de una sustancia y que equipo de proteccin
personal se debe de utilizar. Aqu en Mxico la Secretaria de Trabajo y Previsin
Social tambin se preocupa por los riesgos ocupacionales de los diferentes
centros de trabajo junto con la Secretaria de Salud, por lo que tambin existen
sealizaciones para determinar las reas de trabajo, puertas de acceso, y
salidas, reas despejadas, cdigo de tuberas para sustancias que corran en
ellas, etc. Es por eso que es muy importante tomar en cuenta las barreras y el
tipo de ellas.
Tambin es importante hacer hincapi en el desecho adecuado de las
sustancias que se manejan en los laboratorios los cuales son vigilados por la
SEMARNAT ya que estos son dispuestos al medio ambiente, llmese agua (a
los drenajes que a pesar de llegar a una planta de tratamiento de agua
residuales en algunas ocasiones, estas siguen su curso a canales de irrigacin
y/o acequias para riego de cultivos y por ende al subsuelo), cielo abierto (por la
emisin de los gases y que contaminan el aire que respiramos) o tierra (con la
disposicin de los residuos slidos que impactan a el medio alterando los ciclos
naturales biolgicos).

MATERIAL: Ocupado para la elaboracin de esta prctica

METODO:
Investigue en las diferentes referencias impresas o computarizadas el marco
terico sobre el cual se sustenta la minimizacin de los riesgos para la
realizacin del trabajo seguro en cualquier laboratorio

RESULTADOS:
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________________________________________________________________

DISCUSION:
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________________________________________________________________
________________________________________________________________
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CONCLUSION:
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BLIBLIOGRAFIA CONSULTADA:
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PRCTICA No.2

CARACTERIZACIN DEL ADN

DETERMINACIN Y CUANTIFICACIN DE ADN POR LA


TCNICA DE LA DIFENILAMINA EN BASE A SU CONTENIDO EN
DESOXIRRIBOSA.

OBJETIVO GENERAL:
Cuantificar ADN por el contenido de desoxirribosa por medio de la tcnica de
difenilamina.

OBJETIVOS ESPECFICOS:
Aprender a elaborar e interpretar una curva de calibracin
Determinar y cuantificar la concentracin de desoxirribosa presente de una
solucin tipo por medio de la tcnica
Comparar las concentraciones de la pentosa de la solucin tipo, con la del
problema de ADN

PRERREQUISITOS:
1. Como est formada una molcula de ADN.
2. Principales diferencias entre nucletidos y nuclesidos.
3. Principales diferencias entre ADN, ARN y las protenas.

INTRODUCCIN:
El DNA es un polmero complejo que est organizado como una hlice doble. El
elemento fundamental es la secuencia de bases purnicas y pirimidnicas. Estas
bases estn unidas a la posicin C-1 del azcar desoxirribosa y se conservan
juntas a travs del enlace de los residuos de azcar en sus posiciones 3, y 5
por medio de un enlace fosfodister. La alternancia de los grupos fosfato y
desoxirribosa forman el esqueleto de la doble hlice. Estos enlaces 3- 5 definen
tambin la orientacin de una tira dada de la molcula de ADN y puesto que las
dos tiras corren en direccin opuesta, se dice que son antiparalelas.

La estructura del ADN est compuesta por nucletidos de purina y pirimidina,


esta estructura se va hidrolizando (rompiendo) a nuclesido de purina y
nuclesido de pirimidina ms fosfatos libres, luego se hidrolizan los nuclesidos
de purina a bases pricas y pentosas libres, las pirimidinas se quedan como
estn. La difenilamina reacciona con 2 pentosas libres (desoxiribosas). En
solucin cida, la cadena lineal de una desoxipentosa se convierte en la forma
-hidroxilevulinoaldehdo altamente reactiva y que reacciona con la difenilamina
para dar un complejo azul, con una absorcin definida mxima a 595 nm. En el
ADN nicamente reacciona la desoxirribosa del nucletido de purina, as que el
valor obtenido representa la mitad del total de desoxirribosa presente.

MATERIAL:
Gradilla
Tubos de ensaye
Pipetas serolgicas
Vaso de precipitado
Pinzas para tubo de ensaye
Celdas para espectrofotmetro

EQUIPO:
Espectrofotmetro

MTODO:
Espectrofotocolorimtrico y Comparativo

PROCEDIMIENTO:
Preparar una curva de calibracin de la solucin tipo de desoxiribosa de acuerdo
la tabla abajo expuesta

Tubo Sol. tipo TCA Difenilamina [ADN]


0.001 M 10% mg/ml
Testigo --- 2.0 3.0 0.0
1 0.1 1.9 3.0 0.0125
2 0.2 1.8 3.0 0.0250
3 0.4 1.6 3.0 0.0500
4 0.6 1.4 3.0 0.0750
5 0.8 1.2 3.0 0.1000
6 1.0 1.0 3.0 0.1250
Problema X * 3.0 Y
Tabla 2 Curva Tipo de dexosiribosa

La cantidad del problema (X) deber tener de entre 0.1 a 1.0 ml, mientras que de
TCA deber de tener de entre 1.9 a 1.0 ml, para que con los 3 ml de difenilamina
tenga el tubo problema una cantidad total de 5 ml

Para determinar la concentracin de desoxiribosa en el total de cada tubo, se


deber utilizar la siguiente frmula:

C1V1=C2V2
Ejemplo para el tubo #1
(0.001 M) (0.1 ml) = C2 (5 ml)
C2 = (0.001 M) (0.1 ml) / (5 ml)

C2 = 0.00002 M

Igual para cada tubo

Colocar los tubos en bao a ebullicin, estos se sacan a cambio de vire.


Enfriar a chorro de agua corriente y leer a 600 (595) nm de longitud de onda.

Nota: la absorbancia del problema se interpola en la curva de calibracin

RESULTADOS:
1.- Elaborar la grfica (preferentemente en papel milimtrico) de la curva tipo
para la desoxiribosa.

2.- En base a la interpolacin del la muestra problema en la curva tipo de


desoxiribosa, la concentracin de ADN de la muestra problema es
de:__________

DISCUSION:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

CONCLUSION:
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________________________________________________________________
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BIBLIOGRAFIA:
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CUESTIONARIO

1.-Cual es la absorcin de luz mxima y mnima de los cidos nucleicos.


________________________________________________________________
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________________________________________________________________
2.- Describa una tcnica para identificar ARN.
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________________________________________________________________
________________________________________________________________
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3.-Describa las propiedades fisicoqumicas de los cidos nucleicos.
________________________________________________________________
________________________________________________________________
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________________________________________________________________
4.- Esquematice como est formada una molcula de ADN.
PRCTICA No. 3

CUANTIFICACIN DE CIDO RICO SRICO

OBJETIVO GENERAL:
Determinar la concentracin de cido rico srico por medio de la reaccin del
cido fosfotngstico.

OBJETIVO ESPECFICO:
Comparar los resultados para descartar hiperuricemia y gota.

PRERREQUISITOS:
1. Describir el metabolismo de los nucletidos purcos
2. Describir el catabolismo de las bases purnicas
3. Enumerar las caractersticas metablicas de la Gota.
4. Qu es el monourato de sodio y como se forma

INTRODUCCIN:
La sntesis de nucletidos es un proceso celular dinmico y continuo. Se
requiere de estos para llevar a cabo diversas actividades metablicas en el
organismo, esto ltimo sin tomar en cuenta su funcin primaria que es la de ser
monmeros estructurales de los cidos nucleicos.

La regulacin de esta va es compleja debido a que utiliza mecanismos de


retroalimentacin negativa, regulacin alostrica, as como procesos de
recuperacin de metabolitos. Con frecuencia se presentan desajustes en esta
regulacin, siendo un ejemplo clsico la sobreproduccin de cido rico como
parte de una descompensacin del catabolismo de los nucletidos purnicos. En
la mayora de los organismos este defecto no es perceptible, ya que al ser el
cido rico un producto de excrecin, es eliminado en la orina. Sin embargo, en
pacientes con insuficiencia renal, la excrecin del cido rico tiende a ser ms
lenta y por lo tanto su concentracin en sangre aumenta en forma considerable,
generando un defecto conocido hiperuricemia. En algunos pacientes la
hiperuricemia es tal, que genera depsitos de monourato sdico en los tejidos de
las articulaciones de las extremidades inferiores. Estos depsitos tienden a
formar cristales que a menudo lesionan los tejidos provocando dolores muy
intensos que son caractersticos de la enfermedad llamada gota.

Para determinar la concentracin de cido rico en sangre se utiliza el mtodo


del cido fosfotngstico (constituido por cido fosfrico y tungstato de sodio que
es el que precipita las protenas con un conservador de sulfato de litio), que
hace reaccionar al cido rico con el cido fosfotngstico en un medio alcalino
para formar alantona y azul de tungsteno, ste ltimo genera un color muy
estable que se mide en espectrofotmetro a una longitud de onda de 640 nm.

MATERIAL:
Gradilla
Tubos de ensaye
Pipetas serolgicas
Propipetas
Celdas para espectrofotmetro

EQUIPO:
Centrfuga clnica
Espectrofotmetro

SUSTANCIAS REACTIVAS:
Solucin preparada de cido fosfotngstico
Solucin patrn de cido rico
Agua destilada
Solucin de carbonato de sodio al 3.5%

MTODO:
Espectrofotocolorimtrico

PROCEDIMIENTO:
Preparar una serie de tubos de acuerdo a la siguiente tabla:

Reactivo Tubo problema Tubo patrn Tubo blanco


Suero 0.3 ml --- ---
Sol patrn --- 0.3 ml ---
Agua destilada --- --- 0.3 ml
c. fosfotngstico 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml
Tabla 3 Primera serie de tubos para la determinacin de cido rico srico

Mezclar bien cada tubo y centrifugar el tubo problema a 2,500 rpm durante 10
min. y recuperar el sobrenadante. El tubo blanco no es necesario que se
centrifugue, atendiendo a las propiedades especficas de la reaccin.
Prepare otra serie de tubos de acuerdo a la siguiente tabla.

Reactivo T. problema T. patrn T. blanco


Sobrenadante del 0.5 ml --- ---
tubo problema
Sol. preparada del --- 0.5 ml ---
tubo patrn
Sol. preparada del --- --- 0.5 ml
tubo blanco
Carbonato de 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml
sodio al 3.5%
Tabla 4 Segunda serie de tubos para la determinacin de cido rico srico

Mezclar bien cada tubo y dejar reposar durante 20 min..


Leer la absorbancia del problema y del patrn ajustando a cero el
espectrofotmetro con el tubo blanco a una longitud de onda de 640 nm.

RESULTADOS:
Clculo:

As. problema X [del patrn] = [cido rico]


As. patrn

Concentracin de cido rico = __________________ mg/dl.

Valores normales:
Hombres: 3.5 7.5 mg/dl
Mujeres: 2.5 6.5 mg/dl

DISCUSIN:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
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CONCLUSIN:
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BIBLIOGRAFIA:
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CUESTIONARIO

1.-Esquematice las bases pricas y pirimdicas:

2.-Describa cuatro (4) alteraciones del metabolismo de las purinas.


________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
3.-Mencione cuatro (4) alteraciones del metabolismo de las pirimidinas.
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

4.- Esquematice la degradacin de las bases pricas hasta 2CO2 + 4NH4+


5.- Defina:
a) Uremia:_______________________________________________________
b) Uricemia:______________________________________________________
c) Uricaciduria:____________________________________________________
PRCTICA No. 4

EXTRACCION Y CUANTIFICACIN DE ADN DE LEUCOCITOS

OBJETIVO GENERAL:
Obtencin el DNA cromosmico de clulas blancas

OBJETIVO ESPECFICO:
Determinar que si sea el DNA obtenido por medio de la cuantificacin del mismo
con la tcnica de difenilamina ya aprendida

PRERREQUISITOS:
1. Conocer la estructura de nuclesidos y nucletidos.
2. Indicar las principales diferencias entre ADN y ARN.
3. Identificar los efectos fisicoqumicos de los detergentes y de los
quelantes.
4. Cul es la fuente del ADN en la sangre?
5. Importancia de las endonucleasas de Restriccin.
6. A que se le llama solucin fisiolgica y cul es su funcin?
7. Funcin de los leucocitos

INTRODUCCIN:
Los cidos nucleicos son las molculas que portan la informacin gentica y
regulan las funciones celulares por lo cual es importante conocer sus
caractersticas fsicas, qumicas y biolgicas. Uno de los principales
descubrimientos que han llevado al desarrollo de la Ingeniera Gentica son las
enzimas de restriccin las cuales se caracterizan por cortar al ADN en
secuencias especficas.
Los leucocitos son clulas nucleadas las cuales se encargan del trabajo
inmunolgico, estas pueden ser separadas por una sustancia quelante como lo
es el EDTA, la cual separa los factores de coagulacin y deja al descubierto a
las clulas blancas para poder extraerlas del lquido plsmatico.
Los detergentes son sustancias necesarias para poder romper la tensin
superficial de los lpidos integrantes de las diferentes membranas, sin embargo
la estructura de ADN es muy sensible a cualquier tipo de cambio es por eso que
se debe utilizar una solucin que ayude a mantener estable esa estructura,
como puede ser la presencia de solucin salina o similar.

MATERIAL:
Tubos Eppendorf
Puntas para micropipetas
Micropipetas de 10 y 200 l
Pipetas serolgicas
Tubos vacutainer de tapa morada (con EDTA)
Tubos de ensaye
Gradilla
Matraz Erlenmeyer de 125 ml
Celdas para espectrofotmetro

EQUIPO:
Centrfuga clnica
Vortex
Espectrofotmetro

SUSTANCIAS REACTIVAS:
Muestra sangunea
NaOH 0.2 N SDS al 1%
Tritn x-100 al 1%
NaCl 0.1 mol/lt
Alcohol etlico al 96%
Agua destilada estril

MTODO:
Lisis alcalina, separacin por centrifugacin, y espectrofotocolorimtrico

PROCEDIMIENTO:
1. Tomar una muestra de 3 a 5 ml de sangre en un tubo Vacutainer con
EDTA.
2. Centrifugar 5 minutos a 3000 rpm para separar el plasma de los
elementos formes de la sangre.
3. Separar con una pipeta Pasteur o con un gotero plstico graduado la capa
blanca (leucocitos) entre el plasma y los eritrocitos. Llevar las clulas
blancas a otro tubo de ensaye y
4. Agregar 10 ml de agua destilada estril. Tapar el tubo e invertir varias
veces.
5. Centrifugar 10 minutos a 5000 rpm y descartar el sobrenadante.
6. Al sedimento (pequeo botn blanco) se le agregan 10 ml de Tritn X-10
al 1%. Tapar el tubo y agitar suavemente de manera constante durante
unos minutos hasta resuspender perfectamente el sedimento.
7. Centrifugar durante 10 minutos a 5000 rpm
8. Agregar 10 ml de de SDS al 1% (agitar suavemente, tener cuidado de que
quede bien resuspendido).
9. Vaciar en un matraz y agitar suavemente durante unos minutos ms.
10. Agregar 5 ml de NaCl 0.1 mol/lt. Agita y dejar reposar unos minutos
11. Agregar 5 ml de etanol fro. Agitar muy suavemente y observar como se
precipitan los filamentos que contienen el DNA
12. Colectar los filamentos con una varilla de vidrio muy delgada o por medio
de reconcentracin en un tubo Ependorff conteniendo 0.2 ml de agua
destilada estril
13. Una parte del ADN aislado s
14. e guarda en el refrigerador a 20C hasta correr la electroforesis
15. La otra aparte de la muestra se trabaja en cuantificacin por medio de la
tcnica de la difenilamina

RESULTADOS:
En esta sesin se obtuvo una muestra que se correr en la electroforesis, sin
embargo la otra muestra se cuantifico y se obtuvo una cantidad de___________

Anotar los datos ms relevantes de la tcnica y la discusin de los datos se


orientara hacia la reproducibilidad de los datos.

DISCUSION:
Centrar la discusin explicando la funcin de cada uno de los reactivos
utilizados.
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CONCLUSION:
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BIBLIOGRAFIA:
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CUESTIONARIO
1.- Mencione 5 caractersticas que permitan identificar al ADN
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2.- Mencione 3 diferencias del ADN con respecto a las protenas y 3 diferencias
con ARN.
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PRACTICA No. 5

SEPARACION DE ADN POR ELECTROFORESIS EN GEL DE


AGAROSA

OBJETIVO:
El alumno conocer la tcnica de electroforesis como una herramienta para la
separacin e identificacin de ADN.

PREREQUISITOS:
1. Definir electroforesis.
2. Cual es el fundamento de la electroforesis del ADN en geles de agarosa.
3. Cuales son las diferencias entre la electroforesis y la cromatografa en
capa fina.

INTRODUCCION:
La electroforesis es una tcnica que ha revolucionado los trabajos de
investigacin sobre los cidos nucleicos, ya que permite analizar fragmentos de
ADN o en su caso obtener la secuencia total del ADN.
Se basa en la separacin de compuestos debido a su carga y en este caso
debido al peso molecular de los fragmentos de ADN ya que como se sabe el
ADN tiene carga negativa debido a los grupos fosfato.
Esta tcnica permite identificar fracciones de ADN y a su vez aislar dichos
fragmentos para su estudio posterior.
En esta sesin se va a analizar el ADN de la muestra (si trabajo extraccin de un
plsmido es igual), que se extrajo en la sesin anterior para identificar su peso
molecular y las caractersticas de la extraccin.

MATERIAL:
Tubos Eppendorf
Puntas para micropipetas
Micropipetas de 5 a 200l

EQUIPO:
Vortex
Cmara de electroforsis
Fuente de poder con cables
Microcentrfuga

SUSTANCIAS REACTIVAS:
Agarosa tipo II o de alta resolucin
Amortiguador Tris boratos 1 x
Agua destilada estril (si fuese necesaria)
Buffer de carga 20 x
Leader
Solucin amortiguadora TE

METODO:
Electrofortico

PROCEDIMIENTO:
1. Re suspender la muestra de ADN en 10 ul de amortiguador TE.
2. Dejar la solucin en re suspensin y proceder a preparar el gel de
agarosa.
3. Pesar 0.6 g de agarosa y disolver en 60 ml de amortiguador de tris-
boratos 1X.
4. Calentar hasta disolver y enfriar al chorro de agua hasta que alcance una
temperatura de un poco mayor que la corporal.
5. Vaciar en la cmara de electroforesis y dejar que solidifique.
6. Eliminar los peines y aadir 60 ml de amortiguador tris-boratos 1X.
7. En el tubo Eppendorf con 10 ul del ADN recin disuelto aadir 10 ul de
agua y 2 ul de amortiguador de carga 20 X.
8. Mezclar y centrifugar 2 seg. en la micro centrfuga.
9. Tomar los 22 ul y colocarlo en un de los pozos del gel de agarosa.
10. Una vez que se hayan colocado todas las muestras aadir 2 ul de
amortiguador de carga en los pozos vacos.
11. Tapar la cmara y colocar los cables para realizar la electroforsis a 90
mA durante 1 hora.
NOTA: Este paso es de cuidado por lo cual se recomienda que lo realize
el Profesor de Laboratorio para evitar accidentes.
12. Una vez desconectada la fuente de poder aadir 3 gotas de bromuro de
etidio sobre el gel mezclar y reposar 10 min.
13. Enjuagar varias veces con agua destilada.
14. Desprender el gel y observarlo a travs del transiluminador de luz
ultravioleta
NOTA: El transiluminador emite luz ultravioleta la cual es peligrosa para
el ser humano especialmente para los ojos, por lo tanto solo observar el
gel utilizando una pantalla de acrlico.

RESULTADOS:
Esquematize los resultados obtenidos por todos los equipos del laboratorio.
DISCUSION:
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CONCLUSION:
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CUESTIONARIO
1.- Indique cuales son los efectos de la luz ultravioleta sobre los cidos
nuclicos.
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2.- Explique cul es la funcin del bromuro de etidio.


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3.- El amortiguador de carga contiene sacarosa al 25 % indique cual es su


funcin.
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4.- Explique el fundamento de la separacin electrofortica del ADN


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5.- Mencione otro procedimiento de separacin de ADN


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6.- Que enfoque en el campo mdico tiene este tipo de experimento
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7.- Defina terapia gnica.


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BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:
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PRCTICA No. 6

EFECTO MUTAGENICO DE LA LUZ ULTRAVIOLETA.

OBJETIVO:
Observar, mediante el conteo de la biomasa de una cepa de Escherichia coli
susceptible a la luz ultravioleta, los efectos mutagnicos y la posible capacidad
de reparacin del ADN que presenta esta bacteria.

PRERREQUISITOS:
1. Replicacin del ADN
2. Tipos de errores de copia posibles durante la replicacin.
3. Mecanismos de Reparacin del ADN.
4. Tipos de Mutaciones.

INTRODUCCION:
Todos los organismos vivos contienen ADN. Este tiene la funcin primordial de
regular la actividad metablica y funcional de cada organismo. Para que esto
suceda, es necesario que la clula garantice la sucesin de su ADN en las
clulas hijas al momento de dividirse. Para esto, cuenta con sistemas que
permiten que el ADN se auto replique justo antes de la divisin. Sin embargo,
esta auto replicacin est muy lejos de ser segura, debido a que existen una
serie de elementos que tienden a modificar la secuencia de nucletidos normal
del ADN. A estos elementos se les llama agentes muta gnicos, ya que su
efecto principal es provocar errores de copia en el ADN durante la replicacin. Si
estos errores no son oportunamente reparados, van a provocar modificaciones
en la secuencia del ADN que sern incluidos en los ADN de las posteriores
replicaciones. Si estas modificaciones se expresan genotpica y fenotpicamente,
entonces el error de copia se convierte en una mutacin que puede en un
momento dado modificar a tal grado la informacin gentica que hace imposible
la actividad biolgica de la clula y sobreviene la muerte.

Uno de los agentes muta gnicos ms agresivo es la radiacin ultravioleta cuyo


efecto sobre el ADN es promover la formacin de dmeros de timina. Estos
dmeros son reparables por medio de la enzima fotoreactivante, la cual es una
enzima muy activa en presencia de fotones luminosos. La ausencia de luz
impide por lo tanto la reparacin de este tipo de mutaciones.

MATERIAL:
Cajas de Petri con agar nutritivo
Azas de nicromio
Papel estao o de aluminio
Matraz con extensin
EQUIPO:
Colormetro Klett
Trasiluminador de luz ultravioleta
Incubadora a 37C

SUSTANCIAS REACTIVAS:
Cepa de Echerichia Coli

METODO:
Inoculacin, mutacin por exposicin a luz ultravioleta, reparacin por foto
reactivacin a exposicin a luz blanca.

METODO:
1. Se siembra una cepa de E. Coli en el matraz Erlenmeyer con los 50 ml.
de caldo nutritivo, colocndolo en la estufa de incubacin a 37C durante
24 horas.
2. Se mide la densidad ptica del cultivo antes y despus de las 24 horas de
incubacin colocando el medio lquido en el colormetro y midiendo la
absorbancia a 550 nm.
3. Tomando como referencia que la densidad ptica para esta bacteria es
de 1 x 108 bacterias por ml. se realiza el clculo para hacer diluciones
hasta obtener 300 bacterias del cultivo lquido en una dcima de ml.
4. Se siembra una dcima de ml en cada caja de Petri previamente provista
de medio de agar nutritivo (distribuir equitativamente).
5. Enumerar las cajas del uno al cuatro con marcador de tinta indeleble y se
aplica el siguiente tratamiento de luz ultravioleta:
a) caja # 1 se utiliza como testigo.
b) caja # 2 se somete a 15 segundos de radiacin ultravioleta y se
envuelve inmediatamente en papel estao para evitar contacto con la luz
de da.
c) caja # 3 se somete a 15 segundos de radiacin ultravioleta y se expone
a la luz durante 10 minutos.
d) caja # 4 se somete a 30 segundos de radiacin ultravioleta y se
envuelve inmediatamente en papel estao para evitar contacto con la luz
de da.
e) caja # 5 se somete a 30 segundos de radiacin ultravioleta y se expone
a la luz durante 10 minutos.
f) caja # 6 se somete a 60 segundos de radiacin ultravioleta y se
envuelve inmediatamente en papel estao para evitar contacto con la luz
de da.
e) caja # 7 se somete a 60 segundos de radiacin ultravioleta y se expone
a la luz durante 10 minutos.
6. Una vez llevado a cabo este tratamiento, se incuban las cajas Petri
durante 24 a 48 horas y se cuentan las colonias.
RESULTADOS:

Caja # 1 2 3 4 5 6 7
Cuenta viable
% de sobrevivencia
Efecto mutagnico

DISCUSION:
Enfoque su discusin en base al anlisis de los resultados comparando el % de
sobrevivencia con respecto al % de mutantes por placa.
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CONCLUSION:
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CUESTIONARIO
1.- Explique con frmulas qumicas cual es el principal efecto de la luz
ultravioleta sobre el ADN:
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2.- Indique cuales son los principales daos que se pueden presentar en un
humano cuando se expone por perodos prolongados a radiaciones ultravioleta:
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3.- Cual es la funcin qumicamente hablando de la capa de ozono en la


atmsfera para protegernos de las radiaciones ultravioleta emitidas por el sol:
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4.- Explique cul es la razn de que la luz ultravioleta sea capaz de causar
mutaciones en los organismos:
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5.- Explique cmo funcionan los mecanismos de reparacin de mutaciones (2


tipos):
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6.- Complementarios.
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BIBLIOGRAFIA:
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PRCTICA No7

DIGESTIN DE CARBOHIDRATOS

OBJETIVO:
Determinar el proceso de digestin de los carbohidratos mediante la absorcin
de los mismos con el Test de OSullivan (determinacin de Diabetes
Gestacional) y la prueba Postprandrial (determinacin de Diabetes por
alimentacin), por el mtodo enzimtico espectrofotocolorimtrico para
determinar el buen funcionamiento de los Islotes de Langerhans en el Pncreas,
descartando la patologa de la Diabetes Mellitus

PRERREQUISITOS:
1._ Clasificacin o tipos de Diabetes
2._ Que es el ayuno y como influye en el metabolismo
3._ Clasificacin de ayuno
4._ Importancia mdica de la prueba postprandrial
5._ Importancia mdica del Test de OSullivan
6._ Que es la curva de tolerancia a la glucosa
7._ Que es la hemoglobina glucosilada

INTRODUCCIN:
La Diabetes Mellitus es un conjunto de trastornos metablicos que se caracteriza
por un aumento de niveles de glucosa en sangre: hiperglucemia. La diabetes es
causada por varios transtornos, siendo la ms relevante la baja produccin de la
hormona insulina, la cual es secretada por las clulas de los islotes de
Langerhan en el pncreas, y que regula la entrada de glucosa a la clulas. Otra
es el inadecuado uso de esta hormona debido al exceso y/o deficiencia de
ingesta alimentaria; y la resistencia a la insulina, que en realidad es la
problemtica que hay de la cantidad insuficiente o dao de los receptores que se
encargan de dar entrada a la glucosa a las clulas y que sucede comnmente
en las personas obesas. Sin embargo se habla de factores genticos como otro
punto importante en el desarrollo de la patologa Diabetes
La diabetes se puede clasificar en diabetes tipo I o insulino dependiente,
diabetes tipo II o resistente a la insulina y diabetes gestacional, que se desarrolla
solo mientras existe embarazo afectando as al metabolismo de la madre
Esta patologa puede determinarse por la cuantificacin de glucosa srica
mediante anlisis diferentes dependiendo del paciente: Test de OSullivan,
prueba posprandrial o curva de tolerancia a la glucosa.
MATERIAL:
Tubos de ensaye
Gradilla
Pipetas de 5 ml
Micropipetas de 25 microlitros
Celdas para espectrofotometro

EQUIPO:
Espectrofotmetro

SUSTANCIAS REACTIVAS:
Solucin reactiva de glucosa (glucosidasa peroxidasa)
Estndar de glucosa
Suero

METODO:
Enzimtico espectrotofocolorimtrico

1. Se colocan una serie de tubos en los cuales se les agregan 2.5 ml de


Reactivo de Glucosa a cada uno.
2. Al primer tubo se le agrega 25 microlitros de agua destilada
3. Al segundo tubo se le agrega 25 microlitros de solucin estndar o patrn
de glucosa
4. A los siguientes tubos, se les agrega para cada uno de ellos 25 microlitros
de suero sanguneo de una de las muestras correspondientes.
5. Se homogenizan todos los tubos y se dejan reposar por 10 minutos
mnimo.
6. Se calibra el espectrofotmetro a cero de absorbancia a 500 NM con el
tubo blanco
7. Se obtienen los resultados y se sacan los clculos

RESULTADOS:

V.N. 60-100 mg/dl o 70-110 mg/dl de glucosa dependiendo de la tcnica


utilizada

CALCULOS: Abs. del problema


----------------------- X [patrn] = mg/dl
Abs. del patrn
DISCUSION:
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CONCLUSION:
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BIBLIOGRAFIA:
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PRCTICA No.8

DIGESTIN DE PROTENAS GSTRICAS.

OBJETIVO:
Al termino de esta prctica el alumno estar capacitado para describir en forma
independiente los procesos enzimticos que con llevan a la digestin de las
protenas de la dieta que entran en el tracto gastrointestinal.

PRERREQUISITOS:
1. Definir los terminos proenzima, zimogeno, serin-proteasa, arilamidasa
2. Describir el proceso enzimatico-hormonal presente en el tracto intestinal.
3. Describir los proceso de absorcin intestinal de protenas.

INTRODUCCION:
Uno de los procesos enzimticos ms interesantes es el que se desarrolla en el
tracto gastrointestinal, cuando es necesario digerir protenas de la dieta. Estas
proteinas son digeridas en el tubo digestivo por enzimas proteolticas y
peptidasas que dejan libres sus aminocidos constituyentes. Algunas protenas
de cadena corta y pptidos se absorben directamente del intestino, pero la
mayor parte de los productos de su digestin circulan en forma de aminocidos.
Con excepcin de las peptidasas intestinales, todas las enzimas proteolticas
intestinales se activan mediante la conversin de precursores inactivos de gran
tamao, llamados zimgenos, ms pequeas enzimas activas. Uno de los
primeros zimgenos que se activan es el pepsingeno que se produce por las
clulas principales bajo el estmulo de la gastrina. este pepsingeno se
autocataliza a pH bajo dando porciones activas llamadas pepsinas que a su vez
catalizan a otros zimgenos.
Las enzimas proteolticas se liberan al intestino como respuesta de la actividad
hormonal de la colestocinina-pancreozimina cuya funcin se da como respuesta
de la llegada del quimo al intestino delgado dando por resultado la liberacin de
quimotripsingeno, tripsingeno, proelastasa y procarboxipetidasa que son
activados principalmente por efecto de la tripsina y pepsina principalmente.
La absorcin de protenas se dar en funcin a la capacidad proteoltica
intestinal y regularmente esta no es muy activa por lo cual se absorben gran
cantidad de pptidos pequeos adems de los aminocidos. Sin embargo las
clulas de la mucosa intestinal tienen capacidad peptidoltica para degradar
dichos pptidos antes de pasar al torrente circulatorio.
La intensin de este experimento es la de promover la hidrlisis de una protena
utilizando dos tipos de enzimas intestinales como son la pepsina y la tripsina
para poder comparar la capacidad proteoltica de cada una de ellas analizando
por cromatografa los productos de la digestin de la protena.
MATERIAL:
Tubos de ensayo.
Pipetas de 1.0 ml.
Gradilla.
Placa de cromatografa en capa fina
Capilares

EQUIPO:
Incubadora a 37C
Equipo para cromatografa en capa fina.

SUSTANCIAS REACTIVAS:
Solucin de albumina al 0.5 %
Solucin de peptona al 0.5%
Solucin de gelatina al 0.5%
Proteinasa K 0.005%
Pepsina 0.1%
Tripsina 0.1%
HCl 0.1%
Bicarbonato de sodio 0.1M

METODO:
Digestin por incubacin, cromatografico

PROCEDIMIENTO:
1. Preparar una solucin de protena (albumina, peptona o gelatina) al 2.0%
en HCl 0.1 N (o por separado) y etiquetarla como "Protena".
2. Preparar una solucin de pepsina al 0.1 % en agua destilada.
3. Preparar una solucin de tripsina al 0.1 % en agua destilada.
4. Preparar una solucin de proteinasa K al 0.005% en agua destilada
5. Preparar una serie de tubos de acuerdo al siguiente cuadro:

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Albumina .2 ml .2 ml .2 ml
Gelatina .2 ml .2 ml .2 ml
Peptona .2 ml .2 ml .2 ml
Pepsina .2 ml .2 ml .2 ml
Tripsina .2 ml .2 ml .2 ml
Proteinasa .2 ml .2ml .2 ml
K
HCl .2 ml .2 ml .2 ml
Bicarbonato .2 ml .2 ml .2 ml .2 ml .2 ml .2 ml
de sodio
6. Mezclar el contenido de cada tubo e incubar todos los tubos durante 24
horas a 37 oC.
7. Enfriar al chorro de agua y proceder a colocar una muestra de cada tubo
en la placa de silica gel previamente activada.
8. Utilizando un solvente de butanol-ac. actico-agua (40-10-50) proceder a
correr el cromatograma por 1 hora.
9. Revelar el cromatograma con nihidrina al 2 % en etanol de 96 %.
10. Calcular los Rf para cada mancha que quede bien definida.

RESULTADOS:

Rf de la albumina - pepsina
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Rf de la peptona pepsina
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Rf de la gelatina pepsina
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Rf de la albumina tripsina
________________________________________________________________
Rf de la peptona tripsina
________________________________________________________________
Rf de la gelatina tripsina
________________________________________________________________
Rf de la albumina proteinasa K
________________________________________________________________
Rf de la peptona proteinasa K
________________________________________________________________
Rf de la gelatina proteinasa K
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DISCUSION:
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CONCLUSION:
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CUESTIONARIO

1._ Cual es el fundamento de la cromatografa.


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2._ Describa los tipos de anlisis cromatogrficos existentes.


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3._ Que es Rf y como se calcula.


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4._ Cual es la fuente principal ms frecuentemente utilizada en el diagnstico


clinico para la tripsina.
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5._ En que parte del organismo se comienza la digestin de las protenas.

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6._ Cual es la funcin del HCl en el jugo gstrico y cul es su pH.
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7._ De que se compone el jugo gstrico y en que porcentajes.


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8._ Cual es la funcin de la pepsina en aparato digestivo


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9._ Diga cual es la endopepsidasa especfica para enlaces peptdicos de


aminocidos bsicos.
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10._ Diferencia entre endopepsidasas y exopepsidasa


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11._ Describa con un esquema los puntos de rompimiento que se generan por
medio de la tripsina.
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12._Mencione las diferencias funcionales entre la tripsina y la carboxipeptidasa.


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13._Mencione los posibles mecanismos de absorcin de aminocidos y pptidos
a travs de la mucosa intestinal.
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14._Explique el comportamiento del equilibrio nitrogenado cuando hay una


ingesta excesiva de protenas.
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BIBLIOGRAFIA:
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PRACTICA No. 9

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LIPASA

(DIGESTION INTESTINAL DE GRASAS)

OBJETIVO:
Al trmino de esta prctica, el alumno ser capaz de describir los mecanismos
de absorcin intestinal de las grasas, as como, enumerar las diferentes
caractersticas que complementan el experimento.

PREREQUISITOS:
1. Efecto de los cidos biliares en la absorcin de las grasas.
2. Definir emulsificacin y saponificacin.
3. Caractersticas, origen y funcin de las lipasas.

INTRODUCCION:
Las lipasas y las esterasas catalizan la hidrlisis de enlaces ster que se
encuentran en un gran nmero de lpidos saponificables.

CH2 - O - CO - R1 CH2 - OH
| |
R2 - O - CH LIPASA CH - OH + 3 R-COOH
| ----------> |
CH2 - O - CO - R3 PANCREATICA CH2 - OH

Estas enzimas estn ampliamente distribuidas en la naturaleza y son


especialmente importantes en el tracto gastrointestinal, donde participan en la
digestin y absorcin de grasas.
Debido a que las grasas no son solubles en agua, las enzimas deben de actuar
en la interfase lpido-agua. Consecuentemente, los agentes emulsificantes tales
como las sales biliares producen a menudo una estimulacin marcada de la
hidrlisis enzimtica de los lpidos, debido al incremento de la interfase lpido-
agua. En la leche homogenizada, los glbulos de grasa estn finamente
divididos y este material sirve como sustrato excelente para las lipasas.
En este experimento se emplea como enzima una lipasa muy potente que se
encuentra en el pncreas.

MATERIAL:
Matraces Erlenmeyer de 125 ml
Buretas de 50 ml
Pipetas de 1, 5 y 10 ml
EQUIPO:
Pinza para bureta
Soporte universal
Incubadora a 37C

SUSTANCIAS REACTIVAS:
Leche
Lipasa pancretica
Lipasa pancretica calentada (hervida por 5 minutos)
Bilis (dexosicolato de sodio al 1%)
KOH al 0.1 N
Fenolftalena al 1% en solucin alcohlica
Alcohol de 96

METODO:
Incubacin y valoracin acido base (titulacin)

PROCEDIMIENTO:
Preparar una serie de 8 matraces Erlenmeyer de 125 ml de acuerdo a la
siguiente tabla:

Matraz T1 1 2 3 4 5 6 T2
Leche (ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
Lipasa ___ 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 ____
pancreatica
Lipasa 1.5 ___ ___ ____ ___ ___ ___ 1.5
pancretica
calentada
Bilis (dexo- ___ ___ ___ ___ 1.5 1.5 1.5 1.5
sicolato de
sodio)
Tiempo de 45 15 30 45 15 30 45 45
incubacin
a 37C

Tabla 5 Actividad de la Lipasa Pancreatica

Despus de que cada matraz ha cumplido su tiempo de incubacin, retirarlo del


bao, adicionar 12.5 ml de alcohol 96 y 3 gotas de fenolftalena (indicador)
enseguida titular con KOH 0.1N.
Agitar el matraz durante la titulacin tan rigurosamente como sea posible, ya que
la protena precipitada puede enmascarar los cidos grasos.
Titular cada matraz tan rpido como sea posible (contra un fondo blanco), el
color se tornara rosa y se debe mantener durante 1 minuto, debido a que la
digestin por la lipasa contina durante la titulacin.

RESULTADOS:

Matraz Gasto de KOH Diferencia Tiempo de


de gasto de KOH incubacin
T1 ________ --------- ______

1 ________ 1 - T1 = _______ ______

2 ________ 2 - T1 = _______ ______

3 ________ 3 - T1 = _______ ______

4 ________ 4 - T2 = _______ ______

5 ________ 5 - T2 = _______ ______

6 ________ 6 - T2 = _______ ______

T2 ________ ---------- ______

En una hoja de papel milimtrico anexa, graficar en el eje de las y (ordenadas) la


diferencia de gasto de KOH y en el eje de las x (abcisas) el tiempo de
incubacin.

DISCUSION:
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CONCLUSION:
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CUESTIONARIO

1.- Con que otro nombre se le conoce a la lipasa gstrica y diga cual es su
funcin durante el proceso digestivo.
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2._ Diga cuales son las diferencias entre una lipasa y una estereasa.
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3._ Mencione tres enfermedades en las cuales participen los triacilgliceroles en


el transporte y almacenaje de lpidos.
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4._Que diferencias hay entre los triacilgliceroles y los fosfogliceroles,


esfingomielina y glucoesfingolpidos.
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5._ Indique cuales seran las propiedades de las sales biliares.


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6._ Mencione 3 tipos de lipasa y cules son sus diferencias funcionales (referido
a los productos que se obtienen).
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7._ Diga cual es el modo de activacin de la lipasa pancretica y las condiciones


ptimas para su actividad.
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8._ Mencione 3 posibles causas de esteatorrea.


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9._ Cual es la funcin del clofibrato en pacientes hipercolesterolmicos y porqu.


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10._ Cual es la funcin del desoxicolato de sodio sobre la estructura inicial


lipdica.
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BIBLIOGRAFIA:
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PRACTICA No 10

EXTRACCION Y SEPARACIN CROMATOGRAFICA DE


FOSFOLIPIDOS

OBJETIVO:
Extraer los fosfolpidos de las grasas neutras de una muestra cualquiera e
identificarlos por medio de una cromatografa de acuerdo a su composicin en
base a la fraccin colina o amino que estos tengan.

PRERREQUISITOS:
1. Que es un fosfolpdo?
2. Importancia bioqumica de los fosfolpidos
3. Importancia mdica y nutriolgica de los fosfolpidos
4. Diferencia entre soluciones polares y no polares
5. Qu es la colina y cul es su importancia biomdica?

INTRODUCCION:
Estn constituidas bsicamente por tres elementos: carbono (C), hidrgeno (H) y
oxgeno (O); en menor grado aparecen tambin en ellos nitrgeno (N), fsforo
(P) y azufre (S).
Una caracterstica bsica de los lpidos, y de la que derivan sus principales
propiedades biolgicas es la hidrofobicidad.
La baja solubilidad de los lipdos se debe a que su estructura qumica es
fundamentalmente hidrocarbonada (aliftica, alicclica o aromtica), con gran
cantidad de enlaces C-H y C-C.
Los fosfolpidos son aquellos lpidos que estn constituidos por cido fosfrico
derivado del glicerofosfrico que estn formados por una molcula de glicerol
esterificada en las posiciones 1 y 2 por dos cidos grasos, con la posicin 3
esterificada por un cido fosfrico que lleva unidas adems otras estructuras,
dependiendo del fosfolpido de que se trate. De forma genrica se denominan
"lecitinas", aunque se considera que la lecitina propiamente dicha es la
fosfatidilcolina. Los fosfolpidos son los principales constituyentes lipdicos de las
membranas biolgicas, donde forman estructuras en bicapa, con las zonas no
polares de los constituyentes de cada capa orientadas hacia el interior.
Consecuentemente, los fosfolpidos se van a encontrar presentes en la mayora
de los alimentos complejos, en los que exista material celular.
MATERIAL:
Matraz Erlenmeyer de 1 litro (preferentemente)
Placa de cromatografia

EQUIPO:
Cmara de cromatografa

SUSTANCIAS REACTIVAS:
Muestra orgnica
Cloroformo
Metanol
Acido actico
Agua
KCl 0.1 M

METODO;
Extraccin, separacin por cromatografa

PROCEDIMIENTO:
Preparacin de la muestra:
1. Obtener la yema de un huevo (puede ser cualquier muestra) y mezclar
con 50 ml de cloroformo: metanol (2:1, v/v), agitar durante 20 minutos
chocando con las paredes del frasco y filtrar (este tratamiento permite
extraer los fosfolpidos de los lpidos neutros).
2. Agitar el filtrado claro con 20 ml de KCl 0.1 M y centrifugar durante 10
minutos a 3000 rpm
3. Desechar la fase acuosa (parte superiora9 y utilizar la fase orgnica para
la cromatografa

Preparacin de la placa y aplicacin de la muestra:


1. Identificar su placa con una marca con lpiz en la parte superior, hacer
una muesca en cada lado de la placa aproximadamente 1.5 cm de la
parte inferior y calentar en el horno por unos minutos a 80C para su
activacin (no es necesaria si es nueva la placa), enseguida aplicar una
muestra colocando primeo una gota, dejar secar al aire y volver a colocar
una segunda gota sobre la primera, hacer lo mismo con todas las
muestras que someta a la cromatografa.

Desarrollo del cromatograma:


1. Aadir aproximadamente 50 ml de la mezcla de disolventes cloroformo:
metanol: cido actico: agua destilada (65:25:8:4) recin preparada a la
cmara de cromatografa y cerrar.
2. Posteriormente a la introduccin de todas las placas en la cmara de
cromatografa
3. Sellar con grasa y dejar correr los cromatogramas hasta 1 cm antes de
llegar a la parte superior
4. Sacar los cromatogramas con cuidado, colocndolos en el horno o a la
estufa a 80C

Revelado de los cromatogramas:


Cada placa se revela con diferente reactivo
Placa #1 Impregnar con el reactivo de molibdato y esperar 10 minutos
para la aparicin del color azul. Reacciona con todos los fosfolpidos
Placa 2 Revelar con el reactivo de Bismuto (recin preparado), el cual es
especfico para fosfolpidos que contienen colina

Reactivo de trabajo de Bismuto: tomar 4 ml de solucin de Bismuto A, 2 ml de


cido actico al 20% y 1 ml de solucin de Bismuto B. Colquese en el aspersor.
Placa #3 Revelar con el reactivo de ninhidrina, el cual es especfico para
aminofosfolpidos. Una vez rociada la laca con ninhidrina colocar la placa
en la estufa a 80C por unos minutos

RESULTADOS:
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DISCUSION:
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CONCLUSION:
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BIBLIOGRAFIA:
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PRACTICA No 11

INDUCCION Y REPRESION HORMONAL EN EL

METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS.

OBJETIVO:
Conocer y describir detalladamente cada uno de los eventos del equilibrio
homeosttico de la glucosa tomando en cuenta el papel que juegan las
hormonas insulina y adrenalina en el control de este equilibrio.

PREREQUISITOS:
1. Explicar la diferencia entre induccin y activacin enzimtica.
2. Explicar la diferencia entre represin e inhibicin enzimtica.
3. Definir alosterismo y regulacin enzimtica.
4. Definir hipoglucemia e hiperglucemia.

INTRODUCCION:
La glucosa se considera, en la mayora de los organismos, como la fuente
primaria de energa oxidativa y todo el programa metablico celular est
diseado primordialmente para usar este metabolito como principal materia
prima. Este diseo implica que la absorcin de glucosa exgena sea muy
eficiente de tal modo que garantice un aporte suficiente de la misma a todas las
clulas del organismo. Tal efecto obliga al organismo a mantener sistemas muy
eficientes de regulacin para evitar una posible sobresaturacin de glucosa
celular. En los mecanismos de control homeosttico de glucosa estn implicadas
las principales vas metablicas de los carbohidratos, de hecho estas vas son
las que mantienen el equilibrio y son: la gluclisis considerada como la va
degradativa principal de la glucosa; la glucognesis que genera al glucgeno
como principal fuente almacenable de glucosa; la glucogenlisis mecanismo por
el glucgeno puede en caso necesario convertirse en glucosa y la
gluconeognesis donde se puede formar glucosa cuando las necesidades de la
misma llegan a estados crticos. Todas estas vas presentan sistemas muy
complejos de autorregulacin enzimtica y de regulacin hormonal que
determinar sincrona, actividad e inhibicin de cualquier cambio en la
concentracin de glucosa intra y extracelular.
Con este experimento nos disponemos a comprobar mediante el uso racional de
animales de laboratorio, las implicaciones que diferentes hormonas del
organismo tienen sobre las vas metablicas que mantienen el control
homeosttico de la glucosa extracelular.
Podemos considerar una hiptesis general donde determinamos: si las
hormonas insulina y adrenalina estn directamente relacionadas con la
regulacin del control homeosttico de la glucosa, entonces, modificando la
concentracin de tales hormonas en el organismo se genera un desequilibrio en
la concentracin de glucosa extracelular. Esto nos lleva a dos hiptesis ms
concretas que nos indican:
Si la insulina tiene un efecto principalmente inductor en la captacin de glucosa
por parte de las clulas y de la degradacin glucoltica y el almacenamiento
glucognico de la glucosa, entonces, aumentando la concentracin de insulina
circulante, se generar un efecto hipoglicmico a la vez que se mantendr la
concentracin mxima de glucgeno heptico en un animal de laboratorio con
una concentracin de glucosa extracelular mantenida constantemente alta.
Si la adrenalina tiene un efecto primario inductor de la movilizacin de la
glucosa a travs de membranas celulares por su efecto activador de la
glucogenlisis, entonces aumentando la concentracin de esta hormona se
generar un efecto hiperglicemiante primario y adems disminuir notablemente
la concentracin de glucgeno heptico en un animal de laboratorio donde se
mantiene la concentracin de glucosa extracelular constantemente alta.

MATERIAL:
Celdillas para espectrofotmetro
Puntas para micropipetas
Micropipetas
Pipetas serolgicas
Mortero con pistilo
Tubos de ensaye
Gradilla

EQUIPO:
Balanza de canasta
Balanza de plato
Centrifuga
Espectrofotmetro

SUSTANCIAS REACTIVAS:
Adrenalina
Insulina de accin intermedia
Insulina de accin rpida
Reactivo de glucosa (glucosa pap)
Estndar de glucosa
TCA 10%
Alcohol etlico al 96%
Agua destilada

METODO:
Diseo experimental por induccin y represin de hormonas
Colorimtrico y espectrofotocolorimetrico enzimtico
PROCEDIMIENTO:
Se requiere un lote de 4 ratas adultas (por sesin), sanas y con un peso
promedio de 400 gr. divididas en 4 grupos con el siguiente tratamiento previo:

GRUPO I: (AZUL) Administracin subcutnea de una dosis de 1.0 unidad de


insulina NPH (de accin intermedia)/ Kg de peso durante cinco 5 das, una hora
antes de la hora de clase.

GRUPO AR: (VERDE) Administrar por va subcutnea 1.0 Unidad/Kg. de


insulina rpida, media hora (solo una aplicacin) antes del experimento.

GRUPO A: (ROJO) Administracin intramuscular de una dosis de 0.01 mg/ml/Kg


de peso de adrenalina media hora antes del experimento.

GRUPO T: (NEGRO) Lote de ratas testigo sin tratamiento hormonal.

Nota: A los cuatro lotes de ratas se les administrar una dieta rica en
carbohidratos, grasas y lpidos en una cantidad de 20 gr de purina por da y
solucin de dextrosa el 5.0%. (se deber refrigerar la solucin que no se est
utilizando.)
Si desconoce la forma de administrar las dosis de insulina y adrenalina asi como
el manejo de la rata, favor de consultar al Profesor, quien tambin les indicar
que experimento va a realizar cada equipo.

COLECCION DE MUESTRAS:

EXTRACCION DE GLUCOGENO:
1. Sacrificar a la rata con ter o cloroformo procurando no excitarla
demasiado.
2. Extraer rpidamente el hgado y colocarlo en un recipiente frio.
3. Pesarlo rpidamente y cortarlo en trozos pequeos.
4. Colocar los trozos en un mortero previamente sumergido en hielo al cual
se le agrega cido tricloactico al 10% en una proporcin de 2.0 ml por
gramo de tejido y 0.5 gr de arena lavada. Triturar el hgado hasta formar
una pasta homognea.
5. Centrifugar durante 5 minutos 2000 rpm.
6. Recuperar el sobrenadante en un tubo de ensaye grande y medir el
volumen.
7. Aadir dos volmenes de alcohol al 95% por volumen de sobrenadante
recuperado.
8. Agitar lentamente hasta que el glucgeno flocule.
9. Centrifugar a 2000 rpm durante 5 minutos.
10. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado con 5.0 ml de
agua destilada.
11. Aplicar las diferentes pruebas de molish, fehling y lugol a la muestra.

CUANTIFICACION DE GLUCOSA SANGUINEA:


1. Extraer el mayor volumen posible de sangre de la rata con una jeringa
desechable de 5.0 cc.
2. Introducir la sangre en un tubo dejndolo reposar durante 5 minutos.
3. Centrifugar la sangre por 10 min. a 2000 rpm.
4. Separe el suero y aplicar el siguiente anlisis:

TUBO BLANCO PATRON PROBLEMA


Agua Destilada 25 l --- ---
Sol. Estndar de glucosa --- 25 l ---
Muestra de Suero --- --- 25 l
Reacttivo de Glucosa 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml
(glucosa oxidasa y
peroxidasa oxidasa)
Tabla 6 Preparacion de las muestras para cuantificacin de glucosa

5. Mezclar cada tubo y dejar reposar mnimo 10 minutos (puede incubar a


37C si quiere)
6. Enfriar al chorro de agua y leer la absorbancia de la muestra y el patrn a
500 nm. ajustando a cero de absorbancia con el blanco.
7. Hacer el siguiente clculo:

As problema
Glucosa srica = ---------------------- X [patrn] = mg/dl
As patrn
RESULTADOS:

TRATAMIENTO Deteccin Cuantificacin


de glucgeno de glucosa

RATA I (NPH) ________________ _______________

RATA I (rpida) ________________ _______________

RATA A ________________ ______________

RATA T ________________ ______________

CUESTIONARIO

1. Siendo la glucosa la fuente primaria de energa oxidativa. Qu tejidos la


sintetizan?. Qu tejidos la usan como fuente nica o principal pero no la
sintetizan?
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2. Las hormonas son determinantes en la regulacin del metabolismo


energtico. Obtenga la siguiente informacin para cada una de las siguientes
hormonas:

HORMONA COMPOSICION ORIGEN ACCION EFECTO EN


QUIMICA PRIMARIA LA GLUCEMIA
ADRENALINA
INSULINA
GLUCAGON
SOMATOTRO
FINA
3. Qu es una cascada de regulacin?
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4. Defina glucolisis y su ruta en procesos anaerobios y aerobios


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5. Explique porque la glucolisis se considera tanto una ruta anablica como


catablica
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6. Adems de la glucosa, que otras hexosas pueden metabolizarse en la


glucolisis.
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7. Cules son los destinos metablicos del piruvato?


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8. Caractersticas fsico-qumicas del glucgeno y mencione los tejidos en los


que se almacena.
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9. Describa el proceso de la glucogenlisis y el efecto en ella del segundo


mensajero.
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10. Defina gluconeognesis, en donde se lleva a cabo y cules son sus
principales substratos.
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11. Mencione las enzimas fundamentales en la regulacin de:


a) gluclisis
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b) gluconeognesis
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12. Mencione cuatro enfermedades debidas al almacenamiento del glucgeno,


su dficit enzimtico y el rgano (s) afectado.
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13. Porqu razn el etanol inhibe la gluconeognesis.


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14.Rango de concentracin de glucosa en la sangre.


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15. Cual es la diferencia en la utilizacin de glucosa en un estado de inanicin y


en diabetes.
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PRACTICA 12

DETERMINACION DE TRANSAMINASAS SERICAS

OBJETIVO:
El alumno determinar la transaminasa glutmico pirvica (STGP) y la
transaminasa glutmico oxaloacetica (STGO) en el suero para interpretar
fenmenos fisiolgicos, metablicos y patolgicos relacionados con estas
enzimas.

PRERREQUISITOS:
1. Funcin de las transferasas.
2. Fundamentos metablicos de las transaminaciones.
3. Importancia Clnica de STGO y STGP.

INTRODUCCION:
Las transaminasas son enzimas que realizan la interconversin de aminocidos
alfa-cetocidos por transferencia de grupos amino. Existe una gran variedad de
transaminasas con diferente significado fisiolgico, de ellas la STGO y la STGP
son las mas importantes desde un punto de vista clnico.
La STGO promueve la siguiente reaccin:
STGO
L-aspartato + cetoglutarato <--------> oxaloacetato + L-glutamato

la STGP a su vez promueve la siguiente reaccin:


STGP
L-alanina + cetoglutarato <--------> piruvato + L-glutamato
Estas reacciones son reversibles y utilizan l fosfato de piridoxal como coenzima.
Estas transaminasas estn distribuidas ampliamente en tejidos animales en
forma principal de tejido heptico y tejido cardaco y en forma secundaria en
plasma, bilis y fluido cerebroespinal sus niveles extracelulares deben ser bajos
en condiciones normales y solo cuando hay lesin celular se podrn encontrar
altos ttulos de estas enzimas.
En pacientes con infarto al miocardio con lesin heptica aguda se
encontrarn altos ttulos de dichas transaminasas los cuales se mantendrn
elevados por un periodo de 24 a 36 hrs en caso de infarto y por mucho ms
tiempo en caso de lesin heptica.

MATERIAL:
Tubos de ensaye
Gradilla
Pipetas serolgicas
Propipetas
Celdillas para espectrofotmetro
EQUIPO:
Espectrofotmetro
Incubadora a 37C

SUSTANCIAS REACTIVAS:
Sustrato de TGO
Sustrato de TGP
Estandar de piruvato
Agua destilada
Dinitrofenilhidracina
NaOH 0.4 N
Suero (no hemolizado)

METODO:
Incubacin y espectrofotocolorimetrico

PROCEDIMIENTO:
Se utilizar la reaccin de dinitrofenilhidracina para cuantificar a ambas
transaminasas. Esta reaccin tiene el siguiente fundamento qumico:
El substrato de alanina en solucin amortiguadora de pH 7.4 reacciona con la
STGP produciendo piruvato el cual en un medio alcalino reacciona con la 2,4-
dinitrofenilhidracina formando una fenilcarbazona (dinitrofenilhidrazona) que se
puede cuantificar espectrofotometricamente a 505 nm.
El substrato de aspartato en solucin amortiguadora de pH 7.4 reacciona con la
STGO produciendo oxaloacetato que reacciona con la dinitrofenilhidracina a pH
alcalino dando tambin una fenilcarbazona que se puede medir
espectrofotometricamente a 490 nm.

Primero se deber elaborar una curva de calibracin como se muestra en el


cuadro siguiente:

Tubo ml de piruvato Sustrato H2O Abs Unidades Unidades


de GPT destilada de TGO de TGP
1 0 1.0 0.2 --- 0 0
2 0.10 0.90 0.2 --- 24 28
3 0.20 0.80 0.2 --- 61 57
4 0.30 0.70 0.2 --- 114 97
5 0.40 0.60 0.2 --- 190 150
Tabla 7 Preparacin para la curva de calibracion
1. Agregar 1.0 ml de dinitrofenilhidracina. Reposar 20 mins.
2. Agregar 10 ml de NaOH 0.4 N. Reposar 10 mins
3. Leer a 505 nm ajustando el espectrofotometro con un blanco con agua
destilada
4. Elaborar una grafica en funcionamiento a las unidades GOT y GPT
correspondientes

Reactivos Problema TGO Problema TGP


1. Solucin amortiguadora de
substrato 0.5 ml 0.5 ml
2. Preincubacion a 37 C por 5
mins.
3. Suero (no hemolizado)
0.2 ml 0.2 ml
4. Mezclar e incubar a 37C
por 30 mins
5. Reactivo de
dinitrofenilhidracina 0.5 ml 0.5 ml
6. Mezclar y dejar reposar a
temperatura ambiente por
20 mins
7. Hidroxido de sodio 0.4 N 5 ml 5 ml
8. Mezclar y reposar 5 mins a
temperatura ambiente
Tabla 8 Tratamiento de los problemas

9.-Medir la absorbancia del tubo de STGP a 505 nm. y de STGO a 490 nm


ajustando a cero con agua destilada.

10.-Interpolar los valores de absorbancia obtenidos en la curva patrn para


determinar la unidades de transaminasas.

VALORES NORMALES:

STGO: 4 a 36 Unidades/ ml.

STGP: 4 a 32 Unidades/ ml.

RESULTADOS:
En base a la grfica determinar la concentracin de STGO y STGP

Valores obtenidos:
STGO:____________________unidades/ml.

STGP:____________________unidades/ml.

DISCUSION:
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CONCLUSIONES:
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CUESTIONARIO

1.- Tipo de reaccin que catalizan las aminotransferasas.


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2.- Cual es la vida media de las principales aminotransferasas.


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3.- En el humano donde se encuentran estas enzimas.


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4.- Cuales son las pruebas de la funcin heptica, basndose en:

Pruebas basadas en sustancias producidas o sintetizadas por el hgado:


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Pruebas basadas en sustancias metabolizadas por el hgado:


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Pruebas basadas en sustancias liberadas a partir de tejidos daados:


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Pruebas basadas en sustancias depuradas del plasma por el hgado:


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BIBLIOGRAFIA:
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PRACTICA No. 13

CUANTIFICACION DE BILIRRUBINAS SERICAS

OBJETIVO:
Determinar la concentracin de bilirrubina total y directa por la tcnica de Van
der Berg y las analizar como una prueba de funcin heptica.

PREREQUISITOS:
1. Conocer y describir el metabolismo de las bilirrubinas.

INTRODUCCION:
La bilirrubina es un compuesto cromgeno de color amarillo o naranja formado
en la excresin del catabolismo de la Hemoglobina. El grupo porfirnico HEM es
la fuente directa de bilirrubina y se detecta en dos formas: bilirrubina libre y
conjugada con cido glucurnico, siendo esta conjugacin a nivel heptico.
El hgado tiene la capacidad para concentrar y eliminar la bilirrubina por
mecanismos especficos y es transportada por el torrente sanguneo unida
electrostticamente a la albmina. Se liberan por da 6 gr. de hemoglobina los
cuales son catabolizadas en clulas del sistema retculo endotelial donde es
liberada la bilirrubina, esto se hace por medio de dos reacciones enzimticas:
primero el complejo de oxigenasas microsmicas y la accin de la biliverdina
reductasa.
La determinacin clnica de bilirrubina srica es utilizada como prueba de
funcionamiento heptico, las enfermedades ligadas con altas concentraciones
de bilirrubinas se conocen como hiperbilirrubinemias y son responsables de un
sndrome llamado Ictericia que determina mltiples etiologas.

MATERIAL:
Celdas para espectrofotmetro
Tubos de ensaye
Gradilla
Pipetas serolgicas
Propipetas

EQUIPO:
Espectrofotmetro

SUSTANCIAS REACTIVAS:
Acido sulfanilico 29 mM
Acelerador (cafena + benzoato de sodio + acetato de sodio)
Fehling II (tartrato de sodio y potasio con hidrxido de sodio)
Nitrito de sodio
Suero (no hemolizado)
METODO:
Espectrofotocolorimetrico

PROCEDIMIENTO:
Se va a utilizar la Tcnica de Van der Berg basado en las siguientes reacciones:
El cido sulfanlico diazoico en un medio alcalino reacciona con la bilirrubina
formando un complejo azobilirrubina el cual tiene una coloracin caf parda, la
sensibilidad es mayor para la bilirrubina conjugada que la libre. Si se detecta
sta ltima se aplica un acelerador del color, por ej. cafena, benzoato de sodio y
acetato de sodio.

TECNICA: PARA BILIRRUBINA TOTAL:

TUBO PROBLEMA BLANCO

Acido sulfanlico 0.2 ml. 0.2 ml.

Nitrito de sodio 0.1 ml. -------

Acelerador 1.0 ml. 1.0 ml.

Suero problema 0.2 ml. 0.2 ml.

Mezclar y reposar 30 min.


Fehling II 1.0 ml. 1.0 ml.

Mezclar y leer la absorbancia del problema a 580 nm, ajustando a cero con el
blanco.

CALCULOS:
Absorbancia del problema X 10.5 = [Bilirrubina total] mg/dl.

VALORES NORMALES: Hasta 1.0 mg/dl.

TECNICA: PARA BILIRRUBINA DIRECTA (CONJUGADA).

TUBO PROBLEMA BLANCO

Acido sulfanlico 0.2 ml. 0.2 ml.

Nitrito de sodio 0.1 ml. - ----

Solucin salina 2.0 ml. 2.0 ml.


Suero problema 0.2 ml. 0.2 ml.

Mezclar y reposar 5 min. y leer a 580 nm ajustando a cero con el blanco.

CALCULOS:
Absorbancia del problema X 14 = [Bilirrubina Directa] mg/dl.

Valores Normales = Hasta 0.3 mg/dl.

[Bilirrubina indirecta] mg/dl = Total - Directa.

RESULTADOS:
Desarrolle el clculo y resultados para:

Bilirrubina Total en mg/dl. =

Bilirrubina Directa en mg/dl. =

Bilirrubina Indirecta en mg/dl.=

DISCUSION:
En base a los resultados obtenidos y el objetivo planteado analice la importancia
de esta determinacin, como parte de un Perfil Heptico. Discuta la Tcnica
utilizada.
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CONCLUSION:
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CUESTIONARIO

1.- Porque se dice que la prueba de la bilirrubina plasmtica es poco sensible de


enfermedad heptica
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2.- Que enfermedades producen alteraciones de urobilingeno en orina y heces:


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3.- Explique los siguientes tipos de ictericia:

Ictericia preheptica:
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Ictericia heptica:
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Ictericia postheptica:
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4.- Describa enfermedad hemoltica del recin nacido / Incompatibilidad Rh (D) /


Eritroblastosis fetal:
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5.- Esquematice los pasos que sigue la formacin de bilirrubina:


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BIBLIOGRAFIA:
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