TUJUAN

1. Memahami dan melakukan teknik pemisahan senyawa dengan metode elektroforesis.
2. Mengetahui cara mengukur fragmen DNA.
3. Mengetahui dan memahami prosedur kerja dengan baik dan benar.

DASAR TEORI

Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu
makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran.
Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan
biokimia dan biologi molekuler (Magdeldin, 2012).

Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan secara rutin
digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada berbagai cairan
biologis (serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik yang menggunakan prinsip
elektroforesis zona. Seperti yang diketahui, molekul protein bermigrasi pada medium
padat/gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga di bawah pengaruh medan listrik.
Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik isoelektrik bersih dan massa molekul protein
(Jean and Francois G., 2010)

Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik
ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi
menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya
(Magdeldin, 2012). Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju
kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan
bergerak menuju kutub negatif (katoda) (Klug and Cummings, 1994).

Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan
muatan dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan
untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan
komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu (Fairbanks & Andersen, 1999).

Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju perpindahannya melewati
suatu gel di bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran
molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan
panjang yang sama (Campbell dkk, 2002).

Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda
oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran
besar.
3. Gel agarose formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem
elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar
(Davis dkk. 1994).

Biasanya, gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih besar (lebih
dari 200 bp) dan gel poliakrilamida digunakan untuk fragmen kecil (kurang dari 200 bp).
Jarak antara dua fragmen DNA yang berbeda ukuran dapat ditentukan berdasarkan

mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu. DNA memiliki muatan yang konsisten untuk rasio massa. mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu. 1994. 2. mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam. Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarose. di sisi lain. fragmen yang lebih besar dapat bermigrasi secara lebih cepat daripada fragmen yang lebih kecil. molekul yang lebih kecil bergerak lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil karena memiliki gesekan yang lebih rendah saat bergerak menuju elektroda positif. Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR. mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas. Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis (Birren and Lai. RNA. Tray: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarose. dan menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan plasmid DNA (Russell. kekuatan arus yang digunakan. 3. tetapi juga dapat menurunkan resolusi pemisahan (di atas sekitar 5 sampai 8 V/cm). Fairbanks and Andersen. Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida yang bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Terlepas dari kenyataan bahwa penerapan tegangan tinggi dapat meningkatkan kecepatan migrasi fragmen DNA. antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda. DNA finger printing. Mobilitas/pergerakan DNA relatif tergantung pada faktor-faktor tertentu. kekuatan ionik dari larutan buffer. karena tegangan pada gel yang ditingkatkan. resolusi terbaik dari fragmen yang lebih besar dari 2 kb dicapai dengan menerapkan tidak lebih dari 5 V/cm pada gel (Lee & Bahaman. Molekul DNA bermigrasi melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam padatan gel agarosa. Namun. dan konformasi fragmen DNA itu sendiri. terutama pada konsentrasi agarosa dalam gel. 1993). Selain itu. Untuk alasan itu. Konsentrasi gel yang lebih tinggi. Secara umum. lalu dapat disequencing. 2010). Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari: 1. sehingga ukuran molekul DNA merupakan faktor utama yang mempengaruhi migrasi melalui matriks gel. 1999). . mempelajari evolusi di tingkat molekular. 4. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan. dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA.konsentrasi matriks agarose. memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran. mengetahui susunan sekuens berbagai genom. 1993). dengan memberikan pemisahan yang lebih besar antara band yang secara ukuran tidak terlalu jauh berbeda. menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA. mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu. sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel (Birren and Lai. Konsentrasi yang rendah pada gel agarosa memberikan resolusi yang lebih baik untuk fragmen besar. menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR. Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarose. 2010). protein dan aktivitas enzimatik. dapat mengurangi kecepatan migrasi fragmen panjang yang sementara itu dapat memfasilitasi pemisahan yang lebih baik pada fragmen DNA kecil (Lee & Bahaman.

0. Sisir dan mangko yang terdapat kutub (+) dan(-) 4. Pipet ukur BAHAN 1. Setelah gel tersebut mengeras. Satu set alat elektroforesis {Sisir dan mangko yang terdapat kutub (+) dan(-)} 2. 2. Erlenmeyer 9. Mikropipet dan tip 3. Gel Comb dipasang pada tangki elektroforesis. Setelah semua terlarut kemudian didiamkan pada suhu ±50°C. Produk DNA 3. gel comb dapat diambil dan gel agarose siap untuk digunakan. Gel Doc 5. Ethidium Bromide (EtBr) 4. Timbangan analitik 11. Larutan agarose dituangkan pada tangki elektroforesis dan didinginkan hingga mengeras. dd H2O 5. Batang pengaduk 12. Waterbath 8. Gel Agarose 6.4 gram bubuk agarose dilarutkan pada 50 ml Buffer TAE. Disamping itu. 4. Campuran tersebut dilarutkan dengan cara dipanaskan. Penggunaan elektroforesis gel ini dirasakan kurang efisien karena lama pengerjaannya dan terbatasnya jumlah sampel yang dapat diperiksa. 5. kadang kadang hasil PCR dalam gel muncul pita yang tidak berbentuk (ghost atau smeary bands) atau pita yang terlampau banyak sehingga hasilnya sulit diinterpretasikan (Tarigan. Berackerglass 10. Buffer Tri-Asetat-EDTA (TAE) 8. 3. 2011).Namun disamping itu. Loading Buffer (Loading dye) 7. 6. Akuades CARA KERJA  Pembuatan Gel Agarose 1. ALAT DAN BAHAN ALAT 1. DNA Marker 2. Power Supply 6. elektroforesis gel juga memiliki kekurangan yaitu pada deteksi atau identifikasi amplikon. Lakban 7. .

Tangki elektroforesis kemudian ditutup dan dihubungkan ke power supply. 3. 6. tetapi sudah terlihat dorongan dari listrik bermuatan negatif dan ditarik dengan listrik yang bermuatan positif. Sehingga DNA sudah terlihat bergerak kearah listrik bermuatan positif (+). Power Supply ( 400mA.  Elektroforesis 1. dan warna menjadi violet atau ungu. 4. Gel Agarose direndam dengan Buffer TAE. pada listrik yang bermuatan (+) positif terputus besi/kawat yang bermuatan positif tersebut. 5. PEMBAHASAN Tujuan dari praktikum kali ini adalah agar mahasiswa dapat memahami secara baik dan mampu untuk melakukan salah satu teknik/metode pemisahan senyawa (DNA dan Protein). Jadi tidak didapatkan hasil. 90V) dinyalakan selama 30 menit. yaitu metode elektroforesis. Selain itu diharapkan mahasiswa juga dapat mengetahui bagaimana cara mengukur fragmen DNA pada praktikum ini. . 2. 5µl loading dye dicampur dengan 2µl produk DNA pada lakban yang telah tersedia dengan bantuan mikropipet. Sedangkan untuk 3µl DNA marker 1kb dituangkan pada sumur/well yang berada pada paling tepi atas dan bawah. DOKUMENTASI Pada foto terjadi perpindahan pada gel algarose ditandai dengan warna biru yang berpindah dari well/lubang keluar menuju listrik bermuatan positif. Campuran tersebut dituangkan ke sumur/well pada gel agarose. HASIL DAN PEMBAHASAN HASIL: Tidak didapatkan hasil karena keterbatasan alat dan pada saat melakukan proses pemisahan DNA dan protein dengan menggunakan medan listrik.

Berdasarkan jenisnya ada dua macam elektroforesis yaitu: 1. agarose atau poliakrilamid (Biosciences. kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya (positif).8% karena dilakukan oleh asisten praktikum. Selain kelebihan. Secara umum. elektroforesis horizontal maupun vertikal (Lisdiyanti. Dalam praktikum ini jenis elektroforesis yang digunakan adalah elektroforesis zona dan menggunakan teknik elektroforesis horizontal karena menggunakan gel agarose yang diletakkan pada alat elektroforesis secara horizontal dan teknik ini difungsikan untuk analisais DNA. Kelebihan metode ini adalah mudahnya mengamati reaksi kimia selama proses berlangsung. Praktikan tidak melakukan pembuatan gel agarose 0. 1997). Bubuk agarose yang digunakan sebanyak 0. dan beberapa kelebihan lainnya. 2012).Secara singkat. 2. mempergunakan media penunjang.8% dilakukan dengan cara mencampurkan bubuk agarosa dengan larutan buffer TAE. 2005). 1999). sampel dapat ditangani dengan baik dan cepat. maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif (Elektroforesis) melalui membran matriks gel agarose tersebut (Yuwono.4 gr dan larutan buffer TAE sebanyak 50 mL lalu dipanaskan sampai mendidih. sehingga dapat dipakai untuk dokumentasi penting yang dapat dipelajari lebih lanjut di lain waktu. setelah itu masukan kemangko yang berisi sisir fungsi sisir agar memberi lubang pada gel algarose untuk digunakan sebagai well. elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan ukurannya. selanjutnya dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan dengan comb-nya dan tunggu sampai mengeras. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul. Elektroforesis bebas (free electrophoresis): molekul atau partikel yang akan dipisahkan tersebar di seluruh larutan. gel dari hasil percobaan dapat disimpan dalam kantong plastik dan didinginkan setelah percobaan. metode ini juga memiliki kekurangan. Elektroforesis zona: merupakan jenis elektroforesis yang paling banyak digunakan. yang kemudian dipanaskan di dalam microwave. yaitu rawan terjadi kesalahan pada proses pemindahan campuran sampel ke dalam slot gel. . 1984). dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang dipisahkan. proses pembuatan gel agarose 0. misalnya gel agarose. selulosa asetat. Praktikum elektroforesis gel ini dimulai dengan pembuatan gel agarose 0. Tahap selanjutnya adalah mencampurkan DNA dengan loading buffer yang memiliki fungsi membantu sampel turun ke dalam well dan membantu memonitor berapa lama proses elektroforesis telah berlangsung karena memiliki pewarna bromofenol biru (Magdeldin. Terdapat dua macam teknik elektroforesis yang telah berkembang yaitu. Pemberian arus listrik pada larutan yang mengandung partikel tersebut akan menyebabkan terbentuknya batas di antara dua larutan. 2005). karena slot gel ukurannya sangat kecil (Boffey. seperti kertas. Prinsip kerjanya adalah jika molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui suatu medium.8%. misalnya DNA yang bermuatan negatif (Yuwono.

Larutan ini berfungsi untuk meningkatkan daya fluoresensi DNA saat disinari sinar UV dalam Gel Doc. 1993. Lampu UV berfungsi menerangi bagian dalam dalam dari gel doc. Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA. 2. Gel doc adalah alat yang digunakan untuk mengamati dan mendokumentasikan hasil elektroforesis. . 2012).130 pb (Birren and Lai. yaitu: 1. kamera berfungsi memotret hasil elektroforesis dan komputer berfungsi menjalankan proses dokumentasi lewat bantuan software (Davis dkk. semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA. Pada tahap dokumentasi hal yang pertama dilakukan adalah merendam gel agarose hasil elektroforesis pada larutan EtBr kurang lebih selama 15 menit. Marker berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi. Konsentrasi gel Semakin tinggi konsentrasi agarosa. Marker DNA yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi. 1994). Marker-marker DNA tersebut merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya jelas. Ukuran Molekul DNA Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar. Setelah itu dilakukan pembilasan dengan menggunakan Aquades selama kurang lebih 15 menit juga. Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Proses pemindahan dilakukan dengan memakai mikropipet dan harus dilakukan secara hati-hati agar campuran DNA dengan loading buffer tidak “meluber” ke bagian well yang lain. 1996). Martin. kamera dan komputer. Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan diberikan arus listrik untuk tahap running. 1994). 1996). DNA memiliki muatan negatif (DNA mengandung gugus PO4) sehingga diharapkan akan bergerak menuju kutub positif (Martin. Fragmen DNA yang besar akan bergerak lebih cepat dibandingkan dengan fragmen DNA yang kecil (Magdeldin. Gel agarose nantinya akan dikeluarkan dari ruang elektroforesis setelah mengalami perubahan warna. Salah satu contoh marker DNA adalah lambda HindIII. Kecepatan migrasi DNA sangat dipengaruhi oleh tegangan listrik dan arus listrik yang di berikan oleh power supply ke tangki elektroforesis. Dokumentasi dilakukan dengan gel doc (Davis dkk. Sedangkan untuk marker 1kb dituang pada dua sisi ujung (atas dan bawah) well yang ada. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil. Marker tersebut memiliki delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23. Komponen gel doc terdiri dari lampu UV.Selanjutnya dilakukan penuangan campuran loading buffer dengan produk DNA sebanyak 2µl dan juga loading dye 5µl pada sumur/well yang telah dibentuk pada gel. Setelah tahap-tahap tersebut barulah divisualisasi dengan menggunakan Gel Doc. konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar. Running elektroforesis dilakukan pada tegangan 90 Volt dan dengan arus sebesar 400 mA selama 30 menit.

Selain itu ada faktor lain yang dapat muncul sebagai yang mempengaruhi laju migrasi fragmen itu sendiri. . Elektroforesis memiliki prinsip kerja bahwa suatu molekul (DNA) yang bermuatan negatif jika dialiri listrik akan bergerak menuju kutub positif milik elektroforesis melalui matriks membran gel agarose. 3. Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah. Kenapa bisa begitu. Faktor yang mempengaruhi laju migrasi dari fragmen DNA pada elektroforesis gel adalah ukuran molekul DNA. 3. Hal yang semacam ini kemungkinan disebabkan oleh terlalu lamanya penyimpanan untai DNA setelah di isolasi pada praktikum yang sebelumnya. setelah sebelumnya dilakukan tahap elektroforesis. Setelah itu panjang fragmen DNA dapat diukur menggunakan kurva regresi linier. Larutan buffer elektroforesis Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA (Wolfe. Teknik pemisahan senyawa dengan elektroforesis gel agarose termasuk dalam jenis elektroforesis zona dengan menggunakan teknik elektroforesis horizontal. pori-pori gel. bentuk molekul. Voltase Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan. dan larutan buffer elektroforesis. dimungkinkan karena dalam proses penyimpanan sebelumnya yang kurang baik. Densitas muatan Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Jadi ada kemungkinan faktor yang lain yang dapat mempengaruhi keberhasilan pada proses ini. KESIMPULAN 1. jika dilihat dari faktor-faktor yang mempengaruhi proses elektroforesis dengan kondisi-kondisi yang sudah dicek secara baik dirasa tidak mungkin untuk tidak bermigrasi sama sekali untai DNA tersebut. yaitu dari suhu penyimpanan. Pori-pori gel Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan. 4. Tetapi. 4. 2. Pada hasil praktikum ini terlihat bahwa pita fragmen DNA yang tersinari UV tidak menunjukkan adanya pergerakan atau migrasi sama sekali. yaitu ukuran fragmen DNA dan faktor ketelitian serta kehati-hatian dalam proses penyimpanan produk DNA jika produk tersebut sebelumnya disimpan. 7. densitas muatan. 5. yang terlihat hanyalah migrasi dari marker DNA pada sisi tepi gel agarose. 1993). Jika pita fragmen DNA dapat terlihat maka dapat dihitung panjang fragmen dari suatu produk DNA. semakin lambat pergerakan molekul DNA. atau terdapat sedikit kesalahan dalam penyimpanan. semakin cepat pergerakan molekul DNA. yaitu untai DNA itu sendiri. 6. Bentuk molekul Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat. Pita fragmen DNA dapat diukur dengan menggunakan suatu kurva regresi linier. konsentrasi. voltase. Panjang fragmen DNA dapat terlihat dengan menggunakan gel doc yang pada saat didalamnya disinari dengan menggunakan sinar UV.