GUÍA PRÁCTICA 2016

TECNOLOGÍA MÉDICA

BIOLOGIA CELULAR Y
MOLECULAR
BIO-1113

Profesor responsable

Prof. Carolina Salazar R. Ph D (c).

INSTITUTO DE BIOLOGÍA
PUCV 2016

NORMAS DE SEGURIDAD DE LABORATORIO

1. Observe atentamente las etiquetas de los frascos de reactivos antes de usarlos. Si es necesario léalos dos veces para
asegurarse de que se usa el frasco adecuado. Después de usarlos, déjelos en su lugar correspondiente. Use sólo los frascos
de su mesón.
2. Los experimentos no autorizados están estrictamente prohibidos.
3. Con respecto a los reactivos químicos recuerde que:
a) No debe probar nunca ningún compuesto químico, ni solución.
b) No debe tocar nunca sustancias químicas con las manos, a no ser que se le autorice.
c) Si desea conocer el olor de una sustancia no acerque directamente la cara al recipiente. Abanicar un poco de
vapor hacia la nariz, moviendo la mano sobre la superficie del mismo.
d) Si se vierte sobre sí un ácido u otro compuesto químico, lávese inmediatamente con agua.
4. Está prohibido comer, beber o fumar en el laboratorio. No lleve sus manos o lápiz a la boca.
5. Prepárese siempre para cualquier experimento leyendo las instrucciones de la guía antes de ir al laboratorio. Siga las
instrucciones teniendo presente todas las precauciones.
6. Jamás devuelva soluciones o reactivos al frasco de origen.
7. No introduzca ningún objeto en un frasco de reactivo, excepto la pipeta (con su respectiva punta) o cuenta gotas
cuando sea oportuno.
8. Deje pasar bastante tiempo para que se enfríe el vidrio caliente, recuerde que éste tiene el mismo aspecto que el vidrio
frío.
9. Nunca apunte la boca de un tubo de ensayo hacia Ud. o un compañero cuando éste calentando.
10. No vierta un líquido cerca de un mechero encendido.
11. En caso de temblores, aléjese sin correr, pues la rotura de reactivos y sus mezclas pueden liberar sustancias tóxicas,
letales, inflamables y explosivas.
12. En caso de alarma por incendio, mantenga siempre la calma, abandone el laboratorio sin correr por la salida más
cercana.
13. Vístase adecuadamente para el laboratorio. Use ropa cómoda pero que le cubra las piernas y el torso, los zapatos
deben cubrir los pies completamente. Use siempre delantal blanco, guantes y cabello tomado (cuando corresponda).


CUIDADO DEL MICROSCOPIO

El microscopio es un instrumento costoso, por lo tanto, debe dársele el mejor trato posible. Siga siempre estas
instrucciones generales cada vez que lo vaya a utilizar:

1) Debe transportarlo con ambas manos: una por debajo de la base y la otra en el brazo o columna.
2) Debe colocarlo alejado del borde de la mesa, con el brazo hacia Ud. Si el microscopio posee lámpara, en lugar de
espejo, debe conectarlo a la red de energía eléctrica, evitando jalar o mover, innecesariamente, el cable que lo une al
enchufe.
3) Es conveniente, al trabajar con él, quitar previamente de la mesa trabajo, aquellas cosas que no sean absolutamente
necesarias.
4) Evite los movimientos bruscos, y sobre todo, cambiarlo de posición una vez que haya comenzado a utilizarlo. Del
mismo modo, debe apagar la lámpara al dejar de ocuparlo.
5) Nunca limpie las lentes del microscopio con otra cosa que no sea papel para lentes o en su defecto, con el tipo de
paño que se indique. Las lentes del microscopio cuestan tanto como las demás partes juntas.
6) Cuando termine su trabajo, guarde el microscopio, no sin antes colocar el objetivo de menor aumento en la posición
de enfoque y bajar la platina.









INSTRUCCIONES GENERALES

1. La asistencia es obligatoria.
2. No se admitirán alumnos atrasados.
2. Los alumnos deben presentarse al trabajo práctico con delantal blanco, práctico a realizar impreso y cuaderno de
apuntes, guantes y cabello tomado (cuando corresponda).
3. Celulares apagados.
4. El alumno será responsable del material que se le entregue. Es obligación dejar el material, mesón y frascos de reactivos
en perfecto orden y limpieza. Nadie podrá retirarse del laboratorio sin haber cumplido esta norma.
5. Debe mantenerse la disciplina para evitar accidentes y aprovechar al máximo el tiempo y equipo disponible.
Comportamiento adecuado y respetuoso con docentes, ayudantes y compañeros.
6. El conocimiento de la teoría correspondiente a cada trabajo práctico es imprescindible. Deberá estudiar sus guías con
anterioridad a la clase y llegar preparado para cada sesión de laboratorio.
8. En caso de dudas consulte siempre al PROFESOR O AYUDANTE.

¡RECUERDE QUE EL LABORATORIO ES UN LUGAR DE TRABAJO!

EVALUACIONES

QUIZ (al comienzo de cada clase): 20%
PRUEBA I: 40%
PRUEBA II: 30%
Tareas y presentaciones: 10%

No se eliminan notas de Quiz. Si ha faltado a un laboratorio, se promediaran las notas restantes siempre y cuando esté
debidamente justificado. Si ha faltado a más de un laboratorio debe tener siempre su inasistencia justificada, de lo
contrario se evalúa con nota mínima (1.0).

Asistencia obligatoria: 80% sin necesidad de justificar el 20%. Esto no se aplica a las 2 Evaluaciones de Contenido, las
cuales deberán ser debidamente justificadas en caso de ausencia.

*Solo se permitirá un atraso de máximo 5 minutos, después de este tiempo quedara fuera del práctico.
*La persona que no realice a un Quiz tendrá nota mínima (1.0).

Evaluación Recuperativa: En caso de inasistencia a alguna evaluación se programa una prueba recuperativa. La prueba
recuperativa al final del semestre es SOLO PARA LOS ALUMNOS DEBIDAMENTE JUSTIFICADOS Y ABARCA TODOS LOS
CONTENIDOS VISTOS EN EL SEMESTRE.

Ponderación final de Laboratorio: 20%.

HORARIO CLASES:

Prof. Carolina Salazar R. Ph D (c)

Martes: Grupo Nº1B y 3B Claves (1-4), Comienzo 08:30 PM. Sala CU BIO 103.

Jueves: Grupo Nº1A y 3A Claves (7-10), Comienzo 14:00 PM. Sala CU BIO 104.

Viernes: Grupo Nº2A y 2B Claves (1-4), Comienzo 08:30 AM. Sala CU BIO 104.














CRONOGRAMA LABORATORIO BIOLOGIA CELULAR BIO-328 1ºSEMESTRE 2016 SESIÓN TEMAS FECHA GRUPOS 21/03/17 1B 23/03/17 1A Extracción de DNA y 24/03/17 2A LAB1 Electroforesis en Geles de Agarosa. 28/03/17 3B 30/03/17 3A 31/03/17 2B 04/04/17 1B 06/04/17 1A 07/04/17 2A LAB2 Extracción y Cuantificación de Proteínas 25/04/17 3B 27/04/17 3A 28/04/17 2B SUSPENCIÓN PRÁCTICOS SEMANA SANTA 10 al 14 de abril SEMANA NOVATA 17 al 21 de abril 02/05/17 1B 04/05/17 1A 05/05/17 2A LAB3 Electroforesis SDS-PAGE 09/05/17 3B 11/05/17 3A 12/05/17 2B 16/05/17 1B y 3B PRUEBA I 18/05/17 1A y 3A 19/05/17 2A y 2B 23/05/17 1B 25/05/17 1A 26/05/17 2A LAB4 Microscopía. . Forma y Tamaño celular 30/05/17 3B 01/06/17 3A 02/06/17 2B 06/06/17 1B 08/06/17 1A 09/06/17 2A LAB5 Inmunofluorescencia 13/06/17 3B 15/06/17 3A 16/06/17 2B 20/06/17 1B y 3B PRUEBA II 22/06/17 1A Y 3A 23/06/17 2A y 2B Revisiones y Correcciones 29 y 30 Junio TODOS *EL CRONOGRAMA PUEDE ESTAR SUJETO A CAMBIOS.

.

A continuación debe romperse también la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por último hay que proteger el ADN de enzimas que puedan degradarlo y para aislarlo hay que hacer que precipite con alcohol.Agua destilada .Palillos . 1. • Conocer los fundamentos de la separación de Ácidos nucleicos mediante la técnica de electroforesis en geles de agarosa. El ácido desoxirribonucleico (ADN) es un polímero de diferentes ácidos nucleicos que forma parte de todas las células. pasar el plátano a un vaso precipitado a través de un colador y/o una gaza. de acuerdo al tipo de muestra. INTRODUCCIÓN Los ácidos nucleicos son moléculas constituidas por C. 6. Una vez molido. se componen de un pequeño grupo de unidades monoméricas denominadas nucleótidos. . Posteriormente.Gotario . pero cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el agua. contiene la información genética usada en el desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos conocidos y de algunos virus. N y P. unidos mediante enlaces covalentes fosfodiester. Inclinar el tubo de ensayo en 45° y agregar etanol 90% previamente enfriado cuidadosamente. y es responsable de su transmisión hereditaria. Cuidado de no formar burbujas. además de permitirnos ver el ADN. • Observar la estructura de ADN visible desde una muestra de plátano.Mortero . H. los cuales son dejados en la solución acuosa. 8. agregar 4 gotas de detergente y revolver suavemente para homogenizar el detergente con el plátano. 3. el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares. No agregar más de la mitad de la muestra de plátano. • Aprender la preparación de los geles de agarosa. la cual determinará el Genotipo de todo individuo.Etanol 90% (frio) .Gradillas . ACTIVIDAD PRÁCTICA I MATERIALES.Tubos Falcon 15ml y 50ml . Cortar el plátano por la mitad y molerlo con el mortero agregando 50ml de agua destilada. O. Todas las células portan información genética. junto con el equipamiento requerido para la corrida electroforética.Pinzas metálicas . Traspasar la mezcla de plátano hacia un tubo de 15ml (no completar más de la mitad del tubo). El ADN es soluble en agua. 1. Ya homogenizado con el detergente. Es por eso que en este práctico realizaremos la extracción simple de ADN desde una muestra de plátano. En primer lugar tienen que romperse la pared celular y la membrana plasmática para acceder al núcleo de la célula.Vasos precipitados . Añadir a la mezcla cloruro de sodio 0. dejarlo reposar 5 minutos. 2. así como la preparación de muestras y la interpretación de resultados. La extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas. que se relacionan con la conservación del material genético de los organismos. 3. 7. 2.9% .Gaza y colador .9%. Conocer la estructura y función la macromolécula de ADN ha permitido grandes avances científicos en los últimos años. Agregar una cucharada de jugo de piña a la mezcla de plátano en el tubo de ensayo.Detergente (lavaloza) .Plátano .Espátula .Jugo de Piña . es el componente químico primario de los cromosomas y el material del que los genes están formados.Cloruro de Sodio 0. . 4. 5. GUÍA LABORATORIO Nº1: EXTRACCIÓN DE ADN y ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA OBJETIVOS • Conocer el protocolo de extracción de ADN.Hielo METODOLOGÍA. • Determinar con criterios bioquímicos las condiciones electroforéticas.

entre otros factores. El gel forma una matriz cuya densidad está determinada por la concentración de agarosa. Los más comunes son: bromuro de etidio. dependiendo. La agarosa es más comúnmente utilizada puesto que no es tóxica. los grupos fosfato confieren carga neta negativa a estas moléculas. 9. los métodos electroforéticos son de alta sensibilidad. Esperar a que aparezca la medusa de ADN y rescatarla con un palillo. las moléculas de mayor tamaño serán retardadas respecto a las de menor tamaño. en el que se separan biomoléculas. dependiendo en combinación de su carga. Dado que la carga del ADN está dada por los grupos fosfato y que por cada par de bases hay dos grupos fosfato. (a) Tamaño del ADN: Las moléculas de ADN lineal de doble hebra migran a través del gel a velocidades que son inversamente proporcionales al log del número de pares de bases. La electroforesis. En la electroforesis en geles de agarosa. y recientemente SYBER SAFE. el ADN migra hacia el ánodo.- Ilustración de las fuerzas que se ejercen sobre una partícula cargadas que determina su movilidad en la electroforesis. Syber Green. . la relación carga/masa es la misma para moléculas de ADN de diferente tamaño. Pero. Gel Red. y sirven como método de separación de mezclas complejas de ácidos nucleicos. Figura 1. peso molecular y estructura tridimensional. La solución fundida es puesta en un molde donde gelifica. Los geles de agarosa se preparan fundiendo agarosa en presencia del buffer adecuado hasta que se logre una solución transparente. esto se efectúa mediante la separación por electroforesis en geles de agarosa o de poliacrilamida. debido a la fricción que impone la malla del gel de agarosa. A escala analítica. Electroforesis de Ácido nucleicos: Una vez que se ha realizado la extracción de ADN es necesario revisar la integridad y la cantidad del mismo. de su carga bajo la acción de un campo eléctrico. las moléculas de ADN lineales migran según su tamaño y se pueden visualizar mediante tinción. algunos de los cuales son detallados a continuación. poder de resolución y versatilidad. La velocidad de migración está determinada por varios parámetros. (b) Concentración de la agarosa: Un fragmento de ADN lineal migra a diferentes velocidades dentro de geles con diferentes concentraciones de agarosa. nitrato de plata. Los geles son teñidos con diferentes colorantes para visualizar el ADN. Cuando se aplica un campo eléctrico a través del gel. estas partículas migran hacia el cátodo o ánodo (electrodos + y -). proteínas y otras biomoléculas. La tabla siguiente muestra concentraciones de agarosa usadas para resolver fragmentos de ADN en los intervalos indicados. etc. A los valores de pH en los cuales usualmente se trabaja con ácidos nucleicos. es la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico. Syber Gold. ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA La electroforesis es un método analítico–semipreparativo.

(e) Otros factores Otros factores que influyen son: la dirección del campo eléctrico. EDTA 0. Syber green.Buffer de corrida TBE 1X . 5ª Edición. 10.0) 20 Ml. Aires. (c) Conformación del ADN El ADN circular cerrado de doble hebra superenrollado (forma I). § De Robertis E.5% w/v . 2011. Ediciones Omega S. la velocidad de migración de los fragmentos lineales es proporcional al voltaje aplicado. 2000.Solución para teñir ADN .5 M (pH 8. si es mayor hacer los cálculos conservando la proporción de la concentración del gel). (d) Corriente aplicada A bajo voltaje. el circular relajado con un corte en una de las hebras (forma II) y la forma lineal (forma III) que tengan idéntico peso molecular y misma secuencia van a migrar a distinta velocidad en los geles de agarosa. Colocar 20 mL de TBE en un vaso de precipitado de 100 mL (para un volumen de gel de 20 mL. El Ateneo. Mezclar. Ácido Bórico 27. Verter la solución en una canastilla para electroforesis. 3.).- Preparación de los geles de agarosa 1. Ciudad de México. Sin embargo a medida que la fuerza del campo eléctrico aumenta. Ed.- Muestras de ADN . Colocar la canastilla adentro de la cámara de electroforesis. ACTIVIDAD PRÁCTICA II MATERIALES . & Ponzio R. 2010. . 11. P200 y P10 .Juego de micropipetas P1000. Visualizar el gel en el transiluminador. & Lewis J. METODOLOGÍA 1.Solución de Agarosa 0. 9.Tubos Eppendorf de 1. 4. Colocar el formador de pozos (peine) en la canastilla. . Calentar hasta fundir completamente.Puntas (10. pero también están influidas por otros factores como la corriente eléctrica aplicada.5µL de reactivo para teñir ADN (GelRed.- Marcador de Peso Molecular (100pb) .- Fuente de poder. México. 5. Agregar buffer de corrida (TBE 1X). Bs.. Las movilidades relativas de las tres formas dependen primariamente de la concentración de agarosa. la movilidad de los fragmentos de ADN de alto peso molecular se incrementa menos.- Transiluminador . 12. 6. Biología Molecular de la Célula. 2. Colocar las muestras dentro de los pozos. la fuerza iónica del buffer y de la cantidad del colorante presente (fundamentalmente en el caso de la forma I). G. 4ª Edición.5 mL. Biochemistry. 8. Saunders College Publishing. Bray D. Rojo Texas. 13. Soluciones: TBE: Prepare una solución madre 5x en 1 litro de H2O. Adicionar 0. 200 y 1000 µL) . McGraw-Hill. BIBLIOGRAFÍA § Alberts B. Hib J. Tris base 54 g.- Agua desionizada . A. 14. Biología Celular y Molecular. Barcelona. 7.5 g. Por lo tanto el intervalo efectivo de separación en los geles de agarosa disminuye a medida que el voltaje es incrementado. la temperatura y la composición del buffer de electroforesis. la composición de bases de los fragmentos a analizar.. Biología Celular y Molecular: conceptos y experimentos. § Karp. Agregar 150 mg de agarosa. Llevar a cabo la electroforesis a 100 V x 30 min. § Campell MK. 1995. Second edition. Preparar las muestras a analizar (con buffer de carga. . Dejar gelificar (cubrir el gel con papel aluminio). no más de 10 µL en total).- Cámara electroforética. etc.

transporte. Estos métodos producen la rotura de las membranas celulares. Extracción de Proteínas Animales. INTRODUCCIÓN Las proteínas son macromoléculas de máxima importancia morfo-fisiológica. Dependiendo del tipo de tejido (animal o vegetal. enzimática. reactividad y grupos funcionales propios y únicos) les confiere a las proteínas una gama amplia de funciones (estructural. La posterior centrifugación permite eliminar restos celulares. pueden adoptar espontáneamente estructura secundaria (α-hélice y hoja-β) luego. Este proceso se llama homogenización. causando su hinchamiento y rotura. Las proteínas en la célula pueden localizarse en un organelo. originalmente sintetizadas como una cadena lineal de aminoácidos. suavemente. defensa. La rotura se produce al someter las células a un cambio brusco de temperatura. por ende si el DNA es la macromolécula que guarda la información de la estructura y funcionamiento del organismo. Esto se consigue homogenizando el tejido empleando procedimientos mecánicos suaves. laxo o fibroso) se utilizan técnicas distintas para homogenizar y se asisten agregando un tampón de lisis. Las proteínas vienen codificadas en genes dentro del DNA. dentro de los que se encuentran: shock osmótico. Lisis celular. mortero (fricción) y sonicación. metabólica. Según las características de las proteínas es posibles solubilizarlas. GUÍA DE LABORATORIO Nº2: EXTRACCION Y CUANTIFICACION DE PROTEINAS OBJETIVOS • Comprender las técnicas para la extracción de proteínas desde distintos tejidos y fluidos. Entre estos métodos se encuentran la homogenización (hacer pasar las células entre un tubo y un pistón de vidrio que ajustan casi totalmente). y romperlas. inhibidores de proteasas (enzimas que degradan proteínas) y algún detergente para ayudar a disgregar las membranas celulares. Tanto la composición aminoacídica como su disposición en el espacio. Las distintas combinaciones de 20 aminoácidos (cada uno con propiedades ácido-base. Las proteínas. separarlas y purificarlas mediante diversos métodos. Éste es una solución que tampona a pH fisiológico. Para obtener las proteínas desde un tejido es necesario disgregarlo en células individuales. . conformadas por hetero-polímeros de aminoácidos. pero no es suficiente para células vegetales o bacterias. moler en un mortero y la sonicación (someter las células a vibraciones de ultrasonido) Congelación-descongelación. el complejo multiproteico o la estructura subcelular se encuentre en condiciones que permitan su aislamiento. El primer paso en la purificación de la mayoría de las proteínas y estructuras subcelulares es la rotura de los tejidos o de las células para obtener un “lisado” celular en el que la proteína. Conforman. Válido para células sin pared celular como las células de tejidos animales. Consiste en suspender las células en una solución hipotónica (más diluida que el interior celular). Debido a la diferencia osmótica el agua difunde al interior de la célula. contiene sales en concentración adecuada. las proteínas son sus productos efectores. • Comprender los distintos métodos que existen para cuantificar las proteínas. dado por la estructura tridimensional. congelando primero a -196 ºC (con nitrógeno líquido) y pasándolas rápidamente a temperatura ambiente (25°C). El rol del buffer de lisis es entonces recuperar proteínas cuidando de que mantengan su integridad estructural y funcional. en resumidas cuentas “la mano de obra” de todo lo que realiza el organismo. son claves en la función que cumplen. señalización). Destrucción mecánica. en el citoplasma. por plegamiento adoptan estructuras terciarias y cuaternarias. en la membrana o asociada a otras moléculas. con lo que se libera el contenido celular.

durante el proceso de rotura. Agitar muestra en Vortex a máxima potencia durante 2 minutos. NaCl 0. A la hora de centrifugar hay que tener en cuenta que la centrífuga sea refrigerada. 3. Rotule el tubo y déjelo en la cubeta de hielo.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC.Tras la rotura o bien. 6. mientras genera saliva “raspe” con fuerza. la fase soluble (con o sin detergente) constituye el extracto crudo donde se encuentra la proteína de interés objeto de la purificación. 4. Almacenar en Hielo. Para evitar o minimizar estos factores la manipulación de las proteínas durante el proceso de purificación suele llevarse a cabo en disoluciones tamponadas. Nota: Si no produce mucha saliva. soluciones acuosas de tampones específicos para proteínas solubles o bien que contengan además detergentes si se pretende purificar proteínas asociadas a membranas. 2. Agitar el tubo previamente puesto en hielo durante 20 segundos. 7. para el diagnóstico de enfermedades.5ml y falcon 15ml) . Obtención de muestra biológica 1. tomar un poco de agua. enjuagar vigorosamente durante 30 segundos y botar con cuidado el agua en el tubo de 15mL.Cotones .Piscetas con agua destilada . se utilizan tampones de extracción para solubilizar las proteínas. ACTIVIDAD PRÁCTICA I MATERIALES . que contiene las proteínas solubles. con esto se desprenderán células de este tejido (mucosa bucal). El resultado de todos estos tratamientos es un lisado u homogenizado que contiene una mezcla de enzimas. Esta preparación se somete a centrifugación (10. 2.Puntas 10/200/1000 ul . Agregar 1mL de Buffer de Lisis (Tris 0. temperaturas extremas y la acción de las proteasas (enzimas que hidrolizan los enlaces peptídicos) son los principales factores que pueden desnaturalizar las proteínas. cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática. así como para otros muchos propósitos.1M. a bajas temperaturas (4°C) y se procura que el proceso sea lo más corto posible. las paredes bucales.Juego micropipetas . si se requiere. En cualquier caso.Timer . CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS.000-15. II. .Buffer de lisis . membranas y células rotas.02%).Hielo . Una vez que la proteína se ha extraído de su entorno natural está expuesta a muchos agentes que pueden dañarla. balancear los tubos y asegurarse siempre que los rotores estén fijos. además en ocasiones es necesario añadir el tampón de extracción agentes protectores de grupos funcionales específicos de la proteína o bien inhibidores de proteasas.Guantes .Vasos plásticos (enjuague) . En el tubo de 15ml depositar aproximadamente 5mL de Saliva. tomar 750μL de saliva y depositarlos en el tubo de microcentrífuga de 2mL. Rescatar sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga teniendo sumo cuidado en no tomar nada del precipitado (debris celular). Extracción de proteínas 1.Gradillas (para tubos eppendorf 1.Parafilm . Los cambios bruscos de pH. Pueden utilizarse como tales.02M.Mortero . Con la ayuda de una micropipeta.Microcentrifuga METODOLOGÍA I. Tritón X-100 0. Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta.5ml .Papel absorbente .Tubos falcon 15ml . Métodos para la cuantificación de proteínas: ventajas e inconvenientes. del precipitado que además de restos celulares también contienen proteínas asociadas a membranas y que para solubilizarlas requiere un tratamiento adicional con detergentes.Vortex .Tubos eppendorf 1. ácidos y bases fuertes. el sobrenadante. 5.000 rpm) para eliminar los restos celulares y separar. Centrifugar a 13. usando su lengua.Lápiz marcador .

La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica. Método de Biuret 2+ Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. Entre las sustancias que interfieren están los detergentes y las soluciones básicas. El colorante. Este método es sensible (1-15 μg). Comassie Blue G-250 (también Serva Blue) a las proteínas. existe en dos formas una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. Muchos de estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV. barato y pocas sustancias interfieren en su determinación. de manera que pocas sustancias interfieren. b) para la formación de derivados químicos. o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes.Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. las principales se recogen en la siguiente Tabla. rápido. 2+ 1Cu se acompleja con 4 NH. Método de Bradford Se basa en la unión de un colorante. simple. . Cada uno de estos métodos tiene sus ventajas e inconvenientes. en solución ácida. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).

5ml y falcon 15ml . rápido.Papel absorbente .Cubetas (espectrofotómetro) . una serie de patrones en concentración creciente.Juego micropipetas . . Da positiva esta reacción en todos los compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos consecutivos en sus moléculas. • Se preparan 100 μl de cada dilución de acuerdo a la siguiente tabla. ACTIVIDAD PRÁCTICA II MATERIALES . es decir. • Se construye una regresión lineal graficando Absorbancia v/s Concentración de BSA.Hielo .Guantes .BSA .Tubos falcon 15ml . Para conferir calidad analítica a la cuantificación lo que se realiza es una curva estándar. El resultado es una recta. una especie de concentración conocida.Método de BCA 1+ El ácido bicinconínico.Tubos eppendorf 1. cuya ecuación sigue la Ley de Lambert-Beer.Parafilm . se homogeniza la solución y se deja reaccionar por 3 minutos.Timer . muy sensible.Gradillas (para tubos eppendorf 1. cada cual con una absorbancia que debiese ser igualmente creciente. y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros métodos.Reactivo de Bradford .Puntas 10/200/1000 ul . Este reactivo forma la base de un método analítico capaz de monitorizar el ion cuproso producido en una 2+ reacción entre las proteínas con Cu en medio alcalino (reacción de Biuret). • Se mide la absorbancia de cada cubeta a 595 nm. La estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona un método para la cuantificación de proteínas que es sencillo.5ml . es un compuesto capaz de formar un complejo púrpura intenso con iones Cu en medio alcalino.Piscetas con agua destilada . Para cuantificar: Para correlacionar la señal de absorbancia con la concentración debemos tener una referencia. • Se agregan 1000 μl de reactivo de Bradford a cada cubeta. Construcción de la curva de calibrado con BSA. patrón o estándar. • Se transfieren las soluciones a cubetas espectrofotométricas. • El stock de BSA utilizado estará a 1 μg/μl. sal sódica. • Se sellan las cubetas con parafilm.Microcentrifuga .Vortex METODOLOGÍA 1.

BIBLIOGRAFÍA • Abbas K. 4º Edición. 2. pero experimentalmente siempre hay errores aleatorios que resultan en que la recta no pase por el origen como debiera. • Kazanietz M. Facultad de Biología Universidad de La Habana. 5.. “Signal Transduction”.7mL agregar 795μL de agua destilada. Universidad Nacional de Quilmes-Argentina. ü Según la Ley de Lambert-Beer no debiese existir un intercepto “b”. Biochemistry.. Finalmente agregar 200μL de reactivo de Bradford. 2008. & Pober J. 2000. Second edition. Tomo 2. España.. Ed. • Kurjan J. 3. Madrid-España.. • Lodish H. Una buena recta debiese tener el intercepto lo más cercano a cero. Díaz J. & Taylor B. Luego agregar 5μL de sus proteínas previamente centrifugadas. Berk A. • Albert B. Ed. • Chávez M. & Delfín J. .. 3. 1993. Zipursky L. “Biología Celular y Molecular”.. Lichtman A. & Darnerll J. Cuantificación de proteínas por Método de Bradford 1. 2008. Temas de enzimología. Agregar el contenido del tubo a una cubeta espectrofotométrica y luego medir absorbancia en espectrofotómetro a 595nm. sabiendo que: Ud. Editorial Médica Panamericana. “Biología Molecular de la Célula. Saunders College Publishing. Barcelona. En un nuevo tubo de microcentrifuga de 1. Bray D. Academic Press Inc. 4. Incubar el tubo durante 10 minutos a temperatura ambiente. McGraw-Hill- Interamericana. Matsudaira P.Y. Farmacología Molecular: Receptores. Pérez U. “y” es la Absorbancia.2. & Lewis J.A. obtiene una recta con su ecuación y = m x + b “m”. la pendiente es ε x l “x” es [c].. Madrid. 1995.. N. • Campell M.. Ediciones Omega S. 1990. Determinación de la concentración de proteína total en la muestra Calcule la concentración de proteína total interpolando en la curva. transducción de señales y activación de genes. Baltimore D. Esto significa tomar la absorbancia que obtuvo y ocupar la ecuación de la recta. Inmunología Celular y Molecular. 2009.

GUÍA DE LABORATORIO Nº3: ELECTROFORESIS DE GELES EN CONDICIONES DENATURANTES (SDS-PAGE) OBJETIVOS • Conocer los fundamentos de la separación de proteínas mediante la técnica de electroforesis en poliacrilamida. en el que se separan biomoléculas. relativamente no iónicos y que permiten buena visualización de las bandas durante tiempo prolongado. de su carga bajo la acción de un campo eléctrico. es útil para determinar otros parámetros como.- Ensamble de sistema discontinuo de geles de poliacrilamida. tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros. entre otros factores. Figura 2. Figura 1.8 con tal de tener el porcentaje deseado de acrilamida (5-30%) y al final se añaden Persulfato de Amonio (APS) y Tetrametiletilendiamina (TEMED) que dan inicio a la reacción de polimerización. Es útil además para determinar peso molecular. peso molecular y estructura tridimensional. La poliacrilamida es un soporte empleado frecuentemente en electroforesis en gel. lo que da la información necesaria si se pretende realizar una separación cromatográfica basada en diferencias de carga. de acuerdo al tipo de muestra. es la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico. y sirven como método de separación de mezclas complejas de ácidos nucleicos. Se pueden conocer también mediante estas técnicas. INTRODUCCIÓN La electroforesis es un método analítico-semipreparativo. . • Aprender la preparación de los geles en condiciones denaturantes (SDS-PAGE). • Determinar con criterios bioquímicos las condiciones electroforéticas. dependiendo. poder de resolución y versatilidad. A escala analítica. La electroforesis. Utilidad de la Electroforesis de Proteínas: Se pueden conocer las características ácido-básicas de las proteínas. Asimismo. es químicamente inerte. lo que da la información necesaria si se pretende realizar una separación cromatográfica basada en diferencias de carga. las características ácido-básicas de las proteínas presentes en un extracto crudo. se puede modificar de manera controlada el tamaño del poro. Además. así como la preparación de muestras y la interpretación de resultados. insolubles en agua. los métodos electroforéticos son de alta sensibilidad. punto isoeléctrico y número de cadenas polipeptídicas de las proteínas. punto isoeléctrico y número de cadenas polipeptídicas de las proteínas. estas partículas migran hacia el cátodo o ánodo (electrodos + y -). acrilamida y un tampón Tris a pH=8. El gel se ensambla mezclando agua. peso molecular. Forma geles transparentes con estabilidad mecánica. capaz de ser preparado de forma rápida y reproducible. junto con el equipamiento requerido para la corrida electroforética. dependiendo en combinación de su carga.- Ilustración de las fuerzas que se ejercen sobre una partícula cargadas que determina su movilidad en la electroforesis. proteínas y otras biomoléculas. de propiedades uniformes.

porque causan la formación de radicales libres del persulfato. Los grupos alifáticos dodecil se colocan en el interior.8 + 4% (p/v) SDS + 0. Por lo que el complejo SDS-proteína tiene generalmente mayor densidad de carga y menor tamaño que las proteínas nativas. una vez corridas las muestras. que se producen por radicales libres de oxígeno. como son la temperatura durante la polimerización y la corrida del gel. .Puntas (10. N. mientras que los grupos sulfato dan a los complejos SDS-proteína carga neta negativa (que excede la carga intrínseca de las cadenas de aminoácidos). también se emplea para la determinación del peso molecular de las subunidades de proteínas. para denaturar las proteínas rompiendo las interacciones no covalentes que determinan la estructura terciaria y cuaternaria. determinando el peso molecular de las mismas. ACTIVIDAD PRÁCTICA I MATERIALES . el Sodio-Dodecil-Sulfato (SDS).Buffer de carga 5x .5 mL. la preparación de las muestras y la tinción. la velocidad de la polimerización y los niveles de catalizador.025 M Tris + 0.Gel de Poliacrilamida. ocupa un detergente. El tratamiento de las muestras con un agente reductor de puentes disulfuro. . SDS-PAGE: La variante más usada de la electroforesis en geles de poliacrilamida. por causa de la acción de iones persulfato.25% (w/v) + Glicerina en agua 30% (v/v) . La polimerización se lleva a cabo con la utilización de sistemas catalíticos redox y se inicia con la formación de radicales del monómero.Fuente de poder.Buffer de carga.Buffer de corrida. . la pureza de los reactivos. . Soluciones: Running Buffer: 0. como el β-mercaptoetanol (β-ME) o el Ditiotreitol (DTT) ayuda a la linealización de la estructura tridimensional de las proteínas. SDS) son añadidos a la muestra mediante una solución cargadora (ver soluciones).02% (p/v) Azul de Bromofenol + 8% (v/v) β-ME Tinción: 0. 200 y 1000 µL) . mientras que los grupos sulfato en la superficie y todos los complejos SDS-proteína toman carga neta negativa (que excede la carga intrínseca de las cadenas de aminoácido).192 M Glicina + 0. Estos patrones deben ser tratados de manera similar a la muestra. P200 y P10 . Finalmente. se tiñe el gel con Coomassie Brilliant Blue para visualizar las bandas que adquieren un color azul.05%(p/v) Coomassie Brilliant Blue disuelto en 45% Metanol + 45% Agua + 10% Ácido Acético Destinción: 45% Metanol + 45% Agua + 10% Ácido Acético 6x Amortiguador de carga: Azul de bromofenol 0. El peso molecular (PM) de las proteínas puede determinarse en electroforesis al comparar las movilidades electroforéticas de varios marcadores de peso molecular conocido.01% (p/v) SDS Solución Cargadora: 50% (v/v) Glicerol + 0. .125 M Tris pH = 6. por nombrar algunas. El Rf es una medida convencional de la movilidad de la proteína relativa al frente de migración y se define como la distancia desde el inicio del gel separador hasta el centro de cada banda dividida entre la distancia a la que ha migrado el ión líder.Agua desionizada . se debe aplicar el que abarque el peso molecular esperado para la proteína que se quiere determinar. Existen patrones (mezclas de proteínas de peso molecular conocido y que se tiñen uniformemente) de varios rangos de peso molecular. N ́-tetrametilen-diamina (TEMED) se emplean como catalizadores de esta reacción.Tubos Eppendorf de 1.Juego de micropipetas P10. se obtiene un gráfico ligeramente sigmoideo. La electroforesis con SDS es un excelente método para identificar y monitorear las proteínas durante un proceso de purificación. El SDS-PAGE se emplea normalmente para estimar el peso molecular de las proteínas y se compara con un patrón.Heat block. N'-metilen-bis-acrilamida CH2 = CH-CO -NH -CH2 -NH -CO -CH = CH2. La electroforesis con dodecil sulfato de sodio (SDS) es un excelente método para identificar y monitorear las proteínas durante un proceso de purificación. Las aminas terciarias como el N.Agua ultra pura . Todos estos componentes (DTT. La electroforesis es una técnica muy sensible y puede ser afectada por muchos errores experimentales. el tiempo de corrida. Al realizar un ploteo del log PM de la proteína patrón como función del valor de Rf.Cámara electroforética.Marcador de Peso Molecular .Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización vinílica del monómero acrilamida CH2=CH-CO-NH2 y del monómero entrecruzador N. N. . Con esto se eliminan 2 de las 3 variables que determinan la movilidad electroforética y deja sólo la separación por peso molecular. El peso molecular desconocido puede estimarse por el análisis de regresión lineal o por interpolación en la curva del log de PM contra Rf.

2. Desteñir con solución de destinción hasta que se visualicen las bandas. Añadir 2μl de solución cargadora 4X. Centrifugar (spin).05 mL 0. Saunders College Publishing. 2. Aires. Hib J. • Campell MK. Second edition. 7.05 mL APS 10% 0. por 10 minutos en agitación.5 M (pH 8. Biología Molecular de la Célula. 3. • De Robertis E.05 mL SDS 10% 0. Ediciones Omega S. Homogenizar con vortex. 3. 4. 5. Ed. BIBLIOGRAFÍA • Alberts B. 2011.005 mL TEMED 0. México. Someter 3-5 minutos a 100°C. Biología Celular y Molecular: conceptos y experimentos. Montar los geles en las cámaras de electroforesis. Guardar húmedos. 1. y teñir con Azul de Commasie. Agregar Running Buffer en ambos electrodos.17 mL Tris 1. Ciudad de México. . • Karp. Bray D.8) 1. Biochemistry.13 mL SDS 10% 0.5 M (pH 6. Tomar la cantidad de 6μl de muestra a una concentración de 1μg/μl de proteína. Correr los geles a 150V x 30 minutos. 2010. Sacar el gel de los vidrios.METODOLOGÍA 1. en los pocillos. 1995. G.01 mL TEMED 0.3 mL Tris 0. A.005 mL 0. Biología Celular y Molecular. Verificar que no hayan filtraciones. 5ª Edición. • Preparación del sistema de electroforesis. Hacer los geles máximo 1 día antes de utilizarlos.001 mL • Preparación de las muestras: 1.4 mL 30% A/B 0.68 mL 30% A/B 1. o hasta que el frente (color azul) llegue casi al borde del gel. 2000. McGraw-Hill.8) 0. 5. 4ª Edición.01 mL APS 10% 0. 4.6 mL 2. 6..3 mL 1. Bs.. Barcelona.- Preparación de los geles poliacrilamida (6 ml) (6 ml) Separador 8% 12% Concentrador 1 mL (4%) Agua MQ 3.0 mL 3.8 mL Agua MQ 0. El Ateneo. Cargar las muestras luego de denaturadas (hervidas). & Ponzio R. & Lewis J.05 mL 0.

. la que es desplazada por un carro móvil. las aptitudes del microscopio han ido en ascenso.Tubo o Cañón: en su extremo superior lleva la lente ocular y en el inferior la lente objetiva. Si bien se puede observar muestras sin adulterar. tanto en mecánica como en óptica. INTRODUCCIÓN La microscopía es un conjunto de técnicas que permiten la visualización de entidades pequeñas que.Tornillos de Focalización: Macrométrico. Luego. El microscopio óptico compuesto se compone de 3 sistemas principales. construye el primer microscopio compuesto. Actualmente. destacándose la electrónica y de fluorescencia. de otra manera. . Consta de pinzas para sujetar la preparación. Robert Hooke. la microscopía óptica es llamada “clásica” por cuanto han surgido numerosos tipos de microscopía. • Aplicar las normas de uso y cuidado del microscopio óptico. por cuanto las células son incoloras y traslúcidas. TAMAÑO Y VIABILIDAD CELULAR OBJETIVOS • Conocer la estructura y el funcionamiento del microscopio de luz. lo que es 5 veces menor que el objeto más pequeño observable a simple vista. Se denomina tubo binocular si posee dos lentes oculares. Desde entonces.Revólver: Corresponde a una pieza giratoria en el extremo inferior del tubo. platina y el tubo con el sistema óptico de amplificación. GUÍA LABORATORIO Nº4: MICROSCOPÍA: FORMA. • Utilización de la cámara de Neubauer y microscopio para el contaje de células. el condensador. De cualquier manera. Moviliza por rotación los diferentes objetivos de que dispone el microscopio. ha sido la base del desarrollo de la Biología desde su implementación. El continuo progreso en el sistema de lentes ha permitido alcanzar aumentos de hasta 2000 veces. Sistema Mecánico . el que se utiliza para un enfoque grueso.Platina: plataforma horizontal con un orificio central que permite el paso de los rayos luminosos que atravesarán la preparación. cuando Anton van Leeuwenhoek fabrica lentes capaces de visualizar bacterias. y micrométrico que completa el enfoque de precisión. están fuera del rango de resolución del ojo humano.Pie: Corresponde a la base de sustentación del aparato. • Conocer los diferentes tipos celulares y las funciones específicas de cada uno. conjunto al progreso científico. la microscopía tanto clásica como instrumental sigue siendo una herramienta poderosa y central en la Biología y disciplinas afines. . • Observar distintos tipos de muestras para comprender su funcionamiento. protozoos y otros microorganismos. una limitación en la microscopía óptica es que se necesitan diversas tinciones para evidenciar estructuras y formas celulares. .Columna: sostiene el espejo o el sistema de iluminación. La microscopía data del siglo XVII. • Diferenciar células vivas y muertas mediante el uso de azúl de tripán. 1. el principal gestor de la Teoría Celular. . MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO La microscopía óptica o de luz. . Las bacterias y otros procariotas son aún más pequeños. La célula animal típica tiene 20 μm de tamaño. El tornillo micrométrico trae una escala graduada y cada marca indica un avance de dos micrómetros (2μm).

Diafragma Iris: Por debajo del condensador se dispone un diafragma regulable que gradúa la cantidad de luz que llega a la preparación. Estas lentes dan una imagen inicial real. Los oculares se designan por su aumento (6X. UV. 3. Los microscopios modernos no usan espejos pues su fuente de luz se ubica bajo el condensador. . IR. azul.Condensador: Está formado por un sistema de lentes que enfoca la luz en el plano superior de la preparación. . n = 1.Espejo: Recibe la luz de la fuente luminosa y la refleja sobre el condensador. 2.515) y cuya función es concentrar los rayos que se habrían perdido por refracción en el portaobjetos al llegar a aumentos altos. puede ser una lámpara común de luz visible.) que incide sobre la muestra. .Lentes Objetivas: Sistemas de lentes ubicados inmediatamente encima del objeto o preparación. seleccionando la longitud de onda (roja.Lentes Oculares: Son sistemas ópticos ubicados en la parte superior del tubo del microscopio. 8X. Sistema de Amplificación . Objetivos de inmersión: El medio interpuesto es un líquido viscoso transparente (agua o aceite) con un índice de refracción mayor que el del aire (comúnmente aceite de cedro. aumentada e invertida de la imagen dada por el objetivo.Fuente: Natural o artificial. Objetivos en seco: En estas lentes el medio interpuesto entre la lente y el objeto (preparación) es aire. Pueden ser apocromáticos o corrientemente acromáticos. aumentada e invertida. . 20X). Forman la imagen final virtual. verde. etc. 15X.Anillo porta filtro: Corresponde a un anillo de metal situado bajo el condensador en el cual puede colocarse un filtro de color. . 10X. Van desde el 5X hasta el 100X. Sistema de Iluminación . .

La fórmula de Abbe muestra que para aumentar la resolución.PROPIEDADES DEL MICROSCOPIO Además. Y es principalmente respecto a la manipulación de la longitud de onda donde se han hecho la mayoría de las mejoras. Las células vivas o viables presentan una membrana celular intacta lo que impide que se incorpre el azúl de tripán. es más refractada y forma un foco más cerca de la lente que la de mayor longitud de onda (rojo). Así los rayos de luz son desviados con mayor intensidad en la porción prefractada y forma erisférica originando dos focos. Este límite no es sino la distancia mínima entre dos puntos para que al microscopio de distingan como separados. entre las que tenemos la aberración esférica y la aberración cromática. creándose diferentes tipos de microscopía qué serán analizados más adelante en los laboratorios. ü Poder de Penetración: Capacidad del microscopio de mostrar en foco dos puntos en distintos planos. las células muertas se ven de color azul al microscopio. Debido a que las células vivas son excluidas de la tinción. este método también se llama método de tinción por exclusión. podrá apreciarse que la AN aumenta con el aumento de cada lente. por cuanto se enfoca el haz de luz en un punto cada vez más limitado. El objeto parece estar rodeado de halos de diferentes colores. Tinción para viabilidad célular y conteo en Cámara de Neubauer: Tinción con azul de tripán: El azul de tripán es un colorante azoico que se utiliza en ensayos de viabilidad celular el cual permite diferenciar células vivas de muertas. b) Aberración cromática: Depende de la longitud de onda de la luz ya que una única lente no enfoca todos los colores en un mismo punto. por el contrario.5 μm) y AN es la Apertura Numérica.25 ABERRACIONES Las lentes de un microscopio adolecen de imperfecciones llamadas aberraciones. λ es la longitud de onda de la radiación usada (para luz blanca es 0. .61 para el microscopio óptico). Si se observan los valores de AN de las diferentes lentes objetivas de un microscopio dado (Tabla 1). a) Aberración esférica: Se produce porque los lentes con curvación esférica. en las células muertas el azúl de tripán es capaz de atravesar la membrana celular. Esto se define porque los objetos dispersan la luz. por ende el haz de luz recto que viene del condensador sufre dispersión al pasar por la muestra y llega en un cierto ángulo (α) a la lente objetiva. Tabla nº 1 Aumento Objetivo Apertura Numérica 4X 0. se pueden manipular sólo un pequeño número de variables: la longitud de onda de la luz que se usa (λ) y la apertura numérica (AN) del objetivo con que se está realizando la observación. el poder de penetración disminuye. es decir disminuir el límite de resolución. no hacen foco en un solo punto pues los bordes producen una refracción relativamente mayor que la del centro. Por lo tanto. ü Poder de Definición: Capacidad del microscopio de dar imágenes nítidas de contornos precisos. y esto depende también del índice de refracción del medio entre la muestra y lente (n). Donde k es una constante que depende del índice de refracción del medio entre el objeto y la lente (0. AN: Es una medida del diámetro de apertura de la luz respecto a la distancia focal. es así como en la tabla siguiente se muestran los aumentos de las diferentes lentes objetivas y sus respectivas AN. ü Poder de Resolución: Capacidad para distinguir como separados dos puntos extremadamente cercanos.25 40X 0. el microscopio tal como lo conocemos hoy tiene cuatro características fundamentales: ü Poder de Aumento: Capacidad para entregar imágenes aumentadas. Matemáticamente es el inverso del Límite de Resolución (LR).1 10X 0. ganando resolución en un plano pero perdiendo el foco en otros.65 100X 1. A medida que se sube el aumento. La luz de longitud de onda más corta (violeta). Está definido por el producto entre el aumento del ocular y el aumento del objetivo.

y sólo las células de los borden superior y derecho se consideran que están dentro del cuadrante y se cuentan. para calcular el número de células que hay en un solo cuadrante. AUTOR/ES: Campos. Se cuentan las células que hay en todo el cuadrante. C.1 mm con respecto a la central. desde la relativamente simple cámara de contaje celular. el volumen del área del cuadrante será: 3 -4 1mm x 1 mm x 0.1 mm = 0. situando la punta de la pipeta de tal forma que toque el borde superior del cubreobjetos dejándola penetrar por capilaridad. que a su vez están divididos en 16 cuadraditos iguales y que se utilizan para el contaje celular.1 ul = 10 ml Lectura y cálculo de la concentración celular: Para contar las células viables se coloca un cubreobjetos sobre la zona de la cámara que contiene la cuadícula y clocamos 10 ul de la mezcla de azúl de tripán y la suspención celular entre el cubre y la cámara de Neubauer. cuya porción central está dividida en tres bandas perpendiculares al eje longitudinal de la cámara (divididas por ranuras transversales). Como la longitud de cada uno de los lados del cuadrante es de 1 mm. Este valor se multiplica por 4 la dilución realizada con azul de tripán y por 10 para conocer el nº final de células por ml de la muestra: Manual de prácticas de Inmunología. subdividida en dos semibandas idénticas y separadas por una ranura perpendicular. A. El contaje de la muestra se realiza de la siguiente forma: Se observa un cuadrante en un aumento al 40x. La banda central puede estar. La cámara de Neubauer consiste en una placa gruesa de cristal en forma de portaobjetos.1mm. entre ellas la cámara de Neubauer. / Rubio. . -4 El valor obtenido será el número de células en 10 Bibliografía utilizada: ml (volumen del área del cuadrante). hasta equipos automáticos de contaje celular. Cuadrículas de conteo Cada cuadrícula de recuento consta de 4 cuadros grandes idénticos. y se divide por 4 la cifra obtenida en el recuento.Conteo de células en cámra de Neubauer: El contaje de células en cámaras cuadrículadas se utiliza con bastante frecuencia para determinar la densidad de células como el porcentaje de éstas células que son viables. y la altura del espacio comprendido entre la superficie de la cámara y el cubre es de 0. Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas. Se cuentan las células presentes en los 4 cuadros grandes idénticos de la cuadrícula de conteo. a su vez. El contaje con cámaras nos proporciona un método efectivo y de bajo costo. ( en la siguiente figura se muestra con líneas verdes los bordes a contar) mientras que las células de los bordes inferiores e izquierdo se Fig 3: Tinción con azul tripán (1/10) excluyen. En cada una de estas dos semibandas hay grabado cuadrículas de recuento idénticas. G. / Muñoz.1 mm= 0. situados en las cuatro esquinas (en la imágen se representan con una L). y en esta última hay grabado cuadrículas de recuento. es decir en los 16 cuadraditos del cuadrante. De ellas. las dos laterales se hayan sobre-elevadas 0.

La especialización funcional en organismos superiores.Preparación con Hilo de dos colores (rojo. Nº de células vivas /ml = nº de células contadas /4 x factor de dilución x 10 • Para más información vease Anexo Nº 1. Cada uno de estos se subdivide en diferentes grupos de acuerdo a su especialización.2 μm (Mycoplasma genitalium) y tan grandes como 16 cm (huevo de avestruz).Microscopio óptico . se agrupan. cada uno con una morfología específica. etc. . azul) METODOLOGÍA Letras y papel Enfocar la letra con el objetivo de menor aumento (4x. determine el diámetro del campo observado. que lleva a la diferenciación celular. siendo el tamaño promedio entre 10 a 60 μm. encontrando así 4 tipos básicos: epitelial. éste es muy variable. • Usando las líneas del papel milimetrado determine el tamaño de la letra. Éstos se clasifican de acuerdo a las características que presentan. conectivo o conjuntivo.) • Desplace la platina a la derecha y a la izquierda ¿en qué dirección se mueve la letra? • Usando las líneas del papel milimetrado.Preparación con Papel impreso (hoja de periódico) . ACTIVIDAD PRÁCTICA I MATERIALES . Con respecto al tamaño celular. las células pueden ser tan pequeñas como 0.Líquido para limpiar oculares y lentes . 5x u otro según el caso). difusa. invertida. da como resultado los distintos tipos celulares. muscular y nervioso. Las células son la unidad morfo-funcional de los tejidos los cuales se forman cuando varios tipos celulares que cumplen funciones similares. Pasar al objetivo de 40x y responder lo siguiente: ¿La iluminación experimenta cambio? Hilos de colores • Con el objetivo de 5x ¿Cuántos colores de hilos distintos distingue? • Al pasar al objetivo de 10x ¿Qué sucede? ¿y al de 40x? • ¿Qué explicación le da usted a esto? • ¿Para observar uno de los hilos sobre el otro con más precisión? ¿qué estructura (parte) del microscopio deber mover? ¿Por qué? EJERCICIOS Determinar con cuál de los aumentos se obtiene: • Mayor amplitud de campo • Menor distancia de trabajo • Mayor poder de resolución FORMA Y TAMAÑO CELULAR Los organismos están formados por una gran cantidad de distintos tipos celulares con funciones específicas. Por ejemplo. luego el radio y a partir de éste calcule el área del campo. Realice las siguientes actividades: • Describa cómo se ve la letra (derecha.

Tejido epitelial: Es el tejido que recubre y protege órganos y conductos. caracterizado por su gran resistencia tanto a la tracción como a la compresión. Tejidos óseos: formar el principal tejido de soporte del organismo. -Células Gliales: Es el conjunto de células de soporte que nutren y mantienen a las neuronas. 5. Se clasifica en laxo (células en disposición irregular). térmicas. compuesto por plasma sanguíneo y los llamados elementos figurados: los glóbulos rojos. rodeadas de escaso material intercelular. ya sea por ellos mismos o para otros tejidos del organismo. sanguíneo. Su origen en común es el mesénquima embrionario de mesodermo. . convirtiéndolos en “puentes” inter- compartimento y los agentes clave de la integración sistémica del organismo. para su uso posterior como fuente de energía. Tejidos adiposos: almacenar grasas. médula espinal) o llevar las respuestas de estos centros a efectores (músculos. Tejidos cartilaginosos: formar placas o láminas relativamente sólidas. caracterizadas por una gran resistencia a la compresión. Su organización celular es bastante más dispersa e independiente que en el epitelio. adaptados a funciones específicas tales como: 1. se agrupa en una lámina basal. 6. Tejidos conjuntivos densos: contener a las células que participan en los procesos de defensa ante agente extraños: constituyendo el sitio donde se inicia la reacción inflamatoria. 4. Poseen una matriz extracelular amplia compuesta de colágeno. Tejido nervioso: Se origina desde el ectodermo embrionario y sus principales componentes son las células. los glóbulos blancos y las plaquetas. Existen varios tipos de tejidos conjuntivos localizados en diversos sitios del organismo. La matriz extracelular. cavidades internas y tamaño de órganos. Las células son de dos clases diferentes: -Neuronas o Células Nerviosas: Son la unidad funcional del tejido y están ultra-especializadas en la recepción y transmisión de señales químicas. Gran presencia celular pero baja proporción de fibras. glándulas) para iniciar la acción motora y hormonal. Pueden trasmitir señales sensitivas mecánicas. escasa. 2. Provee además de protección ante la acción mecánica y está encargado en el caso de glándulas de secreción especializada. Tejido Conectivo: Son conjuntos de células que conectan los distintos niveles de los órganos. Compone una barrera selectiva que limita el movimiento de agua. solutos o células de un compartimento a otro y controlan la superficie libre. Tejidos conjuntivos laxos: mantener unidos entre sí a los otros tejidos del individuo. cartilaginoso). 3. Tejido sanguíneo: La sangre es un tejido conectivo especializado. Todas estas funciones se cumplen porque las células están adheridas una a otra por uniones especializadas estrechas que “sellan” los espacios intermedios. elastina y diversos proteoglucanos. óseo. químicas hacia un centro elaborador de respuestas (cerebro. denso (conformación celular y fibrosa más organizada) y especializado (adiposo. Alta concentración fibrilar. formando el estroma de diversos órganos. Cumplen además funciones de mantenimiento y sostén de órganos.

Enfoque la muestra con la lupa. luego: Observe con aumento de 100x y responda: a. involuntario y sin estrías. estriado e involuntario. Tejido Muscular: Este tejido. está constituido por células musculares (miocitos) los cuales son células diferenciadas que forman fibras capaces de generar movimientos al contraerse bajo estímulos adecuados y luego relajarse. de origen mesenquimático. Reconozca una vellosidad intestinal ¿A qué tipo de tejido corresponde?. Corte transversal de intestino delgado Coloque la preparación sobre la platina siguiendo las instrucciones de uso que usted ya conoce. y Liso. recibirá distintas preparaciones con las cuales deberá realizar una serie de actividades: ACTIVIDAD PRÁCTICA II 1. En los vertebrados. ¿Qué aspecto presenta el epitelio intestinal? ¿Cómo son sus células?. que es estriado y voluntario. b. La maquinaria intracelular contráctil está formada por proteínas (actina y miosina) que se orientan paralelos a la dirección del movimiento y ocupan energía química (ATP) y la transforman en energía mecánica. . Musculo cardiaco Musculo liso Musculo esquelético ACTIVIDAD PRÁCTICA Durante el laboratorio Ud. se distinguen 3 tipos de músculo: Esquelético. Cardíaco.

Ediciones Omega S. • Alberts B. 1994. Hib J.. McGraw-Hill.Juego de micropipetas P200 y P20. Lewis J. . Scientific American Books. • De Robertis E.- Preparar la Cámara de Neubauer con un cubre-objetos y colocar 10 ul de la mezcla (suspensión celular/aul de tripán).Puntas (P10 y P200) . & Pober J. ¿Qué diferencias observa? Observe con mayor aumento.Tupos eppendorf de 1. Ed. Ubique y caracterice el epitelio traqueal. Ubique y caracterice el tejido cartilaginoso. la forma celular y la disposición de las fibras. Indique el tipo de tejido muscular. ACTIVIDAD PRACTICA III: MATERIALES: .- Hacer una tinción con Azul de Tripán al 1/1 (suspensión celular/azul de tripán): agregar 100 ul de azúl de tripán a un tubo eppendor de 1. 2.- Aplicar la fórmula de la cámara para saber qué cantidad de células viables se hay. Aires. 2000. 4ª Edición. • Alberts B. 3ª Edición. 2011.Azúl de tripán . 3. a. Biología Celular y Molecular.. Ciudad de México. Mencione en qué posición se encuentra el núcleo dentro de la célula. 4. 4º Edición. & Walter P.. • Lodish H. Identifique la localización de los núcleos. METODOLOGÍA: 1. .Muestra de células en suspensión. Molecular Celll Biology. 2010. • Karp G.Y.. Describa la forma del tejido. b.. N. luego pase a 100x y finalmente a 400x. España. Identificar Neuronas. Bray D. Corte longitudinal de músculo esquelético Recibirá una muestra de músculo esquelético. McGraw-Hill-Interamericana. A. b. 5º Ed. Corte transversal de epitelio traqueal Enfoque la muestra con el aumento menor. Raff M. c.. Identifique la túnica adventicia. Recórrala con aumento menor. f. luego cuidadosamente agregar 100 ul de la muestra de células en suspensión y mezclar pipeteando con suavidad. Barcelona. Johnson A. BIBLIOGRAFÍA • Abbas A. 3. • Darnell J. axones y células gliales. Ed. ¿Reconoce diferencia entre sustancia blanca y gris? b. a. En aumento 400x Ubique la capa muscular..- Contar las células al microscopio: - Localizar la cuadrícula (en la cámara de Neubauer) y las células con el objetivo 10x. & Ponzio R.5 mL . Observe la organización del tejido y disposición de las fibras. 2002.. a. 2002. & Baltimore. Biología Celular y Molecular: conceptos y experimentos. g. Bs. - Pasar al objetivo 40x para el contaje y visualización de células vivas y muertas..Cámara de Neubauer . Corte transversal de médula espinal. Inmunología Celular y Molecular. Médica Panamericana. 5ª Edición. Identifique astas posteriores y anteriores. Hopkin K. 4. ¿Cuántos tipos celulares reconoce en el epitelio en base a su forma?. Madrid. c. Ciudad de México.5 mL.Microscopio . 2011. Biología Molecular de la Célula. c. Bray D. Observe la muestra con aumento menor. 2.Observe con aumento de 400x y responda: c. Ubique la chapa estriada. Molecular Cell Biology. Introducción a la Biología Celular. México.. Lichtman A. & Lewis J. Roberts K.Cubreobjeto . El Ateneo. d. luego con aumentos mayores. México.

Facultad de Medicina. . • Van Holde M. 1999. Madrid.• Spotorno A. Elementos de Biología Celular y Genética. Editado por el Departamento de Biología Celular y Genética. & Hoecker G. Mac Graw Hill-Interamericana. 1993. Bioquímica.

Cultivo de células adherentes . Podemos teñir entonces con componentes coloreados y ver al microscopio óptico convencional o podemos marcar con fluoróforos y visualizar al microscopio de fluorescencia.Etanol 100% .Metanol:Peróxido de Hidrogeno (9:1) .Neoclear .Streptavidina-avidina-HRP . sin embargo el blanco de detección es un conjunto de células que están en un tejido.Microscopio de Epifluorescencia.Solución de bloqueo . se puede conocer la presencia de dicha molécula en una muestra dada. INTRODUCCIÓN A saber. es decir se quiere detectarlas en las células o conjunto de células (tejidos) que las producen. .Solución de revelado .Neomount .Anticuerpo secundario biotinilado . Las técnicas de inmunocitoquímica e histoquímica no se alejan de este esquema general. Primero se debe extraer el tejido. un anticuerpo es capaz de reconocer una molécula específica y llevando acoplado un sistema de detección adecuado. GUÍA LABORATORIO Nº5: TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS “INMUNOFLUORESCENCIA” OBJETIVOS • Reconocer la utilidad de los anticuerpos como herramientas analíticas.Anticuerpo unido a fluoroforo . • Comprender la utilidad de los anticuerpos para Inmuno-ensayos en Muestras Biológicas Íntegras. preparar la muestra histológica y luego se procede con el ensayo. ACTIVIDAD PRÁCTICA I MATERIALES .Hematoxilina .Improntas de Bazo y Riñón de rata .PBS 1X . Los sistemas de detección pueden ser enzimáticos o fluorescentes.Etanol 70% . la inmunohistoquímica apunta al mismo objetivo. • Visualizar la capacidad de detección específica de una molécula presente en una célula o tejido. De manera general.DAPI . pero apuntan a detectar la molécula desde su fuente original.Etanol 50% .

Aires. 2.. • Campell MK. 1995. BIBLIOGRAFÍA • Alberts B. & Lewis J. 70%.03% Peróxido de Hidrógeno. y al mismo tiempo ir introduciendo agua a las células. 2011. Hib J. Desparafinado: La parafina se remueve de cortes histológicos disolviéndola con xilol o neoclear. Inhibición de la enzima endógena: Si se va a ocupar un sistema de detección enzimático. Se revela con Diaminobenzidina + Peróxido de Hidrógeno si es HRP. Con este paso se tiñen los núcleos celulares. tenemos Fosfatasa Alcalina y Peroxidasa de Rábano. 6. 2010. con DAB 1 mg/mL + 0. 7. 4ª Edición. 5. Tinción de contraste: Se añade Hematoxilina diluida por 3 minutos y luego se lava con Agua (2 veces por 5 minutos). G. La biotina se incuba luego con un complejo streptavidina-avidina-HRP. 50% y Agua destilada. Colocar Entellán o Neomount en la muestra y cubrir con cubreobjetos. Ed. Second edition. & Ponzio R. Bloqueo de Sitios Inespecíficos: Se hace con BSA 5% x 30 minutos. Debido a la toxicidad del xilol. Se lava con Neoclear 2 veces x 5 minutos c/u. Para contrastar los núcleos se tiñen con Hoescht o DAPI. Hidratación: Para efectos de reacciones debe haber agua presente. ANEXO Nº 1 . 8. Biología Celular y Molecular: conceptos y experimentos. Las células se visualizan al microscopio óptico. 5ª Edición. A. Ediciones Omega S. Saunders College Publishing. El Ateneo. Ciudad de México. • El ensayo implica incubar 1 hora en cámara húmeda el anticuerpo primario en dilución 1:250 (se verá expresión de IL-4 y IFN-γ en bazo y riñon de ratón) y luego incubar 1 hora con anticuerpo secundario biotinilado. b) Detección Fluorescente: Si el anticuerpo está unido a un fluoróforo. • Sumergir sucesivamente en Etanol 100%. • Karp. Bray D. México. 2000. Deshidratación y Montaje: Para visualizar finalmente al microscopio. Bs. se debe inhibir primero la enzima que es nativa al tejido.. se utiliza comúnmente el último citado. Biología Molecular de la Célula. y con NaftolFosfato si es AP. pero en orden inverso y luego se hacen 2 lavados con Neoclear. McGraw-Hill. Biología Celular y Molecular. Incubación con Anticuerpo: a) Detección Enzimática: Si el detector acoplado a un anticuerpo es enzimático. se ve por microscopía de fluorescencia con filtro de excitación y emisión según el fluoróforo que se ocupe. • Para inhibir las peroxidasas endógenas se debe lavar con Metanol:Peróxido de Hidrogeno (9:1) 20 minutos 2 veces. 3. Lavar con Tris-HCl para detener la reacción. Revelado: Similar a otros ensayos.METODOLOGÍA 1. 4. por ende se utilizan alcoholes en porcentajes decrecientes para eliminar neoclear y trazas de parafina. de utiliza la batería de etanol anterior. Barcelona. Cada inmersión se hace 3 minutos. Biochemistry. • De Robertis E.

TIPOS DE MICROSCOPÍA La potencia amplificadora de un microscopio óptico está limitada por la longitud de onda de la luz visible. Este tipo de microscopio es muy útil a la hora de examinar tejidos vivos. por lo tanto su uso esta mas difundido en el área de la microbiologia. Es ideal para especimenes delgados. aumentando el contraste. Cuando las modificaciones de estos parámetros no fueron suficientes. solo es captada la luz dispersada por el objeto. Este anexo resume algunos tipos de microscopía que existen en la actualidad. El microscopio de contraste de fase se desarrolló para incrementar las diferencias de contraste entre células y el medio que las rodea. por lo que se utiliza con frecuencia en biología y medicina. que contiene un dispositivo en forma de anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase de un cuarto de la longitud de onda. y en consecuencia. En general no es un tipo de microscopio muy usado pero se debe notar que con él se pueden observar algunas estructuras que son invisibles de visualizar en la microscopía de campo claro y de contraste de fases como por ejemplo los penachos de los flagelos de las bacterias. la sombra representa más una diferencia en el índice de refracción que una diferencia de grosor. como en el microscopio de campo oscuro. Fue diseñado para observar relieves de especimenes muy difíciles de manejar. Este tipo de iluminación provoca variaciones minúsculas en el índice de refracción de un espécimen transparente. Se usa principalmente para aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las células sin colorear. El material a observar se colorea con colorantes específicos que aumentan el contraste y revelan detalles que no se aprecian de otra manera. se idearon nuevamente otras tecnologías. Sin embargo. esto se consigue por un condensador especial. es muy utilizado en los tratamientos de fertilización in vitro actuales. dado que también en este caso se utilizan las diferencias de fase producidas por la luz que atraviesa el objeto. Esta microscopía se usa cuando el espécimen es muy grueso para usar contraste de fase. la masa de los elementos celulares individuales. definiendo sus fundamentos. Este tipo de microscopía está construida sobre la base de principios similares al microscopio de contraste de fase. La luz pasa directamente y se aprecian detalles que estén naturalmente coloreados. pudiendo determinar la masa por unidad de superficie del preparado. En este caso la muestra se ilumina en forma oblicua. así se puede ver el objeto brillante sobre un fondo oscuro. luego un segundo prisma junta los dos rayos en uno. En la microscopia de campo oscuro se ocupa básicamente el mismo principio que en la de campo claro. Se utiliza habitualmente en investigación porque permite la observación en montajes húmedos (en los que la muestra permanece viable). MICROSCOPÍA DE CONTRASTE DE FASE. . Esta técnica utiliza luz blanca que pasa a través de un prisma que divide el rayo de la luz incidente de manera que una parte del rayo pasa a través de una región del espécimen mientras que la otra parte pasa a través de una región adyacente. El microscopio de fase ilumina el espécimen con un cono hueco de luz. o células aisladas. MICROSCOPÍA DE INTERFERENCIA. haciéndolo visible. la diferencia reside en el sistema de iluminación y. Es por esto que surgieron nuevos instrumentos de microscopía que modificaron tanto la forma de iluminar la muestra como la longitud de onda con la cual se observa. MICROSCOPÍA DE INTERFERENCIA NOMARSKI (microscopía diferencial de contraste de interferencia). por lo tanto. mediante este microscopio es posible obtener datos cuantitativos. en el microscopio de fase el cono de luz es más estrecho y entra en el campo de visión del objetivo. lo que permite su visualización sin necesidad de tinción. Es una variante especial de la microscopía de interferencia cuya base radica en que utiliza dos rayos de haces luminosos separados con polaridad opuesta y las imágenes combinadas aparecen como si la célula estuviera proyectando sombras hacia un lado. modo de operación y resultados visibles que cada uno de ellos entrega. Mientras que el microscopio de contraste de fase es solo un instrumento cualitativo. MICROSCOPÍA ÓPTICA NORMAL (de campo brillante coloreado). MICROSCOPÍA DE CAMPO OSCURO. MICROSCOPÍA DE CAMPO BRILLANTE. Genera una imagen en la que parece que el espécimen proyecta una sombra hacia un lado. en la imagen recibida. El material se observa sin coloración.

epon) para luego ser cortadas y obtener secciones ultrafinas (50-100 nm de espesor). lo cual descarta investigaciones en células vivas. cuyo sistema suele estar construido en cuarzo. La longitud de onda más corta de la luz visible es de alrededor de 4. Lo que en teoría permite obtener un poder de resolución muy elevado. glutaraldehido seguido de tetróxido de osmio).000X y 2. La longitud de onda de los electrones que se utilizan en los microscopios electrónicos es de alrededor de 0. Los MET utilizan electrones acelerados con voltajes de 30 a 100 kV y su longitud de onda es aproximadamente 100. que utiliza luz visible. El principio que utiliza este tipo de microscopía es que la luz UV duplica el poder de la resolución del microscopio óptico. por lo que se pueden detectar con facilidad. Así mismo. los objetos se ven brillantes sobre un fondo oscuro. Además permite apreciar y es útil para el estudio de células vivas. Una limitación de este tipo de microscopia es el requerimiento de utilizar alto vacío. En consecuencia. Generalmente usa fluorescencia y es iluminado mediante láser. . MICROSCOPÍA DE LUZ ULTRAVIOLETA. que es invisible. ya que el contraste depende del número de electrones dispersados y este a su vez depende del número atómico de los átomos de la muestra. Se basa en un sistema de barrido por planos de la muestra en el que son eliminados todos los puntos desenfocados de la preparación mediante un filtro ubicado con alta precisión para que coincida con el punto iluminado. permite el paso de la luz UV. En principio se debe a que reemplaza la luz visible por un haz de electrones. Las muestras a ser estudiadas deben ser fijadas (ej. La construcción del microscopio electrónico representa un verdadero logro en cuanto a incrementos del aumento y poder de resolución. las muestras deben ser teñidas con sales de metales pesados (osmio. Y la formación de la imagen se registra en una película fotográfica. debido a la división que sufre la luz polarizada plana al traspasar la muestra. deshidratadas y luego incluidas en una resina monomérica (ej. El microscopio confocal ha permitido solucionar este problema eliminando estas áreas borrosas y creando una imagen tridimensional computarizada de alta precisión. dejando pasar solo la luz de longitudes de onda más baja y el segundo filtra la luz transmitida dejando pasar solo la luz de longitudes de onda mayores. Uno que filtra la luz incidente. También se puede visualizar el interior de las membranas celulares realizando técnicas de criofractura y grabado por congelación. De esta forma se logra que los diferentes componentes celulares aparezcan con distintos grados de contraste. MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA. Este microscopio es usado en la detección de proteínas intracelulares como la tubulina.000.000X con una resolución de 10 Ao y 1 Ao respectivamente. Dado que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz pueden mostrar estructuras mucho más pequeñas.000 veces menor que la longitud de la luz visible. Las moléculas fluorescentes absorben luz de una determinada longitud de onda y emiten luz de una longitud mayor. Los cortes deben ser ultrafinos debido a que los electrones tienen un poder de penetración muy limitado. Presenta la gran ventaja de producir imágenes tridimensionales. El primero es que el preparado debe ser extremadamente fino y el segundo es que solo ciertas partes se observan con nitidez mientras que las otras se perciben borrosas y poco claras. - Microscopía electrónica de Transmisión (MET). Esta microscopía se caracteriza por utilizar dos filtros polarizantes que permiten observar estructuras anisótropas o birrefringentes. Existen diferentes tipos de microscopia electrónica desarrolladas hasta este momento.MICROSCOPÍA DE LUZ POLARIZADA. Este tipo de microscopios permiten obtener aumentos mínimos de 1000X y aumentos máximos que pueden oscilar entre 200. mediante este tipo de microscopia es posible obtener información respecto a la estructura a nivel molecular. a través de microinyecciones en un proceso llamado citoquímica análoga MICROSCOPÍA DE BARRIDO CONFOCAL.5 angstroms. como ciertas inclusiones celulares o las fibras musculares. Los objetos pueden poseer fluorescencia natural (autofluorescencia como la vitamina A) o fluorescencia artificial mediante la adición de colorantes como la fluoresceína o la rodamina. El microscopio de luz ultravioleta. La birrefringencia de un objeto depende de una estructura regular determinada.000 angstroms (1 angstrom es 1 x 10-10 metros). uranio o plomo). MICROSCOPÍA ELECTRONICA. así. El microscopio de fluorescencia es capaz de detectar la emisión de estas sustancias debido a que posee 2 filtros. Su gran poder de aumento asociado a su excelente resolución hacen que este microscopio sea particularmente útil para el examen de organelos celulares. La principal importancia de éste es que los ácidos nucleicos absorben luz UV a 260 nm. Al observar una muestra con microscopio óptico común se presentan dos problemas.

Esta limitación se puede superar mediante el MAV cuyo haz de electrones es 10 veces mas rico en energía que el MET. El MET está limitado por escaso poder de penetración del haz de electrones. A continuación la muestra es recorrida por un haz focalizado de electrones. Sin embargo.- Microscopía electrónica de Alto Voltaje (MAV). Aquí la muestra es fijada. La gran profundidad de foco y la baja resolución lograda por este microscopio hacen que sea particularmente útil en el estudio de los detalles superficiales de células o tejidos. se mantiene constante la corriente debido al movimiento constante de la sonda hacia arriba y hacia abajo por las irregularidades de la superficie del preparado. . pero no de organelos celulares. en el cual la profundidad es mayor cuanto mas grueso es el corte de tejido. Al chocar los electrones contra cada punto de la superficie metálica los electrones se dispersan y se emplean para controlar la intensidad de un segundo haz que se mueve sincrónicamente con el haz primario y forma una imagen sobre una pantalla de televisión. Por debajo de la superficie del preparado. La información obtenida durante estos movimientos se registra en una computadora. De esta forma se produce una imagen completa y muy aumentada de la muestra. Mientras que ésta se desplaza por sobre el preparado. la resolución alcanzada por el MEB es menor que la obtenida por el MET (10nm con un aumento efectivo de 20. Con este instrumento es posible captar la estructura de la superficie de un preparado hasta el nivel atómico. Este microscopio proporciona una gran profundidad de foco. se seca y se cubre con una fina película de un metal pesado.000 veces). Se aplica luego un contacto eléctrico en el extremo de la sonda. Este microscopio es muy semejante al MET pero presenta dos diferencias fundamentales: posee un haz de electrones móvil que recorre la muestra en áreas determinadas y utiliza la emisión secundaria de electrones para la formación de la imagen. que al mismo tiempo barre por sobre la superficie del preparado. la cual produce una imagen de la superficie del preparado. El principio se basa en colocar una sonda delgada a una distancia de hasta 1 nm. La MTB permite entre otros adelantos obtener la imagen de la molécula del ADN. Si después se analizan las fotografías mediante un estereoscopio se obtiene un notable efecto tridimensional. De este modo se crea un túnel de electrones a través de la hendidura formada entre el preparado y la sonda. Este tipo de microscopía permite observar cortes de tejido más gruesos ya que el mismo preparado es fotografiado desde dos ángulos diferentes. lo que permite obtener excelentes imágenes tridimensionales. - Microscopía electrónica de túnel de barrido (MTB). Su utilización esta limitada debido a que el preparado debe ser un conductor eléctrico. - Microscopía estereoelectrónica. Esto implica la necesidad de utilizar cortes de tejidos muy delgados. - Microscopía electrónica de barrido (MEB).

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