Practica N° 3

Pruebas Microbiológicas más Usadas en el Control Microbiológico de los
Alimentos
I. Introducción

 Expresión microbiológica de la población microbiana de los alimentos

La población microbiana de los alimentos se expresa por un entero seguido
de un decimal y multiplicado por 10 elevado a una potencia. Esa expresión
en lo posible debe provenir de un promedio de resultados.
Esta población está dada en número de colonias o microorganismos por
gramo de muestra si la muestra es sólida o por mililitro si es líquida. Cuando
la población es cero o cercana a cero se expresa como nulo y cuando la
población está entre cero y uno se dice menor que uno.
Cuando el análisis es cualitativo, es decir se investiga la presencia o
ausencia de un microorganismo en un alimento y no la cuantía, el resultado
se expresa como negativo o positivo, respectivamente.

 Microorganismos indicadores

La calidad microbiológica de los alimentos es fundamental porque influye
en su conservación y vida de anaquel y, sobre todo, porque los
microorganismos presentes en ellos, pueden ser causantes de enfermedades
transmitidas por alimentos.

Los Microorganismos indicadores son organismos (o grupos) que advierten
oportunamente de un manejo inadecuado o contaminación que incrementan
el riesgo de presencia de microorganismos patógenos en alimentos. Además
de que su detección en el laboratorio es más sencilla, rápida y/o económica,
los microorganismos indicadores permiten un enfoque de prevención de
riesgos, puesto que advierten manejo inadecuado y/o contaminación.

Estos nos indican por ejemplo un mal procesamiento, deficiencia de
almacenaje, condiciones higiénicas inadecuadas, contaminación fecal,
tratamiento térmico inadecuado, etc. La presencia de estos microrganismos
en cierto número se considera como índice que el alimento fue tratado,
conservado y manipulado en condiciones inadecuados que permiten la
llegada y proliferación de microrganismos patógenos.

Indicadores de condiciones de manejo o de eficiencia de proceso:mesófilos aerobios (o cuenta total) cuenta de hongos y levaduras cuenta de Coliformes totales 3. Cl.  Microorganismos indicadores de higiene inadecuada Por lo general los alimentos que contienen partes o sus constituyentes en descomposición. quesos y otros productos lácteos. productos fermentados. encurtidos. Es necesario advertir que existen casos en donde los recuentos altos carecen de significado como es el caso de las salchichas. coli enterococos. presentan cargas elevadas alrededor de 106 a 108 microorganismos por gramo o mililitro Las materias primas contaminadas. III. manteniendo el enfoque preventivo. y sirven para evaluar tanto la seguridad que ofrecen los alimentos en cuanto a microorganismos y sus toxinas como su calidad microbiológica. . controlar o mejorar el alimento. E. Objetivos  Enseñar al estudiante el significado y las operaciones a seguir en la ejecución de la prueba microbiológica más utilizadas en el control microbiológico de los alimentos. Indicadores de higiene inadecuada 2. Perfringens La selección de indicadores en un alimento depende fundamentalmente de los riesgos implicados y de lo que se requiera saber para liberar. Revisión literaria Se hace una amplia utilización de grupos o especies de microorganismos cuya enumeración o recuento se realiza con mayor facilidad y cuya presencia en los alimentos en determinado número indica que estos productos estuvieron expuestos a condiciones que pudieran haber introducido organismos peligrosos y/o permitido la multiplicación de especies infecciosas y/o toxigénicas. Los recuentos altos podrían indicar que el producto va a alterarse pronto. limpias y desinfectadas incorrectamente o condiciones inadecuadas tiempo/temperatura durante la producción o conservación de alimentos o una combinación de estas circunstancias se expresan en recuento alto de gérmenes viables. donde es natural una gran multiplicación de lso microorganismo ya que tiene lugar una fermentación o maduración del producto. II. Los principales microorganismos indicadores en alimentos son: 1. Los grupos o especies utilizados con estos fines se denominan "Microorganismos Indicadores". Indicadores de contaminación fecal: Coliformes fecales.

La mayoría de los alimentos industrializados y/o listos para el consumo (excepto por ejemplo los productos fermentados) deben ser considerados como indeseables para el consumo. Esta cualidad se deriva de la propia definición del grupo. aun cuando estos microorganismos no sean conocidos como patógenos y no hayan alterado de forma apreciable los caracteres organolépticos del alimento. el medio más utilizado mundialmente es el agar para recuento en placa o agar tripona-glucosa-extracto de levadura. El principal objetivo de la utilización de microorganismos como indicadores de prácticas no sanitarias es revelar defecto de tratamiento que llevan consigo un peligro potencial que no está necesariamente presente en la muestra particular examinada. Los indicadores de calidad sanitaria más utilizados son:  Determinación de microorganismos a 30 ºC  Determinación de Coliformes  Determinación de Coliformes fecales (actualmente más conocido como termotolerantes)  Determinación de Escherichia coli  Determinación de hongos filamentosos  Determinación de levaduras viables  Determinación de enterobacterias totales  Determinación de enterococos o estreptococos fecales  Prueba de esterilidad Microorganismos indicadores Microorganismos a 30ºC Comúnmente este indicador es conocido como microorganismos aerobios mesófilos. Se incluyen en él a todas las bacterias.Los microorganismos indicadores habitualmente no responden a criterios de agrupación taxonómica. bajo las condiciones en las cuales se ejecuta el ensayo con crecimiento a temperatura óptima para los mesófilos. Las colonias obtenidas en el medio sólido se cuentan después de la incubación en aerobios a 30C por 72 horas. Los microorganismos que forman parte de este grupo son muy heterogéneos. Se definen más bien en función de ciertas características ecológicas y fisiológicas que apoyan o justifican el valor aplicativo que se les intenta conferir. cuando tienen un gran número de microorganismos. mohos y levaduras que en aerobios muestran capacidad para formar colonias visibles. pero que es probable pueda encontrarse en muestras paralelas. En general se utiliza un medio de cultivo rico en nutrientes sin sustancias inhibidoras ni indicadores. . Pueden darse varias razones que justifiquen esta conducta.

En la materia fecal alcanzan cifras de 106 a 109 ufc/g.Organismos Coliformes Por razones prácticas se mantienen agrupadas bajo la denominación de grupo Coliformes. aeróbicos o facultativamente anaeróbicos. pues actualmente ha perdido vigencia como indicador de contaminación fecal. Se definen como bacilos Gram negativos no formadores de esporas. etc. Mohos y Levaduras . en los productos lácteos y en otros alimentos. Escherichia coli Es el representante genuino de origen fecal por lo que es el indicador más confiable de contaminación fecal en alimentos. La determinación cuantitativa de enterococos es bastante discutida. Klebsiella. Ellos pueden indicar en productos procesados falta de higiene en la fabricación. E. Su hábitat natural es el contenido intestinal del hombre y animales superiores. Las bacterias de este grupo consisten en células esféricas u ovoides notablemente más robustas que los micrococos y estafilococos. ya que además de encontrarse en las heces de mamíferos. Enterococos Designaciones como estreptococos fecales y estreptococos del grupo D de Lancenfield se emplearon como sinónimos de enterococos. son muy resistentes al calor. Debido a su capacidad de sobrevivencia y a su potencial para desarrollarse en la materia orgánica. principalmente. implica prácticas inadecuadas de higiene o exposición del alimento a condiciones que pudieran haber permitido la multiplicación de estas bacterias. a la desecación a las bajas temperaturas. Enterobacter y Citrobacter y otras especies de enterobacterias que sean capaces de fermentar la lactosa con producción de gas. coli es un germen cuyo hábitat natural es al tracto entérico del hombre y de los animales de sangre caliente. Con excepción de E. La presencia de gran número de enterococos en los alimentos. excepto en los fermentados por cepas específicas de estos microorganismos. coli ninguno de ellos indican necesariamente contaminación fecal ya que pueden encontrarse en el suelo y en los vegetales y de allí tener acceso a los alimentos. Además un número elevado puede indicar la posible presencia de ciertos patógenos. dispuestos en pares o cadenas cortas. a especies de los géneros Escherichia. pueden recuperarse de una diversidad de sustratos extraintestinales. que fermentan la lactosa con formación de gas dentro de las 48 horas a 35C. Por ello la presencia de este microorganismo en un alimento indica generalmente una contaminación directa o indirecta de origen fecal. Los alimentos no son la excepción y el hallazgo de Coliformes puede estar determinado por una contaminación seguida o no de un activo desarrollo. también se encuentran ampliamente distribuido en la naturaleza. procesamiento inadecuado. en los moluscos. contaminación post-proceso. Es el indicador clásico de la posible presencia de patógenos entéricos en el agua. y a los detergentes y desinfectantes.

mecheros  Refresco de cocona 2. Calcular el número de bacterias viables por ml o gr de muestra. Mientras las primeras pueden proliferar en la masa interna del alimento (sólido como los quesos.1 – 9.Las levaduras y los mohos crecen más lentamente que las bacterias en los alimentos no ácidos que conservan humedad y por ello pocas veces determinan problemas en tales alimentos. Fernández Escarpín) IV. en los alimentos ácidos y en los de baja actividad acuosa. guardando siempre la relación de decimo entre las diluciones contiguas. Algunos mohos muestran una especial resistencia al calor. en productos deshidratados cuyo almacenamiento se realiza en condiciones inadecuadas.37 x106 ufc/ml V. crecen con mayor rapidez que las bacterias. o líquidos como los jugos de frutas). Métodos  La forma de operar y clacular el recuentro bacteriano es el siguiente: se realizó la siembra por incorporación . puede ser 2 o más de 2 Por ejemplo: 5. tubos de ensayo. luego fue solidificado y se adiciono una capa fina de medio de cultivo de más o menos 5 ml (capa selladora). debido a las esporas que producen. Resultados Luego de la siembra por incorporación se obtuvieron: . (Microbiología e inocuidad de los alimentos. 1era edición . Sin embargo. que se someten a almacenamiento largo. Materiales  Placa Petri.E. estufa de incubación. los mohos se limitan de ordinario a las superficies. visiblemente distintivos sin necesidad de aumento alguno. frascos Erlenmeyer  Agar recuentro. En general este indicador es utilizado en productos no perecederos. se mezcló en placas estériles 1ml de la serie de diluciones con 15 ml del medio de cultivo conservado a más o menos 50° C . La expresión del desarrollo de las levaduras en los alimentos se distingue del observado por los mohos. Luego se incubo a 37°C por 48 horas. varía entre 1. el resultado debe expresarse como : N= a x bn Donde a. solución salina peptonada.  Después contar el número de colonias que se han desarrollado en las placas Petri que contiene entre 30-300 colonias. Materiales y métodos 1. es igual a 10 n.9 b. Además existe el peligro potencial de producción de micotoxina por parte de los mohos.

 En los resultados no alcanzaron los límites de entre 30 – 300 por lo que se tuvo que escoger el valor más próximo a 30 y obtener el número de bacterias viables en el refresco de maracuyá  El refresco de maracuyá se puede decir que no tuvo una gran cantidad de microorganismos como se esperaba que tuviera ya que solo se encontraron en las palcas entre 2 – 5 colonias de microorganismos. Discusiones  Los resultados son correctos ya que los refrescos ofrecidos en la calle siempre tienen una contaminación o presencia de microorganismos ya que no se tienen las pautas necesarias para que el refresco este exento de microorganismo. Reporte otros métodos de recuentos bacterianos indicando fundamentos. (Muestras líquidas u homogeneizadas). Se trata de conocer el número total de microorganismos presentes en el alimento. Conclusiones  Se conoció el significado y las operaciones a seguir en la ejecución de la prueba microbiológica (Microorganismos indicadores de higiene inadecuada)  El refresco de maracuyá examinado presento un numero de 5x104 ufc/ml por lo que hubo una higiene inadecuada en su elaboración pero que no puede tener un efecto en la salud al consumirlo. operación y precisión Recuento de microorganismos viables totales. Este número no guarda relación con el de microorganismos patógenos por lo que no puede usarse como índice de su presencia y sólo debe considerarse un indicador de las características higiénicas generales del alimento. VII. Pero este resultado es mínimo con lo que realmente se esperaba. .  Placa 3 con fd = 103 se obtuvieron 2 colonias  Placa 4 con fd = 104 se obtuvieron 5 colonias  Placa 5 con fd = 105 se obtuvieron 3 colonias N = 5 x 104 N= 5 x 104 ufc/ ml VI. Por lo que es apto para el consumo. Cuestionarios 1.

puede ser de interés hacer recuentos de anaerobios totales. psicrófilos) los microorganismos analizados serán miembros de poblaciones diferentes. Contaje de Microcolonias al microscopio: Se añade un pequeño volumen de agar- cultivo a un porta y se incuba para seguir la formación de Microcolonias al microscopio.  Determinación del número más probable. Gotitas de agar: Se hacen diluciones de la muestra (solución madre) y se depositan gotitas de 10 ml en una placa Petri (gotitas de cultivo + agar). lo que facilita el recuento (la epifluorescencia se puede provocar con naranja de acridina que tiñe específicamente los ácidos nucleicos). El resultado es función de una serie de factores como son el método de muestreo. e. En ciertos casos.  Contaje microscópico directo. el tipo de microorganismo. d. b. Microcolonias en DEFT(técnica de epifluorescencia directa en filtro). Son filtros con un poro de 0. Se examina el crecimiento de las colonias en las gotitas tras la incubación. aunque hay que considerar que los cultivos en masa son letales para la flora psicotrofa. La muestra puede haber sido procesada para epifluorescencia previamente. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una placa del medio de cultivo apropiado. Se han desarrollado técnicas que hacen posible la automatización del proceso. Cada bacteria viable formará una colonia. en ciertas situaciones (alimentos envasados al vacío). Contaje de Placa: Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del alimento que se analiza. Hay cuatro técnicas biológicas básicas técnicas de recuento de viables:  Contaje en Placa Standard (Standard Plate Count). c. La detección de los microorganismos ha de hacerse mediante microscopía de fluorescencia o por cualquier otro método de medida de la epifluorescencia.  Métodos basados en la reducción de colorantes por viables. En esta técnica las bacterias se filtran para retenerlas en una membrana apropiada que posteriormente se trata con un agente fluorescente (como la naranja de acridina) para teñir las células bacterianas (se somete el filtrado a un tratamiento previo con detergentes para destruir las células somáticas). el tipo de alimento y las características del medio de cultivo. a. medio limitado en nutrientes para medida de la flora no láctica de alimentos fermentados) y de las condiciones de incubación (mesófilos. . el plaqueo puede hacerse en una placa normal o por medio de un plaqueador en espiral que va depositando concentraciones progresivamente más diluidas de la muestra. Los cultivos pueden hacerse tanto en masa como en superficie. En general se investiga la presencia de microorganismos aerobios o aerotolerantes (anaerobios facultativos). aunque.45 mm que retienen las bacterias. Filtros de membrana: utilizados cuando el número de bacterias es bajo. las membranas se incuban para producir colonias que son más fácilmente detectables. Dependiendo de las características del medio utilizado (medio rico.

etc. Tubos rodantes: son tubos herméticamente cerrados en los que haciéndolos girar se forma una fina capa de agua. al reducirse cambian de color y esto es medible. Tras la incubación se hace el recuento. Utiles para recuento de anaerobios. Los diferentes tipos de microorganismos metabolizan los substratos de forma diferente y. Métodos físicos para la detención de microorganismos. Usado en medios líquidos (lácteos).) lo que permite identificar las bacterias durante su paso por el detector. El método es popular aunque poco exacto.107 células por ml-1. j. se coloca un volumen determinado y se recuentan las bacterias. se ha usado la Microcalorimetria para poder identificar las especies presentes en un alimento: usando un medio de cultivo con una composición definida de azúcares pueden llegar a identificarse diferentes tipos de bacterias lácticas mediante los termogramas de su metabolización de los azúcares presentes en el medio. a. por ello. Citometria de flujo: Método basado en hacer pasar una a una las células de una suspensión por un sistema de detección. Métodos basados en la reducción de colorantes: Usando azul de metileno o resazurina. Microcalorimetria: Estudio de los pequeños cambios de calor producidos como consecuencia del anabolismo de nutrientes. dispersión de luz. Colorantes reducidos por las bacterias. La . Contaje microscópico directo: Usando cámaras de cuenta.f.  Nucleasas Termoestable: S. El método se basa en detectar estos cambios y la cantidad de microorganismos se expresa como función del tiempo que tarda el cultivo en alcanzar unos valores de impedancia correspondientes a 106 . este sistema puede contener un detector capaz de medir diferentes parámetros (diferentes tipos de fluorescencia. b. Films secos (Petrifilm): Son películas deshidratadas de medios de cultivos generales o selectivos en las que se deposita 1 ml de la muestra que rehidrata el medio. Impedancia: Es la resistencia aparente presentada a la corriente alterna. (IDT: Imdepedance Detection Time). Es necesario que el medio de cultivo permite un crecimiento homogéneo sin «escalones». c. Método del número más probable: Basado en series de diluciones y cálculo estadístico del número de bacterias presentes en las diluciones más altas. g. En un cultivo los microorganismos alteran las substratos cambiando su conductividad eléctrica y esto varía la impedancia. i. absorbancia. Se puede hacer con 3 ó 5 tubos. Métodos químicos de detección de microorganismos. h. aureus produce una nucleasas termoestable con mayor rapidez y en mayor cantidad que la enterotoxina responsable de la intoxicación.

Métodos inmunológicos. Normalmente se usan antisueros que detectan flagelos (responsables de las formas móviles de Salmonella y otras bacterias)  Anticuerpo fluorescente: Se utiliza anticuerpo marcado con una molécula fluorescente o un segundo anticuerpo que reconozca el primero. El método detecta células viables y no-viables.  PCR: Método para detectar número extremadamente bajos de microorganismos con una cierta rapidez basado de la producción de copias de genes específicos de un microorganismo en cuestión. endonucleasa puede detectarse experimentalmente como un índice de la presencia de S.  Medida de ATP: Se detecta la presencia de ATP usando luciferasa. el antisuero no se añade al alimento sino que se efectúa un paso previo de enriquecimiento del cultivo y de selección para evitar falsos positivos. aureus incluso en concentraciones demasiado bajas para que hayan producido unas cantidades detectables de enterotoxina.  Serología de enriquecimiento: En este procedimiento especialmente desarrollado para la detección de Salmonella.  Substratos Fluoro y Cromogénicos: Se añaden como aditivos a los medios de cultivos para facilitar y acelerar la detección de los microorganismos. Se pueden usar antisueros complejos en el primer anticuerpo y de esta forma detectar cualquier tipo de Salmonella sin necesidad de aislarlas. Es muy rápido. aunque hay algunos problemas experimentales que hacen que la técnica sea controvertida.  Lisado de Limulus: Usado para detección de endotoxinas (derivadas del lipopolisacaridos LPS de las bacterias Gram negativas).  Sondas de ácidos nucleicos: Sirven para identificar microorganismo desconocidos por medio de Southern.2 de Salmonella: Sistema con dos cámaras de agar blando. Puede detectar 300 células de E. El método también se ha usado para Clostridiums aunque su mayor aplicación ha sido en Salmonella donde es muy conveniente por la sensibilidad y rapidez. Una de las cámaras (la de siembra) contiene un medio selectivo para Salmonella. las bacterias . coli.  Radiometría: Medida de la transformación de un substrato con 14C en 14CO2: el tiempo necesario para detectar el 14CO2 es inversamente proporcional a la cantidad de microorganismos presente. Se basa en la aglutinación de extractos de amibocito de sangre de Limulus (cangrejo de mar) producido por cantidades del orden de picogramos de LPS.  Test 1 .

se trata con el antisuero correspondiente y la interacción se detecta mediante una actividad marcadora (peroxidesa) unida al anticuerpo en cuestión o a un segundo anticuerpo de revelado. Las muestras se recogen en seco o en húmedo y se depositan sobre medios de cultivo líquido (generales o de enriquecimiento). coli. toxinas de C. Definir que es un factor de dilución El factor de dilución es el número total de volúmenes al que se lleva un volumen dado de muestra original. Se realiza o bien directamente en el alimento humedecido e incubado a 22ºC o bien mediante diluciones sucesivas y siembra en placa en superficie. que es más rápido que el de los mohos. 2.  Difusión en gel: Método de Ouchterlony para detección de antígenos. Algunas veces es necesario añadir agentes neutralizantes para eliminar el efecto de detergentes que han sido utilizados para limpiar la superficie. Examen de superficies. Recuento de mohos y levaduras. enterotoxina de E.  Radioinmunoensayo: se basa en el marcaje con un radioisótopo de un antígeno determinado (toxina producida por una bactería patógena) y su posterior detección por anticuerpos específicos fijados sobre un soporte sólido. En otros términos. El método más clásico de obtención de muestra es el uso de torundas de algodón o de alginato cálcico. Es necesario añadir agentes antibacterianos al medio de cultivo para evitar el crecimiento de las bacterias. micotoxinas. el factor de dilución también corresponde a la división de la concentración de la muestra original sobre la concentración de la muestra diluida 3. Definir que es un microorganismo indicador .  ELISA: El método es similar al radioinmunoensayo: el antígeno se fija en un soporte sólido. Toxinas de S aureus. El método se ha usado para detección de Salmonellas. móviles de este género atraviesan la cámara selectiva y pasan a la no selectiva pero portadora de un anticuerpo específico por lo que se forma una banda de aglutinación cuando entre Salmonella. botulinum. En algunos casos se usan otros métodos como el contacto con placa o la jeringa de agar. Métodos dirigidos a detectar y medir los números de microorganismos presentes en superficies contaminadas.

84x104 ufc/g N3 = 28x103 = 2.8x104 ufc/g N3 = 6x104 = 6x104 ufc/g El resultado es: N = 2. mala higiene. Infin.8x105 ufc/ml N°2 . ¿Qué significa los límites de 30 – 300? Significan los limites en los que se deben contar las colonias para determinar el número de unidades formadores de colonias en un alimento.08x104 ufc/g N2 = 284x102 = 2. condiciones higiénicas inadecuadas. 5.8x104 El resultado es: N = 2. -2 458 Infin.22x105 ufc/ml N3 = 222x103 = 2. 4. se obtuvo el siguiente resultados de gérmenes aerobicos mesófilos viables (considere que analizo 18 g de muestra) Lecturas Dil N°1 N°2 S.84x104 ufc/g ufc/g 6. etc . Son los microorganismos que nos indican el mal procesamiento. deficiencia del almacenaje. La presencia de estos microorganismos se considera que el alimento fue tratado. contaminación fecal. ya sea para ver mal procesamiento. Infin. conservado y manipulado en condiciones inadecuadas . -1 629 Infin. de agua N°1 El resultado es: N = 2. -2 308 284 -3 28 76 -4 04 6 N°1 N°2 N2 = 308x102 = 3.O Infin. El análisis microbiológico de una muestra de harina de maíz. -3 222 531 -4 38 98 -5 3 11 Se pide: a) El número de microorganismos por ml.22x105 ufc/ml N4 = 38x104 = 3. Del análisis micorbioligico de na muestra de agua se ha obtenido el siguiente resultado de gérmenes aerobicos mesófilos viables (GAMV) Lecturas Dil N°1 N°2 M. etc.M Infin.

N3 = 98x104 = 9.1x106 ufc/ml = 1.04x106 ufc/ml .98x106 + 1.1x106/2 N4 = 11x105 = 1.8x105 ufc/ml El resultado es = 0.

Hace que se formas mas colonias por lo que es difícil de contarlas como tal ejemplo las muestras de la lectura N°2 “Año de la Inversión para el Desarrollo Rural y la Seguridad Alimentaria” Universidad Nacional San Martin Facultad: Escuela Profesional De Ingeniería Agroindustrial Localidad: Tarapoto Departamento: San Martin . b) Fundamentar el porqué de la elección de los datos para los cálculos Se eligieron esa lecturas ya que en si no están en el límite de 30-300 pero los resultados indican que si hay una formación de colonias de microorganismos que están en el agua y por ende no son aptos para su consumo así que se eligen los valor cercanos a este límite de 30-300 para obtener los resultados. c) Discutir acerca de la importancia del agitado de la solución La importancia del agitado en las diluciones es que facilita el crecimiento de los microorganismos en las palcas Petri.

pdf .pdf  http://www. Título: Pruebas Microbiológicas más Usadas en el Control Microbiológico de los Alimentos Materia: Microbiología Agroindustrial Docente encargado: Ing. Schlegel  http://www.analizacalidad. Fernández Escarpín. Referencias bibliografía  Microbilogia General – Hans G. 1era edición  http://www.cu/index.um. Microbiología e inocuidad de los alimentos. Nelson García Garay Alumno: Jhimmy Saucedo Cercado Tarapoto – 2013 VIII.com/docftp/fi168arf2005-1.ecured.es/nutbro/docs/hica/Microorganismos_marcadores.php/Microbiolog%C3%ADa_de_los_alimentos  E.