ACTIVIDAD ENZIMATICA

OBJETIVOS:
 Comprobar la acción de la temperatura, el pH y sustancias inhibidoras sobre la
actividad enzimática.
 Determinar la especificidad enzimática.

I.- FUNDAMENTO TEORICO
Los enzimas son catalizadores muy potentes y eficaces, químicamente son proteínas.
Como catalizadores, los enzimas actúan en pequeña cantidad y se recuperan indefinidamente.
No llevan a cabo reacciones que sean energéticamente desfavorables, no modifican el sentido
de los equilibrios químicos, sino que aceleran su consecución. Ello hace posible que en
condiciones fisiológicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requerirían condiciones
extremas de presión, temperatura o pH.
Las enzimas están formadas por dos tipos de aminoácidos: aminoácidos estructurales
(forman la mayor parte de la enzima y le confieren su estructura terciaria) y aminoácidos
catalíticos (conforman el centro activo de la enzima, donde se une el sustrato covalentemente
para comenzar la reacción enzimática).
Prácticamente todas las reacciones químicas que tienen lugar en los seres vivos están
catalizadas por enzimas. Los enzimas son catalizadores específicos: cada enzima cataliza un
solo tipo de reacción, y casi siempre actúa sobre un único sustrato o sobre un grupo muy
reducido de ellos. En una reacción catalizada por un enzima:
• La sustancia sobre la que actúa el enzima se llama sustrato.
• El sustrato se une a una región concreta del enzima, llamado centro activo. El centro activo
comprende (1) un sitio de unión formado por los aminoácidos que están en contacto directo
con el sustrato y (2) un sitio catalítico, formado por los aminoácidos directamente implicados
en el mecanismo de la reacción
• Una vez formados los productos el enzima puede comenzar un nuevo ciclo de reacción.

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1. CLASIFICACION El Comité de Enzimas (EC) de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular clasifica a las enzimas en 6 clases. 2..Unión al centro 3. de acuerdo con del tipo de reacción que catalizan: • Oxidorreductasas: Aceleran las reacciones de oxidación-reducción. • Ligasas o sintetasas: Catalizan reacciones de formación de enlaces dependientes del rompimiento de enlaces de alta energía. • Isomerasas: Aceleran reacciones de cambio de posición de átomos. Así. que rompe los enlaces amida de proteínas y péptidos de muy diverso tipo. PROPIEDADES. 2 .. mientras que la maltosa y la isomaltosa son sustratos análogos. para el enzima sacarasa. Sin embargo hay distintos grados de especificidad. • Hidrolasas: Estas aceleran las reacciones en las que una sustancia se rompe en componentes más pequeños por reacción con moléculas de agua. 1. El enzima actúa con máxima eficacia sobre el sustrato natural y con menor eficacia sobre los sustratos análogos. • Transferasas: Participan en la transferencia de grupos (amino o fosfato.. • Liasas: Generan o hacen desaparecer dobles enlaces en forma no oxidativa. por ejemplo).Formación de sustrato activo productos Ciclo de reacción de las enzimas Los enzimas. Entre los enzimas poco específicos están las proteasas digestivas como la quimotripsina. a diferencia de los catalizadores inorgánicos catalizan reacciones específicas. la sacarosa es su sustrato natural.El enzima y su 2. El enzima sacarasa es muy específico: rompe el enlace b-glucosídico de la sacarosa o de compuestos muy similares.

Como la conformación de las proteínas depende. LA TEMPERATURA 3 . Sólo hacen que este equilibrio se alcance más rápidamente. Efectos del pH sobre la actividad enzimática 3. cambiando el mecanismo de reacción. los seres vivos han desarrollado sistemas más o menos complejos para mantener estable el ph intracelular: Los amortiguadores fisiológicos.  Pueden estar sujetas a regulación en su actividad. El pH Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH. etc. Según el pH del medio.2. la regulación alostérica. Como ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalización de la proteína.  Son eficientes en pequeñas cantidades: la enzima no sufre cambios al catalizar las reacciones  químicas. Desviaciones de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad. tiol -SH.  Son altamente específicas para sus sustratos y para una reacción. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA: Los factores que influyen de manera más directa sobre la actividad de un enzima son: 3.  Aceleran las reacciones químicas sin sufrir modificación. la pepsina gástrica tiene un pH óptimo de 2. negativa o neutra. en parte. La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Este es el llamado pH óptimo. Por ejemplo.  No alteran las concentraciones de equilibrio de la reacción. estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva. amino -NH2.1. habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica. imidazol.  No modifican el carácter exotérmico o endotérmico de la reacción 3.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. la ureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10. Así. de sus cargas eléctricas. de manera que una pequeña cantidad de enzima puede catalizar repetidas veces una reacción.

En general. mercurio y arsénico inhiben enzimas que tienen en su centro activo grupos – SH libres.  Irreversible: Ciertas sustancias inhiben a las enzimas en forma irreversible. la velocidad de reacción se duplica. el cual no experimenta su transformación posterior en producto.  Acompetitiva: el I se combina con el complejo enzimasustrato  para formar un complejo inactivo enzima-sustratoinhibidor. al ser proteínas. Es reversible. y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. se empiezan a desnaturalizar por el calor. LOS INHIBIDORES El efecto que ocasionan los inhibidores sobre la actividad enzimática puede ser:  Reversible:  Competitiva: el S y el I compiten por el sitio activo de la enzima. Efectos de la temperatura sobre la actividad enzimática 3. sea fijándose permanentemente de manera covalente o desnaturalizándolas. Entre estos están ciertos metales como el plomo.3. el aumento de velocidad de la reacción debido a la temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida a la desnaturalización térmica.  No competitiva: El I se fija a la enzima en un sitio de la molécula que no es el activo. 4 . El resultado de la competencia depende de cuántas moléculas de cada tipo hay. Puede combinarse con la enzima libre o con el complejo enzima-sustrato. los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas: por cada 10ºC de incremento. pero no por la cantidad de sustrato. La temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llama temperatura óptima Por encima de esta temperatura. a partir de cierta temperatura. Sin embargo.

etc. Cuando los cofactores y las coenzimas se encuentran unidos covalentemente al enzima se llaman grupos prostéticos.Cu2+. b) El substrato debe tener habitualmente algún otro grupo funcional. es decir.4.Ca2+. un grupo de unión. LA ESPECIFICIDAD ENZIMATICA. La forma catalíticamente activa del enzima. Cuando el cofactor es una molécula orgánica se llama coenzima. Muchos de estas coenzimas se sintetizan a partir de vitaminas. La estructura tridimensional de este sitio activo. 3. La parte proteica de un holoenzima (inactiva) se llama apoenzima.5.Co . Mg++.K+. donde solo puede entrar un determinado sustrato (ni siquiera sus isómeros) es lo que determina la especificidad de las 5 . Mn++. Casi un tercio de los enzimas conocidos requieren cofactores. Estos son resistentes al calor mientras que las proteínas generalmente no lo son. un enzima requiere para su función la presencia de sustancias no proteicas que colaboran en la catálisis: los cofactores. que se une a la enzima y ubica en posición a la molécula de substrato de modo que el enlace susceptible se disponga apropiadamente en relación al sitio activo de la enzima. LOS COFACTORES A veces. Dos características estructurales determinan la especificidad de una enzima por su substrato: a) El substrato debe poseer el enlace químico específico o unión. Zn++. Fe3+. Inhibidor no competitivo Inhibidor competitivo Efecto de los inhibidores sobre la actividad enzimática 3. que puede ser atacado por la enzima.Fe2+. el enzima unido a su grupo prostético. Los cofactores pueden ser iones inorgánicos como el Fe++. se llama holoenzima.

el conjunto de los cuales constituyen la esencia del metabolismo. Influyendo en la velocidad de las reacciones metabólicas. Con participación de las enzimas se verifican numerosos procesos químicos. El acoplamiento es tal que E. Fisher (1894) enunció: "el sustrato se adapta al centro activo o catalítico de una enzima como una llave a una cerradura" Las enzimas son esenciales para la vida ya que.enzimas. provocada por una sobreproducción o subproducción. Una mal función en una enzima. Especificidad enzimática II. etc. mutación. deleción. puede provocar enfermedades como la fenilcetonuria. FUNDAMENTOS QUIMICOS: 6 . de otra forma. los enzimas son capaces de regular efectivamente los procesos de vitalidad.. las reacciones en las células se darían con poca rapidez.

y el enzima se inactiva. electrostáticos. necesaria para la manifestación de su actividad catalítica. Con cierto aumento de la temperatura del medio ocurre aceleración de la reacción a consecuencia de la activación de las moléculas de sustrato. participan en el mantenimiento de la conformación de la molécula proteínica necesaria para la formación de los centros catalíticos del enzima y favorecen también a su combinación con el sustrato. en donde están dadas las condiciones favorables para el mantenimiento de la conformación funcionalmente activa de la molécula. A los valores de pH extremo los enzimas se desnaturalizan. Mientras que si baja la temperatura en la enzima solo se inactiva su actividad catalítica. etc. hidrófobos. Los grupos amino y carboxilo de los resto de aminoácidos. E+S ES E+P El sustrato se une al enzima a través de numerosas interacciones débiles como son: puentes de hidrógeno. Cofactor. Un pequeño aumento de la temperatura conduce al debilitamiento de los enlaces que mantienen la conformación de la molécula de una enzima. Algunas enzimas actúan con la ayuda de estructuras no proteicas. INFLUENCIA DEL CAMBIO DE TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA: La estructura terciaria de una proteína es muy sensible a los cambios de temperatura. A un pH distinto se altera la ionización de los grupos correspondiente. ionizados a una magnitud de pH determinada. en un lugar específico. En función de su naturaleza se denominan: 1. y como resultado se rompen los enlaces que aseguran la formación de los centros catalíticos. se mantiene gracias a fuerzas no covalentes. 7 .1. La temperatura óptima para la acción de enzimas es la temperatura del cuerpo de los animales que oscilan en el intervalo de 36 a 41 °C. ESPECIFICIDAD ENZIMATICA: La acción enzimática se caracteriza por la formación de un complejo que representa el estado de transición. 2. constituida por una serie de aminoácidos que interaccionan con el sustrato. Este centro es una pequeña porción del enzima. 3. Cuando se trata de iones o moléculas inorgánicas. INFLUENCIA DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Para cada enzima existe un pH óptimo. (centro activo).

INFLUENCIA DE LOS INHIBIDORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA: Determinadas sustancias se comportan como inhibidores enzimáticos porque disminuyen e incluso anulan la velocidad de la reacción catalizada. o Inhibidores no competitivos: se unen a la enzima por un lugar distinto al centro activo y provocan cambios en este que le impiden ejercer su acción sobre el sustrato. la enzima no puede actuar. se puede señalar que muchas vitaminas funcionan como coenzimas.  Reversibles: la unión de la enzima y el inhibidor es temporal. 8 . Impide el normal funcionamiento de la enzima.2. solo mientras dura. A su vez estos inhibidores pueden ser de dos tipos: o inhibidores competitivos: se unen a la enzima en su centro activo. Los inhibidores son de dos tipos:  Irreversibles (venenos): son compuestos que se unen de forma permanente (irreversiblemente) a determinados grupos del centro activo de un enzima y anulan su capacidad catalítica. y realmente las deficiencias producidas por la falta de vitaminas responde más bien a que no se puede sintetizar un determinado enzima en el que la vitamina es el coenzima. A B Coenzimas (A) Cofactores (B) 4. Cuando es una molécula orgánica. Al estar ocupado el centro activo. Coenzima.

11.. 2. PREPARACION DE REACTIVOS: 1.3%: Pesar 0.CLORURO DE SODIO AL 1%: Pesar 1 g de Cloruro de Sodio y diluir en 100 ml de agua destilada 8. SOLUCIÓN DE FEHLING A: Disuelva 34. 7.6 g de Sulfato de Cobre pentahidratado en agua destilada y diluya a 500 ml. 3. CARBONATO DE SODIO 0. SALIVA DILUIDA (Amilasa): Se enjuaga la boca con 25 ml de agua destilada medidos en un cilindro graduado y se trasvasa a un beacker. 9 .III.3 g de Cloruro de sodio y diluir en 100 ml de agua destilada. 14. SOLUCIÓN AMORTIGUADORA pH 9: Se mezclan 80 ml de Solución A con 20 ml de Solución B.. KNaC4H4O6) y 50 g de Hidróxido de Sodio ( NaOH ) en agua destilada y diluya a 500 ml. 13..2 M (SOLUCIÓN A) 10. 9. SOLUCIÓN AMORTIGUADORA pH 7: Se mezclan 80 ml de Solución A con 80 ml de Solución B.. 5. En esta solución diluir 2 g de almidón soluble.LEVADURA DE HACER PAN (Sacarasa): Pesar 10 g de Levadura granulada de hacer pan y diluir en 100 ml de agua destilada. ACIDO CITRICO 0. 12.SACAROSA AL 2%: Pesar 2 g de Sacarosa y diluir en 100 ml de agua destilada 6..SULFATO CUPRICO 1%: Pesar 1 g de Sulfato Cuprico y diluir en 100 ml de agua destilada. ALMIDÓN AL 2% DILUIDO EN CLORURO DE SODIO AL 0. SOLUCIÓN AMORTIGUADORA pH 4: Se mezclan 20 ml de Solución A con 80 ml de Solución B.ALMIDON AL 2% EN AGUA DESTILADA: Pesar 2 g de Almidón y diluir en 100 ml de agua destilada 4. REACTIVO DE LUGOL: En 100 ml de agua destilada se disuelven 20 g de Yoduro de Potasio y 10 g de Yodo. 15. SOLUCIÓN DE FEHLING B: Disuelva 173 g de Tartrato de Sodio y Potasio (sal de Rochelle.1 M SOLUCIÓN B).

REACTIVOS Y EQUIPOS MATERIALES REACTIVOS EQUIPOS  Tubos de ensayo  Agua destilada  Agitador de tubos  Sulfato Cúprico de ensayo c/tapa y s/tapa  Campana de  Gradilla anhidro  Espátula  Cloruro de sodio extracción.IV. 3 y 4 agregue: Sustancia 3 ml cambio de temperatura sobre problema: Saliva diluida (Amilasa o ptialina) 10 . PARTE EXPERIMENTAL ( I ) PRUEBAS PROCEDIMIENTO VOLUMEN LABILIDAD TERMICA: Tome cuatro tubos de ensayo: Comprobar la influencia del En los tubos 2.  Propipeta  Almidón  Baño de maría  Pipetas graduadas de  Yodo  Balanza Analítica  Yoduro de Potasio  Estufa 2 y 5 ml  Carbonato de Sodio  Pisetas  Cilindro graduado de Anhidro  Acido Cítrico 25 y 100 ml  Solución  Beacker de 100 ml amortiguadora pH 4  Solución amortiguadora pH 7  Solución amortiguadora pH 9  Sacarosa (Azúcar)  Levadura (Sacarasa)  Sulfato de cobre Pentahidratado  Tartrato de Sodio y Potasio  Hidróxido de Sodio V. MATERIALES.

Al tubo 3 agregue Solución amortiguadora 3 ml pH 7. Observar y reportar. enzimática. Al tubo 4 agregue Solución amortiguadora pH 9. agregar a todos los 1 gota tubos Reactivo de Lugol. PARTE EXPERIMENTAL ( II ) PRUEBAS PROCEDIMIENTO VOLUMEN ESPECIFICIDAD Tome cinco tubos de ensayo: 5 ml ENZIMATICA: A los tubos 1 y 2 agregue Almidón 2% A los tubos 3 y 4 agregue Sacarosa 2% 5 ml Determinar la influencia de la Al tubo 5 agregue Almidón 2% o Sacarosa 5 ml enzima amilasa y sacarasa 2% sobre diferentes sustratos. agregar a los tubos que 1 gota 11 . La saliva en el Tubo 2 se hierve durante 2 min y el tubo 4 se lleva al congelador durante el mismo tiempo Coloque en todos los tubos Solución de almidón al 2% en cloruro de sodio al 0. agregar a todos los tubos Reactivo de Lugol. A los tubos 1 y 3 agregue Saliva diluida.la actividad enzimática. 3 ml A los tubos 2 y 4 agregue Sacarasa 3 ml Mezcle y lleve a la estufa a 37ºC durante 20’.3% 5 ml Los tubos 1. 2 y 3 se llevan a la estufa a 37ºC durante 20’ y el 4 se sumerge en hielo durante el mismo tiempo. INFLUENCIA DEL pH: Tome cuatro tubos de ensayo: Comprobar la influencia del Al tubo 1 agregue agua Al tubo 2 agregue pH sobre la actividad Solución amortiguadora pH 4. A todos los tubos agregue Saliva diluida. No agite 1 gota Observar y reportar. 3 ml A todos los tubos agregue Almidón al 2%. Transcurrido los 20’. Transcurrido los 20’. 5 ml Mezcle y lleve a la estufa a 37ºC durante 20’. Transcurrido los 20’.

SUSTANCIAS Tome tres tubos de ensayo: 5 ml INHIBIDORAS: Agregue a todos los tubos Almidón 2% Al tubo 1 agregue Cloruro de Sodio 1% 2 ml Comprobar la influencia de Al tubo 2 agregue Sulfato de Cobre 1% 2 ml los inhibidores sobre la Al tubo 3 agregue Agua destilada 2 ml actividad enzimática A todos los tubos agregue Saliva diluida 2 ml Mezcle y lleve a la estufa a 37ºC durante 20’. Sin amilasa Almidón 37 ºC x 20’ 2 Amilasa Enzima Almidón 37 ºC x 20’ desnaturalizada 3 Amilasa Enzima Activa Almidón 37 ºC x 20’ 12 . V. Observar y reportar. Transcurrido los 20’.Influencia de la temperatura sobre la actividad enzimática TUBO ENZIMA CONDICIONES SUSTRATO INCUBACIÓN COLORACIÓN Nº 1 -------.. agregar a todos los 1 gota tubos Reactivo de Lugol. contienen Almidón Reactivo de Lugol. Tabla 1. Observar y reportar. Llevar a baño de María por 5’. RESULTADOS. A los tubos que contienen sacarosa agregue 2 ml c/u Fehling A y B.

. 4 Amilasa Enzima Activa Almidón 0 ºC x 20’ Tabla 2.Influencia del pH sobre la actividad enzimática TUBO ENZIMA CONDICIONES SUSTRATO INCUBACIÓN COLORACIÓN Nº 1 Amilasa Agua destilada Almidón 37 ºC x 20’ 2 Amilasa pH 4 Almidón 37 ºC x 20’ 3 Amilasa pH 7 Almidón 37 ºC x 20’ 4 Amilasa pH 9 Almidón 37 ºC x 20’ Tabla 3.Especificidad enzimática TUBO Nº ENZIMA SUSTRATO INCUBACIÓN COLORACIÓN 1 Amilasa Almidón 37 ºC x 20’ 2 Sacarasa Almidón 37 ºC x 20’ 3 Amilasa Sacarosa 37 ºC x 20’ 4 Sacarasa Sacarosa 37 ºC x 20’ 13 ..

Influencia de los inhibidores sobre la actividad enzimática TUBO ENZIMA AGENTE SUSTRATO INCUBACIÓN COLORACIÓN Nº 1 Amilasa Cloruro de Almidón 37 ºC x 20’ Sodio 1% 2 Amilasa Sulfato de Almidón 37 ºC x 20’ Cobre 1% 3 Amilasa Agua Almidón 37 ºC x 20’ Destilada 14 . 5 Almidón o 37 ºC x 20’ Sacarosa Tabla 4..