ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD: CIENCIAS PECUARIAS
CARRERA: INGENIERÍA EN INDUSTRIAS PECUARIAS INDUSTRIAL
TEMA: “CRECIMIENTO MICROBIANO – DENSIDAD ÓPTICA”

1. INTRODUCCION

La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones
biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación
absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de
soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.
Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun el vidrio que parece ser
completamente transparente absorbe longitud de ondas que pertenecen al espectro
visible; el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo.
La absorción de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura
de las moléculas, y es característica para cada sustancia química.
Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía
radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida.
El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la
luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de
onda no absorbida.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo general

Establecer la curva de crecimiento microbiano usando las mediciones de densidad óptica.

2.2. Objetivo especifico

Conocer la velocidad de crecimiento en la fase exponecial.

3. METODOLOGÍA

Preparar medio extracto de levadura (YE)
Medir la densidad óptica del medio en un tubo de ensayo
Inocular 1 colonia del organismo o 0,1 ml de una suspensión microbiana en el tubo con
8ml de YE.
Usar para ello el asa de platino esterilizada a la llama del mechero o una pipeta estéril.
Agitar en el vórtex.
Marcar el tubo con el número de grupo de trabajo.
Incubar el tubo con el cultivo a 37º C en la cámara de incubación correspondiente.
Realizar la medición de la absorbancia en el espectrofotómetro. Repetir la medición cada
24 horas.
Desarrollar las gráficas de crecimiento microbiano

4. EQUIPOS Y MATERIALES:
Tubos de ensayo estériles
Tampones estériles
Gradillas
Pipetas Pasteur estériles
Medio extracto de levadura

5. MARCO TEORICO:
La medición de la densidad óptica en el espectrofotómetro es el método más habitual
para el seguimiento del crecimiento de un cultivo bacteriano.
La medición de alícuotas o muestras del cultivo a lo largo del tiempo, permite desarrollar
curvas de crecimiento de la población bacteriana. Ello permitirá, a su vez, la comparación
de tasas de crecimiento en diferentes condiciones, el establecimiento de las condiciones
óptimas, etc.
El incremento en el número de células es lento al principio y después llega a ser de forma
exponencial.

En la curva se distinguen:
Fase de latencia. Fase de adaptación de las células a las nuevas condiciones del medio de
incubación al que han sido transferidas
Fase de crecimiento exponencial. Fase en la que las células se están dividiendo
regularmente a ritmo constante.
Fase estacionaria. El nº de células no se incrementa más porque los nutrientes del medio
se van agotando y posibles sustancias tóxicas pueden ir acumulándose.
6. PROCEDIMIENTO:

Preparar medio extracto de levadura (YE)

Inoculamos 1 colonia del organismo en el tubo con 8ml de YE y para ello usamos el asa
de platino una vez que este esterilizada a la llama del mechero.

Despues el tubo de ensayo lo ponemos agitar en el vortex para luego marcarlo con el
número de grupo de trabajo que corresponda.

Procedemos a realizar la respectiva incubacion, el tubo con el cultivo a 37º C en la
cámara de incubación correspondiente.
Biomasa después de de 24 horas despues de haber realizado el cultivo

Biomasa después de de 96 horas despues de haber realizado el cultivo

Biomasa después de de 120 horas despues de haber realizado el cultivo

Biomasa después de de 144 horas despues de haber realizado el cultivo

Curva de crecimiento
Chart Title
6

5

4

3

2

1

0
00 horas 24 horas 72 hora s 96 horas 120 hora s

7. Conlusiones

8. Recomendaciones

9. BIBLIOGRAFÍA:
Madigan, M.; Martinko, J. y Parker, J. 2004. Biología de los Microorganismos. Décima
edición.

ANEXOS CUESTIONARIO

Describir 3 técnicas distintas para cuantificar la concentración de biomasa [X] en una
suspensión celular.

Medida de la Biomasa

La medida de la masa de los constituyentes de la célula bacteriana es
utilizada frecuentemente como base para la medida de una actividad
metabólica, o de un constituyente metabólico o químico.

Algunos de los métodos para cuantificar la biomasa son obvios y
confiables, pero pueden volverse complicados si se busca la exactitud.
Microscopio de Epifluorescencia

El microscopio de epifluorescencia es un microscopio óptico. En un microscopio
óptico convencional la luz atraviesa la muestra estudiada, mientras que en un
microscopio de epifluorescencia la luz que incide sobre la muestra estudiada no
la atraviesa sino que el mismo lente ilumina y recibe la luz emitida por la muestra.
Su funcionamiento se basa en la propiedad de fluorescencia que tienen ciertas
moléculas denominadas fluorocromos.

Los fluorocromos son sustancias que tienen la propiedad de emitir un fotón de
una longitud de onda determinada cuando son excitados por un fotón incidente
de una longitud de onda característica. La parte de la molécula que emite la
fluorescencia se denomina fluoróforo. Las moléculas de fluorocromo se utilizan
para marcar ciertas estructuras celulares destacándolas del resto de los
elementos que componen la célula. Esto permite identificar distintas moléculas o
conjuntos de moléculas. El fluorocromo puede tener afinidad por distintos
elementos celulares o puede ser acoplado químicamente a otras moléculas como
anticuerpos que reconocen específicamente cierto componente celular.

Figura 4 - Fluoróforo "Stokes shift"

En el pasaje de los electrones del estado excitado al estado estable se pierde
energía. Como resultado el espectro de emisión de un fluoróforo excitado se
corre hacia una longitud de onda mayor en relación al espectro de excitación. Es
lo que se denomina "Stokes shift".

Figura 5 - Esquema de funcionamiento

Peso húmedo: Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que
es pesada luego de la separación de las células por filtración o
centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes de muestra.

La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el
espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad
de líquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de
células bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio
intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma
y deformación celular. Para corregir el peso húmedo se determina la
cantidad de líquido que queda retenida en el espacio intercelular luego
de una centrifugación, para ello se utilizan soluciones de polímeros no
iónicos (como el Dextran) que pueden ingresar en el espacio
intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas.

Peso seco: El peso seco (contenido de sólidos) de las células
bacterianas que se encuentran en una suspensión se obtiene por el
secado de un volumen en un horno a 105°C hasta peso constante. Esta
técnica es útil para grandes volúmenes de muestra, debido a que
diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran
número de bacterias.

La desventaja de este método es que componentes volátiles de la
célula pueden perderse por el secado y puede existir alguna
degradación. También la muestra seca puede recobrar humedad
durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad
relativa alta.

Qué aplicaciones considera se puede dar al conocimiento de la cinética de crecimiento
microbiano.