You are on page 1of 66

2,013

Manual de prcticas de
laboratorio de Inmunologa

Elaboracin
Licda. Ana Margarita Paz Morales de Ramrez (QB, MA)
Licda. Isabel Cristina Gaitn Fernndez (QB, MA)
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

REGLAMENTO GENERAL DE LABORATORIO DE INMUNOLOGA

1. El alumno deber ingresar al laboratorio con equipo de seguridad:


Bata blanca hasta la rodilla y de manga larga (con su respectivo nombre y el
logo de la universidad bordado).
Gafas de seguridad.

2. Para tener derecho a ingresar al laboratorio, el alumno debe entregar al inicio


de cada prctica:
- Cuaderno completo de laboratorio con los aspectos solicitados para la
prctica.
- Reporte de la prctica anterior.

El laboratorio inicia puntualmente, no se permitir el ingreso tarde bajo ninguna


excusa. NO SE REPONDR LABORATORIO POR NINGN MOTIVO

3. El alumno no podr ingresar al laboratorio si:

- Si tiene el cuaderno incompleto o hay evidencia de copia entre dos o ms


compaeros de laboratorio, de lo contrario tendr inasistencia aunque haya
firmado la lista de asistencia.

4. En el laboratorio est prohibido el ingreso de:


- Telfonos celulares, localizadores, reproductores de msica, cmaras o
cualquier otro artefacto electrnico (iPod, iPad, Laptops, tablets etc.) que
pueda interferir con la atencin del estudiante.
- Comida y bebidas.
- Gorras, suteres o chumpas que no sean del uniforme.
- Mochilas, bolsos u otro accesorio que no sea requerido por el docente.
Todas las pertenencias deber dejarlas en los casilleros asignados

5. No puede trabajar en el laboratorio si tiene uas acrlicas y joyera.

6. Las personas con cabello largo deben recogerlo con una cola o gancho (no
fleco).

7. El alumno es responsable del material que recibe, mantenindolo limpio y en


perfecto estado a lo largo de cada prctica. Deber realizar una requisicin del
material antes de iniciar la prctica y al finalizar ser revisado por las
licenciadas a cargo.
8. En caso de que el estudiante dae parcial o totalmente un material, deber
firmar un vale con su nombre, nmero de puesto, descripcin del material

2
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

daado, fecha y firma, comprometindose a reponer el material durante las dos


prcticas siguientes, de no hacerlo perder el derecho a ingresar al laboratorio.
NOTA: El estudiante deber estar solvente al momento de realizar los
exmenes parciales y el final de laboratorio.

9. Los alumnos sern responsables de dejar los reactivos cerrados y sin


contaminar por otros, las mesas limpias y en orden, lo mismo que el equipo que
sea utilizado durante la prctica.

10. Es necesario que cualquier persona que se encuentre dentro de las


instalaciones del laboratorio se comporte de forma adecuada, cumpliendo con el
reglamento y las normas de seguridad requeridas (Prctica No. 1).

3
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

ASPECTOS A EVALUAR

1. PLANIFICACION

Generalidades para presentar el cuaderno


El cuaderno debe ser:
- De pasta dura, tamao media carta de 80 hojas con lneas (no espiral).
- Forrado con plstico sin color en particular.
- Identificado en la primera hoja

El cuaderno de laboratorio contiene las siguientes secciones:

Seccin Contenido Valor (pts)


Indicar claramente el nmero, ttulo y la fecha en que se
Encabezado ---
llevar a cabo la prctica de laboratorio.
Deber de escribir los objetivos de cada prctica, para
Objetivos familiarizarse con el contenido que se espera aprender en 5
cada una de ellas.
Realizar una representacin grfica del procedimiento que
Diagrama de flujo se llevar a cabo en el laboratorio en forma clara y 10
resumida.
Para todos los reactivos utilizados en la prctica deber
indicar en una tabla:
Toxicidad por contacto en piel
Toxicidad por contacto en ojos:
Toxicidades/ Toxicidad por inhalacin:
Valores normales/ Toxicidad por ingestin: 5
Es de vital importancia incluir los efectos de exposicin, la
forma de aplicar primeros auxilios y la forma adecuada
de desecho. Si existen reactivos que se repitan en
diferentes prcticas, deber escribir esta informacin cada
vez que ste se repita.
Principio de la Se describir el principio inmunolgico en el que se basa
prueba la reaccin realizada durante la prueba de laboratorio
Se realizarn las tablas que contengan la informacin
Tablas de generada durante la prctica, as como los dibujos que se
resultados y consideren necesarios.Estos resultados servirn para
dibujo de realizar el informe de laboratorio. Para poderse retirar el
observaciones alumno deber presentarlos, y sern sellados por el
instructor
Se calificar el orden, legibilidad de la escritura, limpieza y
Presentacin ---
que el cuaderno est al da.
Nota total del cuaderno de laboratorio 20 pts

4
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

NOTA: No puede usarse el mismo cuaderno de laboratorio para dos cursos


simultneos.
Debe escribir con lapicero azul o negro y con letra legible, los dibujos deben de pintarse
y describirse segn se indique en cada prctica.
El cuaderno se calificar al iniciar cada prctica de laboratorio.

2. DESARROLLO DE LA PRCTICA DE LABORATORIO

Antes de poder realizar cualquier trabajo dentro del laboratorio, el estudiante


deber demostrar fehacientemente que tiene el conocimiento necesario para poder
llevar a cabo la prctica. Para ello se realizar un examen corto al inicio de cada
prctica. El examen corto ser sobre el contenido de la prctica y tendr un valor de 30
puntos.

Durante el desarrollo de la prctica el docente evaluar los siguientes aspectos:


atencin, orden, limpieza y capacidad y disposicin para seguir instrucciones. Las faltas
graves, especialmente las que puedan poner en riesgo la salud y seguridad de los
dems, puede ameritar el retiro temporal o definitivo de un estudiante, teniendo cero en
la prctica completa.

Toda expulsin del laboratorio es contada como inasistencia, aunque el


estudiante ya haya firmado la lista de asistencia.

3. REPORTE DE LABORATORIO

La principal forma de evaluacin del trabajo hecho durante el laboratorio, as


como la comprensin obtenida despus de realizada la prctica, es el reporte de
laboratorio. En l se evidencia el nivel de comprensin y la calidad de trabajo realizado
por el estudiante.

Es necesario que muestre tanto una buena redaccin como una buena
ortografa. Como futuros profesionales de las ciencias mdicas, es importante que los
estudiantes ejerciten y mejoren su habilidad de redaccin de informes, ya que es parte
de la formacin de todo profesional.

Generalidades para presentar el Reporte:


Hojas tamao carta impresas en dplex
Letra tipo Arial, tamao 11 a espacio cerrado (1,0)

5
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

El reporte de laboratorio incluye las siguientes secciones:

Seccin Contenido Valor (pts)

Debe mostrar toda la informacin de identificacin del


estudiante y de la prctica.
Encabezado
REPORTE No. X Fecha de entrega ---
NOMBRE DE LA PRCTICA
Nombre y Apellido, carn, seccin y nmero de
puesto.

Debe expresar en forma clara y breve los objetivos, as


como los resultados y conclusiones ms importantes
Resumen 5
de la prctica, deber redactarse en tiempo pasado e
impersonal. Mximo 10 lneas.
Se deber buscar informacin relacionada al tema de
la prctica, el cual servir tambin para reforzar el
Marco Terico conocimiento adquirido durante la misma. 5
Deber de tener por lo menos dos pginas y no
exceder de tres.
Se solicita que esta seccin se presente en cuadros
tabulados de fcil lectura, a manera que la
interpretacin sea de fcil entendimiento para cualquier
otra persona que no haya estado en el desarrollo de la
prctica. Cada cuadro debe tener nmero, ttulo que lo
describa y fuente de donde se obtuvo la informacin.
Resultados 10
NO se aceptan datos, clculos y resultados escritos a
mano. De presentarlos as, se calificar con un cero
esa seccin.
En el caso de realizar dibujos estos deben de estar
descritos, pintados y sealados en caso de que en
cada uno hayan distintas estructuras
Es un anlisis e interpretacin de los resultados
obtenidos, contrastando con lo descrito en la teora. El
estudiante puede poner en prctica el aprendizaje que
haya obtenido. Debe explicar su experimento en base
Discusin de
al principio qumico estudiado, utilizando un lenguaje 10
Resultados
tcnico-cientfico y redaccin adecuada. Adems,
debe discutir sobre las posibles fuentes de error
involucradas en la prctica y posibles formas de
mejorar la ejecucin y rendimiento de la misma.
Responden a los objetivos y se derivan de los
resultados obtenidos, no deben ser muy extensas.
Conclusiones Como regla, no se puede concluir teora ni aspectos 10
que no hayan sido incluidos en la discusin.
Debern colocar por lo menos 3 conclusiones

6
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

Responder las interrogantes planteadas al final de


Cuestionario 5
cada prctica en el manual de laboratorio.
Referencias Presentar segn los lineamientos del curso de
5
Metodologa de la Investigacin.
Nota total del reporte de laboratorio 50

NOTA: Algunas secciones no tienen valor asignado, ya que su presencia no agrega


puntos, sin embargo su ausencia s resta puntos de la nota del reporte de laboratorio.
Los estudiantes que no lleguen al da de la lectura de los cultivos, NO podrn entregar
reporte, aunque hayan elaborado otras partes de la prctica.

OBSERVACIONES IMPORTANTES
El reporte de laboratorio debe ser entregado en el periodo de laboratorio de
la siguiente prctica.
No se calificarn reportes sin nombre.
No se recibirn reportes parcial o totalmente escritos A MANO.
No se recibirn reportes tardos ni en formatos electrnicos (correo
electrnico o traslado por USB).
El reporte debe entregarse engrapado (no clips).
Toda aquella persona que se haya ausentado o haya sido retirada por
cualquier motivo de una prctica, NO TIENE DERECHO a entregar el
informe respectivo, sin importar si la falta haya sido justificada. Sin embargo,
esto no quiere decir que el alumno se libere de la evaluacin del tema de la
prctica durante las pruebas parciales y final del laboratorio.

Los reportes se corregirn y devolvern en la semana siguiente a la entrega del mismo.


Si algn alumno tiene cualquier duda o reclamo sobre la forma en que se ha calificado
su reporte, debe hablar con su instructor DENTRO DE LA PRIMERA SEMANA
despus de haberlo recibido corregido NO AL FINAL DEL SEMESTRE. No se
aceptarn reclamos posteriores.
IMPORTANTE:
Se tomar como falta grave (nota 0) cualquier indicio de plagio:
- Reproduccin no autorizada de una publicacin, palabra por palabra,
incluyendo internet),
- Copia total o parcial del contenido del reporte por parte de dos o ms
alumnos (la sancin aplica a todos los estudiantes involucrados). Todo caso
quedar documentado, y una reincidencia puede significar el retiro definitivo
del laboratorio.

DISTRIBUCIN DE LA ZONA DE LABORATORIO

7
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

Rubro a evaluar Punteo


Prcticas de laboratorio y hojas de trabajo 15
Examen final de laboratorio (incluye todo el contenido
5
estudiado en el laboratorio)
Trabajo en grupo sobre inmunopatologa y diagnstico de
5
enfermedades inmunes
Total nota de Laboratorio 25
-

-
Rubro a evaluar por prctica Punteo neto Porcentaje
Examen
- Corto 0.30 30 %
Cuaderno 0.20 20 %
-
Reporte 0.50 50 %
- Total Prctica Individual 1.00 100 %

8
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

CALENDARIZACIN DE PRCTICAS
No. Nombre Fecha
0. Informacin general 2 y 4 de julio
1. Bioseguridad y buenas prcticas en el laboratorio 9 y 11 de julio
2. Venopuncin y manejo de especmenes hematolgicos 16 y 18 de julio
3. Clulas sanguneas. Observacin microscpica de la 23 y 25 de julio
sangre. Evaluacin hematolgica
4. Inmunodifusin 30 de julio y 1 de
agosto
5. Reacciones de precipitacin 6 y 8 de agosto
Primeros exmenes parciales 12-17 de agosto
6. Reacciones de aglutinacin 20 y 22 de agosto
7. Reacciones de hemaglutinacin (grupo sanguneo y Rh) 27 y 29 de agosto
8. Hemaglutinacin pasiva 3 y 5 de septiembre
9. Inmunocromatografa 10 y 12 de septiembre
10. Ensayos inmunoenzimticos (ELISA) 17 y 19 de septiembre
11. Presentaciones: Inmunologa de enfermedad reumtica 24y 26de septiembre
12. Presentacin: Inmunologa de lupus 24y 26 de septiembre
13. Presentaciones: Inmunologa de enfermedades 1 y 3 de octubre
neurolgicas autoinmunes
Segundos exmenes parciales 7-12 de octubre
14. Presentacin: Inmunologa del cncer 15y 17 de octubre
15. Presentacin: Enfermedad tiroidea 22 y 24 de octubre
16. Presentaciones: Inmunodeficiencia (VIH/SIDA) 28 y 30 de octubre
17. Examen final de laboratorio 5 y 7 de noviembre

9
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

INDICE

Pgina

Practica 1. Bioseguridad 11

Practica 2. Venipuncin y manejo de especmenes 16


hematolgicos
Practica 3. Clulas sanguneas 27

Practica 4. Inmunodifusin radial 35

Practica 5. Reacciones de Precipitacin 41

Practica 6. Reacciones de Aglutinacin 44

Practica 7. Reacciones de Hemaglutinacin directa e indirecta 48

Practica 8. Hemaglutinacin pasiva 53

Practica 9. Inmunocromatografa 57

Practica 10. Ensayo inmunoenzimticos (ELISA) 60

10
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO


Practica 1

1. Introduccin

Las siguientes son las prcticas generales requeridas para todo laboratorio que maneja
sustancias infecciosas.
a. Deber estar disponible un manual de procedimientos especficos (de seguridad)
en el laboratorio para todo el personal que trabaje en l. Todos sus
requerimientos debern ser seguidos, el mismo estar documentado y ser
revisado y actualizado con regularidad. Deber estar colocado en un lugar
accesible para todos y ser firmado por todo el personal.
b. El personal debe recibir entrenamiento sobre todos los potenciales peligros
asociados con el trabajo, as como sobre las precauciones necesarias para
prevenir la exposicin a agentes infecciosos y la disposicin y descarte de
materiales. El personal debe mostrar evidencia de que ha entendido las
instrucciones dadas en el entrenamiento, el cual deber ser documentado y
firmado por el personal y por el supervisor; debern tambin implementarse
programas continuos de entrenamiento.
c. No est permitido comer, beber, fumar, guardar cualquier tipo de alimentos,
pertenencias personales o utensilios. Est prohibido maquillarse, colocarse o
removerse lentes de contacto. El uso de lentes de contacto est permitido
solamente cuando no hay otra opcin. El uso de joyas y accesorios no es
recomendado en el laboratorio.
d. Est prohibido pipetear con la boca cualquier sustancia.
e. El cabello largo debe estar atado atrs o arreglado de manera que no entre en
contacto con las manos, con las muestras, con los contenedores ni con el equipo.
f. El acceso al laboratorio y reas de apoyo est limitado a personal autorizado. No
se admiten nios.
g. Las heridas abiertas, cortadas, rasguos y abrasiones deben estar cubiertos con
materiales a prueba de agua.
h. Los laboratorios deben mantenerse limpios. El almacenamiento de materiales que
no son pertinentes al trabajo y que no puedan ser fcilmente descontaminados
(por ejemplo revistas, libros, correspondencia), debe ser minimizado; el trabajo de
papelera y escritura de reportes debe estar aparte de las reas de trabajo con
material infeccioso.
i. Deber usarse ropa protectora, apropiadamente cerrada, por todo el personal,
incluyendo visitantes, estudiantes y todas las personas que entren o trabajen en el
laboratorio. Deber usarse zapato cerrado y con tacones adecuados en todas las
reas de laboratorio. La bata del laboratorio debe ser usada siempre.
j. Cuando se sabe de un riesgo potencial de exposicin a salpicaduras y otros
objetos, ya sea durante las operaciones de rutina o bajo circunstancias especiales
(ej. Accidentes), debe usarse proteccin de los ojos y la cara. Debe tenerse

11
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

cuidadosa consideracin para identificar los procedimientos que requieran


proteccin de ojos y cara.
k. Para todos los procedimientos que involucren contacto directo con la piel y
material biolgico o animales infectados, deben usarse guantes (de ltex, vinilo u
otro co-polmero). Estos debern ser removidos antes de abandonar el laboratorio
y descartados.
l. La ropa protectora (bata) no debe ser usada en las reas que no son de
laboratorio (pasillos, biblioteca, etc.).
m. Si existe sospecha o certeza de exposicin, la ropa contaminada debe ser
descontaminada antes de lavarla.
n. El uso de agujas, jeringas y otros objetos punzo-cortantes debe estar
estrictamente limitado; las agujas y jeringas deben ser usadas slo para la
inyeccin parenteral y aspiracin de fluidos de animales de laboratorio. Debe
tenerse especial cuidado cuando se usan agujas y jeringas para evitar auto-
inoculacin y generacin de aerosoles durante su uso y descarte. Las agujas no
deben ser dobladas, cortadas, tapadas o removidas de las jeringas; deben ser
colocadas rpidamente en un contenedor resistente de punzo-cortantes para su
descarte.
o. Las manos deben ser lavadas despus que se han quitado los guantes y antes de
dejar el laboratorio, as como en cualquier momento despus de manipular
material conocido o sospechoso de estar contaminado.
p. Las superficies de trabajo deben estar limpias y descontaminadas con un
desinfectante adecuado (etanol 70%) al final del trabajo y despus de cualquier
salpicadura de material potencialmente infeccioso. No usar cloro en las
campanas, excepto en caso de algn derrame. Es altamente corrosivo.
q. Si algn material o equipo debe salir del laboratorio para servicio de
mantenimiento o para descarte, debe ser apropiadamente descontaminado y
etiquetado como tal. Es responsabilidad del operador autoclavear y descartar
todo desecho potencialmente peligroso.
r. Debe realizarse regularmente un monitoreo de las autoclaves usadas para
descontaminar, usando indicadores biolgicos y todos los resultados deben ser
archivados.
s. Todo material contaminado, slido o lquido, debe ser descontaminado antes de
descartarlo o de reusarlo.
t. Todo el tiempo deben estar disponibles los desinfectantes efectivos dentro de las
reas en donde se manipula o se almacena material infectivo
u. Para el transporte de materiales infecciosos dentro de las instalaciones, debern
usarse contenedores a prueba de derrames.
v. Las salpicaduras, accidentes o exposiciones a materiales infecciosos, deben ser
reportados inmediatamente al supervisor del laboratorio. Deben mantenerse
registros escritos de tales incidentes dentro del Departamento, y los resultados de
las investigaciones de tales incidentes deben ser usados para educacin continua.
w. Debe mantenerse un programa efectivo de control de insectos y roedores.

12
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

2. Objetivo General

En esta prctica el estudiante aprender las normas de bioseguridad aplicadas al


laboratorio de inmunologa.

3. Objetivos Especficos

Que el estudiante:
- Se familiarice las normas de bioseguridad en el laboratorio de inmunologa
- Conozca la importancia de los riesgos biolgicos del manejo de material
infeccioso
- Aplique sus conocimientos en la resolucin de casos de accidente ocupacional
con material infeccioso

4. Procedimiento

Revise literatura sobre bioseguridad en el laboratorio y esuelva los siguientes casos de


accidente ocupacional:

CASO No. 1
Edad: 34 aos
Sexo: femenino
Profesin: tcnico de laboratorio
Evento: Manipulacin de tubo de ensayo para procedimiento de valores sanguneos
Situacin: Ruptura de tubo de ensayo que provoc herida del dedo medio de la mano
derecha en contacto con sangre de paciente VIH positivo, se desconoce valores de CD4
y carga viral.
Cul es el riesgo para el tcnico de laboratorio al entrar en contacto con la sangre del
paciente?
Qu medidas de intervencin se le deben de realizrsele al tcnico de laboratorio?
Qu medidas de proteccin y prevencin que debi utilizar el tcnico para disminuir el
riesgo de contacto con el material infeccioso?

CASO No. 2
Edad 27 aos
Sexo. Femenino
Profesin: Mdico
Evento: colocacin de sonda nasogstrica a con tuberculosis pulmonar, con franca
hemoptisis y hematemesis.

13
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

Situacin: hemoptisis y hematemesis activa durante el procedimiento de colocacin de


la sonda que contamina la conjuntiva del mdico.
Cul es el riesgo para el mdico al entrar en contacto con los fluidos del paciente?
Qu medidas de intervencin se le deben de realizrsele al mdico?
Qu medidas de proteccin y prevencin que debi utilizar el mdico para disminuir el
riesgo de contacto con el material infeccioso?

CASO No. 3
Edad: 42 aos
Sexo: masculino
Profesin: mdico
Evento: puncin del ganglio cervical en paciente VIH positivo en fase de SIDA,
Situacin: realiza procedimiento de obtencin de muestra y al separar la aguja de la
jeringuilla el protector se separa y se introduce profundamente en el pulgar de la mano
derecha
Cul es el riesgo para el mdico al entrar en contacto con los fluidos del paciente?
Qu medidas de intervencin se le deben realizar al mdico?
Qu medidas de proteccin y prevencin que debi utilizar el mdico para disminuir el
riesgo de contacto con el material infeccioso?

CASO No. 4
Edad: 22 aos
Sexo: masculino
Profesin: estudiante de medicina
Evento: preparacin de pipetas de Westergreen para la evaluacin de velocidad de
sedimentacin
Situacin: realiza procedimiento de llenado de la pipeta, sin embargo el estudiante NO
utiliza un pipetor y lo hace con la boca. La sangre entra en contacto con su boca.
Cul es el riesgo para el estudiante al entrar en contacto con los sangre del paciente?
Qu medidas de intervencin se le deben de realizrsele al estudiante?
Qu medidas de proteccin y prevencin que debi utilizar el estudiante para disminuir
el riesgo de contacto con el material infeccioso?

CASO No. 5
Edad: 19 aos
Sexo: femenino

14
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

Profesin: estudiante del curso de Inmunologa


Evento: preparacin de reactivos para la elaboracin de agua regia (cido clorhdrico y
cido ntrico, proporcin 3:1)
Situacin: al realizar la mezcla de suero y reactivo el estudiante deja caer sobre la mesa
de trabajo gotas de los mismos y no se da cuenta de ello. Posteriormente pone el
antebrazo sobre el lquido derramado.
Cul es el riesgo para el estudiante al entrar en contacto con el suero y reactivos?
Qu medidas de intervencin se le deben de realizrsele al estudiante?
Qu medidas de proteccin y prevencin que debi utilizar el estudiante para disminuir
el riesgo de contacto con el material infeccioso?

CASO No. 6
Evale la bioseguridad en el laboratorio de inmunologa, haciendo nfasis en los
cuidados que se debe de tener para mantener un ambiente seguro para las personas
que trabajen en l, incluya:
- Descarte de material bioinfeccioso
- Limpieza del rea de trabajo
- Lavado de cristalera
- Lavado de manos

5. Referencia

Laboratory Biosafety Guidelines. 2004. 3rd edition. Published by the authority of the
Minister of Health Population and Public Health Branch, Centre for Emergency
Preparedness and Response, Government of Canada.Pp. 19-23.

15
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

VENIPUNCIN Y MANEJO DE ESPECMENES HEMATOLGICOS


Prctica 2

1. Introduccin

Las venas de un paciente constituyen la principal fuente de especmenes para anlisis


de laboratorio, como punto de entrada de medicamentos, as como el sitio ideal para
transfusiones sanguneas y/o procedimientos intravenosos. El proceso mediante el cual
la sangre es removida de la vena es conocido como venipuntura o flebotoma.
La importancia de la flebotoma reside en que es el primer contacto entre el laboratorio y
sus pacientes, mientras que desde el punto de vista de la muestra, un proceso
cuidadoso conlleva una muestra apropiadamente colectada, as como la garanta de la
seguridad de su origen y el correcto envasado y transporte, factores necesarios para la
correcta evaluacin e informe de los exmenes a realizar.
La toma de muestra de sangre para anlisis de laboratorio se puede realizar mediante
las siguientes tcnicas: venosa o perifrica y capilar. Para la mayora de los exmenes
clnicos, incluyendo hemogramas y dosificacin de hemoglobina, se recomienda utilizar
sangre venosa, mientras que para las frmulas leucocitarias o frotes perifricos puede
extraerse sangre en el lbulo de la oreja o de la yema de un dedo. En los casos de
nios, se recomienda utilizar la yema del dedo gordo del pie o del taln.

2. Objetivos
Que el estudiante:
- Se familiarice con el equipo utilizado para la extraccin de sangre.
- Realice la extraccin de sangre venosa utilizando jeringa o equipo vacutainer.
- Conozca la importancia de realizar correctamente este procedimiento.

3. Alcance
En esta prctica el estudiante aprender el procedimiento correcto de extraccin de
sangre venosa.

4. Antecedentes
REQUERIMIENTOS PREVIOS A LA VENIPUNTURA
4.1 Orden mdica
Una solicitud mdica debe acompaar cada muestra admitida dentro del laboratorio.
Dicho documento debe contener la informacin apropiada para el correcto
procesamiento de la muestra. Los elementos esenciales de una orden mdica son:
- Nombre del paciente

16
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

- Nmero de identificacin del paciente y/o nmero de historia clnica


- Gnero y edad del paciente
- Nombre completo del mdico solicitante
a) Anlisis requeridos

4.2 Equipo necesario para la venipuncin


El siguiente equipo es necesario para la venipuntura de rutina:
- Equipo Vacutainer
o Tubos de vaco: Estos dispositivos estn diseados para llenarse con un
volumen predeterminado de sangre por medio de vaco, esto garantiza una
adecuada relacin entre sangre y anticoagulante. Los tapones de goma
estn codificados por color de acuerdo con el aditivo que contienen as por
ejemplo, los tubos morados (EDTA) son los ms utilizados para hematologa
rutinaria y los tubos celestes (citrato) para pruebas de coagulacin.
o Agujas especiales para adaptador.
o Adaptador para tubos de vaco.
- Jeringuillas de 3, 5 y 10 cc.
- Agujas: Estn numeradas dependiendo de su calibre. Para coleccin de sangre
para hemogramas, se recomienda una
aguja de dimetro de 0.8mm (21G)
para evitar dao a las clulas. Las
agujas de 0.9-1.1mm de dimetro
(20G-19G) se utilizan normalmente
para puncin venosa en adultos.
- Torniquete: Generalmente una liga
plana de ltex.
- Alcohol: Etlico o isoproplico al 70%.
- Algodn
- Gasas y/o vendas adhesivas
- Dispensador de agujas
4.3 Etiquetado de los tubos
Un adecuado etiquetado de los tubos es esencial para que los resultados de los anlisis
concuerden con el paciente correcto. Los elementos clave en el etiquetado para
garantizar la calidad de la muestra pre-analtica son:
- Nombre o iniciales del paciente
- Nmero de identificacin del paciente
- Fecha y hora de la toma de muestra
- Iniciales del flebotomista

17
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

PUNCIN VENOSA
Fundamento terico
La puncin venosa permite extraer una mayor cantidad de sangre para las pruebas
necesarias en hematologa. Las venas de eleccin suelen ser las de la cara anterior del
antebrazo (vena cubital, vena ceflica y la vena baslica) porque resulta fcil acceder a
ellas. Las cifras hemticas permanecen constantes no obstante el sitio seleccionado
para obtener la puncin venosa.
Preparacin del paciente
- Instruya al paciente sobre la tcnica para tomar la muestra. Valore la existencia de
problemas hemorrgicos o de circulacin, o alergias en ltex.
- Evite puncionar en un rea con hematoma, fstulas, quemaduras, escoriaciones de
la piel, cicatrices o del costado en que se ha realizado mastectoma reciente.
- Evite puncionar en el brazo donde hay venoclisis, inyeccin intramuscular previa o
administracin de medicamentos va intravenosa.
- Avisar al paciente que al introducir la aguja sentir dolor.
- Extienda completamente el brazo con la superficie palmar hacia arriba. Solicite
ayuda del paciente, si ste est consciente, para realizar palanca con el brazo libre.
- Si existen dificultades para extraer la muestra, se entibia la extremidad con
masajes. Se debe permitir que la extremidad permanezca inclinada durante varios
minutos antes de realizar la puncin. Si el paciente no tiene pruebas de glucosa o
electrolitos, favorecer el ejercicio leve del brazo.
Metodologa
Precauciones generales
- Durante la toma de muestra deben guardarse las ms estrictas normas de higiene.
Practique las precauciones universales mnimas con todo paciente a ser atendido.
Toda muestra debe ser considerada potencialmente infecciosa y se deben tomar
las precauciones que garanticen la seguridad del flebotomista y de los pacientes.
- El material descartable a usar se abrir slo al momento de su utilizacin y, una vez
manipulado, no podr guardarse nuevamente an cuando se le considere nuevo.
o Tome precauciones al manipular agujas y/o lancetas.
o No deje agujas y/o lancetas usadas en la mesa de trabajo.
o No coloque el protector a la aguja.
o Evite que los nios toquen o jueguen con los equipos de flebotoma.
- Una vez realizada la toma de muestra, descartar inmediatamente los materiales
usados en recipientes para ese fin.
- Los recipientes que contienen algodn y los de desecho deben estar perfectamente
cerrados todo el tiempo y se abrirn solamente al momento de usar.

18
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

- Al momento de hacer la extraccin colocarse los


guantes desechables, los cuales se mantendrn
puestos durante todo el procedimiento.
- Si ocurre un pinchazo accidental, informar
inmediatamente al jefe de laboratorio. Mantenga la
calma, y lvese inmediatamente con agua, jabn y
alcohol. Favorezca la salida de sangre por presin
continua.

Procedimiento en adultos
- Identifique correctamente al paciente. Preprelo
correctamente para la extraccin.
- Coloque un torniquete en la parte superior del brazo
(aproximadamente 5 cm por encima del pliegue)
para producir congestin venosa. El torniquete
prolongado causa estasis y hemo-concentracin. El
lazo debe ser colocado de modo de producir una
compresin del msculo no mayor a 1 mm.
- Seleccione el sitio de la puncin: Pida al paciente
que abra y cierre el puo varias veces; escoja una
vena accesible.
- Limpie el sitio de la puncin, previo a puncionar
debe estar seco. Debe tener presente que una vez
realizada la decontaminacin, no debe volver a tocar
el rea venosa.

- Para realizar la puncin el paciente debe tener el


puo cerrado.
- Coloque la punta de la aguja en un ngulo de 15-
30 sobre la superficie de la vena escogida y
atraviese la piel con un movimiento firme y seguro,
hasta el lumen de la vena.
- Una vez que penetra en la vena, la sangre llena los
tubos aspiradores automticamente por la presin
negativa dentro del tubo en el caso de Vacutainer,
mientras que con jeringas se debe jalar el mbolo
con movimiento continuo para extraer la sangre
hasta el volumen requerido. Evite presionar
fuertemente la aguja durante la extraccin.
- Solicite al paciente que abra el puo y afloje el
torniquete para que la sangre fluya mejor y remueva
la aguja del brazo con movimiento suave al terminar
de colectar, sin apretar el rea de la puncin con el
algodn. Presione el algodn sobre el sitio de la

19
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

puncin aplicando una presin adecuada y no excesiva para evitar la formacin de


hematoma.
- Descartar las agujas y/o jeringuillas en un contenedor apropiado.

Procedimiento en nios
- En nios mayores de 6 meses, se recomienda
hacer la extraccin del brazo como en adultos,
pidindole a un adulto que colabore en mantener
inmvil al nio, en particular el brazo.
- En el caso de nios menores de 6 meses, se
proceder a extraer la muestra del taln con una
lanceta descartable. Antes de la extraccin
conviene calentar el taln frotndolo entre las
manos para favorecer la irrigacin de la zona.
- Desinfectar con un trozo de algodn embebido en
alcohol, dejar evaporar y punzar con la lanceta en
la zona lateral del taln.
- Limpiar la primera gota y dejar gotear la sangre en el tubo con anticoagulante.
- Secar la zona con un trozo de algodn seco y una vez que no haya sangrado,
colocar una curita o apsito.

PUNCIN CAPILAR
Fundamento terico
Es utilizada para extraer pequeas cantidades de sangre para determinaciones de
hemoglobina, hematocrito y frotes perifricos. Hay tres lugares de donde realizar esta
puncin: el lbulo de la oreja, la yema del dedo y el taln del pie.
Metodologa
- Tome la muestra de las yemas de los dedos o lbulo de la oreja (adultos); del dedo
pulgar del pie o del tobillo (en lactantes o nios menores de 6 meses).
- Desinfecte el sitio de la puncin, squelo y puncione la piel con una lanceta estril
que no debe penetrar ms de 2 mm.
- Deseche la primera gota de sangre. Tome las gotas subsecuentes en un microtubo
y prepare las laminillas con esa muestra.
Recomendaciones:
No oprima el sitio de la puncin para obtener sangre porque se altera la
composicin hemtica o invalida los resultados.
Muchas veces se facilita la toma e muestra si se calienta la extremidad o se
coloca en postura colgante.

20
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

Cuidados del paciente despus de la puncin:


Aplique una pequea curacin o cinta adhesiva sobre el sitio de la puncin, si bien
hay que verificar presencia de hemorragia. De haberla, presione; en caso de que
persista el sangrado, busque en los antecedentes del paciente si ha sido sometido
a un tratamiento con anticoagulantes (aspirina) y/o antecedentes de alteraciones
en la circulacin o coagulacin.

CONSIDERACIONES ADICIONALES PARA LA BUENA CALIDAD DE LA


EXTRACCIN DE MUESTRA
Para prevenir la formacin de hematoma
No puncionar directamente sobre la pared de la vena.
Remover el torniquete antes de retirar la aguja.
Sostener las venas superficiales al momento de la puncin.
Asegurarse que la aguja penetre completamente hacia el lumen de la vena. La
penetracin parcial permite que la sangre escape hacia el tejido blando, rodeando la
vena va el bisel de la aguja.
Aplicar una presin adecuada en el sitio de la puncin.

Para prevenir la hemlisis (principal interferente en muchas pruebas)


Mezclar los tubos con anticoagulante gentilmente (en forma de 8) de 15-20 veces.
Evite la extraccin sangunea directamente de un hematoma.
Evite la extraccin forzada generada por el aspirado violento del mbolo, en el caso de
jeringas. Evite la formacin de espuma en la muestra.
Asegrese que el sitio de venipuncin est seco.
Evite la venipuncin traumtica.
En tubos no llenados al vaco, puede ocurrir hemlisis al llenarlos cuando se hace una
fuerte presin sobre el mbolo provocando un chorro de sangre violento.

La aplicacin prolongada del torniquete conlleva...


A la hemo-concentracin de elementos no filtrables (ej. protenas). La presin
hidrosttica ocasiona que el agua y algunos elementos filtrables abandonen el espacio
extracelular y se acumulen en la sangre. En algunos casos esto ocasiona serias
interferencias en los anlisis a efectuar.
Un aumento del volumen del paquete globular sanguneo.
Alteraciones dentro de los parmetros evaluados en la qumica sangunea.

21
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

GUA PARA LA RESOLUCIN DE PROBLEMAS DURANTE LA EXTRACCIN


VENOSA
Si no se obtiene muestra sangunea o la misma es incompleta...
Cambie la posicin de la aguja. Un leve movimiento hacia delante (cuando hay menos
de 2/3 de la aguja dentro de la piel), en el ngulo correcto ayuda. Es muy probable que
no se encuentre en el lumen.
En caso de una penetracin muy profunda (cuando hay ms de 2/3 de la aguja dentro
de la piel), un leve movimiento hacia atrs favorece la entrada al lumen venoso.
Asegrese que el ngulo sea el correcto.
En caso fallido, tome en cuenta lo siguiente:
o Afloje el torniquete. Este podra estar obstruyendo el flujo sanguneo.
o Pruebe otro tubo. Es posible que no haya vaco en el que se est utilizando.

o Fije nuevamente la vena. Algunas veces


las venas se mueven del sitio de la puncin.

Si la sangre deja de fluir en el tubo...


Es probable que la aguja se haya salido de la vena durante el recambio de tubos. Con
movimientos gentiles, redireccinela. Para evitar los anterior, mantenga el equipo
firmemente sin ejercer una presin que cause molestias al paciente.
Es probable que la vena haya colapsado; afloje el torniquete para incrementar el flujo
venoso, remueva la aguja ligeramente y vuelva a redireccionarla. Si esto no es exitoso,
remueva la aguja, tenga los cuidados correspondientes en el sitio de la puncin.
Puncione nuevamente en un lugar diferente.

Otros problemas que deben considerarse


Si se forma un hematoma bajo la piel adyacente al sitio de la puncin, afloje el
torniquete y retire la aguja. Aplique presin firmemente sobre el hematoma. Aconseje
el uso de paos intermitentes de agua fra y caliente.

22
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

Pudiera suceder que se atraviese una arteria, en estos casos la sangre se observa de
color rojo brillante. Afloje el torniquete, retire suavemente la aguja y aplique una presin
uniforme y constante durante 5 minutos.

5. Materiales y equipo
- Algodn
- Etanol al 70%
- Ligadura
- Tubos vacutainer con anticoagulante EDTA
- Jeringas de 3 cc
- Descartador de punzocortantes
- Bolsas roja

6. Procedimiento
- Instruya al paciente sobre la tcnica para tomar la muestra:
Coloque al paciente bien sentado con el brazo a puncionar extendido.
Busque la vena que va a puncionar visualmente, y luego con el dedo ndice tquela
para ver su trayectoria.

23
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

Figura 1. Venas del antebrazo

- Coloque el torniquete haciendo un nudo moderadamente apretado en la parte


superior del brazo donde va a hacer la puncin
- Avisar al paciente que al introducir la aguja sentir dolor.
- Extienda completamente el brazo con la superficie palmar hacia arriba. Solicite
ayuda del paciente, si ste est consciente, para realizar palanca con el brazo libre.
- Si existen dificultades para extraer la muestra, se entibia la extremidad con
masajes. Se debe permitir que la extremidad permanezca inclinada durante varios
minutos antes de realizar la puncin. Si el paciente no tiene pruebas de glucosa o
electrolitos, favorecer el ejercicio leve del brazo.
7. Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad
Observar todas las normas de bioseguridad. Debe tomarse en cuenta que todo el
tiempo se est trabajando con muestras potencialmente infectivas.

8. Formato de presentacin de resultados


Entregue la hoja de trabajo del cuestionario escrita a mano, junto con su pareja de
extraccin

9. Cuestionario

a. Describa brevemente el proceso de extraccin

24
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

b. Cul es el calibre de la aguja utilizada para el procedimiento de venipuncin?


c. Por qu se utiliza una ligadura en el brazo para realizar la extraccin
sangunea?
d. Por qu no se debe de realizar la extraccin sangunea en una vena muy
delgada y cul es la consecuencia de hacerlo?
e. Cules pueden ser las causas por la cual deja de salir sangre durante la
extraccin sangunea?
f. Mencione tres precauciones para evitar hemlisis de la muestra de sangre
obtenida
g. Mencione tres precauciones para evitar hematomas
h. Como se debe de introducir el bisel de la aguja y Por qu?
i. Explique porqu no debe de pasarse la sangre de la jeringa al tubo sin quitar la
aguja
j. Mencione dos soluciones desinfectantes que se pueden utilizar, adems del
etanol al 70%
k. Defina que es un anticoagulante
l. Qu anticoagulante contienen cada uno de los tubos vacutainer que se
identifican con los tapones de los siguientes colores
a. Celeste
b. Morado
c. Verde
d. Rojo
m. Qu ventajas tiene la utilizacin de mariposas para extraer sangre?
n. En qu se diferencia la sangre arterial de la sangre venosa?
o. Qu diferencia hay entre suero y plasma?
p. Qu ventaja tiene la extraccin venosa sobre la capilar?
q. Defina qu es un sistema de extraccin tipo vacutainer, como funciona y qu se
requiere para la extraccin con vacutainer a diferencia de la extraccin con
jeringa
r. Qu diferencia hay entre venopuncin y venociclis?
s. Qu hacer en caso de no tener vena visible para la extraccin sangunea?
t. Que venas se pueden utilizar para realizar la flebotoma en el brazo

NOTA: coloque su bibliografa al final del cuestionario

10. Bibliografa
- William W., et al. Hematologa. Barcelona: Salvat, 1979. x + 455p.
- Fink N., et al. Mtodos del laboratorio hematolgico. Primera parte. Argentina:
Universidad Nacional de la Plata, 2005. 58p.
- Prez JR., Fernndez J. Manual de prcticas de laboratorio de hematologa. 3 ed.
Guatemala: Universidad de San Carlos, 1997. 102p.

25
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

- Albarenga S., Crdoba C., Plazas L. Sangre. Mar de Plata: Escuela de Enfermera
Hospital de la Comunidad, 2004. 11p.
- Phlebotomy. Disponible en URL:
http://www.medlib.med.utah.edu/WebPath/TUTORIAL/
- TUTORIAL.html#2 Fecha de consulta: Junio, 2006.

26
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

CLULAS SANGUNEAS
Prctica 3

1. Introduccin
La frmula leucocitaria tiene por objetivo determinar los porcentajes de las distintas
clases de leucocitos normales y anormales en la sangre. A partir de los porcentajes
puede incluso calcularse el nmero real de cada clase de leucocitos por mm3 de sangre
(valor absoluto), conocindose el total de leucocitos.
Por ejemplo:
Si se tiene 60% de neutrfilos segmentados y el recuento total de leucocitos es de 20
000, entonces el valor absoluto de neutrfilos segmentados sera: 60/100 x 20 000 = 12
000.
Valores de referencia absolutos de neutrfilos segmentados = 3000 5000 por mm3

Conclusin: Los valores relativos slo nos sirven cuando los valores totales de
leucocitos se encuentran dentro del valor normal. En caso contrario (leucocitosis o
leucopenia) se debe emplear la frmula para obtener el valor real, y as determinar que
elemento celular se encuentra fuera del rango normal, sea elevado o disminuido.

2. Objetivos
- Conocer las clulas que conforman la sangre
- Identificar la morfologa de cada una de los leucocitos presentes en la sangre
- Realizar una formula leucocitaria y conocer las distintas patologas donde hay
alteracin.

3. Alcance
Al final de la prctica el estudiante podr identificar las distintas morfologas de los
leucocitos presentes en la sangre, as como la aplicacin de de la realizacin de una
formula leucocitaria y su importancia en el diagnstico de determinadas patologas.

4. Antecedentes
4.1 Granulocitos
Aquellos que tienen grnulos especficos: neutrfilos, eosinfilos y basfilos. Los
grnulos observados en extendido estn cargados de lisosomas y enzimas
hidrosolubles que son agentes antibacterianos necesarios para la digestin de
partculas fagocitarias. Aqu tenemos:
4.1.1 Neutrfilos
4.1.1.1 Neutrfilos en cayado (Fig. 1)

27
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

Es el granulocito en banda. Mide de 10m a 14m, ncleo condensado que puede


presentar una dos constricciones, pero no tiene puente de cromatina. El citoplasma
presenta grnulos especficos e inespecficos, membrana celular lisa, citoplasma de
color ligeramente rosado dependiendo de la coloracin.
4.1.1.2 Neutrfilos segmentados (Fig. 2)
Mide igualmente de 10m a 14m, ncleo que presenta mayor condensacin y est
formado por varios lbulos (hasta 4) unidos por puentes de cromatina. El citoplasma
est cargado de grnulos.

Alteraciones leucocitarias de los neutrfilos


Granulaciones txicas (Fig. 3)
Son grnulos basfilos ms oscuros que lo normal y se observan durante el transcurso
de infecciones severas y estadios txicos.
Vacuolas txicas (Fig. 4)
Se observan en el citoplasma de los neutrfilos durante infecciones severas y estados
txicos.
Cuerpos de Dohle (Fig. 5)
Son reas teidas de azul en el citoplasma de los polimorfonucleares neutrfilos y se
encuentra en infecciones, especialmente en neumonas.
Palillo de tambor (Fig. 6)
Es un pequeo apndice (cromatina sexual) que permite conocer el sexo del individuo
mediante una simple observacin en un frotis de sangre perifrica en los neutrfilos. Se
presenta en las mujeres.
Polisegmentacin (Fig. 7)
Son neutrfilos con 5 o ms lobulaciones. Se observa en las anemias por deficiencia de
vitamina B-12 y cido flico, Sndrome de Down y otras anomalas.
Existe aumento en el nmero de neutrofilos (neutrofilia) en:
- Infecciones bacterianas por agentes piognicos.
- Abscesos y septicemias.
- Procesos inflamatorios y necrosis tisular.
- Trastornos metablicos por intoxicacin.
- Procesos malignos: Carcinoma
- Hemorragias y hemlisis.
- Postesplenectoma.

28
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

Fig. 1 Neutrfilo en banda Fig. 2 Neutrfilos segmentados Fig. 3


Granulacin txica
y neutrfilo segmentado

Fig. 4 Vacuolizacin delcitoplasma Fig. 5 Cuerpos de Dohle


Fig. 6 Palillo de tambor

Fig. 7. Polisegmentacin

29
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

Desviacin a la izquierda: Significa el aumento de las formas inmaduras (en banda o


cayado, y juveniles) dentro de los neutrfilos. Constituye un importante valor diagnstico
y pronstico. Puede observarse en: infecciones e intoxicaciones.
Desviacin a la derecha: Corresponde a la hipersegmentacin nuclear. La mayora de
polimorfonucleares presenta ms de 5 lobulaciones. Ocurre en:
- Anemia perniciosa.
- Hipersegmentacin constitucional hereditaria.
- Reacciones mieloides de la sepsis.
- Afecciones hepticas.
- Leucemia mieloide.
- En la agona.
Existe disminucin de neutrfilos (neutropenia) en:
- Aplasia medular
- Mieloptisis de la mdula sea
- Agentes citotxicos
- Granulopoyesis inefectiva (anemias megaloblsticas).

4.1.2 Eosinfilos (Fig. 8)


Son parecidos a los neutrfilos, pero son algo mayores.
Generalmente el ncleo es bilobulado y lo que ms caracteriza
a esta clula es la presencia de grnulos color naranja-marrn
vistos claramente, muchas veces estos grnulos hacen que se
pierda la membrana celular por el rompimiento de sta, ya que
estas clulas son muy frgiles.
Patologa: Existe aumento de eosinfilos (eosinofilia) en:
Figura 8. Eosinofilo
- Infecciones parasitarias.
- Reacciones alrgicas.
- Enfermedades cutneas.
- Neoplasias.

4.1.3 Basfilos (Fig. 9)


La caracterstica ms importante de esta clula es la cantidad
de grnulos de color azul negruzco que se encuentra
ocupando toda la clula (esto cuando la clula es madura) y
parte de la clula cuando sta es inmadura. Presenta un
ncleo que muchas veces no logra observarse por la cantidad Figura 9. Basofilo
de grnulos que contienen histamina y heparina.
Patologa: Existe aumento (basofilia) en Leucemia por basfilos.

30
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

4.2 Agranulocitos
No poseen grnulos. Aqu tenemos a los linfocitos y monocitos.
4.2.1 Linfocitos: Linfocitos grandes y linfocitos pequeos.
4.2.1.1 Linfocitos grandes (Fig. 10)
Miden de 15m a 25m, presentan generalmente un ncleo ligeramente oval
discretamente indentado, la cromatina es densa pero no tanto como en el linfocito
pequeo (esto lo puede confundir con el monocito). Citoplasma abundante, azul plido y
puede contener grnulos azurfilos inespecficos.
4.2.1.2 Linfocitos atpicos (Fig. 11)
Llamados tambin virus linfocitos, clulas linfomonocitoides, clulas activadas de Turk,
clulas de Turk, virocitos, inmunoblastos, etc. Miden de 15m a 30m, ncleo irregular,
indentado, excntrico y puede observarse nucleolos. El citoplasma es amplio, color azul
tenue, y puede presentar grnulos azurfilos y vacuolas. Estas clulas pueden
observarse en mononucleosis infecciosa, hepatitis viral, herpes zoster, enfermedades
autoinmunes y normalmente pueden hallarse hasta en 5%.
4.2.1.3 Linfocitos con mitosis o binucleados (Fig. 12)
Pueden encontrarse en enfermedades virales.
4.2.1.4 Linfocitosvacuolados (Fig. 14)
En caso de linfocitos que reaccionan por efecto de la radiacin ultravioleta o respuesta a
tratamientos de quimioterapia.
4.2.1.5 Linfocitos pequeos (Fig. 10b)
Miden de 9m a 15m, presentan un ncleo que ocupa casi toda la clula, excntrico,
cromatina fuertemente densa. El citoplasma es escaso, basfilo y puede contener
grnulos azurfilos inespecficos.

Figura 10. Linfocitos Figura 11. Linfocitos Figura 12. Linfocitos Figura 13. Linfocitos
grandes y pequeos atpicos en mitosis vacuolados

31
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

4.2.2 Monocitos (Fig. 14)


Son los leucocitos de mayor tamao en la sangre (14m a
20m). Su ncleo es generalmente excntrico, aunque puede
ser central. Su cromatina nuclear es laxa, distribuida en forma
regular, la forma del ncleo generalmente es de una madeja
de lana o arrionada, aunque puede tener forma de un
abastonado. El citoplasma es de color gris y puede presentar
grnulos inespecficos (azurfilos) que carecen de significado
clnico.
Patologa: Los monocitos estn elevados en:
- Tuberculosis.
Figura 14. Monocito
- Endocarditis bacteriana.
- Enfermedades virales como sarampin, rubola, etc.
- Colagenosis, neoplasias, etc.

CRITERIOS PARA EL DESARROLLO DE UN LEUCOGRAMA


- Se considera leucocitosis cuando la cifra de glbulos blancos excede de 10 000.
- Se considera leucopenia cuando la cifra de glbulos blancos es inferior a 5 000.
- No olvidar que el ejercicio produce leucocitosis fisiolgica de consideracin, de
all que el recuento debe hacerse en condiciones basales.
- En los granulocitos debe informarse el nmero de lobulaciones del ncleo. A
mayor edad de la clula mayor el nmero de lbulos y lo contrario.
citoplasma

5. Materiales
- Aceite de inmersin
- Alcohol 70%
- Algodn
- Beaker con cloro al 5%
- Cloro 5%
- Colorante de Wright
- Laminas portaobjetos (3/A)
- Muestras de sangre
- Pizeta con agua de chorro
- Varillas para tincin

32
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

6. Procedimiento
- Preparar frotes sanguneos utilizando para ello una gota de sangre sobre un
portaobjetos limpio y desengrasado.
- Extender la gota de sangre con otro portaobjetos, procurando una capa fina de
clulas
- Teir los frotes con colorante de Wright durante 10 minutos.
- Agregar agua destilada hasta formar una capa tornasolada.
- Lavar.
- Limpiar los frotes con algodn y alcohol en la parte de abajo para quitar el
exceso de colorante.
- Examinar la lmina a pequeo aumento para comprobar si los elementos
celulares estn bien distribuidos. Si es favorable se examina con el objetivo de
inmersin.
- La parte ideal para visualizar clulas para la frmula leucocitaria es en la parte
final del cuerpo y comienzos de la cola, recorriendo la lmina de izquierda a
derecha o de arriba hacia abajo hasta contar 100 leucocitos incluidos los
agranulocitos y granulocitos. Aqu no se incluyen los elementos inmaduros de
sangre roja.
- Anotar a medida que se va contando, el nmero de cada una de las clases de
glbulos blancos observados.
- Determinar luego los porcentajes de cada uno de ellos para luego comparar con
los porcentajes normales.

LEUCOCITOS Valores relativos (%) Valores absolutos (%)

Neutrfilos segmentados 55-65 3000-5000


Neutrfilos en banda 3-5 150-400
Eosinfilos 0,5-4,0 20-350
Basfilos 0-0,5 10-60
Monocitos 4-8 100-500
Linfocitos 25-35 1500-400

7. Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad


Observar todas las normas de bioseguridad. Debe tomarse en cuenta que todo el
tiempo se est trabajando con muestras potencialmente infectivas.

8. Formato de presentacin de resultados


Entregar un informe completo de sus resultados.

33
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

9. Cuestionario
1. Indique las caractersticas de un frote sanguneo bien preparado, dibuje
2. Realice un cuadro comparativo de las anormalidades morfolgicas que pueden
observarse en los leucocitos diferenciando cada una de las clulas: Neutrfilos,
eosinfilos, linfocitos, basfilos y monocitos y haciendo un dibujo de cada una de
ellas
3. Qu colorantes componen el reactivo de Wright, y que componentes celulares tie
cada uno de ellos?
4. Por qu se debe de agregar buffer o agua de chorro durante la tincin?
5. Si su paciente tiene un conteo total de leucocitos de 8,000 clulas/mm3 y 3500
eosinofilos/mm3 Cul es el valor relativo de eosinofilos, expresado en porcentaje?
Deje constancia de sus clculos matemticos

34
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

INMUNODIFUSIN RADIAL
Precipitacin I
Prctica 4

1. Introduccin
El principio de la inmunodifusin es la precipitacin, la cual consiste en la unin del
antgeno con el anticuerpo estando ambos en solucin, los cuales al unirse forman un
complejo insoluble que precipita. Esta es una tcnica que permite determinar cualitativa
y cuantitativamente la concentracin de un antgeno y que utiliza un soporte o matriz de
agar en el que difunden Ag y Ac. Es un mtodo sensible que es usado clnicamente
para detectar niveles de protenas plasmticas. En la zona del agar en donde se
establece el equilibrio entre las concentraciones de Ag y de Ac se observa una banda
de precipitado. La difusin puede realizarse en una o dos dimensiones y adems en
tubo y en placa.
Las reacciones en geles fueron utilizadas primero para estudios inmunoqumicos a
mediados de la dcada de 1940, cuando Oudin introdujo la inmunodifusin simple en
una dimensin en tubos conteniendo gel de agar. El demostr que un sistema sencillo
Ag-Ac daba lugar a una banda de precipitina y que la mezcla de sistemas en el mismo
tubo daba bandas mltiples e independientes. Con estas observaciones, las reacciones
de precipitina se desarrollaron tanto cualitativas como cuantitativas.
Los mtodos en gel tienen significativamente mayor sensibilidad y mayor poder de
resolucin que las tcnicas sin medio de soporte. Adems, los geles actuales pueden
ser fotografiados y almacenados, ya que los inmunoprecipitados insolubles que se
forman en la zona de equivalencia, son atrapados permanentemente en la matriz del
gel.
Muchas modificaciones han surgido despus del mtodo de difusin de Oudin y
probablemente las ms usadas sean la inmunodifusin doble y la inmunodifusin radial
para estudios cualitativos y cuantitativos, respectivamente. La combinacin de la
electroforesis con la difusin ha resultado en mtodos muy importantes, que sern
tratados en otra prctica.

35
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

La difusin simple en agar se basa en la incorporacipon de un anticuerpo es en


agarosa fundida, la cual es vertida dentro de una caja de Petri la cual se deja solidificar.
Se cortan pequeos pozos dentro de la agarosa y estos son llenados con
concentraciones conocidas de antgeno correspondientes al anticuerpo, con el objeto de
construir una curva de calibracin. Las muestras desconocidas se colocan dentro de
los pozos. Los antgenos en solucin difundirn hacia fuera del pozo en un patrn
circular rodeando al pozo. El anticuerpo est presente en exceso y la difusin del
antgeno continuar hasta que se forme un precipitado antgeno-anticuerpo en forma de
anillo estable.

Figura 1. Inmunodifusin simple

Habr complejo Ag-Ac en toda la zona circundante al pozo dentro de la lnea de


precipitina. En esta lnea es donde est presente el mayor nmero de complejos, ya
que en ese punto el antgeno y el anticuerpo estn en proporciones iguales. Esta es
conocida como la zona de equivalencia.

Generalmente toma de 24 a 48 horas para que ocurra la difusin ptima y la


precipitacin se haga evidente. Para cada antgeno, se formar una precipitacin final
en anillo de cierto dimetro. De las concentraciones conocidas estndar, se traza una
curva de calibracin, colocando en los ejes: concentracin de antgeno vrs mediciones
de dimetro cuadrado de los anillos. A partir de esta curva de calibracin lineal, la
presencia y cantidad de antgeno en las muestras desconocidas pueden ser
determinadas.

2. Objetivos

36
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

- Comprender la naturaleza de la reaccin antgeno-anticuerpo in vitro.


- Conocer los factores que intervienen en la reaccin Ag-Ac y la forma en que
afectan el resultado final.
- Conocer la diferencia entre la reaccin primaria y las reacciones secundarias.
- Conocer los diferentes tipos de reacciones secundarias, sus ventajas,
desventajas y sus aplicaciones.

3. Alcance
Al final de la prctica el estudiante podr visualizar los tipos de reaccin Ag-Ac in
vitro que existen as como la aplicacin de cada una de ellas de acuerdo a sus
caractersticas individuales en el diagnstico serolgico.

4. Antecedentes
La reaccin antgeno-anticuerpo (Ag-Ac) es una unin molecular entre el epitopo
(antgeno) y la regin hipervariable del anticuerpo, mediante interacciones no
covalentes o secundarias. Estas uniones son dbiles tales como: puentes de hidrgeno,
fuerzas inicas y fuerzas de van der Waals. Estas fuerzas slo se convierten en
agentes de unin efectivos cuando ocurren a distancias muy cercanas. Las
interacciones hidrofbicas intervienen tambin y constituyen el 50% de la fuerza total.
De tal manera que debe ocurrir una combinacin de molculas complementarias entre
el sitio de unin del anticuerpo y el determinante antignico o epitopo. Mientras ms se
complementan las configuraciones moleculares, ms uniones secundarias se forman
entre el antgeno y el anticuerpo, y es ms difcil que ese complejo sea alterado por
fuerzas tales como la agitacin trmica.
La asociacin Ag-Ac est determinada por la ley de accin de masas, es reversible y
est definida por una constante de equilibrio K = AcAg/(Ac)(Ag).
La velocidad de la reaccin depende de tres factores:
- afinidad,
- avidez
- especificidad

Aunque estos dos trminos a menudo son usados indistintamente, no son


exactamente lo mismo. La avidez se refiere a la fuerza de unin mostrada por los
anticuerpos a un antgeno complejo (antgeno que contiene una variedad de epitopos), y
la afinidad se refiere a la fuerza de unin entre el anticuerpo y un epitopo; es la suma de
las fuerzas de atraccin sobre las de repulsin.
En la unin Ag-Ac ocurren dos reacciones:
- La reaccin primaria es la formacin del complejo Ag-Ac
- La reaccin secundaria es la evidencia de esos complejos mediante la
observacin de un fenmeno, el cual depende de la naturaleza del antgeno, las
propiedades de los anticuerpos y la presencia de otros factores en el medio de
reaccin.

37
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

La mayor aplicacin de estas reacciones in vitro son las pruebas serolgicas. Son
llamadas as porque es el suero el vehculo habitual de los anticuerpos. Sin embargo,
pueden realizarse en otros fluidos corporales tales como plasma, orina o lquido
cefalorraqudeo, en busca de antgenos o anticuerpos especficos.
Una prueba serolgica para un antgeno especfico idealmente es realizada usando
un reactivo de anticuerpo monoespecfico (que contenga anticuerpos reactivos con una
sola clase de epitopo). No siempre es posible obtener anticuerpos monoespecficos,
por lo que en estos casos son usados los antisueros polivalentes (que contienen
anticuerpos de ms de una especificidad.
Existen dos trminos importantes en los mtodos serolgicos:
Idealmente, las pruebas serolgicas debieran ser 100% especficas y 100%
sensibles. La especificidad se refiere a la relativa ausencia de reaccin cruzada de los
anticuerpos con sustancias que estn qumicamente relacionadas (pero no idnticas) al
antgeno contra el que se produjeron, y la sensibilidad se refiere a la cantidad ms
pequea de sustancia desconocida (antgeno o anticuerpo) que pueda ser detectada
por la prueba. Si una muestra reacciona cruzadamente con sustancias naturales
diferentes a las que se intentan determinar en la prueba, decimos que se obtiene un
resultado biolgico falso positivo (BFP). Si una prueba serolgica no detecta la
sustancia que se est buscando y que realmente s est contenida en la muestra, se
obtiene un resultado biolgico falso negativo (BFN). Si en cien muestras de suero que
contienen todos los mismos antgenos, la prueba produce cinco BFN, se dice que tiene
una sensibilidad del 95%.
Existen otros factores, tales como los errores tcnicos, que producen resultados
falsos positivos y negativos, pero no son considerados de origen biolgico.

5. Materiales
- Agarosa al 3% - Laminas con muestras positivas
y negativas para inmunodifuisn
- Alcohol al 70%
radial
- Algodn
- Muestras de suero desconocidas
- Antiglobulina humana
- Pipetas automticas de 20 uL
- Beaker con cloro al 5%
- Pipetas serolgicas de 10 mL
- Cmara hmeda
- Pipetores o bulbos
- Cloro al 5%
- Puntas amarillas para pipeta
- Lmina porta objetos de vidrio automtica
- Rosetones para perforar las
laminas de agarosa
6. Procedimiento
Preparacin de una lmina con agarosa:
- Colocar la lmina horizontalmente y con la ayuda de un hisopo estril
embadurnar con agarosa al 3% toda la superficie. Dejar secar por unos
minutos.

38
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

- Con la ayuda de una pipeta serolgica verter el contenido del tubo con agarosa
12 % fundida a una temperatura de unos 37-40C.
- Dejar enfriar. Horadar los pozos sobre el agar como se indica en la plantilla.
Marcar la esquina superior derecha haciendo un corte sobre el agar.
- Colocar en cmara hmeda y refrigerar hasta que se vaya a utilizar.
- Abrir con la ayuda de la plantilla cinco agujeros en el centro de la lamina
- Colocar en el centro el antgeno a utilizar (antiglobulina humana) y en los
agujeros de la periferia suero desconocido (Anticuerpos)
- Observar la reaccin

7. Interpretacin de resultados
Interpretar las lminas de difusin en agar, determinando en que pozos hay reaccin
Ag-Ac
Interpretacin:

Rosetn 1
1. Positivo
2. Positivo 1 1
3. Negativo Rosetn 4
6 2 6 2
4. Negativo Todos negativos
5. Negativo
6. Negativo 5 3 5 3
4 4

Rosetn 2
1. Positivo 1
2. Positivo 6 2
3. Negativo
4. Negativo
5. Positivo 5 3
6. Negativo
4

Existen tres tipos de reacciones


- Reaccin de identidad: los dos sistemas difunden en una nica banda de
precipitacin.
- Reaccin de no identidad: cada sistema reacciona independientemente,
originando bandas de precipitacin que se cruzan.
- Reaccin de identidad parcial: Se produce cuando uno de los antgenos tiene
menos de un componente y es capaz de dar una reaccin cruzada con un
anticuerpo elaborado contra un antgeno ms simple. En este caso las bandas
de ambos sistemas se unen y funden parcialmente en una banda, apareciendo
una prolongacin o espoln. Esto indica que en este antgeno hay componentes
antignicos no compartidos.

39
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

8. Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad


Observar todas las normas de bioseguridad. Debe tomarse en cuenta que todo el
tiempo se est trabajando con muestras potencialmente infectivas.

9. Formato de presentacin de resultados


Entregar un informe completo sobre sus resultados obtenidos.

10. Cuestionario
a. Qu aplicaciones tiene la inmundodifusin radial en el diagnstico de
enfermedades?
b. Por qu se utiliza agarosa al 3% para la prueba de inmunodifusin radial?
c. Qu diferencia existe entre inmunodifusin simple y doble?
d. Mencione tres ventajas de la tcnica de inmunodifusin
e. Mencione tres desventajas de la tcnica de inmunodifusin

11. Bibliografa
- Rose NR et al. Manual of Clinical Laboratory Immunology. 6th ed. Washington,
ASM, 2000.
- Stites D et al. Inmunologa Clnica. Mxico, El Manual Moderno, 1998.

40
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

REACCIN DE FLOCULACIN
Precipitacin II
Prctica 5

1. Introduccin
Los precipitados inmunolgicos son complejos insolubles formados por la unin de
anticuerpos (precipitinas) y antgenos (precipitgenos) que se encuentran en solucin.
Para la formacin de una malla de precipitado se requiere que tanto las precipitinas
como los precipitgenos sean al menos bivalentes.
Esta reaccin tiende a ocurrir ms rpido con el aumento de la temperatura, aunque
la precipitacin ms completa es obtenida usualmente a temperaturas bajas (0-4C).
Est determinada por el fenmeno de zona, lo cual quiere decir que la mxima
precipitacin ocurre en un punto o zona de equivalencia que para poder ser visible es
necesario determinar las proporciones ptimas de los reactivos.

2. Objetivos
- Comprender las bases tericas de la reaccin de precipitacin
- Conocer los diferentes factores que contribuyen a la reaccin
- Conocer las distintas formas de reacciones basadas en la precipitacin de Ag-Ac
- Conocer las aplicaciones clnicas de la precipitacin

3. Alcance
Al final de la prctica se pretende que el estudiante tenga una visin clara del
fenmeno de precipitacin del complejo antgeno-anticuerpo y que adquiera las
destrezas para aplicar diferentes metodologas basadas en dicha reaccin.

4. Antecedentes
La precipitacin de los complejos antgeno-anticuerpo en solucin, ha sido utilizada
desde 1920 para la cuantificacin de antgenos y anticuerpos.
Todas las reacciones de precipitacin estn basadas en los mismos principios fsico-
qumicos. Los aspectos bsicos de exceso y de equivalencia de antgeno o anticuerpo
son de particular importancia; de hecho, la relativa solubilidad de los complejos con un
exceso significativo de cualquiera de los reactantes y la insolubilidad de los mismos en
la zona cercana a la equivalencia (proporciones ptimas), son crticos para el proceso
de visualizacin.
La reaccin de precipitacin tiene base en la reaccin fundamental antgeno-
anticuerpo in vivo, ya que la formacin de este complejo es el primer paso en la

41
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

remocin de agentes infecciosos del cuerpo por el sistema inmune. Estos complejos
forman precipitados que pueden ser depurados por diversos mecanismos.

Tcnica de VDRL
Las "reaginas" presentes en individuos infectados por T. pallidum se detectan en
suero por la reaccin con un antgeno cardiolipnico purificado y estabilizado conocido
como reactivo de VDRL (Venereal Diseases Research Laboratory). Si la muestra
contiene reagina, sta se unir al antgeno produciendo una floculacin visible en
microscopio. Una tcnica modificada es la de USR (UnheatedSerumReagin) en la que
no es necesario inactivar la muestra y disminuye las reacciones inespecficas con el
empleo de antgeno altamente purificado y el agregado de cloruro de colina.

Interpretacin de los resultados


Reactivo: presencia de floculacin.
No reactivo: ausencia completa de floculacin.
Prueba semicuantitativa: el ttulo estar dado por la inversa de la ltima dilucin que se
observe reactiva.

Limitaciones de la prueba
Resultados falsamente positivos pueden ser observados en individuos con cuadros
patolgicos diversos como hepatitis, influenza, brucelosis, lepra, malaria, asma,
tuberculosis, cncer, diabetes y enfermedades autoinmunes.
Estos casos no son muy comunes y generalmente presentan reacciones con ttulos
bajos y una historia clnica que no coincide con las caractersticas de sfilis.
Es imprescindible por estos motivos ante toda prueba cualitativa reactiva realizar la
prueba semicuantitativa.
Resultados falsamente negativos pueden observarse cuando se presenta el
fenmeno de prozona.

5. Materiales
- Alcohol al 70%
- Algodn
- Agua destilada
- Beaker con cloro al 5%
- Cloro al 5%
- Lminas de reaccin de VDRL
- Micropipetas automticas y puntas de 5-50 l
- Muestras desconocidas.

42
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

- Papel aluminio
- Reactivo de VDRL
- Toallas de papel

6. Procedimiento
Floculacin: Reaccin de VDRL
- Tomar la placa e identificar los pozos como control positivo, control negativo y
muestra.
- Colocar una gota de reactivo de VDRL en cada pozo
- Con la pipeta colocar una gota de la muestra (pozo de Mx) y una de control
(pozo control)
- Mover la placa suavemente
- Observar en el microscopio la formacin de precipitado y cuantificar por cruces,
utilizando el aumento de 10x.

7. Interpretacin:

Reactivo No reactivo

8. Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad


Tener en mente que trabaja con materiales biolgicos, potencialmente infecciosos.
Aplicar las medidas de bioseguridad tanto personales, como en el descarte de los
materiales.

9. Formato de presentacin de resultados


Presentar los resultados en forma grfica y en forma escrita, con una discusin de
los mismos.

10. Bibliografa de referencia


- Rose NR et al. Manual of Clinical Laboratory Immunology. 6th ed. Washington,
ASM, 2000.

43
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

- Stites D et al. Inmunologa Clnica. Mxico, El Manual Moderno, 1998.

11. Cuestionario
1. De la sfilis investigue
a. Agente causal
b. Etapas clnicas de la enfermedad
2. Qu diferencia existe entre la prueba de VDRL y RPR?
3. Explique,Por qu el VDRL no es una prueba confirmatoria para sfilis?
4. Qu otras enfermedades autoinmunes pueden dar un falso positivo en la prueba de
VDRL
5. Qu otras pruebas inmunolgicas se pueden utilizar para el diagnstico de sfilis?,
mencione por lo menos dos

44
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

REACCIONES DE AGLUTINACIN
Prctica 6

1. Introduccin
Las reacciones de aglutinacin consisten en la agregacin de material en partculas,
tales como clulas o material sinttico. En este caso, el antgeno o el anticuerpo se
encuentra en la superficie de una partcula (inmunolgicamente inerte) y la formacin
del complejo inmune es evidente por formar un entramado visible. La reaccin toma
lugar sobre la superficie de las partculas (o clulas) en donde el antgeno se une a los
sitios de unin especfica de los anticuerpos. La aglutinacin es un ejemplo de una
reaccin inmune secundaria.
Las primeras reacciones de aglutinacin involucraban aglutininas bacterianas en
experimentos llevados a cabo por los primeros bacterilogos. Este trabajo llev a la
formulacin de la idea de anticuerpos. La utilidad de este simple procedimiento dio
lugar a la era del serodiagnstico en microbiologa. El uso prctico de los
procedimientos de aglutinacin se ha expandido de las reas de la infectologa e
inmunohematologa para el estudio de enfermedades infecciosas, autoinmunes,
ensayos endcrinos y otros. Las tcnicas clsicas de aglutinacin directa han dado
lugar a una variedad de tcnicas que involucran el recubrimiento de partculas
portadoras con antgeno (o anticuerpo), ya sea por procesos de adsorcin pasiva o a
travs de la unin covalente de los antgenos al portador, mediante una manipulacin
qumica.

2. Objetivos
- Comprender las bases tericas de la reaccin de aglutinacin
- Conocer los diferentes factores que contribuyen a la reaccin
- Conocer las distintas formas de reacciones basadas en la aglutinacin
- Conocer las aplicaciones clnicas de la aglutinacin

3. Alcance
Al final de la prctica se pretende que el estudiante tenga una visin clara del
fenmeno de aglutinacin del complejo antgeno-anticuerpo y que adquiera las
destrezas para aplicar diferentes metodologas basadas en dicha reaccin.

4. Antecedentes
Bordet propuso que la aglutinacin tomaba lugar en dos fases: a) la combinacin
especfica del anticuerpo y el antgeno y b) la agregacin visible de las partculas.
Ambas fases son mediadas por la atraccin especfica entre el anticuerpo y el antgeno.
Las partculas tales como los eritrocitos y las bacterias, poseen cargas ligeramente
negativas en suspensin (potencial z) y se repelen unos a otros. La reduccin de la
fuerza inica mediante protenas u otras sustancias inorgnicas, reduce las distancias

45
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

entre las partculas, permitiendo la formacin de puentes y de una malla del complejo
Ag-Ac visible: la aglutinacin.
Aunque la carga es importante para determinar que la aglutinacin sea completa, es
evidente que otros efectos juegan un papel en la aglutinacin de las partculas por los
anticuerpos. La viscosidad del medio de prueba, por ejemplo, aumenta la aglutinacin.
La principal desventaja del fenmeno de aglutinacin es que la reaccin es semi-
cuantitativa. Sin embargo, el hecho de que numerosos sistemas permiten reacciones
de aglutinacin, la simplicidad bsica del sistema de aglutinacin desarrollado en la
actualidad y la alta sensibilidad de esta reaccin, la hace de amplia aplicacin y uso.
La exitosa aplicacin de las reacciones de aglutinacin para la deteccin de
antgenos o anticuerpos, requiere una partcula estable, un antgeno puro y un
anticuerpo especfico. Generalmente, el uso del fenmeno de aglutinacin tambin
requiere el conocimiento de la posibilidad de que la reaccin se realice. Los anticuerpos
IgM en el medio de prueba usualmente agregan al antgeno sobre las partculas, en
base al tamao de la molcula de IgM, mientras que los anticuerpos de tipo IgG por s
mismos, no pueden completar la reaccin. Se dice que la IgM es unas 750 veces ms
eficiente que la IgG en las reacciones de aglutinacin.
Tambin debe tenerse en mente que el llamado fenmeno de zona (pro-zona)
puede contribuir a que la reaccin de aglutinacin no sea completa, an con ttulos
adecuados de anticuerpos IgM en el medio. Este fenmeno puede producirse por
diversos factores: por ejemplo, un suero de baja dilucin puede no ser capaz de agregar
partculas debido al recubrimiento de los sitios antignicos con un gran nmero de
anticuerpos individuales, situacin que bajo las condiciones de equilibrio, disminuye el
nmero de complejos. De forma similar, la cantidad de reaccin tambin puede
disminuir cuando se aumenta la concentracin de antgeno. El fenmeno de prozona
tambin puede ser producido por la alteracin de protenas (por calor, por ejemplo) o
por interferencia con la aproximacin excesiva de partculas por la presencia de material
coloidal extrao.
En general, las reacciones de aglutinacin pueden ser observadas a simple vista,
sin necesidad de aumento ni la ayuda de microscopio.
En la actualidad, las partculas ms empleadas como portadoras de antgeno o
anticuerpo en las reacciones de aglutinacin son: ltex, partculas de gelatina y
partculas de carbn. Los eritrocitos son empleados para las reacciones de
hemaglutinacin.
Los ensayos de aglutinacin puede clasificarse en:
- Ensayo de aglutinacin directa: es la clsica reaccin que involucra la
agregacin de clulas o antgenos en partculas.
- Ensayo de aglutinacin indirecta o pasiva: el desarrollo de esta tcnica tiene
numerosas ramificaciones en el laboratorio. Esta consiste en la aglutinacin de
clulas o partculas recubiertas artificialmente con antgeno soluble.
- Ensayo de aglutinacin pasiva en reversa: es la modalidad de la aglutinacin, en
la que el anticuerpo est unido a las partculas.

5. Materiales

46
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

- Agua destilada
- Alcohol al 70%
- Algodn
- Aplicadores
- Beaker con cloro al 5%
- Calibradores con concentraciones conocidas de antgeno de ASO o FR
- Cloro al 5%
- Descartadores de punzo cortantes
- Lminas de reaccin de fondo oscuro
- Micropipetas automticas y puntas de 5-50 l
- Muestras desconocidas.

6. Procedimiento
Aglutinacin pasiva de ltex: Deteccin de Factor Reumatoideo, Antiestreptolisina O.
- Lleve los reactivos, sueros control y muestras de suero de pacientes a
temperatura ambiente.
- Agregue sobre el rea de reaccin 50 l de suero o control.
- Agite el reactivo de ltex, asegurndose que est en homogneo antes de
usarlo.
- Agregue una gota de la suspensin de partculas antignicas sobre la gota de
suero.
- Con la ayuda de un aplicador, distribuya la mezcla en el rea de reaccin,
homogneamente.
- Agitar por 2-5 minutos sobre un agitador mecnico o con un movimiento rotatorio
y gentil entre sus manos.
- Realice la lectura de resultados despus del tiempo de agitacin, teniendo
cuidado que la mezcla no se seque.

7. Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad


Recuerde que las muestras de pacientes son potencialmente infectivas, por lo que
debe observar las medidas universales de bioseguridad.
Aplique tambin las medidas de bioseguridad en el descarte de los materiales.

8. Formato de presentacin de resultados


Presentar los resultados en forma escrita, con una discusin de los mismos.

47
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

Investigue las aplicaciones de la reaccin de aglutinacin y especficamente sobre la


deteccin de Factor Reumatoideo y Antiestreptolisina O sus usos y su importancia.

9. Bibliografa de referencia
- Rose NR et al. Manual of Clinical Laboratory Immunology. 6th ed. Washington,
ASM, 2000.
- Stites D et al. Inmunologa Clnica. Mxico, El Manual Moderno, 1998.

10. Cuestionario
a. Qu diferencias existen entre las reacciones de aglutinacin y precipitacin?
b. Investigue sobre la importancia de detectar el Factor Reumatoideo(FR) y la
Antiestreptolisina O (ASO) en un paciente.
c. Qu es la PCR? En qu patologas se encuentra elevada?
d. Esquematice la reaccin que se lleva a cabo durante la aglutinacin con el reactivo
de PCR, ASO y FR, indicando si se detecta Ag o Ac en la muestra del paciente y el
contenido de los reactivos (tome en cuenta que cada uno mide Ag o/y Ac en la
muestra del paciente y que los reactivos contienen diferentes Ag o Ac)
e. Describa en que consiste la prueba RPR

11. Anexo
Figura 1. Reaccin de aglutinacin

48
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

REACCIONES DE HEMAGLUTINACIN DIRECTA E INDIRECTA


(Grupo ABO y Rh)
Prctica 7

1. Introduccin
La hemaglutinacin es una reaccin de aglutinacin, especficamente involucrando
al eritrocito como el portador del antgeno o del anticuerpo. La determinacin de grupo
sanguneo se basa en la reaccin antgeno-anticuerpo, la cual se puede llevar a cabo
de forma directa (determinando los antgenos presentes en la superficie del eritrocito del
paciente al contacto del reactivo anti A, B, AB o D) o indirecta (determinando los
anticuerpos presentes en el suero del paciente y enfrentndolo a eritrocitos conocidos
(A, B o AB).

2. Objetivos
- Comprender las bases tericas de la reaccin de aglutinacin para la
determinacin de grupo sanguneo
- Conocer los diferentes factores que contribuyen a la reaccin

3. Alcance
Al final de la prctica se pretende que el estudiante tenga una visin clara del
fenmeno de aglutinacin del complejo antgeno-anticuerpo para la determinacin de
grupo sanguneo ABO y RH y que adquiera las destrezas para aplicar diferentes
metodologas basadas en dicha reaccin.

4. Antecedentes
El grupo sanguneo son los tipos en que se ha clasificado la sangre de las personas
en relacin con la compatibilidad de los hemates y suero de otro individuo que la
recibe.
Segn la clasificacin de Landsteiner (clasificacin hoy universal) y se denominan:
O, A, B, AB. Se caracterizan por las diferentes combinaciones de dos aglutingenos
existentes en los glbulos rojos y de dos aglutininas contenidas en el suero.
Los eritrocitos poseen antgenos en su membrana que son distintos para cada
individuos; las pruebas utilizadas para establecer la hemoclasificacin sangunea
relacionada a los diversos grupos sanguneos, aprovechan las caractersticas
inmunolgicas que expresa cada individuo de acuerdo a su particular codificacin
gentica. En dichas pruebas se evidencian los antgenos y/o anticuerpos del grupo
sanguneo, de acuerdo a su comportamiento in vitro.
En el sistema ABO se investigan tanto antgenos o aglutingenos como los
anticuerpos o isoaglutininas naturales.

49
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

El factor Rh es un aglutingeno encontrado en 1940 por Landsteiner y Weiner, en


los glbulos rojos de primates (Macacusrhesus) y que tambin existe normalmente en el
85% de los humanos, que por esta causa se denomina Rh positivos. En el sistema Rh,
existen varios antgenos: D, C, c, E, e; sin embargo, de rutina, solo se determina la
presencia del antgeno D en los eritrocitos y de acuerdo a su presencia o ausencia se
dice que un individuo es Rh D positivo o Rh D negativo.

5. Materiales
- Alcohol al 70%
- Algodn
- Beaker con cloro al 5%
- Cloro al 5%
- Descartadores de punzo cortantes
- Glbulos rojos A, B y O
a. Lminas de reaccin de fondo oscuro
- Palillos
- Suero Anti A, Anti B, Anti A,B y anti D (anti Rh)
- Laminas portaobjetos
- Tubos de ensayo
- Suero de grupos A, B, AB y O

6. Procedimiento
Hemoclasificacin directa
Mtodo en lmina
- Marcar tres lminas portaobjeto como A, B, AB y D.
- Adicionar una gota de anti A, anti B, anti AB y anti D en su lugar
correspondiente.
- Agregar una gota de eritrcitos del paciente a cada antisuero.
- Mezclar cada preparacin con un palillo de madera.
- Rotar manualmente cada lamina con cuidado de que no se mezclen.
- Observar aglutinacin y registrar los resultados:

POSITIVO: La aglutinacin fuerte de los glbulos rojos en presencia de cualquier


anticuerpo ABO y Rh. Las reacciones positivas muestran 3+ de aglutinacin.

NEGATIVO: La presencia de una suspensin uniforme (O) de glbulos rojos.

Mtodo en tubo

50
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

- Separar el plasma de los eritrocitos de la muestra desconocida.


- Lavar los glbulos rojos del paciente 3 veces consecutivos en solucin salina y
preparar una suspensin final al 2% en dicha solucin.
- Rotular cuatro tubos con Anti A, Anti B, Anti AB y Anti D.
- Colocar una gota de suero Anti A, Anti B, Anti AB y Anti D en el tubo respectivo.
- Agregar una gota de la suspensin al 2 % de eritrocitos a cada uno de los tubos.
- Mezclar cada tubo y centrifugar 15 30 segundos a 3400 rpm o 1 minuto a 1000
rpm.
- Resuspender suavemente los botones celulares y observar aglutinacin:
(4+) Botn completo, fcilmente desprendible, fondo limpio
(3+) Botn disperso, 2 o 3 partes, fondo limpio
(2+) No hay botn, pequeos grumos
(1+) Pequeos grumos
(0) No hay seales de grumos (aglutinacin)

Hemoclasificacin inversa
Mtodo en tubo
- Marcar tres tubos como A, B y O.
- Adicionar dos gotas de suero del paciente a cada tubo.
- Agregar una gota de suspensin de eritrocitos del grupo A al tubo rotulado como
A, una gota de eritrocitos del grupo B al tubo rotulado como B y una gota de
eritrocitos del grupo O al tubo rotulado como O.
- Incubar de 5 15 minutos a temperatura ambiente
- Centrifugar por 15 30 segundos a 3400 rpm o 1 minuto a 1000 rpm.
- Resuspender los botones celulares y observar aglutinacin.
- Interpretar los resultados.

7. Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad


Recuerde que las muestras de pacientes son potencialmente infectivas, por lo que debe
observar las medidas universales de bioseguridad.
Aplique tambin las medidas de bioseguridad en el descarte de los materiales.

8. Formato de presentacin de resultados


Presentar los resultados en forma escrita, con una discusin de los mismos.

9. Bibliografa de referencia
- Rose NR et al. Manual of Clinical Laboratory Immunology. 6th ed. Washington,
ASM, 2000.

51
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

- Stites D et al. Inmunologa Clnica. Mxico, El Manual Moderno, 1998.

10. Cuestionario
a. Cules son los carbohidratos presentes en los grupos A, B, AB y O
b. Complete el siguiente cuadro
DONADOR DE Antgeno en la superficie del Anticuerpo en el plasma
ERITROCITOS eritrocito
Grupo 0
Grupo A
Grupo B
Grupo AB
c. Qu inmunoglobulina son los anticuerpos presentes en el grupo ABO?
d. Qu inmunoglobulina son los anticuerpos presentes en el Rh?
e. Por qu la reaccin de aglutinacin es ms evidente en la determinacin de ABO
que en Rh?, explique su respuesta

11. Anexo
Figura 1. Antgenos presentes en los
grupos sanguneos ABO

Figura 2. Esquema de reaccin en la


prueba de tipificacin directa de grupo
sanguneo ABO

52
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

53
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

HEMAGLUTINACIN PASIVA
Practica 8

1. Introduccin
La hemaglutinacin indirecta (HAI), tambin llamada hemaglutinacin reversa
pasiva, se basa en la propiedad que tienen los anticuerpos de producir aglutinacin
especfica en presencia de glbulos rojos sensibilizados con los correspondientes
antgenos.
En el suero existen anticuerpos inespecficos (heterfilos) que son capaces de
aglutinar glbulos rojos de distintas especies. Su presencia se investiga enfrentando el
suero con glbulos rojos no sensibilizados. Los anticuerpos interferentes se eliminan
mediante tratamiento con 2-mercaptoetanol.

2. Alcance
En esta prctica el estudiante comprender los conceptos bsicos de la
hemaglutinacin pasiva y su aplicacin en el diagnstico de la enfermedad de Chagas.

3. Objetivos Especficos
Que el estudiante:
- Sea capaz de describir el principio de la hemaglutinacin pasiva.
- Comprenda el uso eritrocitos como fuente de antgenos
- Diferencie entre un eritrocito sensibilizado y no sensibilizado
- Conozca las ventajas y desventajas de sta tcnica

4. Materiales y equipo
- Alcohol al 70% - Kit de hemaglutinacin
- Algodn - Pipetas automaticas de 25 uL
- Beaker - Pizetas cloro 5%
- Bolsas blancas y rojas - Pizetas etanol 70%
- Cloro al 5% - Placas de fondo en U
- Descartadores de punzo - Puntas amarillas
cortantes
- Torundas de algodn
- Frasco vaco de 10 mL
- Sueros control
- Goteros de 25 uL
- Guantes, S, M y L

54
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

5. Antecedentes
Aglutinacin pasiva: los anticuerpos se dirigen contra molculas que se han
adherido intencionalmente a una partcula que acta como medio de soporte pasivo
(eritrocitos).
Es una tcnica que puede emplearse para la determinacin de anticuerpos en
muestras de pacientes en enfermedades como sfilis, chagas, toxoplasmosis, etc.
Reactivos provistos en el kit:
- Antgeno HAI: glbulos rojos de carnero sensibilizados con antgenos
citoplasmticos del agente infeccioso a determinar
- Glbulos rojos no sensibilizados: suspensin al 1% de eritrocitos de carnero no
sensibilizados, para control de heterofilia.
- 2-Mercaptoetanol: alcohol utilizado para eliminar anticuerpos interferentes
- Control Positivo: suero inactivado conteniendo anticuerpos contra el agente
infeccioso a determinar
- Control Negativo: suero no reactivo, inactivado

6. Procedimiento
- Con microgotero de 25 ul, colocar una gota de Diluyente de Sueros HAI en todos
los pocillos a usar de la policubeta.
- Tomar una alcuota de cada suero a ensayar con microdilutores de 25 ul (uno
para cada muestra). Colocar cada microdilutor en el primer pocillo y rotarlo por lo
menos 10 veces para asegurar una correcta dilucin de la muestra.
- Realizar diluciones seriadas a partir del primer pocillo (dilucin 1/2), pasando los
microdilutores al pocillo siguiente (dilucin 1/4) y as sucesivamente hasta la
dilucin que se desea investigar (por ejemplo: 1/8, 1/16, 1/32), rotando en cada
paso el microdilutor por lo menos 10 veces para asegurar una correcta dilucin
de la muestra. Si se emplea una micropipeta automtica de 25 ul para la toma
y/o dilucin de la muestra, homogeneizar por carga y descarga. Transferir 25 ul
de pocillo a pocillo hasta la dilucin que se desee investigar. Descartar los
ltimos 25 ul.
- Colocar en los pocillos conteniendo las diluciones y 1/4, una gota (25 ul) de
GR no sensibilizados para control de heterofilia.
- En el resto de los pocillos, agregar una gota (25 ul) de Antgeno HAI.
- Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta.
- Dejar en reposo, a resguardo de vibraciones, durante 90 minutos.
- Leer a partir de los 90 minutos. Se puede aumentar la nitidez de la apreciacin,
leyendo sobre un espejo, iluminando la placa desde arriba e interponiendo un
papel blanco y traslcido entre la policubeta y la fuente de luz.

55
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

7. Interpretacin
- No reactivo: presencia de un sedimento en forma de botn.
- Reactivo: formacin de una pelcula o manto en el fondo de los pocillos. En caso
de observar la presencia de un pequeo anillo de bordes regulares, la muestra
se considerar dudosa y deber ser ensayada por otro mtodo

8. Formato de presentacin de resultados


Realice una discusin de resultados y conclusiones de la teora e indique con un
esquema el principio de la prueba (anexo)

9. Precauciones
Los Reactivos Provistos son para uso diagnstico "in vitro". Las muestras deben
manipularse como si fueran capaces de transmitir la infeccin. Los sueros controles
han sido examinados para antgeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) y virus de
inmunodeficiencia humana (HIV) encontrndose no reactivos. Sin embargo deben
emplearse como si se tratara de material infectivo.
Todos los materiales empleados en el ensayo deben ser destruidos a fin de
asegurar la inactivacin de agentes patgenos.
No intercambiar reactivos de distintos equipos y lotes.

10. Bibliografa de referencia


- Rose NR et al. Manual of Clinical Laboratory Immunology. 6th ed. Washington,
ASM, 2000.
- Mazza, S. - VI Congreso Nacional de Medicina (Crdoba), pg. 155 (1938).
- Cerisola, J.A. - La Prensa Mdica Argentina 49/34:1761 (1962).
- Fontenla S., Moretti, E. y Gonzlez, G. - 50 Triduo de la ABA, Huerta Grande
(Crdoba), 1985.
- Basso, A. y col. - 50 Triduo de la ABA. Huerta Grande (Crdoba), 1985.
- Lorenzo , L.; Capriotti, G.; Rojkn, F. - Rev. Arg. Transf. XVII/ 1: 51, 1991.
- Ministerio de Salud y Accin Social, Instituto Nacional de Parasitologa "Doctor
Mario FatalaChabn" - Normas para el diagnstico de la infeccin chagsica -
Resolucin ministerial 523/97, 1998

11. Cuestionario
a. Defina que es un eritrocito sensibilizado
b. Por qu se utiliza eritrocitos no sensibilizado como control?
c. Cul es el procedimiento in vitro de sensibilizacin de eritrocitos con antgenos
de un agente causal de enfermedad?

56
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

d. Describa brevemente la inmunopatologa de la enfermedad de la prueba utilizada


e. Si usted tiene un paciente cuyo ttulo de anticuerpos es 128, y le da tratamiento.
Al realizarle nuevamente la prueba el ttulo es 256. Explique que est
sucediendo con el paciente. Explique, Qu hara en este caso?
f.
12. Anexo
Figura 1. Esquema de la prueba

25 uL 25 uL 25 uL

1 2 3 4 5 6 7 8 9
Sin 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 Descartar
dilucin ltimos
50 uL 25 uL 25 uL 25 uL 25 uL 25 uL 25 uL 25 uL 25 uL 25 uL
Mx mx + mx + mx + mx + mx + mx + mx + mx +
+ 25 uL 25 uL 25 uL 25 uL 25 uL 25 uL 25 uL 25 uL
ES diluyente diluyente diluyente diluyente diluyente diluyente diluyente diluyente
+ + + + + + + +
ES ES ES ES ES ES ES ES
ES: Eritrocitos sensibilizados

Figura 2. Interpretacin de resultados

57
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

INMUNOCROMATOGRAFA

Prctica 9
1. Introduccin
La inmunocromatografa es una de las tcnicas de inmunodiagnstico ms
modernas cuyas principales ventajas son la sencillez y rapidez de la prueba.
Actualmente se utiliza como prueba rpida de tamizaje para la deteccin de antgenos o
anticuerpos presentes en el suero del paciente.

2. Objetivos
- Explicar el fundamento inmunolgico de la prueba de inmunocromatografa
- Conocer las aplicaciones de la prueba
- Conocer los diferentes tipos de pruebas que existen en el mercado basados en
esta tcnica-

3. Alcance
Al final de la prctica el estudiante podr describir el principio de las pruebas de
inmunocromatografa, as como su interpretacin.

4. Antecedentes
La inmunocromatografa se basa en la migracin de una muestra a travs de una
membrana de nitrocelulosa. La muestra es aadida en la zona del conjugado, el cual
est formado por un anticuerpo especfico contra uno de los eptopos del antgeno a
detectar y un reactivo de deteccin. Si la muestra contiene el antgeno a problema, ste
se unir al conjugado formando un complejo inmune y migrar a travs de la membrana
de nitrocelulosa. De lo contrario, migrarn el conjugado y la muestra sin unirse.
La zona de captura est formada por un segundo anticuerpo especfico contra otro
eptopo del antgeno. Al llegar la muestra a esta zona, los complejos formados por la
unin del antgeno y conjugado quedarn retenidos y la lnea se colorear (muestras
positivas). En el caso contrario las muestras son negativas.
La zona control est formada por un tercer anticuerpo que reconoce al reactivo de
deteccin. Cuando el resto de muestra alcanza esta zona, el anticuerpo se unir al
conjugado libre que no ha quedado retenido en la zona de captura. Esta lnea es un
control de que el ensayo ha funcionado bien, porque se colorea siempre, con muestras
positivas y negativa.

58
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

Figura 1. Esquema de la prueba de inmunocromatografa

5. Materiales
- Pipetas pasteur
- Pruebas rpidas de inmunocromatografa
- Papel mayordomo
- Descartador de punzocortantes
- Muestras de suero
- Beaker con cloro

6. Procedimiento
- Anotar cada una de las pruebas a realizar
- Colocar una gota de muestra de suero de paciente en cada una de las pruebas
rpidas que se le proporcionan.
- Dejar que la muestra fluja a lo largo de la prueba de inmunocromatografa
- Anotar los resultados positivos y negativos

7. Interpretacin de resultados
o Positivo: dos lneas en el casete
o Negativo: una lnea en el casete

NOTA: Si no aparece la lnea de control, la prueba debe de repetirse.

8. Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad


Recuerde que las muestras de pacientes son potencialmente infectivas, por lo que
debe observar las medidas universales de bioseguridad.
Aplique tambin las medidas de bioseguridad en el descarte de los materiales.

9. Formato de presentacin de resultados


Presentar los resultados en forma escrita, con una discusin de los mismos.

59
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

10. Cuestionario
a. Defina que es conjugado
b. Escriba tres ventajas y tres desventajas de estas pruebas
c. Mencione cinco aplicaciones en el diagnstico de enfermedades que se pueden
realizar por inmunocromatografa
d. De qu est compuesto el control interno de la prueba de
inmunocromatografa?
e. Cules son las razones por las cuales se considera una prueba de
inmunocromatografainvalida?

11. Bibliografa
Inmunocromatografa. Disponible en
http://es.scribd.com/doc/36487446/ INMUNOCROMATOGRAFIA-pba-rapida.
http://www.socpemi.org/Doc/pruebasrapidas.pdf
http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/mariamc/lacteos/practica8.htm

60
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

ENSAYO INMUNOENZIMTICOS (ELISA)


Prctica 10

1. Introduccin
La tcnica ELISA (ensayos de inmunoabsorbencia ligada a enzimas) se basa en la
deteccin de un antgeno inmovilizado sobre una fase slida mediante anticuerpos que
directa o indirectamente producen una reaccin marcada enzimticamente cuyo
producto, puede ser medido espectrofotomtricamente. La cantidad de antgeno se
determina comparando la curva estndar generada con cantidades conocidas del
antgeno.
Ventajas: verstil, robusto, simple en su realizacin, emplea reactivos econmicos y
consigue, mediante el uso de la fase slida, de una separacin fcil entre la fraccin
retenida y la fraccin libre, es fcil de adaptar a analizadores automticos. Este se
caracteriza por ser un mtodo cuantitativamente exacto por la medicin de la velocidad
de la reaccin y la duracin de la reaccin en un instante fijo nico
Desventajas: para adaptarlo a analizadores automticos se necesitan de reactivos muy
purificas, lo que aumenta el costo de las pruebas.

2. Alcance
En esta prctica el estudiante comprender y observar la aplicacin y la
elaboracin del ensayo de inmunoabsorbencia ligada a enzima (ELISA).

3. Objetivos
Que el estudiante:
- Conozca los principios en los que se basa la prueba de ELISA
- Se familiarice con el equipo utilizado para la elaboracin del la prueba de ELISA.
- Conozca la importancia de este tipo de pruebas y su aplicacin en el mbito de
la medicina.

4. Antecedentes
Dispositivos Empleados En Elisa
Se han ensayado numerosas fases slidas, desde los tubos de cristal de los
orgenes a las actuales microplacas de 96 pocillos de plstico tratado para aumentar su
capacidad de absorcin de molculas y con fondos de pocillo pticamente claros para
poder realizar las medidas de densidad ptica en instrumentos especficos,
espectrofotmetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA.
Actualmente se estn desarrollando dispositivos de mayor capacidad, por ejemplo con
384 y 1536 pocillos, adecuados para los sistemas de screening masivo de los
sistemas robotizados (HTS, High throughput system).

61
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

Los lectores ELISA son espectrofotmetros capaces de realizar lecturas seriadas de


cada uno de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotmetro
convencional, con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el
visible de manera continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que
slo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda. Son la que se corresponden
con las necesarias para determinar la densidad ptica de los cromgenos ms
comnmente utilizados.

Fases de un ensayo ELISA


Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:

1. Unin del antgeno (o del anticuerpo) a los pocillos.


La unin de anticuerpos o antgenos se realiza con facilidad a la superficie de
plsticos tratados que tienen gran afinidad por protenas.
Generalmenteeste paso ya no se realiza debido a que los kits comerciales ya lo
traen.

2. Formacin de una o ms capas de inmunocomplejos:


Se realiza al agregar la muestra del paciente que contiene los antgenos o
anticuerpos a detectar.
En el caso del antgeno unido a la placa se puede detectar mediante un
anticuerpo anti-antgeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo
primario anti-antgeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto).
Este segundo mtodo permite la amplificacin de la seal al poderse unir uno o
ms anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo
unido a la placa se incuba con una mezcla de antgeno y antgeno marcado. Se
ensayan diferentes relaciones de antgeno frio frente a una cantidad fija de antgeno
marcado. Es el ensayo de competicin del antgeno.

62
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

3. Conjugado:
Se agrega un anti-anticuerpo ligado a una enzima (fosfatasa o peroxidasa) que
se une al inmunocomplejo que ya se ha formado.

4. Revelado de la reaccin enzimtica.


Despus de un lavado para eliminar todas las molculas marcadas no fijadas en
forma de inmunocomplejos se aade el sustrato enzimtico en solucin (cromgeno).
Se deja reaccionar y se lee la densidad ptica (D.O.) mediante espectrofotometra.

Tipos de ensayos ELISA


Se han desarrollado mltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la
cuantificacin de un antgeno en solucin, la deteccin de un anticuerpo en una solucin
por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales, o la determinacin de la
subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuacin se describen los ms comunes. La
versin ms comn de ELISA es el ensayo sandwich.
- Ensayo directo: (Ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se
preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se
encuentra el antgeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la
presencia de antgeno en la solucin analizada. Es necesario incluir controles
negativos que sern muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,
etc.) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antgeno buscado.
Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el
antgeno buscado, o bien se le ha aadido).

63
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

- Ensayo indirecto: Las placas ELISA se preparan de una forma idntica a la


anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de
deteccin emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antgeno, y uno
secundario marcado contra el primario. La deteccin tiene mayor sensibilidad
por presentar una amplificacin de seal debida a la unin de dos o ms
anticuerpo secundarios por cada primario. Es el ensayo ms popular, como lo es
la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un
mismo sistema enzimtico permite cuantificar una gran cantidad de antgenos.
- Ensayo sandwich: (Ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante
inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el
pocillo con un primer anticuerpo anti-antgeno. Despus de lavar el exceso de
anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antgeno,
que ser retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo.
Despus de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una
solucin con un segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As pues cada
molcula de antgeno estar unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un
segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran
especificidad y sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el
segundo anticuerpo.

Aplicaciones
Este mtodo ha tenido una enorme aplicacin en todos aquellos campos en los
que se precisaba la cuantificacin de productos mediante anticuerpos: diagnstico
clnico, deteccin viral, clasificacin de anticuerpos en isotipos, bsqueda de
anticuerpos monoclonales, etc.

Enzima Sustrato Tampn


Estas enzimas son utilizadas en la etapa de deteccin, las cuales unen de manera
covalente a mAbs (anticuerpos monoclonales), sin afectar la capacidad de unin a
antgenos del anticuerpo, o bien, sin inhibir la actividad de la enzima. Una gran
variedad de sustratos se puede incubar con estas enzimas para generar productos de
color susceptibles de cuantificacin mediante espectrofotmetros con placas de
microtitulacin. Las enzimas ms comunes empleadas en la etapa de deteccin son:
peroxidasa de suero de caballo y la fosfatasa alcalina. A continuacin se describe la
preparacin de las enzimas ms comunes:
HRP (peroxidasa de rbano) OPD 10 mg/25 mL de tampn citrato sdico 0.15 M
pH 5; aadir microL de 30% perxido de hidrgeno 30%
AP (Fosfatasa alcalina) PNPP 5 mg/5 mL de tampn dietanolamina-HCl0.1 M pH
9.8 +1 mM cloruro de magnesio
TMB (tetrametilbenzidina) 2.5 mg/250 microL de DMSO; hasta 25 ml con tampn
citrato sdico 0.1M pH 6; aadir 5 microL de perxido de hidrgeno 30%

64
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

5. Materiales
- Alcohol al 70%
- Algodn
- Beaker con cloro al 5%
- Cloro al 5%
- Kit de reactivos para ELISA
- Pipetas automticas de 100 uL
- Pipetas automticas de 1000 uL
- Puntas azules para pipetas de 200-1000uL
- Puntas amarillas para pipetas de 200-1000uL

6. Procedimiento
- Permitir que los reactivos alcancen la temperatura ambiente. Organizar y
etiqueta con el nmero necesario de tiras.
- Aadir 100 uL control positivo, control negativo y suero de paciente por
duplicado en los pocillos.
o Pozos B1,C1 y D1: C-
o Pozos E1 y F1: C+
o Pozos G1 y H1: Mx 1
- Aadir 50 ul de conjugado en los pozos B1 al H2. Cubrir con cinta
adhesiva. Mezcle suavemente. Incubar durante 90 minutos a 37C.
- Lavar llenando cada pozo con 350 uL de solucin de lavado. Repetir el
procedimiento 5 veces
- Aadir 100 ul de cromgeno (sustrato) a los pozos A1 a H1. Mezcle
suavemente. Cubrir con cinta adhesiva e incubar 30 minutos protegidos de la
luz.
- Aada 50 ul de solucin de parada a los pozos A1 a H1. Si el cambio de color no
parece uniforme, golpee suavemente la placa para que se mezcle bien.

7. Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad


Aplique las medidas de bioseguridad en el descarte de los materiales, suero y manejo
de reactivos.

8. Formato de presentacin de resultados


Presentar los resultados en forma escrita, con una discusin de los mismos.
Investigue los diferentes anlisis que se pueden realizar utilizando en ensayo de ELISA

65
Universidad Mariano Glvez
Facultad de Ciencias Mdicas y de la Salud
Carrera de Mdico y Cirujano

9. Bibliografa
- Parslow t, Stites d et al. Inmunologa bsica y clnica 10 Ed. 2002. Editorial El
manual moderno Mxico. P.917 (Pg. 254 257).

10. Cuestionario
Indique cual es la funcin de los siguientes pasos en la prueba de ELISA
a. Incubacin inicial de la muestra en el pocillo
b. Lavados
c. Adicin del conjugado
d. Adicin del cromgeno
e. Cubrir los pozos del ELISA una vez que se ha agregado el cromgeno

66

You might also like