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4.

- Hidrlisis de los Aminocidos

Para determinar los aminocidos que componen un determinado alimento (en este caso

la kiwicha), es menester proceder a su hidrlisis, para luego valorarlos individualmente,

es decir desnaturalizar la protena, lo cual se puede hacer mediante a adicin de cidos o

bases (lo que vamos a practicar), o tambin por el calentamiento, la exposicin a la luz

ultravioleta, la agitacin vigorosa, la adicin de acetona, rea, etc.

Pero la hidrlisis presenta problemas, dado la sensibilidad de varios aminocidos al

proceso, tales como la serina, la treonina, la cistina y el triptofano. Durante la hidrlisis

acida la cistina es parcialmente destruida y el triptfano lo es totalmente.

Es recomendable realizar dos hidrlisis: una durante 24 horas y otra durante 72 horas.

Es tambin aplicada la hidrlisis bsica, emplendose: NaOH 5 N o mejor Ba(OH) 2 al

14% (P/V), calentando a reflujo durante 18 a 20 horas para liberar la protena.

Consideraciones generales:

El tratamiento de una protena con un cido, a la temperatura ambiente no es suficiente

para llevar a cabo el desdoblamiento completo de la molcula proteica en sus

componentes. Para efectuar la hidrlisis por un cido o por un lcali deben observarse

las siguientes reglas:

-Concentracin de los cidos y lcalis

Para realizar una hidrlisis exacta y estar en condiciones de repetir sus propios

resultados es necesario expresar la concentracin de los cidos y los lcalis en trminos

de su normalidad, ya que esta influye en la desnaturalizacin parcial o total de las


protenas, por ejemplo se ha recomendado para disminuir la prdida de serina y treonina

emplear acido clorhdrico 3 N en vez de 6 N.

-Concentracin de las Protenas para la Hidrlisis

As como seleccionamos un cido o un lcali como agente hidroltico es conveniente

especificar no solo la cantidad de cidos o hidrxidos, sino tambin la de protenas en el

volumen de la mezcla final.

Las condiciones que gobiernan la velocidad de la hidrlisis de las protenas deben estar

de acuerdo con la Ley de la accin de las masas, la cual establece: la velocidad de la

reaccin, a temperatura y presin constante, es proporcional al producto de

concentracin en molculas gramo por litro. As, pues, es evidente que para obtener

resultados constantes y exactos debe conocerse tanto la concentracin del agente

cataltico como la del substrato.

-Velocidad de la hidrlisis

Dunn investig la velocidad de la hidrlisis de la casena por los cidos, y sobre la base

de una simple serie de mediciones afirm que se ajusta a una reaccin de primer orden.

Greenberg y Burk estudiaron la hidrlisis de la gelatina, la gliadina y la fibrona de la

seda mediante diferentes concentraciones de cido clorhdrico y de cido sulfrico. Sus

datos indicaban que la velocidad de hidrlisis de estas protenas, medida por el aumento

de nitrgeno amnico, era la de una reaccin de segundo orden. Tambin demostraron

que la accin cataltica de los cidos sobre la hidrlisis de las protenas es proporcional

a la actividad termodinmica del in hidrogeno.

Nasset y Greenberg reinvestigaron la hidrlisis acida de la casena y hallaron que su

velocidad se ajusta a la ecuacin para una reaccin de segundo orden.

-Efecto de la Temperatura y la Presin


Evidentemente, a mayor temperatura mayor velocidad de hidrlisis. El procedimiento

general que nos ha sido trasmitido es hervir a reflujo la mezcla que contiene el agente

cataltico y la protena hasta que se haya completado la reaccin. La velocidad de la

hidrlisis puede acelerarse si la misma mezcla se calienta bajo presin. Es

recomendable evitar prolongar la ebullicin de las protenas en los cidos o los lcalis

mas all del tiempo necesario para completar la hidrlisis, pues algunos aminocidos

pueden destruirse o racemizarse parcialmente.

La hidrlisis de las protenas por los cidos o los lcalis bajo vapor a presin o en un

autoclave tiene ventajas manifiestas sobre la hidrlisis por ebullicin a reflujo ya que

hay una considerable reduccin de tiempo y material cuando hidrolizamos las protenas

sea por cidos o lcalis, bajo este mtodo a elevadas temperaturas.

-Trmino de la Hidrlisis

Se juzga que la hidrlisis de una protena esta terminada cuando se encuentran del todo

rotas las uniones peptdicas, esto es bastante difcil de determinar con exactitud, pero la

reaccin de Biuret, que es realmente til y se emplea en gran escala con el fin de

establecer la presencia de uniones peptdicas.

-Humus

El humus es considerado una condensacin de triptfano con un aldehdo. Aunque

tambin existe la posibilidad de que la tirosina en presencia de vestigios de metales

como por ejemplo el hierro, de lugar a la formacin de humus. La hiptesis de que la

cantidad de triptfano de una proteica es proporcional al humus formado por la

hidrlisis cida espera ser confirmada.

Amonaco
Cuando se digiere en forma completa una protena por medio de un cido y luego se

alcaliniza, se libera amonaco, el cual puede recuperarse cuantitativamente por

destilacin. Esto se ver ms adelante en la aplicacin del mtodo de Kjeldahl.

4.1 Hidrlisis cida

Los agentes catalticos ms corrientes son el cido sulfrico y el cido clorhdrico. El

cido fosfrico y actico, y el anhdrido arsenioso no son cidos suficientemente fuertes

para romper la molcula de protena en sus componentes.

a) Acido Sulfrico

Fue el primer acido utilizado para efectuar la hidrlisis de las protenas. Sus

ventajas fueron reconocidas por los primeros investigadores de la qumica de las

protenas, por la sencilla razn de que sus aniones pueden eliminarse casi del todo

por lo catin del xido de calcio o del hidrxido de bario. Su principal

inconveniente es que los voluminosos precipitados de sulfato de calcio o de sulfato

de bario retienen o adsorben una cierta cantidad de los componentes de las

protenas digeridas. As, pues, para la determinacin cuantitativa exacta de los

aminocidos en particular es aconsejable utilizar cido clorhdrico.

b) Acido Clorhdrico

A causa de las dificultades que se hallaban para la eliminacin de sus aniones, no se

utiliz ampliamente este cido hasta la primera mitad del siglo XX. Es un agente
cataltico muy eficaz al que numerosos investigadores dan preferencia sobre el cido

sulfrico. Se utiliza generalmente en concentraciones de 6 N.

Algunas desventajas de la hidrlisis acida

La hidrlisis de las protenas mediante los cidos sulfrico o clorhdrico ocasiona la

destruccin del triptfano y la posible dismutacin de una cierta cantidad de cistina,

serina, treonina y cidos dicarboxilicos. Con excepcin de la zena y pepsina, la mayor

parte de las protenas, al hervirlas con cualquiera de estos agentes catalticos fuertes,

dan lugar a una sustancia negra o pardo negruzca llamada melanina o humus.

4.2 Hidrlisis por lcalis

Es la hidrlisis de protenas por agentes catalticos tales como el hidrxido de Sodio, el

hidrxido Potasio y el hidrxido de Bario, la principal ventaja de los hidrxidos sobre

los cidos es que no dan lugar a la formacin de humus. As pues, segn informes, no

destruyen el triptfano. La tiroxina y el cido iodogorgoico no se afectan por su accin

cataltica, por otra parte, ocasionan la descomposicin parcial o total de la cistina, la

arginina y la lisina.

Cuando una protena se hidroliza por un lcali, sus componentes, con excepcin de la

glicocola, se racemizan. La concentracin a usar de hidrxido de bario ser al 14%.

4.3 Hidrlisis por Enzimas


Se utilizan enzimas proteolticas cuya actividad es lenta y a menudo incompleta, sin

embargo no se produce racemizacin y no se destruyen los aminocidos; por lo

tanto es muy especfica.


Reaccin de Biuret:
Los polipptidos (la mnima unidad de reaccin es el tripptido) reaccionan con una

disolucin diluida de sulfato cprico en medio fuertemente alcalino, mostrando una

cloracin azul caracterstica.

I. HIDRLISIS

HIDRLISIS CIDA Y ALCALINA:

Materiales:

0.5 gr de kiwicha (para cada ampolla)

8 ampollas de vidrio (4 ampollas para la cida y 4 para la alcalina)

Esptula

Placa de toques
Prueba de Biuret
Embudo, etc.

Equipos:

Estufa

Balanza analtica

Productos Qumicos (reactivos):

HCl 6 N H. cida

Ba(OH)2 al 14% H. alcalina

CuSO4
Reaccin de Biuret
NaOH
HIDRLISIS CIDA:

Objetivo:

Obtener todos los aminocidos contenidos en la kiwicha a excepcin de triptfano que

es destruido.

Procedimiento:

Se agrega 0.5 gramos de kiwicha (previamente pulverizada y desengrasada) en cada

ampolla, luego con ayuda de una pipeta, se aade unos 6mL de HCl 6 N y se procede al

sellado de cada ampolla con un mechero.

Se lleva a la estufa por 24 horas a 90 - 110C, luego se verifica la totalidad de la

hidrlisis con la prueba de Biuret, la cual se procede de la siguiente manera:

Se realiza el filtrado para eliminar todo el humus de la muestra se recibe en un tubo de

ensayo y en una placa de toques se aade unas gotas de muestra problema (kiwicha),

luego se agrega 2-3 gotas de NaOH (para alcalinizar el medio) y seguido de esto se

aade 2 gotas de CuSO4.

La coloracin de la prueba es celeste lo cual indica que no hay enlaces peptdicos y la

hidrlisis es total.

Se conserva la muestra hidrolizada en un vial y se refrigera para su posterior anlisis

cromatogrfico.

HIDRLISIS ALCALINA:

Objetivo:

Obtener el aminocido triptfano, el cual no es destruido por medio de esta hidrlisis.


Procedimiento:

El procedimiento es similar al de la hidrlisis cida, pero en este procedimiento el

reactivo a utilizar es el Ba (OH) 2 al 14%, se obtiene un filtrado de color amarillo claro y

se realiza la prueba de Biuret indicando destruccin de los enlaces peptdicos, es decir la

presencia de aminocidos. El filtrado obtenido se vierte en un vial para su posterior

cromatografa.