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UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE

GROHMANN - TACNA

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA ACADMICA POFESIONAL DE INGENIERA AMBIENTAL

EXPERIMENTO 21

CURSO:

Microbiologia

DOCENTE:

Cesar Julio Caceda Quiroz


ALUMNA:

Rosmeri Claros Espinoza

CDIGO:

2015 178025

CICLO:

TACNA PER

2016
Deteccin de parsitos
protozoarios transmitidos
por el agua

21.1. DESCRIPCIN GENERAL


Objetivo: Revisar cmo parsitos protozoarios son concentrados y detectados
en el agua.

Examinar muestras preparadas de las etapas de vida y ambientalmente


resistentes de parsitos protozoos transmitidas por el agua.

21.2. TEORIA Y SIGNIFICADO

General
Enfermedades entricas Protozoarias se transmiten por va fecal-oral,
ambientalmente por las etapas de oocyst y quiste de Cryptosporidium y Giardia,
respectivamente. Son transmitidos muchas veces tomando agua y travs de
lugares recreacionales donde haya contacto con el agua (piscinas) y agua
potable con las aguas superficiales.

Ha habido numerosos brotes transmitidos por agua debido al Cryptosporidium


ya que se llega registro de los sucesos en el mundo desde el ao de 1987.El
brote ms grande registrado de cryptosporidiosis ocurrido en 1993 fue en los
Estados Unidos en la ciudad de Milwaukee, Wisconsin. La contaminacin del
lago y la penetracin posterior de los oocyst a travs de un rgimen de
tratamiento de agua potable de la coagulacin, sedimentacin, alteracin rpida
de arena y desinfeccin con cloro afectaron aproximadamente a 400.000
personas.

Entamoeba histolytica es otro protozoo parsito que se le ha asociado a


enfermedades transmitidas por el agua. Sin embargo, mientras que una causa
comn de gastroenteritis se crea que se desarrollaba en el mundo, se han
registrado brotes transmitidos por el agua en los Estados Unidos desde 1953.

Microbiologa de los principales parsitos que se transmiten a


travs del agua

Giardia
La Giardia es un protozoario flagelado caracterizado por un ciclo de vida que
implica 2 estados el de quiste y de un Trofozoito. La Giardia habita en heces de
animales y humanos, se le encuentra ms a menudo en forma de quiste ya que
es su forma ms resistente, cada quiste viable que se ingiere produce dos
trofozoitos flagelados que se adhieren a clulas epiteliales del duodeno y del
yeyuno. Los quistes pueden sobrevivir en agua durante dos meses a 8 C y son
ms resistentes al cloro que bacterias y las Entamoeba histolytica. Sin embargo,
son altamente vulnerables a la desecacin y temperaturas superiores a 50 C.
El quiste tiene forma de baln de futbol americano con un promedio de 8 12mm
de longitud por 7 10mm de ancho. Contiene estructuras internas, especficas
a la Giardia, llamado cuerpos mediana y un axostillo que se utilizan para un
resultado que da positivo cuando se quiere identificar al quiste.

En la actualidad, ya que no hay mtodos de rutina para cultivo de quistes de


Giardia o ooquistes Cryptosporidium en muestras de agua, la nica tcnica
practica para la deteccin en agua se basa en el examen microscpico de los
concentrados derivados de procesamiento de grandes volmenes de agua (10
400 litros). Por lo tanto, recuperacin de quiste y positiva identificacin dependen
de factores tales como la cantidad de agua bombeada a travs del filtro y los
factores ambientales que afectan a la distribucin del quiste en el medio acutico.
Ms importante an, identificacin del quiste depende de la experiencia,
habilidad y persistencia de la persona analizar la muestra.

Cryptosporidium
Cryptosporidium es un parsito coccidian protozoario que desarrolla en el epitelio
gstrico o intestinal de la mucosa en los mamferos. A diferencia de Giardia, tiene
un ciclo de vida relativamente complicado que implica etapas sexuales y
asexuales. Produce un medio ambiente estable ooquistes que despus de la
ingestin excystation, liberando 4 esporozoitos que inician entonces una
infeccin intracelular en las clulas epiteliales del tracto gastrointestinal. El
esporozoito distingue en un trofozoito que sufre multiplicacin asexual tipo
formulario meronts y, a continuacin, merozoitos que pueden infectar nuevas
clulas. Merozoitos de tipo II meronts producen microametocytes y
macrogametocytes que se someten a reproduccin sexual para formar los
ooquistes. Los ooquistes luego se excretan en las heces. Los ooquistes son muy
resistentes a la comn desinfectantes, incluso ms que Giardia. Son ms
pequeos que Giardia, siendo de 4 a 6mm de dimetro y forma redonda. Ganado
y otros animales pueden servir como reservorios de Cryptosporidium.

Entamoeba Histolytica
El ciclo de vida de la Entamoeba Histolytica se caracteriza por tres fases:
trofozoito, precyst y cyst, el quiste es la etapa contagiosa. La fase de quiste es
resistente, pero no puede soportar temperaturas superiores a 50 C, luz solar o
exposicin prolongada a desinfectantes. Las tres etapas del organismo pueden
encontrarse en las heces de personas infectadas. A diferencia de Giardia y
Cryptosporidium, los seres humanos y primates subhumanos son los embalses
slo de E.histolytica.Aspectos de la microbiologa de los principales parsitos
protozoos transmitidos por el agua que ocurre se comparan en la tabla 21-1.
Cryptosporidium Entamoeba Giardia

Fuente de Infecta animales y Seres humanos Infectados


contaminacin humanos infectados humanos y
ambiental y portadores animales,
crnicos portadores
crnicos
Primera 1986 1929 1965
documentacin
Fase Presente Oocyst quiste quiste
en el agua
Principales Filtrado y fuentes Contaminacin Uso de agua de
causas de de agua de las aguas cao sin usar
enfermedades desinfectada residuales de filtros de
transmitidas por aguas potables desinfeccin
el agua como aguas
potables

Tabla21-1 Comparacin de los principales protozoos


Figura 21-1 Aparato utilizado para la recuperacin de quistes u
ooquistes del filtro plisado. (Foto Cortesa K.L. Josephson.)

Mtodos de deteccin en agua


Como virus entricos, solamente unos pocos parsitos protozoarios necesitan
ser ingeridos para causar la infeccin en el hombre. Por lo tanto, son muestras
de grandes volmenes de agua (10 400 litros). Los quistes u ooquistes se
recogen pasando el agua poniendo a prueba a travs de un filtro de cartucho
plisado.

El volumen de agua bombeada a travs del filtro depende del propsito de la


investigacin. Despus de finalizado el muestreo, el cartucho de filtro se coloca
en una bolsa de Ziplock 1, doble empaquetado, sellada, etiquetado, colocado
en hielo y procesada dentro de 48h.

Quistes y ooquistes son estables durante muchas semanas a 4 C cuando son


almacenados en formalina o dicromato de potasio. La recuperacin de los
quistes u ooquistes implica el uso de un tampn de elucin y la sacudida que
ayuda su separacin del filtro. En el laboratorio, tampn de elucin se agrega
hasta el final de la entrada de la cpsula filtro asegurndose que el filtro plisado
est cubierto con la solucin. La cpsula del filtro es conectada a una coctelera
y agit durante 5 minutos a 600 rpm (Figura 21 - 1). La solucin se decanta en
un tubo de centrfuga cnico de 250 ml. Tampn de elucin se agrega otra vez
al filtro con un perodo de agitacin adicional de 5 minutos. Esta solucin tambin
se decant en un tubo de centrfuga cnico de 250 ml. La solucin se centrifug
a 1000 g durante 10 15 minutos para que sedimenten los quistes y
oocystsand el sobrenadante se aspira a la pelotilla. El volumen de pellets es
medido y registrado y ajustado para llevar el volumen final hasta 10ml (si el pellet
es menor de 0,5 ml), o la siguiente ecuacin puede utilizarse si el volumen de
pellets es mayor de 0,5 ml:

10
() =
0.5

Separacin inmunomagntica
Algas y otras partculas suspendidas (arcillas, suelo) tambin se concentran
junto a los ooquistes y quistes que pueden interferir con su observacin bajo el
microscopio. Para separar los ooquistes/quistes, se utiliza la separacin
inmunomagntica. Esto implica la adicin de bolas magnticas que estn
recubiertos con anticuerpos especficos contra los quistes y ooquistes.

Despus de acoplamiento de los quistes/ooquistes a los granos, los granos se


separan de la solucin con el uso de un imn. Los quistes/ooquistes se colocan
en una solucin para desasociar de la beads.

1ml magntica de 10 X SL-tampn-A y 1ml de 10 X SL-tampn-B (suministrado


en IMS Dynal kit1) se agrega al tubo de muestra cara de at; 10ml del
concentrado de muestra de agua luego se agrega al tubo de muestras at-sided
junto con 100 ml de Dynabeads Crypto-Combo y 100 ml de granos magnticos
Dynabeads Giardia-Combo del kit IMS Dynal. El tubo de muestra es conectado
a un mezclador rotativo y gira a 18 rpm durante 1 hora. El tubo de muestra se
coloca en la MPC-1 (concentrador de partculas magnticas) con el lado at del
tubo al lado del imn. Se vierte el sobrenadante del tubo. La muestra se
resuspendi en 1ml de 1 X SL-tampn-A y colocada en un concentrador de
partculas magnticas en segundo lugar (MPC-M), el sobrenadante se aspira del
tubo. La banda magntica se retira de la MPC-M y 50mlof 0.1N cido clorhdrico
se aade al tubo de la muestra y agit durante 10 15 segundos. Despus de
10 minutos, el tubo se coloca en el MPC-M, el sobrenadante se retira y se coloca
en el primer bien que contiene 5ml de 1.0N NaOH en una diapositiva bien. La
muestra es secada al aire. Este procedimiento se repite dos veces para el
organismo se desvincularon de la tira magntica y el sobrenadante se coloca en
el segundo pozo de la diapositiva (~50l/well)

La coloracin
Para ayudar en la deteccin de quistes de Giardia y ooquistes de
Cryptosporidium, el uso de microscopio directo immunouorescent utilizando
anticuerpos monoclonales es de uso frecuente cuando concentra el examen
ambiental. Isotiocianato de fluorescena (FITC) es conjugado a anticuerpos y
microscopia de epiuorescente utilizado para la deteccin final. Se considera una
caracterstica uorescence de verde alrededor del quiste u ooquistes.

Un control positivo y negativo tambin debe ser preparado cada vez que se
realiza la tincin. Una gota de reactivo de deteccin y una gota de Contratincin
reactivo se aade a cada pocillo que contenga la muestra.

Tabla 21-2 Procedimientos para la determinacin de parsitos protozoarios en


muestras de agua

Muestra de Pasos Procedimientos Usados


Recogida 0 a 100L de agua pasa a travs de un filtro de cartucho
de muestras plisado membrana
Elucin Tampn de elucin aadido al final de la entrada del filtro
y recopilacin de cpsula y agit durante 5 minutos a 600 rpm
Concentracin Centrifugacin se utiliza para concentrar los quistes y
y Clarication ooquistes desde el medio de elucin. Los pellets estn
magnetizados por el accesorio de bolas magnticas
conjugado con anticuerpos contra Giardia y ooquistes y
quistes Cryptosporidium. Una vez magnetizado se
separan de la solucin utilizando un imn. Los granos
magnticos complejos entonces se desvincularon de los
quistes y ooquistes utilizando una solucin de cido dbil
Deteccin El sobrenadante se coloca en un portaobjetos bien y
teido con anticuerpos especficos dirigidos contra el
quiste u ooquistes en un procedimiento de uorescent
directa

La diapositiva se incuba en cmara hmeda en la oscuridad a temperatura


ambiente durante 30 minutos. Despus de este tiempo, se aade 1 gota de
tampn de lavado a cada bien y suavemente aspirada desde abajo el bien con
una pipeta Pasteur limpia sin alterar la muestra. Una gota de medio de montaje
se aade a cada pocillo un cubreobjetos se aplica y sellado con esmalte de
ngernail y enumerado por microscopia uorescent.

Un resumen de los mtodos utilizados en la investigacin de muestras de agua


para los parsitos transmitidas por el agua se da en la tabla 21-2.

21.3 PROCEDIMIENTOS
Materiales

Muestras preparadas de:

Quistes de Giardia lamblia

Trofozoitos de Giardia lamblia

Trofozoitos de Entamoeba histolytica

Ooquistes de Cryptosporidium

Microscopio

Se le dar una serie de muestras preparadas para examinar. Dibujar las


observaciones de los siguientes: trofozoitos de Giardia lamblia, quistes de
Giardia lamblia, Cryptosporidium ooquistes, Trofozoitos de Entamoeba
histolytica. Tenga en cuenta el tamao y la forma de los organismos. Cuenta y
dibuja cualquier caracterstica interna que observas.
21.4 CUESTIONARIO Y PROBLEMAS
1. Cul de los parsitos slo infecta a los primates?
2. Cul de los parsitos produce un ooquiste?
3. Qu proceso de tratamiento de agua potable es ms eficaz para
eliminar Quistes de parsitos y oocistos del agua?
4. Cul es la etapa infecciosa de Giardia que se encuentra en el agua?
5. Por qu es necesario muestrear grandes volmenes de agua para
quistes y Ooquiste
6. Cmo se eliminan los quistes / oocistos del filtro utilizado para
concentrar Agua.
7. Cul es el propsito de las perlas magnticas utilizadas para Quistes /
oquistes?
8. Cul es el propsito de los anticuerpos marcados con isotiocianato de
fluorescena?
9. Cul es mayor, quistes de Giardia o oquistes de Cryptosporidium?

21.5 REFERENCIAS

Rose, J.B. (1990) Occurrence and control of Cryptosporidium in drinking water.


Drinking Water Microbiology. G.A. McFeters, ed., pp. 298321. Springer-Verlag,
New York.

Rose, J.B., Gerba, C.P., and Jakubowski, W. (1991) Survey of potable water
supplies for Cryptosporidium and Giardia. Environmental Science and Technology
25, 13931400.

United States Environmental Protection Agency (2001) Method 1623:


Cryptosporidium and Giardia by Filtration/IMS/FA. Office of Water. Washington, DC.

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